CN103356637B - 毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用，经实验研究表明，毛壳素能够显著改善心肌纤维化程度，提高高压力负荷诱发的心脏功能，防止心肌肥厚和心室重构，延缓心力衰竭的发生，并且能够抑制遭受急性心肌梗死引起的心肌细胞氧化应激，减少缺血梗死面积，减少心肌细胞氧化应激，维持心肌细胞正常功能，延缓心力衰竭的发生，显示出了很好的预防和治疗心脏病的作用，并且实验过程中未见明显不良反应，有望开发成新一代安全有效防治心脏疾病的药物。

Description

毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用

技术领域

本发明涉及毛壳素化合物的，特别涉及毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用，属于药物制剂领域。

背景技术

心脏疾病是威胁人类生命健康的最主要疾病之一，心力衰竭是由于心泵功能下降,导致心输出量减少,不能满足机体组织代谢需要的一种病理过程。它是许多心血管系统疾病发展的最终结果。近年来,一些新的治疗技术或药物的问世,如 :PT仪、溶栓术、冠脉搭桥等使心血管疾病的防治取得长足进展,特别是威胁人类生存的急性心肌梗塞、脑血管意外逐年以来呈逐年下降趋势。但心力衰竭则相反呈大幅度上升,成为当今全球范围内威胁人类健康的主要原因之一。据世界卫生组织最新报道，估计在2008年有1730万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的30％。这些死者中，估计730万人死于冠心病，620万人死于中风。

心肌肥厚和心室重构是心脏功能有正常到衰竭的转变过程，也是心肌组织中大量细胞功能和蛋白质表达异常，心脏结构和功能发生改变的过程。在此过程中，各种致心肌功能异常的因素，通过心脏细胞内信号转导途径改变相关基因的翻译后修饰，导致大量基因表达异常，从而使心脏的形态结构和功能发生变化。临床上治疗心力衰竭的药物ACEI、β-受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂的应用使心衰的临床预后得到了一定的改善，但病死率和致残率仍然很高，因此人们一直努力想研究新的治疗药物以期更大限度的改善心衰的预后。

Sirtuins主要是一类组蛋白去乙酰化酶（HDAC），它可以通过去除组蛋白中赖氨酸残基上的乙酰化，来调节和控制蛋白质和酶的活性，维持酶和蛋白质的稳定性。广泛存在的一类最古老、最普遍、最基本、最重要的基因或蛋白质，在体内能量代谢、生长发育、细胞存活、损伤修复、炎症免疫等各种生理和病生理反应中起着重要作用，是机体调节能量平衡、延缓衰老，维持内环境恒定，保证人体正常功能的守护者和调节者，亦称长寿基因。它是心血管系统和人体的“正能量”。 其中Sirt1最长，约含有700多个氨基酸残基，它既可存在于细胞核内，又可分布在胞浆中，具有核-质穿梭作用，是最重要的一种Sirt蛋白，主要参与体内细胞存活、损伤修复、糖脂代谢、炎症应激和胰岛素分泌调节等。在心肌梗死病中，Sirt1表达下降，并且Sirt1启动子区域的组蛋白修饰使其处于沉默状态。抑制或者逆转此过程可以明显改善心肌肥厚和心肌梗死的症状，减少心肌的氧化应激。

前期有毛壳素用于防治肿瘤疾病的报道，但是有关毛壳素在防治心脏疾病方面，还没有研究报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，在毛壳素原有功效的基础上，开发其新的临床用途，提供毛壳素在预防和治疗心脏病中的应用，实验结果表明，具很好的防治心脏疾病的功效，且无不良反应，临床应用安全。

技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的毛壳素，其结构式为：

分子式为：C ₃₀ H ₂₈ N ₆ O ₆ S ₄ ，分子量 696.84。

本发明通过大量实验研究表明，毛壳素能够显著改善心肌纤维化程度，提高高压力负荷诱发的心脏功能，防止心肌肥厚心室重构，延缓心力衰竭的发生；并且能够抑制遭受急性心肌梗死引起的心肌细胞氧化应激，可以减少缺血梗死面积，减少心肌细胞氧化应激，维持心肌细胞正常功能，延缓心力衰竭的发生。

本发明提供的毛壳素具有很好的预防和治疗心脏病的作用，可用于制备预防和治疗心脏病药物中的应用。

作为优选方案，本发明所述的毛壳素在制备预防和治疗缺血性心脏病药物中的应用。

作为另一优选方案，本发明所述的毛壳素在制备预防和治疗心室重构和心力衰竭药物中的应用。

作为另一优选方案，本发明所述的毛壳素在制备预防和治疗压力负荷诱导心室重构和心力肥厚药物中的应用。

作为另一优选方案，本发明所述的毛壳素在制备预防和治疗心肌梗死药物中的应用。

本发明所述的毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用，根据临床应用需要，可以将毛壳素和药学上可接受的载体制成注射剂、粉针剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、微囊、片剂或透皮控释贴剂剂型的药物

本发明提供的毛壳素制成胶囊剂时把毛壳素和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的毛壳素制成片剂时，把毛壳素和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的毛壳素制成颗粒剂时，把毛壳素和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的毛壳素制成注射液时，取毛壳素加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

本发明提供的毛壳素除热原之后，经无菌过滤，冷冻干燥，得到注射用粉针剂。

有益效果：本发明在毛壳素原有功效的基础上进行新的用途开发，实验研究表明毛壳素能够显著改善心肌纤维化程度，提高高压力负荷诱发的心脏功能，防止心肌肥厚和心室重构，延缓心力衰竭的发生，并且能够抑制遭受急性心肌梗死引起的心肌细胞氧化应激，早期应用，可以减少缺血梗死面积，减少心肌细胞氧化应激，维持心肌细胞正常功能，延缓心力衰竭的发生，显示出了很好的预防和治疗心脏病的作用，并且实验过程中研究表明，安全无毒，有望开发成新一代安全有效，防治心脏疾病的新药。

附图说明

图1 TAC术后两周后小鼠RCCA PSV/LCCA PSV比例柱状图。

图2 为毛壳素对TAC术两周后小鼠室间隔舒张厚度ISVd的实验结果柱状图。

图3为毛壳素对TAC术两周后小鼠左心室舒张后壁厚度IVPWd的实验结果柱状图。

图4 为毛壳素对TAC术两周后小鼠射血分数EF的实验结果柱状图。

图5为毛壳素对TAC术两周后小鼠轴缩短率FS的实验结果柱状图。

图6 为毛壳素对TAC术四周后小鼠HW/BW的实验结果柱状图。

图7为毛壳素对TAC术四周后小鼠LVW/TL的实验结果柱状图。

图8为毛壳素对TAC术四周后小鼠室间隔舒张厚度ISVd的实验结果柱状图。

图9 为毛壳素对TAC术四周后小鼠左心室舒张后壁厚度IVPWd的实验结果柱状图。

图10 为毛壳素对TAC术四周后小鼠射血分数EF的实验结果柱状图。

图11 为毛壳素对TAC术四周后小鼠轴缩短率FS的实验结果柱状图。

图12为毛壳素对TAC术四周后小鼠心脏外观的影响。

图13为毛壳素对TAC术四周后小鼠心肌纤维化影响的石蜡切片结果图。

图14为毛壳素对TAC术四周后小鼠心肌纤维化影响的石蜡切片结果图。

图15为毛壳素对LAD术24h后小鼠心肌梗死面积的实验结果柱状图。

图16 为毛壳素对LAD术一周后小鼠心肌纤维化的石蜡切片结果图。

图17 为毛壳素对LAD术一周后小鼠心肌纤维化的石蜡切片结果图。

图18为毛壳素对LAD术后小鼠存活率的曲线图。

图19为毛壳素对LAD术后小鼠心肌组织Sirt1 mRNA水平影响的示意图。

图20为毛壳素对LAD术后小鼠心肌组织Sirt1 组蛋白H3K9-Me3的柱状图。

图21为毛壳素对LAD术后小鼠心肌组织Sirt1 组蛋白H3K9-Ac的柱状图。

图22为毛壳素对双氧水处理的原代心肌细胞中Sirt1蛋白表达影响的示意图。

图23为毛壳素对抗霉素A和2脱氧葡萄糖处理的原代心肌细胞中Sirt1蛋白表达影响的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

以下实施例以下方法配制：取毛壳素（Chaetocin）（sigma公司，货号C9492） ，用DMSO 配制成终浓度1ug/ul。

实施例1 毛壳素对压力负荷诱导的心室重构保护作用实验

1、实验分组及实验方法：

选用SPF级雄性C57BL/6小鼠（购于南京大学模式动物所，下同），6至8周，随机分为四组：假手术组（Sham）、手术组（TAC）、手术+溶剂对照组（TAC+DMSO）、手术+给药组（TAC+毛壳素Chaetocin），每组6至8只。小鼠麻醉后进行人工通气，于胸部左侧第2至3肋间打开胸腔，分离主动脉弓，按统一标准缩窄主动脉弓（Transverse aortic constriction, TAC）,关闭胸腔。假手术组除了不进行TAC外，其余手术程序与模型组完全相同，溶剂对照组和给药组术后即经腹腔给药，每三天一次，毛壳素（Chaetocin）给药浓度为0.5mg/kg,持续给药2周后，对小鼠进行二维超声心电图检测，持续给药饲养至4周后再次进行二维超声心电图检测，随后取心肌组织进行各项分析。

术后2周的小鼠称重，麻醉，进行二维超声心电图检测。继续饲养至4周后，再次进行此过程。随后处死小鼠，快速打开胸腔取出心脏，去除心房组织，按统一标准修剪心脏，用滤纸充分吸干水分，电子天平准确称量全心和左心重量。并且取其胫骨，准确测量其长度。计算全心重/体重（HW/BW）比和左心重/胫骨长（LVW/TL），统计比值和心超结果。

2、实验结果：

由图1结果表明，手术组（TAC）、手术+溶剂对照组（TAC+DMSO）和手术+给药组小鼠左右颈总动脉峰值血流速比例，显示手术均一度良好。

由图2、图3、图4、图5示超声心动图结果，TAC 2周后手术组（TAC）、溶剂对照组的小鼠室间隔舒张厚度ISVd和心室舒张后壁厚度IVPWd的回声区明显增强，射血分数EF和轴缩短率FS未出现较明显变化，提示左心室肥厚，暂无心功能下降。与手术组和溶剂组相比，本发明提供的毛壳素（Chaetocin）组小鼠室间隔舒张厚度ISVd和心室舒张后壁厚度IVPWd的回声区明显降低，射血分数EF和轴缩短率FS无明显下降，与手术组（TAC）、手术+溶剂对照组（TAC+DMSO）组相比，p<0.05，显示出了很好的防治效果。

TAC4周后，由图6和图7结果表明，TAC组和溶剂对照DMSO组的HW/BW和 LVW/TL显著增加，与周龄配对的假手术组sham组相比有显著性差异，提示左心室肥厚；而本发明提供的毛壳素组药物组的HW/BW和 LVW/TL与TAC组和DMSO组相比则明显降低，具有显著性差异，具有明显防止心室肥厚的功效。

并且由图8至图11超声心动图结果表明，TAC 4周后，手术组（TAC）和溶剂对照组的小鼠室间隔舒张厚度ISVd和心室舒张后壁厚度IVPWd的回声区明显增强，射血分数EF和轴缩短率FS明显下降，提示左心肥厚并伴随有心功能下降。而本发明提供的毛壳素药物组得的小鼠ISVd和心室舒张后壁厚度IVPWd明显降低，射血分数EF和轴缩短率FS呈现回升，显示出了很好的防止心肌肥厚，心室重构，保护心脏的功效。

并且结果表明，图12所示TAC组和DMSO溶剂组小鼠心脏明显增大，毛壳素药物组小鼠心脏与TAC组和DMSO溶剂组小鼠心脏相比有明显减小。

对小鼠左心室心肌组织做石蜡切片，进行Sirius Red Staining和Masson's Trichrome Staining观察心肌重构和纤维化的情况。如图13和图14的实验结果表明，TAC组和DMSO溶剂组小鼠心脏纤维结缔组织增多，而毛壳素药物组小鼠心脏纤维化程度较TAC组和DMSO溶剂组均有所减轻。

通过以上实验结果表明，本发明提供的毛壳素能够显著改善心肌纤维化程度，提高高压力负荷诱发的心脏功能，防止心肌肥厚和心室重构，延缓心力衰竭的发生

实施例2 毛壳素对急性损伤的心肌保护实验

1、 实验分组和实验方法：

选用SPF级雄性C57BL/6小鼠，6至8周，随机分为三组：假手术组（Sham+DMSO）、心梗组（MI+DMSO）、心梗+给药组（MI+毛壳素Chaetocin），每组18至20只。小鼠麻醉后进行人工通气，于胸部左侧第2至3肋间打开胸腔，按统一标准结扎冠状动脉左前降支（Blocking Left Anterior Descending Coronary Artery, LAD）,制作急性心肌梗死模型,关闭胸腔。假手术组除了不进行LAD外，其余手术程序与模型组完全相同，心梗组和心梗+给药组，在术前24h经腹腔给药，持续两天，给药浓度为0.5mg/kg，术后36h内即处死小鼠，取心肌组织进行各项分析。部分实验动物术后观察一周，做存活率实验，观察完后，处死小鼠，取心肌组织进行各项检测。

小鼠心脏进行Evans blue灌流后，将心脏横切成5-6片，用TTC复染15分钟，福尔马林固定后拍照。用软件AlphaEaseFC分析 IA/LV(梗死区面积/左心室面积)，检测心肌损伤程度。

2、 实验结果

2.1由图15示的实验结果表明，心梗组（MI+DMSO）小鼠的IA/LV(梗死区面积/左心室面积)明显升高，达50%左右，而本发明提供的MI+ Chaetocin能显著降低IA/LV比值(梗死区面积/左心室面积)，约为10%，显示出了很好的防治心肌梗塞的作用。

2.2对小鼠左心室心肌组织做石蜡切片，进行Sirius Red Staining和Masson's Trichrome Stainin观察心肌重构和纤维化的情况，由图16和图17结果表明，MI+DMSO组小鼠心脏纤维结缔组织增多，而毛壳素组小鼠心脏纤维化程度较心梗组（MI+DMSO）有明显减轻。

2.3并且由图18存活率实验结果表明，毛壳素组存活率维持在85%以上，明显高于心梗组（MI+DMSO）组。

2.4并且由图19实验结果表明，毛壳素组小鼠的心肌组织Sirt1 mRNA水平明显高于心梗组（MI+DMSO）组，能够很好的改善心肌肥厚和心肌梗死的症状，减少心肌的氧化应激。

2.5小鼠心肌组织经匀浆、交联，超声破碎后提取核蛋白，分别用H3K9-Me3和H3K9-Ac抗体进行ChIP（染色质免疫共沉淀）实验，实验所提取DNA用小鼠Sirt1启动子区域设计的引物进行qPCR，检测Sirt1启动子区域组蛋白H3K9-Me3和H3K9-Ac的修饰情况。实验结果表明，H3K9-Me3伴随所修饰基因的沉默，H3K9-Ac则伴随所修饰基因的激活。

由图20实验结果表明，毛壳素治疗组Sirt1启动子区域H3K9-Me3修饰相对于MI+DMSO组有显著下降。由图21示毛壳素治疗组Sirt1启动子区域H3K9-Ac的修饰相对于MI+DMSO组有显著回升。

由以上实验结果表明，本发明提供的毛壳素能够抑制遭受急性心肌梗死引起的心肌细胞氧化应激，早期应用，可以减少缺血梗死面积，减少心肌细胞氧化应激，维持心肌细胞正常功能，延缓心力衰竭的发生。

实施例3毛壳素对原代心肌细胞的作用实验

1、实验方法：

体外培养原代心肌细胞方法如下：取1至3天清洁级SD乳鼠颈椎脱臼处死后，取其心尖，进行消化离心，在15%血清的DMEM培养基，37℃，5%二氧化碳孵箱中培养36-48h后换液。再对心肌细胞给予浓度梯度上升的毛壳素预处理以后，对心肌细胞给予H₂O₂(体外模拟氧化应激)或者抗霉素A（AA）和2-脱氧葡萄糖（2-DG）（体外模拟心肌细胞缺血模型）。收取细胞后，裂解全蛋白，做Western Blot实验。

2、实验结果

由图22、23的实验结果表明，在H₂O₂或者抗霉素A（AA）和2-脱氧葡萄糖（2-DG）的刺激下，原代心肌细胞Sirt1蛋白水平均显著下降，但是在本发明提供的毛壳素预处理的心肌细胞中，Sirt1蛋白水平表达明显上升，并且呈现浓度依赖性，显示出了很好的降低心肌细胞氧化应激，维持心肌细胞正常功能，防止心力衰竭的功效。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用，其特征在于，毛壳素在制备预防和治疗压力负荷诱导心室重构和心力肥厚药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的毛壳素在制备预防和治疗心脏病药物中的应用，其特征在于，将毛壳素和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂或片剂剂型的药物。