CN103348017A - 使用检测剂、探针和抑制剂检测核酸靶标 - Google Patents

使用检测剂、探针和抑制剂检测核酸靶标 Download PDF

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Abstract

本发明总体上是关于用于检测特定核酸序列的存在或不存在的方法。本发明总体上涉及将检测剂并入靶核酸中、向所述反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂、以及检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标，以及包含其的试剂盒。

Description

使用检测剂、探针和抑制剂检测核酸靶标
相关申请和以引用的方式并入
本申请主张2010年12月7日提交的美国临时专利申请序号61/420,747的优先权。
上述申请和其中引用的或在其审查期间引用的所有文献(“申请引用的文献”)和申请引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)，以及本文引用的文献中引用或参考的所有文献，连同本文或任何以引用的方式并入本文的文献中提到的任何产品的任何制造商指导书、说明书、产品说明和产品介绍单均在此以引用的方式并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地讲，以引用的方式并入所有参考的文献其程度如同特别地和单独地指出以引用的方式并入每个单独的文献。
发明领域
本发明属于生物技术的技术领域。更具体地讲，本发明属于分子生物学的技术领域。
联邦基金代号
本发明部分由国家卫生研究院授予号：1R43HG005144-01资助。联邦政府可以享有本发明的某些权利。
发明背景
在分子生物学中的大多数过程中，具备考虑检测特定事件发生的能力的反应是至关重要的。例如，诸如在延伸引物上并入一个或多个核苷酸等事件可能表示存在单核苷酸多态性。在发生某种事件如并入一个或多个核苷酸时，可以将用于检测的机制构建到反应中或(作为替代)在随后的反应中使用，从而提供指示事件发生的方法。
单碱基链延伸(借此并入单个二-脱氧核苷酸，它可以含有用于检测的染料(或使用质量作为检测方法))是同时含有用于核酸的询问(interrogation)和检测机制的反应的实例。检测单核苷酸延伸的最简单的方式之一就是荧光，例如，使用荧光标记的核苷酸或FRET(荧光共振能量传递)信号。然而，单碱基链延伸成本高，因为它需要使用荧光标记的核苷酸和/或探针。此外，为了使反应进行，探针和核苷酸两者的浓度必须要高，这就导致高的背景信号。因此，必须采用多个严格的冲洗步骤来除去未杂交或未结合的材料，这对大多数应用来说是不现实的，特别是使用小反应容器时。
基于荧光的检测的另一个表现是利用荧光标记分子(荧光团)和淬灭团。如上所述，当用多个分子操作时，荧光分子的浓度就信号而言可能是有问题的。
这个问题的一种解决方案是使用双链荧光-淬灭团探针。这些测定往往对诸如探针长度、靶DNA长度或酶反应等特定参数进行优化。大多数荧光团-淬灭团配对测定只在严格的温度控制下对短DNA链或扩增子(<200bp)有效(例如，Holland等，“Detection of specificpolymerase chain reaction product by utilizing the5'→3'exonucleaseactivity of Thermus aquaticus DNA polymerase”，PNAS(1991)第88卷，7276-7280页；Piatek等，“Molecular beacon sequence analysis fordetecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis”,NatBiotechnol(1998)第16卷，第4期，359-363页；Udvardi等，“Elevengolden rules of quantitative RT-PCR”,The Plant Cell(2008)第20卷，1736-1737页；Vet等，“Design and Optimization of Molecular BeaconReal-Time Polymerase Chain Reaction Assays”，于P.Herdewijn,ed.2004.Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(Methods inMolecular Biology,第288卷).New Jersey:Humana Press Inc.,273-290页中；“Top Ten Pitfalls in Quantitative Real-time PCR Primer/ProbeDesign and Use”，Applied Biosystems TechNotes(2011)第13卷，第4期，(www.ambion.com/techlib/tn/134/13.html):“PCR Primer DesignGuidelines”，PREMIERBiosoft(2011)(www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)。
因此，需要一种使用多种核酸探针长度、靶核酸长度、温度条件或DNA聚合酶来检测特定核酸序列的存在或不存在的可靠、有效和划算的方法，这种方法由以下发明提供。
在本申请中的引用或标识任何文献并不是认可这些文献可以作为本发明的先前技术得到。
发明概述
本发明总体上是关于用于检测特定核酸序列的存在或不存在的方法。根据本发明的一个方法是关于将检测剂并入靶核酸中，向所述反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂，以及检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标。没有干扰表示不存在特定的核酸序列。
本发明还关于用于检测乳液内的核酸样品中的靶核酸序列的方法。这种方法是关于将检测剂并入靶核酸中，向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂，以及检测抑制剂对寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标，并且其中所述反应在乳液内发生。没有干扰表示不存在特定的核酸序列。
本发明还关于用于检测微流体装置中的核酸样品中的靶核酸的方法。这种方法是关于将检测剂并入靶核酸中，向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂，以及检测抑制剂对寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标，并且其中所述反应在微流体装置内发生。没有干扰表示不存在特定的核酸序列。
本发明还关于含有用于检测核酸样品中的靶核酸序列的方法的这些试剂的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于并入所述靶核酸中的检测剂、向所述反应中添加的寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂连同用于检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰(作为存在特定靶核酸序列的指标)的试剂。所述试剂盒可以进一步含有用于执行本发明方法的试剂。
因此，本发明的一个目的是在本发明内不涵盖任何先前已知的产品、制造所述产品的工艺或使用所述产品的方法，从而使申请人保留权利并且在此公开任何先前已知的产品、工艺或方法的放弃权利。应进一步指出，本发明不希望在本发明的范畴内涵盖不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一节)或EPO(EPC的第83款)的书面描述和可实施性要求的任何产品、工艺或制造，从而使申请人保留权利并且在此公开任何先前描述的产品、制造所述产品的工艺或使用所述产品的方法的放弃权利。
应该注意的是，在本公开中，特别是在权利要求书和/或章节中，诸如“包括”、“包含”、“含有”等术语可以具有它在美国专利法中所具有的含义；例如，它们可以表示“包括”、“包含”、“含有”等；并且诸如“主要由...组成”等术语具有它在美国专利法中所具有的含义，例如，它们虑及没有明确列举的要素，但是排除先前技术中有的或影响本发明的基本或新颖特性的要素。
公开了这些和其它实施方案或从以下详细描述变得显而易见并且由以下详细描述涵盖。
附图简述
结合附图可以充分地理解以下详细描述，它们是通过举例给出的，但是不希望将本发明仅仅限制在描述的特定实施方案。
图1A和1B是展示用于检测靶核酸的反应的示意图，其中检测剂与荧光团缀合并且抑制剂与淬灭团缀合。图1A描绘与靶核酸匹配的寡核苷酸探针，它作为DNA聚合的引物。所得的双链DNA阻断检测剂上的抑制剂结合位点，产生荧光信号。图1B描绘与靶核酸不匹配的寡核苷酸探针。因此，抑制剂与检测剂结合并且淬灭荧光信号。F是荧光标记(即检测剂-荧光团缀合物)，Q是淬灭团(即抑制剂-淬灭团缀合物)。
图2是展示用于检测靶核酸的反应的示意图，其中检测剂与淬灭团缀合并且抑制剂与荧光团缀合。
图3是说明检测剂上的荧光团和抑制剂上的淬灭团的各种位置的示意图。
图4是说明检测剂上的淬灭团和抑制剂上的荧光团的各种位置的示意图。
图5是说明检测剂上的第一荧光团和抑制剂上的第二荧光团的各种位置的示意图。
图6是说明实施例的示意图，其中抑制剂与生物素缀合并且使用辣根过氧化酶化学发光测定作为读数机制。
图7是说明实施例的示意图，其中检测剂可以包含荧光团并且抑制剂与生物素缀合(“抑制剂-生物素缀合物”)。
图8是实施例1中使用的寡核苷酸探针的核苷酸匹配和错配位置的图示。
图9展示使用微板读数器测定实施例1的7个反应中含有匹配探针或6个错配探针之一的样品的荧光。
图10展示使用探针测定的来自杂合体和纯合体患者的样品中的荧光以区分TNNT2基因的2个不同等位基因，如实施例2中描述。
图11展示用于分析实施例3的靶核酸的每个探针匹配和错配探针类型的平均荧光和标准偏差。
发明详述
本发明总体上是关于检测特定核酸序列(本文称为“靶核酸”)的存在或不存在的方法。所述靶核酸是在从人或动物获得之后进行查询(queried)的核酸样品并且包括但不限于基因组DNA、PCR扩增子、cDNA和其它的。所述靶核酸可以是双链或单链的。在一个实施例中，所述单链靶核酸是DNA。在一个实施方案中，双链靶核酸首先被转化成单链靶核酸。在又一个实施方案中，检测之前在所述靶核酸上进行PCR。在这个实施方案的一个方面中，PCR产物随后被转化成单链形式。用于将双链核酸转化成单链核酸的方法在本领域是已知的并且在以下文献中有描述：例如，Mitsis等，“Characterization of theinteraction of lambda exonuclease with the ends of DNA”，Nucleic AcidsRes(1999)第27卷，第15期，3057-3063页；Sanchez等，“Linear-After-The-Exponential(LATE)-PCR:An advanced method ofasymmetric PCR and its uses in quantitative real-time analysis”，PNAS(2004)第101卷，第7期，1933-1938页；Chen等，“AsynchronousPCR”，于D.Park,ed.2011.PCR Protocols(Methods in MolecularBiology，第687卷).New Jersey:Humana Press Inc.,231-243页中。
本发明方法可用于检测在靶核酸内核酸序列的存在或不存在。在一个实施方案中，检测在靶核酸序列内的单核苷酸。在这个实施方案的一个方面中，可以查询特定位点以检测特定的核酸序列变异的存在或不存在。“变异”是在核苷酸序列中相关多核苷酸之间的差异。差异可以是与相关多核苷酸的序列相比从一个多核苷酸的序列缺失一个或多个核苷酸、添加一个或多个核苷酸或用一种核苷酸替换另一种。术语“突变”、“多态性”和“变异”在本文中可互换使用。本文中使用的单数形式的术语“变异”应理解为包括多个变异，即在相同多核苷酸中的两个或两个以上核苷酸添加、缺失和/或替换。“点突变”是指一种核苷酸与另一种核苷酸的单个替换。
例如，可以查询特定位点以检测单核苷酸多态性的存在或不存在。“单核苷酸多态性”或“SNP”是指多核苷酸的核苷酸序列中不同于另一种多核苷酸的变化只有单核苷酸差异。SNP包括例如并且不限于在整个多核苷酸序列中用一个A替换一个C、G或T，或用一个C替换一个G、T或C等等。此外，在特定核酸序列中可能具有一个以上SNP。例如，在核酸序列中的一个位置，G可以被替换为A，在另一个位置C可以被替换为T等等。
在另一个实施例中，可以查询特定位点以检测单核苷酸突变的存在或不存在。在另一个实施方案中，在相同反应中检测多个核苷酸靶标(例如两个或两个以上核苷酸)。在这个实施方案的一个方面中，检测靶核酸序列内的短核酸序列。在一个实施例中，所述核酸探针短至约6至8个核苷酸长。在这个实施方案的另一个方面中，可以依次使用短核酸探针的完整互补来测定靶核酸的整个序列。例如，所述短核酸探针的完整互补可以是一组所有4096种可能的六聚体。因此，可以使用本发明方法检测靶核酸而没有特定的目标长度限制。
本发明方法可以进一步包括使用并入靶核酸的检测剂。所述检测剂是并入靶核酸起反应抑制剂结合位点的作用的寡核苷酸。在一个实施方案中，所述检测剂通过衔接头连接而并入靶核酸。在这个实施方案的一个实施例中，接头是彼此相似的两种寡核苷酸。在这个实施例中，接头将检测剂连接至靶核酸上。在另一个实施方案中，使用PCR引物将检测剂并入核酸样品。在这个实施方案的一个实施例中，PCR引物包括靶标特异性序列(在引物的3’端上)、用于与下游步骤中的抑制剂杂交的通用核酸序列(在引物的5’端上)和检测剂。在任何实施方案中，检测剂被并入靶核酸序列中并且位于靶核酸序列的5’。
在一个实施方案中，检测剂与荧光团缀合。荧光团是能够从特定波长的光吸收能量并且随后以特定荧光团的另一种特定波长特征作为荧光发射这个能量的分子。以这种方式，荧光团将有助于最终测定读数，指示靶核酸的存在或不存在。采用的特定荧光团对本发明不是关键性的。荧光团在本领域是已知的并且在以下著作中描述：例如，Marras,“Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for FluorescentNucleic Acid Hybridization Probes”，于V.Didenko,ed.2006.Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes:Designs andProtocols(Methods in Molecular Biology，第335卷).New Jersey:Humana Press Inc.,3-16页中。在本发明中可以采用的荧光团的实例包括但不限于Marras2006描述的那些以及下文进一步描述的那些。荧光团相对于检测剂的特定位置对本发明不是关键性的。荧光团可以沿检测剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿检测剂内部的任何位置。
本发明方法可以进一步包括使用抑制剂。所述抑制剂是类似于所述检测剂并且与所述检测剂杂交的寡核苷酸。所述抑制剂起只有当寡核苷酸探针与靶核酸匹配时才允许信号被检测的作用。抑制剂与检测剂的杂交在标准反应缓冲液中进行，例如，DNA聚合酶反应缓冲液，检测剂和抑制剂在适当的温度在所述缓冲液中混合。在一个实施例中，可以将反应加热至95℃达30秒并且随后冷却至低于抑制剂退火温度5℃。
在一个实施方案中，所述抑制剂与淬灭团缀合。淬灭团是通过从第一荧光团向第二荧光团或向非荧光分子转移能量来起降低，即淬灭荧光强度的作用的分子。采用的特定淬灭团对本发明不是关键性的。淬灭团在本领域是已知的并且由例如Marras2006描述。在本发明中可以采用的淬灭团的实例包括但不限于Marras2006描述的那些以及下文进一步描述的那些。淬灭团相对于抑制剂的特定位置对本发明不是关键性的。淬灭团可以沿抑制剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿抑制剂内部的任何位置。
在一个替代实施方案中，所述检测剂与淬灭团缀合。采用的特定淬灭团对本发明不是关键性的。在本发明中可以采用的淬灭团的实例包括但不限于Marras2006描述的那些以及下文进一步描述的那些。淬灭团相对于检测剂的特定位置对本发明不是关键性的。淬灭团可以沿检测剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿检测剂内部的任何位置。
在一个替代实施方案中，所述抑制剂与荧光团缀合。采用的特定荧光团对本发明不是关键性的。在本发明中可以采用的荧光团的实例包括但不限于Marras2006描述的那些以及下文进一步描述的那些。荧光团相对于抑制剂的位置对本发明不是关键性的。荧光团可以沿抑制剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿抑制剂内部的任何位置。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述抑制剂与生物素缀合(“抑制剂-生物素缀合物”)。抑制剂-生物素缀合物可以从不同供应商商购(例如，Integrated DNA Technologies,Inc.,Eurofins MWG Operon,Eurogentec,TriLink BioTechnologies,Inc.)。市售的纯化试剂盒的实例包括-XP(Beckman Coulter,Inc.)和QIAquick96PCR Purification kit(Qiagen)。生物素相对于抑制剂的特定位置对本发明不是关键性的。生物素可以沿抑制剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿抑制剂内部的任何位置。
在本发明方法的另一个实施方案中，检测剂或抑制剂与有助于从反应中分别分离检测剂或抑制剂的分子缀合。有助于这种分离的分子可以是例如表位，它是能够与抗体反应的任何东西。所述表位可以是例如抗原、肽或蛋白质。在一个实施例中，所述表位是生物素。
在本发明方法的另一个实施方案中，检测剂或抑制剂与有助于在反应内分别检测检测剂或抑制剂的分子缀合。有助于这种检测的分子可以是例如表位。所述表位可以是例如抗原、肽或蛋白质。在一个实施例中，所述表位是生物素。在另一个实施例中，所述表位是可以使用化学发光测定检测的肽，例如通过使用与HRP酶缀合的二抗。
在检测剂或抑制剂与生物素缀合的以上实施方案中，所述缀合可以通过检测剂或抑制剂与生物素缀合的引物的PCR扩增来获得(商购自Integrated DNA Technologies,Inc.,Operon,Eurogentec,and TriLinkBioTechnologies,Inc.)。在使用与HRP酶缀合的抗体检测表位的以上实施方案中，缀合试剂盒可以从Solulink商购或可以直接从供应商(例如Eurogentec)定购抗体-HRP酶缀合。
在本发明方法的一个实施方案中，当检测剂与荧光团缀合时，抑制剂与淬灭团缀合。在本发明方法的另一个实施方案中，当检测剂与淬灭团缀合时，抑制剂与荧光团缀合。检测剂和抑制剂或抑制剂和检测剂之间的能量传递效率分别对选择的荧光团-淬灭团对有特异性并且因此应该优化，如Marras2006和下文列出的已知供应商提供的产品资料所描述的。
在本发明方法的另一个实施方案中，检测剂与第一荧光团缀合并且抑制剂与第二荧光团缀合，从而从第一荧光团发射将通过能量传递激发第二荧光团，并且其中传递的能量作为第二荧光团的荧光特性发射。这种淬灭现象在本领域是已知的并且由例如Marras2006描述。荧光团-荧光团对在本领域也是已知的并且由例如Marras2006描述。在本发明中可以采用的荧光团-荧光团对的实例包括但不限于Marras2006描述的那些以及下文进一步描述的那些。第一荧光团相对于检测剂和第二荧光团相对于抑制剂的特定位置对本发明不是关键性的。第一荧光团可以沿检测剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿检测剂内部的任何位置。第二荧光团可以沿抑制剂的任何位置连接，包括5’端、3’端或沿抑制剂内部的任何位置。检测剂和抑制剂之间的能量传递效率对选择的荧光团-荧光团对有特异性并且因此应该优化。
只要距离(“FRET距离”)不在特定FRET对的有效能量传递距离之外，荧光团-淬灭团对的荧光团和淬灭团或荧光团-荧光团对的第一荧光团和第二荧光团(分别以及总称“FRET对”)可以位于相对于彼此的任何位置。FRET距离的重要性在本领域是已知的并且由例如Marras2006描述。检测剂和抑制剂之间的能量传递效率对选择的FRET对有特异性并且因此应该优化。
如图3中说明，只要它们在彼此的FRET距离之内，荧光团可以位于检测剂上的任何位置并且淬灭团可以位于抑制剂上的任何位置。此外，如图4中说明，只要它们在彼此的FRET距离之内，淬灭团可以位于检测剂上的任何位置并且荧光团可以位于抑制剂上的任何位置。因此，荧光团和淬灭团必须在允许反应发生的彼此可接受的FRET距离之内。这种FRET距离对选择的荧光团-淬灭团对有特异性并且每个荧光团和淬灭团可以在邻近的核苷酸上，相隔数十个核苷酸或甚至数百个核苷酸，这取决于选择的特定FRET对。
在一个实施例中，荧光团在检测剂的5’端上并且淬灭团在抑制剂的3'端上。在另一个实施例中，淬灭团在检测剂的5’端上并且荧光团在抑制剂的3'端上。
如图5中说明，只要它们在彼此的FRET距离之内，第一荧光团可以位于检测剂上的任何位置并且第二荧光团可以位于抑制剂上的任何位置。因此，第一荧光团和第二荧光团必须在允许反应发生的彼此可接受的FRET距离之内。这种FRET距离对荧光团-荧光团对有特异性并且每个荧光团和淬灭团可以在邻近的核苷酸上，相隔数十个核苷酸或甚至数百个核苷酸，这取决于选择的特定FRET对。
在一个实施例中，检测剂与其5’端上的FAM荧光团缀合并且抑制剂与位于距离FAM荧光团大约15nt的TAMRA荧光团缀合。
特定荧光团-淬灭团或荧光团-荧光团对的选择不是关键性的。在本发明中可以采用的荧光团的类型的实例包括但不限于邻近探针(例如，
Figure BDA00003294770500111
杂交探针，购自Sigma-
Figure BDA00003294770500112
)、5’-核酸酶探针(或
Figure BDA00003294770500113
探针，购自PREMIER Biosoft))、小沟结合物(MGB探针，购自Applied
Figure BDA00003294770500121
)探针、分子信标探针、
Figure BDA00003294770500122
引物(购自PREMIER Biosoft和Biosearch Technologies)和链置换探针(或Yin-Yang探针)。
在本发明中可以采用的特定的荧光团的实例包括但不限于荧光素和其衍生物(例如，荧光素isothianate(FITC)、羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、2’,7’-二氟荧光素(Oregon
Figure BDA00003294770500123
488)、Oregon
Figure BDA00003294770500124
514羧酸和具有氯和甲氧基取代基的荧光素(JOE和6-JOE))；罗丹明衍生物(例如四甲基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、四甲基罗丹明(TMR)、羧基-X-罗丹明(ROX)、Texas Red(同分异构磺酰氯和磺基罗丹明的混合物；InvitrogenTM)和TexasRed-X(Texas Red琥珀酰亚胺基酯，它在荧光团和其反应性基团之间含有额外的七原子氨基己酰基间隔臂(“X”)；InvitrogenTM)和Rhodamine X)；菁(Cy)染料(例如Cy3、Cy5和Cy5.5)和菁衍生物(例如吲哚碳菁(570、
Figure BDA00003294770500126
670和
Figure BDA00003294770500127
705)、Oregon
Figure BDA00003294770500128
异硫氰酸酯和曙红异硫氰酸酯(EITC)；N-羟基琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯(PYB)；N-羟基琥珀酰亚胺基1-芘磺酸酯(PYS)；(5-(2’-氨乙基)氨基萘(EDANS)；CAL
Figure BDA00003294770500129
Gold540、CALOrange560、
Figure BDA000032947705001211
Red590、CAL
Figure BDA000032947705001212
Red610和CALRed635(购自Biosearch Technologies,Inc.的专利荧光团)；
Figure BDA000032947705001214
Figure BDA000032947705001215
(6-异构体亚磷酰胺)和
在本发明中可以采用的特定的淬灭团的实例包括但不限于BlackHole
Figure BDA000032947705001217
染料(
Figure BDA000032947705001218
Figure BDA000032947705001219
Figure BDA000032947705001220
)；对-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；Deep Dark Quencher DDQ-I(Eurogentec)；Eosin(2’,4’,5’,7’-四溴荧光素)；
Figure BDA000032947705001221
Dark Quencher(Eurogentec)；Iowa
Figure BDA000032947705001222
Quenchers，例如Iowa
Figure BDA000032947705001223
FQ和Iowa
Figure BDA000032947705001224
RQ(Integrated DNA Technologies,Inc.)；QSY-7、QSY-9和QSY-21(Molecular
Figure BDA000032947705001225
)。
在本发明中可以采用的特定的荧光团-淬灭团对的实例包括但不限于荧光素/DABCYL,EDANS/DABCYL、CALGold
Figure BDA00003294770500132
Cy3/BHQ-1、
Figure BDA00003294770500135
Figure BDA00003294770500136
Oregon
Figure BDA00003294770500137
Figure BDA00003294770500138
Cy5/BHQ-2、
Figure BDA00003294770500139
TAMRA/BHQ-2、
Figure BDA000032947705001310
和
Figure BDA000032947705001311
在本发明中可以采用的特定的荧光团-荧光团对的实例包括但不限于FAM/TAMRA、FITC/TAMRA、FITC/Rhodamine X、PYS/FITC、FITC/EITC、FITC/PYB、FITC/Texas Red和FITC/TRITC。
本发明方法可以进一步包括使用起寻找靶核酸中的序列(“查询序列”)的匹配的查询分子作用的寡核苷酸探针。如果寡核苷酸探针与靶核酸匹配，那么它与它杂交并且作为核酸聚合酶链延伸的引物。随着延伸进行，它将从检测剂替换抑制剂。如果寡核苷酸探针与靶核酸不匹配，那么它不会与靶核酸杂交并且不会发生链延伸，使抑制剂保持与检测剂连接。
本发明方法可以进一步包括使用聚合酶。这可以是具备链置换能力的任何酶。市售的聚合酶的实例包括但不限于：Klenow片段(NewEngland
Figure BDA000032947705001312
Inc.)、Taq DNA聚合酶(QIAGEN)、9°NTMDNA聚合酶(New England
Figure BDA000032947705001313
Inc.)、Deep VentTMDNA聚合酶(NewEngland
Figure BDA000032947705001314
Inc.)、Manta DNA聚合酶(
Figure BDA000032947705001315
)、Bst DNA聚合酶(New England
Figure BDA000032947705001316
Inc.)和phi29DNA聚合酶(NewEngland
Figure BDA000032947705001317
Inc.)。
在本发明方法的一个实施方案中，检测剂与荧光团缀合并且抑制剂与淬灭团缀合。在这个实施例中，将检测剂并入靶核酸中，随后向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂。荧光团发射荧光直到抑制剂与检测剂结合并且通过淬灭团淬灭荧光信号。如果寡核苷酸探针在靶核酸中找到匹配(如图1A中说明的)，则聚合酶将延伸探针直到它到达抑制剂并且从检测剂替换抑制剂。结果，淬灭团不再淬灭荧光团发射的荧光并且发射相对强的荧光。如果寡核苷酸探针在靶核酸中没有找到匹配(如图1B中说明的)，则抑制剂将保持在适当的位置并且淬灭团将继续淬灭荧光团发射的荧光，导致持续相对低的荧光信号。
在本发明方法的另一个实施方案中，检测剂与淬灭团缀合并且抑制剂与荧光团缀合。在这个实施例中，将检测剂并入靶核酸中，随后向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂。抑制剂与检测剂结合并且荧光团发射的荧光被检测剂的淬灭团淬灭。如果寡核苷酸探针在靶核酸中找到匹配，则聚合酶将延伸探针直到它到达抑制剂并且从检测剂替换抑制剂(如图2A中说明的)。结果，淬灭团不再淬灭荧光团发射的荧光并且发射相对强的荧光。如果寡核苷酸探针在靶核酸中没有找到匹配(如图2B中说明的)，抑制剂将保持在适当的位置并且淬灭团将继续淬灭荧光团发射的荧光，导致持续相对低的荧光信号。
在这个实施方案的另一个方面中，检测剂与第一荧光团缀合并且抑制剂与第二荧光团缀合。在这个实施例中，将检测剂并入靶核酸中，随后向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂。抑制剂与检测剂结合并且由第一荧光团作为荧光发射的能量被传递到第二荧光团并且作为第二荧光团的荧光特性发射。如果寡核苷酸探针在靶核酸中找到匹配，则聚合酶将延伸探针直到它到达抑制剂并且从检测剂替换抑制剂。结果，第二荧光团不再具有从第一荧光团传递的能量，并且因此不再发射荧光。因此，发射的荧光不再是第二荧光团的特征并且再次是第一荧光团的特征。如果寡核苷酸探针在靶核酸中没有找到匹配，则抑制剂将保持在适当的位置并且发射的荧光将持续是第二荧光团的特征。
在本发明方法的另一个实施方案中，检测剂与荧光团缀合并且抑制剂与生物素缀合(“抑制剂-生物素缀合物”)，如图7中说明的。在这个实施例中，将检测剂并入靶核酸中，随后向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂-生物素缀合物。如果寡核苷酸探针在靶核酸中找到匹配，则聚合酶将延伸探针直到它到达抑制剂-生物素缀合物并且从检测剂替换抑制剂-生物素缀合物。如果寡核苷酸探针在靶核酸中没有找到匹配，那么抑制剂-生物素缀合物将保持在适当的位置。反应完成之后，可以使用链霉亲和素底物，例如链霉亲和素珠(可容易地商购自各种供应商，例如Invitrogen、Solulink、Thermo Scientific和其它的)从反应中提取抑制剂-生物素缀合物，链霉亲和素珠将与抑制剂-生物素缀合物的生物素结合。在探针错配的情况下，其中抑制剂-生物素缀合物没有被探针从检测剂替换，链霉亲和素珠将从反应中提取检测剂-抑制剂-生物素缀合物对。在探针匹配情况下，其中抑制剂-生物素缀合物被探针替换，链霉亲和素珠将提取未结合的抑制剂-生物素缀合物。从提取的样品发射荧光信号表示存在检测剂-抑制剂-生物素缀合物对，并且因此探针错配，即不存在靶核酸序列。从提取的样品发射相对低的荧光信号表示不存在检测剂，并且因此探针匹配，即存在靶核酸序列。
在本发明方法的另一个实施方案中，抑制剂可以与表位(例如抗原、肽或蛋白质)缀合(“抑制剂-表位缀合物”)。在这个实施例中，将检测剂并入先前描述的靶核酸中，随后向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂-表位缀合物。如果寡核苷酸探针在靶核酸中找到匹配，则聚合酶将延伸探针直到它到达抑制剂-表位缀合物并且从检测剂替换抑制剂-表位缀合物。如果寡核苷酸探针在靶核酸中没有找到匹配，那么抑制剂-表位缀合物将保持在检测剂上的适当的位置。反应完成之后，可以纯化靶核酸从反应中除去任何错配的探针和任何未结合的抑制剂-表位缀合物。纯化之后，靶核酸与对表位特异性的抗体反应。所述抗体与检测系统(例如荧光标记的蛋白质)缀合，或使用辣根过氧化酶(“HRP”)测定法(HRP化学发光测定法可从各种供应商商购，例如Sigma-Aldrich、InvitrogenTM、Thermo Scientific、Bio-RadLaboratories,Inc.、Cell Signaling Technology,Inc.、InvitrogenTM和Biological Industries)检测。表位信号的检测表示存在与检测剂结合的抑制剂-表位缀合物，并且因此探针错配，即不存在靶核酸序列。相对低的表位信号表示抑制剂-表位缀合物没有与检测剂结合，并且因此探针匹配，即存在靶核酸序列。
图6说明抑制剂与表位缀合的实施例，其中所述抑制剂-表位缀合物可以包含生物素作为表位。在这个实施例中，反应如上所述进行，并且在纯化之后，通过定量在测定法中剩余的生物素的量来测试与靶核酸结合的抑制剂的存在。例如，可以通过在化学发光测定法(如先前描述)中使用抗生物素、HRP连接的抗体来检测剩余的生物素。
随后可以将与特定靶核酸序列有关的本发明的检测方法的结果(本文中称为“数据”)保存在可存取的数据库中，并且可以与来自与所述靶核酸序列有关的特定的人或动物的其它数据或来自其它人或动物的数据相关联。可以将获得的数据储存在可以与其它数据库合并或关联和/或交叉匹配的数据库中。
本发明方法和试剂盒可以进一步与网络接口相关联。本文定义的术语“网络接口”包括能够存取数据、存放数据、合并数据、分析数据、搜索数据、传输数据或储存数据的任何人或计算机系统。所述术语广义上是分析数据的人、在分析中使用的电子硬件和软件系统、储存数据分析的数据库和能够储存数据的任何存储介质。网络接口的非限制性实例包括人、自动化实验室设备、计算机和计算机网络、数据存储机制，诸如但不限于磁盘、硬盘或存储芯片。
本发明方法和试剂盒可以进一步提供乳液中的核酸样品中的靶核酸序列的检测。本文中使用的“乳液”是至少两种不互溶或部分不互溶液体的稳定混合物。总体上，不互溶液体趋向于分离成两种不同的相。因此，可以加入表面活性剂通过降低至少两种不互溶或部分不互溶液体之间的表面张力来稳定乳液和/或稳定界面。例如，根据本发明方法和试剂盒的乳液可以包含多个在不互溶的油(如氟碳油、硅油或烃油)中的含水液滴，其中液滴直径尺寸在约0.5至5000微米范围内。本文中使用的“液滴”表示在连续相内的具有任何形状(例如但不限于圆柱形、球形和椭球形以及变平、拉伸或不规则的形状等等)的分离的水相或脂相。
虽然已经详细描述了本发明及其优点，但是应理解的是，在本文中可以做出各种改变、替换和变化而不脱离附加的权利要求书中定义的本发明的精神和范畴。
本发明将在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的并且无论如何都不希望限制本发明。
实施例
实施例1
在这个实施例中，如下进行测定：将与FAM荧光团缀合并且并入靶核酸的检测剂在抑制剂存在下在34℃孵育10分钟，所述抑制剂与Iowa Black FQ淬灭团(Integrated DNA Technologies,Inc.)、MantaDNA聚合酶(
Figure BDA00003294770500171
)、dNTPs、适当的缓冲液(供应自
Figure BDA00003294770500172
的DNA聚合酶)和具有与靶核酸精确匹配或在沿8个核苷酸长的探针的6个不同位置之一有单个位置错配(如图8中说明的)的短寡核苷酸探针缀合。
使用微板读数器测定7个反应的荧光。如图9中说明的，含有匹配的探针的样品中的荧光比含有错配的探针的样品高2至5倍。
实施例2
在这个实施例中，进行将一组寡核苷酸探针用于辨别患者样本中的两种不同等位基因。首先使用来自一个患者是A/G SNP杂合体并且另一个患者是纯合体(G)的基因组DNA将TNNT2基因进行PCR扩增(外显子4-5，477bp)。将PCR引物(正向)之一用FAM荧光团(Integrated DNA Technologies,Inc.)标记。将PCR样品转化成单链DNA并且与缀合至Iowa
Figure BDA00003294770500173
FQ淬灭团(Integrated DNATechnologies,Inc.)的抑制剂、Manta DNA聚合酶()、dNTPs、适当的缓冲液(供应自
Figure BDA00003294770500182
的酶)和匹配SNP等位基因(等位基因1)、“WT”等位基因(等位基因2)或不匹配靶标(即，它随机选自六聚体探针库)的短探针混合。在34℃孵育30分钟之后测定每个样品的荧光。如图10说明的，对于杂合体患者用同时匹配等位基因1和2的探针观察到相对高的荧光，但是对于纯合体患者只匹配等位基因2的探针观察到相对高的荧光，并且所有错配的探针也观察到相对低的荧光。
实施例3
在这个实施例中，将含有与FAM荧光团(Integrated DNATechnologies,Inc.)缀合的检测剂的191bp单链DNA扩增子在34℃下孵育30分钟，并且随后与缀合至Iowa
Figure BDA00003294770500183
FQ淬灭团(IntegratedDNA Technologies,Inc.)的抑制剂、Manta DNA聚合酶()、dNTPs、适当的缓冲液(补充来自
Figure BDA00003294770500185
的酶)和精确匹配靶标(18探针)或是错配(6探针)的24个短探针(6至8个核苷酸长)之一合并。将24种混合物中的每一种乳化成皮升大小的液滴，随后检测数千个乳化液滴的荧光(每个探针平均测量1700滴)。每个探针类型的平均荧光和标准偏差在图11中展示。错配的探针(阴性)全都具有低的荧光并且所有匹配用探针(阳性)都具有高的荧光(条形图=标准偏差)。
***
至此已经详细描述了本发明的优选实施方案，应理解上文定义的本发明不应被限制在以上说明书中提出的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范畴下许多显而易见的对本发明的变型是可能的。

Claims (18)

1.一种用于检测靶核酸的方法，其包括：
a)将检测剂并入靶核酸中；
b)向所述反应中添加寡核苷酸探针；
c)向所述反应中添加抑制剂；以及
d)检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰作为所述靶核酸存在的指标。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是单链的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的单核苷酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的核苷酸的短序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述整个靶核酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的变异。
7.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的突变。
8.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的多态性。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测剂与荧光团缀合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂与淬灭团缀合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测剂与淬灭团缀合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂与荧光团缀合。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测剂与表位缀合。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂与表位缀合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中检测了一个以上靶核酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述方法在乳液内进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述乳液处于微流体机制中。
18.一种用于执行根据权利要求1-17中任一项所述的方法的试剂盒。
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