CN103360609B - 一种双亲性的蛋白质-高分子键合体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型的双亲性的蛋白质-高分子键合体及其制备方法；其过程为1）使用二氯亚砜将端基为羧基的PCL酰氯化，在60～85℃反应温度下反应4～6小时，纯化得到酰氯化的PCL；2）将酰氯化的PCL与马来酰亚胺制备马来酰亚胺化的PCL，两者投料摩尔比为1:2～1:5，透析除去过量的马来酰亚胺；3）马来酰亚胺化的PCL与BSA反应，利用BSA上的巯基（-SH）与马来酰亚胺通过迈克尔加成反应实现键合，制备得到BSA-PCL键合体。本发明制备的BSA-PCL键合体具有双亲性，可进行自组装和负载药物，用作药物载体材料，且本制备方法可实现PCL的定点键接以及数目可控。用于药物载体材料。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体材料制备技术领域，特别涉及一种新型的双亲性的蛋白质-高分子键合体及其制备方法。
背景技术
药物载体能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。由于各种药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度，因而对它的研究越来越受到重视。为了寻找合适的药物载体，人们对各种体系如微球、脂质体、微乳液等进行了研究。
近年,对药物传递系统(DDS)的研究逐渐受到了材料化学、药学、生物化学等领域学者的广泛关注,尤其两亲性共聚物包括亲水链和疏水链两部分组成的大分子，因为两亲性嵌段共聚物的各嵌段的热力学不相容性，在选择性溶剂中趋向于相互聚集自组装形成特定形态的聚集体，而这些聚集体有时具有纳米空腔结构，所以在药物释放方面具有很广阔的应用前景。这样,水溶性较差的药物可以被包裹在憎水性的核内,增大其水溶性；同时降低了药物在血液循环中发生降解的可能性.亲水性的壳(例如:聚乙二醇)可以提高聚合物胶束的稳定性,增强载药胶束穿透网状内皮组织体系的渗透性同时延长了药物体内循环的时间。
到目前为止，研究者已经合成了一系列双亲性的高分子用于制备药物载体的材料。在这其中，常用的组成双亲性高分子的亲水聚合物主要包括：聚乙二醇(PEG)、多肽(如聚谷氨酸)、聚丙烯酸(PAA)和聚(2-甲基丙烯酞氧基乙基磷酸胆碱)(PMPC)等。常用的组成双亲性高分子的疏水聚合物主要包括：聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丁二烯(PBD)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)和聚(N,N-二甲基氨基乙氧基甲基丙烯酸酯)(PDAEMA)等。选用不同链长的亲水聚合物与疏水聚合物得到的亲双亲性聚合物，通过自组装可以得到不用形貌的组装体。这些组装体都可用来负载药物，用于药物载体。
白蛋白由于本身所具有的可生物降解、无毒、无抗原性、病人耐受和生物利用度高等特点，已受到了生物医药领域研究工作者的重视，被广泛用作诊断试剂和药物载体等。白蛋白载药体系更是成为现今药学研究中一个极具生命力的研究方向。近年来，白蛋白作为药物载体与小分子化合物的相互作用得到广泛的研究，这催生了一些经典研究方法，如平衡透析法、超滤法、电化学法、荧光光谱法等，和一些新的技术如毛细管电泳技术、核磁共振技术以及蛋白质结构模拟等，这些新方法新技术反过来也对药物与蛋白载体之间相互作用关系的考察起着推动作用，不断扩充着白蛋白作为药物载体的适用范围。目前应用最广泛的白蛋白主要有人血清白蛋白(HSA)以及牛血清白蛋白(BSA)。
聚己内酯(PCL)具有优越的生物相容性、药物通透性、形状记忆性以及较好的生物降解性能，是一种很好的医用高分子材料，广泛的用于药物的载体及缓释剂。从分子结构看，PCL的生物降解过程主要通过主链上的不稳定键的水解变成低相对分子质量、水溶性的小分子。PCL被美国食品和药物管理局(FDA)所认证，可应用于人体。
本发明中，将牛血清白蛋白(BSA)和聚己内酯(PCL)通过共价键将两者键合起来，制备一种新型的双亲性的蛋白质-高分子键合体。BSA-PCL体系具有很好的生物安全性并可生物降解。与此同时，BSA赋予此体系生物功能化且作为亲水部分，PCL提高BSA的稳定性，同时作为一种疏水链接到BSA上面，使得该蛋白质—高分子键合体具有双亲性，且可进行自组装和负载药物，可作为一种新型的药物载体材料。
发明内容
本发明制备了一种双亲性的蛋白质-高分子键合体，其特征是选用牛血清白蛋白(BSA)和聚己内酯(PCL)，利用BSA上的巯基(-SH)将马来酰亚胺化的PCL键合到BSA上，本发明中所使用的PCL的分子量为2000～10000；其结构式如下：
本发明的技术方案如下：
1)使用二氯亚砜将端基为羧基的PCL酰氯化，反应温度为60～85℃，反应时间为4～6h；
2)将1)制备的酰氯化的PCL溶解好后加入马来酰亚胺，PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:2～1:5，反应时间为12～24h，反应温度为20～40℃，反应结束，透析除去过量的马来酰亚胺，然后除去溶剂得到马来酰亚胺化的PCL粉末；
3)将2)制备的马来酰亚胺化的PCL溶解好后滴加到牛血清白蛋白的水溶液中，在室温下，利用BSA上的巯基(-SH)与马来酰亚胺通过迈克尔加成反应，制备得到BSA-PCL蛋白质—高分子键合体，BSA与PCL的摩尔比为1:1～1:3，反应时间为12～24h，经后处理得到BSA-PCL键合体絮状产品。
所述的步骤2)中溶解酰氯化后的PCL的溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种的组合。
所述的步骤2)中对于过量的马来酰亚胺采用透析的方法除去，透析所用溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种的组合。
一种新型的双亲性的蛋白质-高分子键合体的制备方法，其特征在于在制备的步骤3)中溶解马来酰亚胺化的PCL的溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种的组合。
所述的步骤3)中后处理过程为反应结束后，透析除去体系中未反应的PCL，然后冻干得到产品。透析先在四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种的组合溶剂中进行，然后转移至水中透析。
本发明制备的新型的双亲性的蛋白质-高分子键合体的优点在于：
1、选用两种生物相容性好、毒性低且可生物降解的原材料牛血清白蛋白(BSA)和聚己内酯(PCL)，制备的BSA-PCL键合体为一种生物安全性好并可生物降解的生物材料；
2、牛血清白蛋白(BSA)具有很好的亲水性，聚己内酯(PCL)具有很好的疏水性，通过共价键将PCL键合到BSA上制备BSA-PCL键合体，使得该蛋白质—高分子键合体具有双亲性，且可进行自组装和负载药物，可作为一种新型的药物载体材料。
3、本发明中制备BSA-PCL键合体的键合方法可实现PCL的定点键接和数目可控。
附图说明
图1本发明制备的BSA-PCL键合体的红外谱图。
图2本发明制备的BSA-PCL键合体自组装后的透射电镜照片。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施案例1：
1)称取一定量羧基的聚己内酯(分子量为2000)加入三口瓶中，然后加入1ml二氯亚砜，10μL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌下升温至60℃，反应时间为4h。反应结束，减压蒸馏除去过量的二氯亚砜，真空烘箱中烘干得酰氯化的聚己内酯，产率为97％。
2)称取一定量酰氯化的聚己内酯(PCL)加入单口瓶中，并加入2ml三氯甲烷溶解。待完全溶解后加入一定量马来酰亚胺(PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:2)和10μL三乙胺，20℃下反应12h。反应结束后在三氯甲烷中透析除去未反应的马来酰亚胺，烘干得到马来酰亚胺化的聚己内酯，产率92％。
3)称取一定量牛血清白蛋白加入三口瓶，加2ml水溶解。称取马来酰亚胺化的聚己内酯(牛血清白蛋白与马来酰亚胺化的聚己内酯的摩尔比为1:1)用1ml四氢呋喃溶解。室温下将溶解好的聚己内酯滴加至三口瓶中，滴加完毕后反应12h。反应完成后，在四氢呋喃中透析除去未反应的聚己内酯，然后转移至水中透析。透析完全后，在冻干机中冻干，得白色絮状产品。产物的红外谱图见图1，图1中在1743cm-1处出现了酯键上羰基的吸收峰，而单纯的BSA只有在1689cm-1处酰胺键上的羰基的吸收峰。图1中出现了PCL中酯键的吸收峰，说明PCL已成功键合到BSA上(见图1所标示)。
实施案例2：
1)称取一定量含羧基的聚己内酯(分子量为5000)加入三口瓶中，然后加入1.2ml二氯亚砜，10μL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌下升温至65℃，反应时间为4h。反应结束，减压蒸馏除去过量的二氯亚砜，真空烘箱中烘干得酰氯化的聚己内酯，产率为98％。
2)称取一定量酰氯化的聚己内酯加入单口瓶中，并加入2ml二氯甲烷溶解。待完全溶解后加入一定量马来酰亚胺(PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:3)和10μL三乙胺，30℃下反应18h。反应结束后在二氯甲烷中透析除去未反应的马来酰亚胺，烘干得到马来酰亚胺化的聚己内酯，产率95％。
3)称取一定量牛血清白蛋白加入三口瓶，加2ml水溶解。称取马来酰亚胺化的聚己内酯(牛血清白蛋白与马来酰亚胺化的聚己内酯的摩尔比为1:1)用1ml二甲基亚砜溶解。室温下将溶解好的聚己内酯滴加至三口瓶中，滴加完毕后反应18h。反应完成后，在二甲基亚砜中透析除去未反应的聚己内酯，然后转移至水中透析。透析完全后，在冻干机中冻干，得白色絮状产品。
实施案例3：
1)称取一定量羧基的聚己内酯(分子量为8000)加入三口瓶中，然后加入1.3ml二氯亚砜，10μL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌下升温至70℃，反应时间为5h。反应结束，减压蒸馏除去过量的二氯亚砜，真空烘箱中烘干得酰氯化的聚己内酯。
2)称取一定量酰氯化的聚己内酯加入单口瓶中，并加入2ml丙酮溶解。待完全溶解后加入马来酰亚胺(PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:4)和10μL三乙胺，35℃下反应24h。反应结束后在丙酮中透析除去未反应的马来酰亚胺，烘干得到马来酰亚胺化的聚己内酯。
3)称取一定量牛血清白蛋白加入三口瓶，加2ml水溶解。称取马来酰亚胺化的聚己内酯(牛血清白蛋白与马来酰亚胺化的聚己内酯的摩尔比为1:2)用1ml四氢呋喃溶解。室温下将溶解好的聚己内酯滴加至三口瓶中，滴加完毕后反应24h。反应完成后，在四氢呋喃中透析除去未反应的聚己内酯，然后转移至水中透析。透析完全后，在冻干机中冻干，得白色絮状产品。
实施案例4：
1)称取一定量羧基的聚己内酯(分子量为10000)加入三口瓶中，然后加入1.5ml二氯亚砜，10μL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌下升温至80℃，反应时间为6h。反应结束，减压蒸馏除去过量的二氯亚砜，真空烘箱中烘干得酰氯化的聚己内酯。
2)称取一定量酰氯化的己内酯加入单口瓶中，并加入2ml二氯甲烷溶解。待完全溶解后加入马来酰亚胺(PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:5)和10μL三乙胺，35℃下反应20h。反应结束后在二氯甲烷中透析除去未反应的马来酰亚胺，烘干得到马来酰亚胺化的聚己内酯。
3)称取一定量牛血清白蛋白加入三口瓶，加2ml水溶解。称取马来酰亚胺化的聚己内酯(牛血清白蛋白与马来酰亚胺化的聚己内酯的摩尔比为1:3)用1ml四氢呋喃溶解。室温下将溶解好的聚己内酯滴加至三口瓶中，滴加完毕后反应20h。反应完成后，在四氢呋喃中透析除去未反应的聚己内酯，然后转移至水中透析。透析完全后，在冻干机中冻干，得白色絮状产品。
实施案例5：
1)称取一定量羧基的聚己内酯(分子量为5000)加入三口瓶中，然后加入1ml二氯亚砜，10μL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌下升温至85℃，反应时间为6h。反应结束，减压蒸馏除去过量的二氯亚砜，真空烘箱中烘干得酰氯化的聚己内酯。
2)称取酰氯化的己内酯加入单口瓶中，并加入2ml二氯乙烷和二氯甲烷的混合溶液中溶解。待完全溶解后加入马来酰亚胺(PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:5)和10μL三乙胺，40℃下反应18h。反应结束后在二氯乙烷和二氯甲烷的混合溶液中透析除去未反应的马来酰亚胺，烘干得到马来酰亚胺化的聚己内酯。
3)称取一定量牛血清白蛋白加入三口瓶，加2ml水溶解。称取马来酰亚胺化的聚己内酯(牛血清白蛋白与马来酰亚胺化的聚己内酯的摩尔比为1:2)用1ml四氢呋喃溶解。室温下将溶解好的聚己内酯滴加至三口瓶中，滴加完毕后反应18h。反应完成后，在四氢呋喃中透析除去未反应的聚己内酯，然后转移至水中透析。透析完全后，在冻干机中冻干，得白色絮状产品。
实施案例6：
1)称取一定量聚己内酯(分子量为5000)加入三口瓶中，然后加入1ml二氯亚砜，10μL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌下升温至85℃，反应时间为6h。反应结束，减压蒸馏除去过量的二氯亚砜，真空烘箱中烘干得酰氯化的聚己内酯。
2)称取酰氯化的己内酯加入单口瓶中，并加入2ml三氯甲烷溶解。待完全溶解后加入马来酰亚胺(PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:5)和10μL三乙胺，40℃下反应24h。反应结束后在三氯甲烷中透析除去未反应的马来酰亚胺，烘干得到马来酰亚胺化的聚己内酯。
3)称取一定量牛血清白蛋白加入三口瓶，加2ml水溶解。称取马来酰亚胺化的聚己内酯(牛血清白蛋白与马来酰亚胺化的聚己内酯的摩尔比为1:2)用1ml二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺的组合溶剂溶解。室温下将溶解好的聚己内酯滴加至三口瓶中，滴加完毕后反应24h。反应完成后，在二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺的组合溶剂中透析除去未反应的聚己内酯，然后转移至水中透析。透析完全后，在冻干机中冻干，得白色絮状产品。
实施案例7：
BSA-PCL键合体自组装后形态观察
称取一定量的实施案例4中制备的BSA-PCL键合体，溶解中在1ml二氯甲烷中，在细胞粉碎仪下滴加2ml水，滴加完成后继续超声2min。然后用旋转蒸发仪除去二氯甲烷。取少量组装后的样品滴于碳支持膜上制样，并用磷钨酸负染，在透射电镜下观察并拍照。所得的形貌如图2所示。
Claims (7)
1.一种双亲性的蛋白质-高分子键合体，其特征是选用牛血清白蛋白(BSA)和聚己内酯(PCL)，利用BSA上的巯基(-SH)将马来酰亚胺化的PCL键合到BSA上，所述的PCL的分子量为2000～10000；其结构式如下：
2.权利要求1的蛋白质-高分子键合体的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)使用二氯亚砜将端基为羧基的PCL酰氯化，反应温度为60～85℃，反应时间为4～6小时；
2)将1)制备的PCL溶解好后加入马来酰亚胺，PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:2～1:5，反应时间为12～24h，反应温度为20～40℃，反应结束，透析除去过量的马来酰亚胺，然后除去溶剂得到马来酰亚胺化的PCL粉末；
3)将2)制备的马来酰亚胺化的PCL溶解好后滴加到牛血清白蛋白的水溶液中，在室温下，利用BSA上的巯基(-SH)与马来酰亚胺通过迈克尔加成反应，制备得到BSA-PCL蛋白质—高分子键合体，BSA与PCL的摩尔比为1:1～1:3，反应时间为12～24h，经后处理得到BSA-PCL键合体。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的酰氯化的PCL的溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述对于过量的马来酰亚胺采用透析的方法除去，透析所用溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的溶解马来酰亚胺化的PCL的溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种的组合。
6.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的后处理过程为反应结束后，透析除去体系中未反应的PCL，然后冻干得到产品。
7.根据权利要求6中所述的制备方法，其特征在于透析先在四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种的组合溶剂中进行，然后转移至水中透析。
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