CN103347849A - 富勒烯с60的均聚氨基酸和杂多氨基酸衍生物、其制备方法和基于该衍生物的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药工业和药物，具体涉及以下通式的新的富勒烯C₆₀均聚(氨基酸)和杂多(氨基酸)衍生物：C₆₀(H)_x{NH(CH₂)_nCOO^-}_x{NH₃ ⁺(L)COOH)}_x，其中n=2～5、х=3、L=-(СН₂)_m，其中m=1～5，或-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2，所述的富勒烯衍生物的特征在于包括共价结合的氨基酸基团和极性离子形式的氨基酸，本发明还涉及制备所述衍生物的方法和生产包括所述衍生物的药物组合物。制备富勒烯的均聚氨基酸衍生物和杂多氨基酸衍生物的方法基于氨基酸对富勒烯的亲核结合反应，形成富勒烯的共价结合的氨基酸衍生物，随后引入极性离子形式的氨基酸。药物组合物包括下式的富勒烯均聚氨基酸衍生物和杂多氨基酸衍生物作为活性物质：C₆₀(H)_x{NH(CH₂)_nCOO^-}_x{NH₃ ⁺(L)COOH)}_x，其中n=2～5、х=3、L=-(СН₂)_m，其中m=1～5，或者-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2。

Description

富勒烯С60的均聚氨基酸和杂多氨基酸衍生物、其制备方法和基于该衍生物的药物组合物

技术领域

本发明涉及制药工业和药物，即，涉及新的式(I)的富勒烯C₆₀的均聚(氨基酸)和杂多(氨基酸)衍生物，以及制备该衍生物的方法和制备包含该衍生物的药物组合物。

其中n=2～5，x=3，L=-(СН₂)_m，此时m=2～5时或-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2。

背景技术

富勒烯衍生物的医学用途基于富勒烯核的亲脂性能（该富勒烯核使富勒烯衍生物能够渗透细胞膜）和富勒烯以高量子产率生成使DNA裂解的单线态氧的能力。这些性能赋予功能性富勒烯衍生物以细胞毒性、抗病毒以及其它性能(参见Bedrov,D.、Smith,G.D.、Davande,H.，“Passive transport of fullerenes through a lipid membrane”，J.Phys.Chem.,B,2008,Vol.l 12.,pp.2078-84；Qiao,R.、和Roberts A.E.，“Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilayer”，Nano Lett.，2007,Vol.7,pp.614-9；Nelsen,G.D.等人，“In vivo biologyand toxicology of fullerenes and their derivatives”，Basic and ClinicalPharmacology and Toxicology，2008,Vol.103,pp.197-208；以及美国专利6204391，2005，“Water soluble fullerenes with antiviralactivity”)。

阻碍对富勒烯衍生物的生物学研究和基于这些研究创造药物的主要问题是由富勒烯的水不溶性引起的，其妨碍了它们直接给予到人体中。克服这些困难的一种可能的方法是将富勒烯分子包埋到增溶性基质中。已知有通过形成聚乙烯吡咯烷酮加合物来制备水溶性富勒烯类的方法(参见Kiselev,O.I.等人，Mol.Materials，1998,Vol.11,p.121；Piotrovsky,L.B.等人，同前，2000,Vol.13,p.41)。这种加合物表现出有效对抗A型和B型流感病毒。

另外，已知一种制备富勒烯的方法，其包括以下步骤：将预溶解于有机溶剂中的富勒烯与在氯仿中的聚合物基质混合，在真空下将该混合物浓缩直到溶剂被完全除去，以及将得到的复合物溶解在磷酸盐缓冲液(pH 7.4-7.6)中，随后对产物进行超声处理(参见RU No.2162819，10月2日,2001)。根据该专利使用的水溶性聚合物基质是膜脑磷脂。通过这类修饰得到的产物是不稳定的组合物，储存潜力有限。

一种有前景的制备水溶性富勒烯组合物的方法是通过结合亲水性增溶配体对富勒烯球进行化学修饰来提供的。国际申请WO2005/070827公开了一组通过氨基酸部分与富勒烯的环化加成反应制备的富勒烯的氨基酸衍生物，以及它们插入到生物学活性的有机底物中的产物。在该技术方案中公开的合成方法是多步骤的且适用性差。得到的化合物的水溶解度低。

目前，已经制备了广范围的官能化富勒烯，其中亲水性部分存在于与富勒烯连接的配体的侧链中(洗涤剂类型的复合物)，以及其中极性基团分布在整个富勒烯球上的球状衍生物(这一类型包括富勒醇（fullerenols）和氨基加合物)。

富勒烯的氨基酸衍生物具有最大的应用潜力。

本发明的类似物是如国际申请WO2009/00203中以及在俄罗斯联邦专利2236852中所述的化合物，以及制备它们的方法。

国际申请WO2009/00203描述了下式的多官能氨基酸衍生物

其中R=H、单-或二-羟基烷基、卤代烷基、单-或二-硝酰基烷基、马来酰亚胺(maleinimde)；N-Z是通式-NH-C_mH_2m-COOM或C₄H₈N-COOM的α、β、γ或ω氨基酸的部分，其中m=2～5，且M是硝酰基烷基、烷基或碱金属盐或二肽。这些化合物是通过如下反应来制备的：将氨基酸等摩尔加成至富勒烯，随后用生物学活性的有机配体置换氢，以形成所述类型的化合物。得到的化合物对转移性肿瘤具有抑制活性，增强环磷酰胺的抗白血病活性，且可以适合作为一氧化二氮供体或作为用于抗高血压治疗的快速起效的血管扩张剂。

根据上述申请的化合物的主要缺点在于它们是共价加成产物，包含少量的极性基团，且水溶解性低。

从技术本质和可达到的结果方面说，最相关的一份现有技术在于根据RU专利2236852的用于抑制包膜病毒复制的药物和制备该药物的方法。通过使富勒烯与氨基酸盐在有机溶剂中在聚氧化烯的存在下反应，制备了通式C₆₀H_n[NH(CH₂)_mC(O)O^-]_n的富勒烯-多羧酸阴离子，其中C₆₀是富勒烯核，NH(CH₂)_mC(O)O^-是氨基羧酸阴离子；m是1到5的整数，且n是2到12的整数。

为了制备这些化合物，向富勒烯在邻二氯苯(或甲苯或另一种有机溶剂)中的溶液中加入盐(钾盐或钠盐)形式的氨基酸，然后加入增溶剂。所述氨基酸和增溶剂的添加顺序并不重要；可以将它们作为预混的复合物加入。有用的增溶剂是各种聚氧化烯(摩尔重量为150到400或大于400的聚乙二醇(例如，PEG-1500)，以及摩尔重量为500的聚乙二醇二甲酯。为了增加反应速率，添加任意的强还原剂(碱金属)。

将富勒烯与氨基酸的比例提高超过50倍。得到期望的可药用盐（尤其是钠盐或钾盐）的转化是通过用适当的碱来处理所述酸进行的，或者通过添加弱挥发性酸的盐来进行的。尤其是，将不溶于水的富勒烯-多羧酸被转化为更优选的可药用的水溶性盐，例如钠盐。添加弱挥发性酸的盐是通过用弱挥发性酸的碱金属盐处理所述溶液来进行的。通过蒸发或冷冻干燥将溶液浓缩，弱酸被除去且富勒烯-多羧酸以它们的碱金属盐形式被回收。该发明的目标产物具有恒定的组成；目标产物中的主要物质的含量低至87.8%。说明书没有提供关于测定起始化合物的最佳量的流程图规程、所用溶剂的量的比例，以及最主要的，没有提供分离想要的化合物的方法的说明。

通过所引用的专利中所示的方法制备的富勒烯氨基酸衍生物的主要缺点在于产生以盐和酸两类物质形式存在的富勒烯-羧酸根阴离子的混合物。通过所引用的专利中所述的方法不能制备单独的化合物。另外，通过该现有技术方法制备的酸形式的富勒烯多(氨基酸)几乎是不溶于水的。使用富勒烯-多羧酸阴离子制备稳定药物组合物的尝试失败了，因为在储存期间化合物发生沉淀。

在合成中必须使用大过量的氨基酸的钾盐或钠盐以及大过量的溶剂，这引起废物循环的环境问题，并且提高了生产过程的成本。由于工艺学的原因，在使用氯化芳族溶剂时，不能使用碱金属增加反应速率。

然而，在所引用的专利中所述的包括具有氨基酸部分的富勒烯化合物的药物的独特生化特性提出了制备新的富勒烯衍生物、开发高适应性大规模的制备它们的方法的问题，该方法的特征在于简单和高效、没有污染物、环境安全且起始试剂的可利用性。

发明内容

为了解决上述问题，我们提出了一组彼此关联以形成一个发明构思的发明，即：富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物、制备富勒烯衍生物的方法以及包含富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物作为活性剂的药物组合物。通过改变试剂比例和工艺参数，可以通过本发明要求保护的方法制备不同的富勒烯衍生物。

通过如下通式(II)的富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物解决了上述的问题：

C₆₀(H)_x{NH(CH₂)_nCOO-}_x{NH₃ ⁺(L)COOH)}_x，

其中n=2～5，х=3，L=-(СН₂)_m，其中m=1～5，或-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2。

在m=n时，制备的是富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物；在m≠n时，制备的是富勒烯的杂多(氨基酸)衍生物。

通过制备富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物的方法解决了所述问题，其中如下制备这些衍生物：使富勒烯与十倍过量的无水氨基酸的钾盐在有机溶剂介质中反应，在搅拌并加热到不高于60℃的温度下向得到的悬浮液中添加相转移催化剂，直到溶液完全脱色并形成固体沉淀物，然后将固体沉淀物分离并再次溶解于水中，随后用有机酸或无机酸在极性溶剂中的1N溶液处理富勒烯多(氨基酸)的钾盐的水溶液。该方法采用了新制备的细分散状态的无水氨基酸钾盐，且富勒烯多(氨基酸)的钾盐的固体沉淀物的分离是通过过滤、乙醇洗涤并干燥来进行的。在实验过程中发现，只有在使用新制备的无水氨基酸钾盐时，才可以制备具有所具体说明的组成的富勒烯多(氨基酸)。有用的相转移催化剂是分子量为200、400或500的聚氧化乙烯的甲基酯。

解决所述问题的另一种方法是设计其中活性剂是式(II)的富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物的药物组合物，所述式(II)的富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物具有对抗疱疹、丙型肝炎病毒、各种流感病毒和HIV的抗病毒活性，以及抗肿瘤和抗牛皮癣活性。药物组合物可以以片剂、胶囊、软膏、乳剂、栓剂、溶液或喷雾剂的形式实施。

根据本申请要求保护的技术方案的药物组合物包含有效获得期望结果的量的通式(II)的化合物，并可以作为标准剂型给药(例如，作为固体剂型、半固体剂型或液体剂型)，所述剂型包含与适合于通过肌内、静脉内、经口、舌下、吸入、局部、经鼻、经直肠或经阴道的途径给药的载体或赋形剂一起配制的作为活性剂的所要求保护的技术方案的化合物。可以在组合物中将所述的活性剂与适合于制备溶液、片剂、丸剂、胶囊、小珠、栓剂、乳剂、悬浮液、膏剂、凝胶剂和其它剂型的常规无毒的可药用载体一起配制。

对于特定患者的具体给药水平和周期取决于许多因素，包括特定的富勒烯衍生物的活性、其代谢稳定性和作用时长；排泄率；患者的年龄、体重、一般健康状况和性别；药物联合；以及所要治疗的受试者的疾病的严重程度。

对于以悬浮液形式的经口给药，根据用于制备药物制剂的本领域中公知的方法来制备组合物，且它们可以包含用于提供期望重量的微晶纤维素或其衍生物、作为助悬剂的海藻酸或海藻酸钠、作为粘度增强剂的甲基纤维素和本领域中已知的甜味剂和/或香料。当被制备成片剂时，这些组合物可以包含微晶纤维素、磷酸钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或本领域中已知的其它赋形剂、粘合剂、增充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。

当意欲通过经鼻气雾剂或通过吸入给药时，通过药物制剂领域中公知的方法制备组合物，且可以使用苯甲酸或其它适合的防腐剂、用于增强生物适用性的吸附促进剂和/或本领域中已知的其他增溶剂或分散剂，将组合物制备成生理盐水中的溶液。

可以根据已知的方法形成用于注射的溶液或悬浮液，该方法使用无毒的、适合非肠道应用的稀释剂或溶剂，例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格溶液或等渗氯化钠溶液；或适合的分散剂或润湿剂和助悬剂，例如无菌的、柔和的和稳定的油类，包括合成的单甘油酯或二甘油酯或包括油酸在内的脂肪酸。

当意欲以栓剂形式通过经直肠或经阴道的途径给药时，可以通过将药物与在常温下为固体但是在体腔内液化和或溶解以释放药物的非刺激性赋形剂混合来制备组合物，所述的非刺激性赋形剂例如可可脂、合成的甘油酯或聚乙二醇。

当以膏剂、凝胶剂、洗液、搽剂等形式局部给药时，可以通过将活性成分与可接受的软膏基质混合来制备组合物。

有用的软膏基质是油脂、石油或亲水性基质，例如矿脂、矿物油、石蜡、蜂蜡、羊毛脂、聚乙二醇等等。

有用的用于凝胶剂的基质是甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基(oxypropyl)纤维素、聚乙二醇或聚氧化乙烯、聚羧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等等。

本发明的技术成果如下：已制备了新的式C₆₀(H)_x{NH(CH₂)nCOO′}_x{NH₃ ⁺(L)COOH)}_x的富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物，其中n=2～5，х=3，L=-(СН₂)_m，其中m=1～5，或-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2，特征在于所述化合物包括共价结合的氨基酸基团和极性离子形式的氨基酸；已开发了新的用于生产具有多种组分比例的富勒烯C₆₀的氨基酸衍生物的大规模方法，该方法使用氨基酸与富勒烯的亲核加成反应以形成加聚产物。本申请要求保护其中活性剂是式(II)的富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物的药物组合物，这些衍生物具有针对疱疹、丙型肝炎病毒、各种流感病毒和HIV的抗病毒活性，以及抗肿瘤和抗牛皮癣活性。所述的药物组合物可以表现为片剂、胶囊、膏剂、栓剂、溶液或喷雾剂的形式。

所述的化合物具有以下新的性能：

-可溶于二甲亚砜-水(1:100或1:200)混合物中的性；

-生物利用度高；

-影响受感染细胞的功效高；以及

-毒性低。

根据试剂比例和工艺参数，所要求保护的方法可制备富勒烯的多种均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物。所述方法所基于的理念在于在合成步骤中它使用了最佳的试剂比例(1:10)和最小量的有机溶剂和相转移催化剂，随后使用有机酸和无机酸的浓溶液回收所要求保护的组合物，随后进一步添加NH₂LCOOH系列的氨基酸，其中L=-(СН₂)_m或-CO(CH₂)_kCH(NH₂)，从而提供定制的富勒烯氨基酸组合物的定量生产，并使得所要求保护的方法适合于这些组合物的有效率的和环境安全的大规模合成。

通过如下的实施例举例说明本申请要求保护的发明。

本发明的不同实施方案

实施例1.式C₆₀(H₃){NH(CH₂)₅COO-}₃{NH₃ ⁺(CH₂)₅COOH}₃的富勒烯多(氨基己酸)的制备。

向7.2g(0.01mol)富勒烯C₆₀在400mL邻二氯苯中的溶液中加入17g(0.1mol)的新制备并细粉碎的无水ε-氨基己酸钾盐。在搅拌并加热到不高于80℃的温度下，向得到的悬浮液中加入邻二氯苯和甲基聚乙二醇400醚的比例为2.5:1的混合物2小时。将得到的反应混合物在不高于60℃的温度搅拌2-3小时，直到溶液完全脱色并形成固体沉淀物。在这之后，将混合物过滤。在过滤器上将沉淀物用乙醇分几次洗涤并在不高于60℃的温度真空干燥。将分离的富勒烯氨基酸的钾盐溶解于2L蒸馏水中。在搅拌下向这个溶液中缓慢加入1N盐酸，直到pH变为5.1。让混合物静置，直到产物完全沉淀出来。然后将水层倾析掉。在搅拌下向作为固态产物在水中的细悬浮液的沉淀物中缓慢加入氨基己酸在二甲亚砜/水混合物(1:10)中的溶液。搅拌混合物到完全溶解。然后通过真空蒸馏除去溶剂。将固体残余物在真空干燥器内在不高于60℃的温度干燥。

相对于起始的富勒烯，目标产物的收率是定量的。该化合物是暗褐色固体，可溶于二甲亚砜/水(1:200)且不完全溶于СН_зСN:Н₂O(1:1)和DMF-H₂O。

该产物的热重分析表明，该复合物包含三摩尔的弱键合的氨基己酸，其在200℃分解时被裂解掉。该富勒烯多(氨基酸)在345℃发生热分解，得到富勒烯及其氧化产物。化合物分解之后的固体残余物的量(其表示未被取代的富勒烯，如通过X射线衍射所示)相当于1:6比例的С₆₀:氨基酸部分。

用0.1M HCl溶液进行的化合物酸水解导致氨基己酸盐酸盐的释放，每摩尔起始物质的释放量为3摩尔。

将化合物吸附在硅胶上导致离子键裂解并释放游离的氨基己酸。在随后氨基己酸与茚三酮的反应产物的光度分析中测定离子键结合的氨基酸基团的数目。它们的数目符合所要求保护的化合物的组成。

产物的电子吸收光谱中没有来自游离富勒烯的吸收谱带。

产物的红外吸收光谱的特征在于N-取代的氨基酸的特征吸收谱带：-COOH-基团，在1704cm^-1和1658cm^-1；NH_з ⁺基团，在3100、2550和2000cm^-1；-N-H-伸缩振动，在3300cm^-1；以及N-H-弯曲振动，在1552cm^-1；C₆₀-NH-R-，吸收谱带出现在1104cm^-1、930cm^-1和830cm^-1。

元素分析表明产物具有以下的元素比例：%C=76.84；%H=4.80；%N=5.15；对于分子式C₉₆H₇₅N₆O₁₂(分子量：1503)，计算值：%С=76.49；%Н=4.90；%N=5.57。

实施例2.式C₆₀(H₃){NH(CH₂)₃COO^-}₃(NH₃ ⁺CH₂-CH₂-COOH)₃的含β-丙氨酸的N-富勒烯γ-氨基丁酸的制备。

向7.2g(0.01mol)富勒烯C₆₀在400mL邻二氯苯中的溶液加入14g(0.1mol)的新制备的无水γ-氨基丁酸钾盐。在搅拌并加热到不高于60℃的温度下，向得到的悬浮液中加入邻二氯苯和甲基聚乙二醇400醚的比例为3:1的混合物2小时。将反应混合物在不高于60℃的温度搅拌2-3小时，直到溶液完全脱色并形成固体沉淀物。在这之后，将混合物过滤；在过滤器上将沉淀物用乙醇分几次进行洗涤并在不高于60℃的温度真空干燥。将分离的产物溶解于蒸馏水中。在搅拌下向这个溶液中缓慢加入1N盐酸，直到pH变为5.1。让混合物静置，直到产物完全沉淀出来。然后将水层倾析掉。在搅拌下向作为固态产物在水中的细悬浮液的沉淀物中缓慢加入2.7g(0.03mol)的β-丙氨酸的乙醇溶液。将混合物搅拌2小时，直到沉淀物完全溶解。在除去溶剂之后，将产物分离(12g)。

该化合物是暗褐色固体，可溶于二甲亚砜/水(1:200)且不完全溶于СН_зСN:Н₂O(1:1)混合物和DMF-H₂O混合物。

该产物的热重分析表明，该复合物包含三摩尔的弱键合的β-丙氨酸，其在210℃分解时被裂解掉。整个复合物的热分解发生在335℃，以对应于1:6比例的С₆₀:氨基酸部分的量产生富勒烯。

得到的化合物用0.01M HCl溶液进行酸水解导致β-丙氨酸盐酸盐的释放，每摩尔起始物质的释放量为3摩尔。

在二甲亚砜溶液和在0.1N NaOH水溶液中记录的该产物的光谱特征在于在217、260和335nm区域的吸收谱带，它们是富勒烯衍生物的特征且没有显示来自游离富勒烯的吸收谱带。

该化合物的红外吸收光谱显示了N-取代氨基酸和氨基酸的阳离子形式特征性的吸收谱带：-COOH^-基团，在1717cm^-1、1710cm^-1和1658cm^-1；NH₃ ⁺基团，在3100、2550和2000cm^-1；N-H伸缩振动出现在3400cm^-1；N-H伸缩振动出现在3400cm^-1；N-H弯曲振动出现在1552cm^-1；以及C₆₀-NH-R-，吸收谱带出现在1104cm^-1、930cm^-1和830cm^-1。

元素分析表明产物具有以下的元素比例：%С=75.24；%Н=3.80；%N=6.25；对于分子式C₈₁H₄₈N₆O₁₂(分子量1296)，元素分析计算值：%С=75.00、%Н=3.70、%N=6.48。

实施例3.式C₆₀(H₃){NH(CH₂)₅COO^-}₃{NH₃ ⁺(CO)(CH₂)₂CH(NH₂)COOH}₃的含谷氨酰胺的N-富勒烯ε-氨基己酸的制备

以与实施例1中相同的方式实施该方法。唯一不同之处为如下：在富勒烯-氨基己酸的酸性形式沉淀出来之后处理该沉淀物的步骤中，加入的是4.5g谷氨酰胺在二甲亚砜-水中的溶液。通过真空蒸馏除去溶剂。

元素分析表明产物具有以下的元素比例：%С=71.34；%Н=4.80；%N=8.25；对于分子式C₉₃H₆₉N₉O₁₅(分子量：1551)计算值：%С=71.95、%Н=4.50、%N=8.12。

该产物的红外吸收光谱特征在于N-取代氨基酸和氨基酸的阳离子形式特征性的吸收谱带：-COOH-基团，在1714cm^-和1707cm^-1；-C=O(NH-C₆₀)，在1658cm^-1；NH₃ ⁺基团，在3000、2550和2000cm^-1；N-H伸缩振动出现在3400cm^-1；N-H弯曲振动出现在1552cm^-1；以及C₆₀-NH-R-的吸收谱带，在1104cm^-1、930cm^-1和830cm^-1。

该化合物的酸水解导致谷氨酰胺盐酸盐的释放，每摩尔起始物质的释放量为3摩尔。

研究了所述化合物针对HIV、HSV和流感病毒的抗病毒活性，还研究它们的抗肿瘤活性。在以下实施例中，通过实施例1所述方法制备的药物在下文中被称为药物1(富勒烯多(氨基己酸))。

实施例4.富勒烯-多(氨基己酸)药物的抗HIV活性研究。

在抗病毒药物和消毒剂专家评价测试中心的免疫缺陷病毒实验室(Ivanovsky病毒学研究所，俄罗斯医学科学院)中进行这些研究。

为细胞添加试验制剂并以0.01 TCD₅₀/细胞的剂量用病毒感染。将细胞培养物在37℃在5%CO₂气氛和98%湿度下保温4到5天。通过用染料对细胞染色和光学显微术来确定结果：病毒的细胞致病作用(CPE)和病毒诱导的合胞体形成(合胞体是具有通过膜融合形成的完全密封的细胞膜的若干细胞的集聚体)的研究。

根据对应于一个试验参数的四个孔中的每孔中的死亡细胞的数目，根据普遍接受的四加系统使用符号“+”和“-”在显微镜下评价细胞破坏的程度。

++++意指在单次稀释试验中四个孔中的细胞100%死亡；

+++意指四个孔中的细胞75%死亡；

++意指四个孔中每孔中的细胞50%死亡；

+意指四个孔中每孔中的细胞25%死亡；

+-意指变性开始；以及

-意指不存在细胞破坏。

这些研究的结果显示在表1和2中。

这些结果（参见表1和2）表明，所研究的富勒烯多(氨基己酸)样品具有针对1型人类免疫缺陷病毒的抗病毒活性。样品的EC₅₀(50%有效浓度)是0.9mcg/mL。在0.5～10mcg/mL的浓度，所述药物对细胞没有细胞毒作用。

实施例5.富勒烯-多(氨基己酸)药物的抗疱疹活性的体外实验研究。这些研究是在莫斯科的俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所进行的。

研究的主题是所述药物在Vero细胞培养物中的细胞毒活性和抗疱疹活性。

在该研究中使用了：可移植的猴肾细胞培养物(VERO)，购自俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所的组织培养物中心；以及单纯疱疹病毒1型，在Vero细胞中繁殖的Lg株。为细胞感染100TCD₅₀/0.2mL和1000TCD₅₀/0.2mL剂量的病毒。

使用的物质的试验样品是深色的粉末。

最初将样品以1:20的比例溶解于二甲亚砜(DMSO)中，然后在IGLA MEM培养基中制备工作浓度。根据保护细胞免受HSV的病毒诱导的细胞毒作用的程度来评价试验样品的活性，使用显微镜法和作为光学密度的MTT试验。

研究结果。研究了所使用浓度的所述物质的毒性和溶剂(含1.5mLDMSO的50mL水)的毒性。

向VERO细胞培养物物单层中添加50～1000mcg/mL的最终浓度的药物，并在5.0%CO₂气氛下在37℃保温24～48小时。用0.4%锥虫蓝溶液将细胞单层染色，然后在显微镜下检查。

在以至多100mcg/mL的浓度使用时，样品没有对VERO细胞培养物物产生毒性作用；在浓度为200mcg/mL时，出现毒性作用的特征：细胞死亡率为25%。500mcg/mL或更高的浓度对于Vero细胞来说是毒性的(表3)。

在一次给药方案中研究了所述样品的保护性能，即，在感染之前的一小时和用两个病毒剂量(100TCD₅₀和1000TCD₅₀)。

结果显示在表3～7中。上述研究表明，对于从5.0mcg/mL起和更高的所有试验浓度，在以100TCD₅₀剂量的单纯疱疹病毒感染细胞培养物之前60分钟给予药物，完全保护了细胞免于病毒的细胞破坏作用(参见表4和5)。

在感染用疱疹病毒剂量增加到1000TCD₅₀/0.2mL时(参见表6和7)，在选定的试验方案(其中在将药物加入培养基之后60分钟用病毒感染细胞)中，药物样品提供了敏感细胞培养物免受病毒的细胞破坏作用的完全保护。

实施例6.富勒烯多(氨基己酸)(编号1的药物)对A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1流感病毒的抗病毒活性研究。

这些研究是在莫斯科的俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所进行的。任务是研究这些药物在MDCK细胞培养物中对A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1流感病毒的抗病毒活性。

将药物用DMSO稀释(5mg物质+0.5mL DMSO)，随后加入4.5mL MEM细胞培养基，以此方式获得浓度为1.0мг/mL的储备溶液。随后，将储备溶液用MEM培养基稀释，以获得以下系列的工作浓度：6.5mcg/mL-12.5-25.0-50.0-100mcg/mL。

根据ELISA识别，由MDCK细胞培养物中的流感病毒复制的减少确定抗病毒活性。

为此目的，使MDCK细胞在96孔板上生长，以获得完整的单层，从生长培养基中洗涤，并加入在100mcL MEM培养基中的两倍浓度的物质。以两个规程用100～1000TCD₅₀的工作剂量的病毒进行感染：在加入物质后的2小时进行和同时进行。将所述板在充满CO₂的恒温箱中在37℃保温24小时。在保温之后，除去培养基并用含80%丙酮的PBS固定细胞15分钟，然后充分干燥，并通过特异性试剂(即，单克隆抗体、缀合物和底物(邻苯二胺))的连续吸附进行ELISA。通过用Biokom分光光度计在492nM测量光密度来监控反应的程度。每个病毒稀释度一式三份进行研究，计算其平均光密度(OD)值。测定百分比抑制，其为实验OD和细胞对照的OD之间的差值除以病毒对照的OD与细胞对照的OD之间的差值的商乘以100%。使用如此获得的数据测定引起50.0%病毒复制抑制的最小药物浓度(MIC₅₀)。

在使用不同感染复数的三个实验中确定对A(H1N1)流感病毒复制的抑制。结果显示在表8(三个实验的规程)和表9(三个实验的平均结果)中。

从表9中可见，在复制程度与药物浓度之间存在明确的相关性：随着浓度增加，病毒复制减少。另外，无论感染规程如何(在加入药物后2小时进行或同时进行)，在数值之间没有显著的差异。

因此，针对A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1流感病毒获得的不同稀释度的药物的活性结果证明了在MDCK细胞培养物中具有高的复制抑制活性。药物添加规程(在感染之前2小时或与感染同时进行)不影响药物在MDCK细胞培养物中的活性。

实施例7.富勒烯多(氨基己酸)(编号1的药物)对小鼠的诱发的流感肺炎的抗病毒活性研究。

这些研究是在莫斯科的药物化学中心(TsKhLS-VNIKhFI)进行的。

用于研究的药物呈暗褐色晶体粉末的形式。通过将经过称重的药物部分溶解在1%的用水煮过的淀粉溶液中来制备用于经口给药所需的药物剂量。对于腹膜内或肌内给药，将经过称重的药物部分溶解于1.5%DMSO溶液中。

使用的病毒是经过小鼠适应的A/Aichi/2/69(H3N2)流感病毒。这种病毒被广泛用于测定抗病毒药对小鼠的诱发的流感肺炎的效能，购自俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所的病毒株和细胞培养物保藏中心。为了制备感染材料，用尿囊病毒经鼻内感染小鼠。一旦发展出疾病的症状，将小鼠处死并在无菌条件下制备肺组织匀浆。然后，用这个匀浆感染10天龄的小鸡胚胎，从所述小鸡胚胎中获得待用的尿囊病毒，并在小鼠中进行滴定之后，用于感染动物。

体重为12～14g的白色非纯种(non-pedigree)(雌性)小鼠购自Andreevka动物养殖场(莫斯科oblast)并在经过调节的动物饲养条件下以标准配给维持。

在轻度乙醚麻醉下用A/Aichi/2/69(H3N2)流感病毒(在100mcL中的10LD₅₀)鼻内感染经过称重的小鼠(平均体重为12～14g的非谱系(nonlinear)雌性小鼠)。通过在随后用于主要实验中的相同小鼠中滴定尿囊病毒，在初步试验中测定LD₅₀。试验药物的治疗方案如下：感染前24小时，感染前1小时，感染后24小时，然后一日一次，24小时，连续5天。对于经口给药，使用带有专用针头(灌胃)的胰岛素注射器；每个剂量都是以100mcL的量给药。对于腹膜内和肌内给药，每个剂量也是以100mcL的量进行注射给药。病毒对照组由用病毒感染但没有用药物治疗的10只小鼠组成。在实验中，还有两组（每组10只）未经感染的小鼠，每只小鼠接受经腹膜内和经肌肉内给药的100mcL的用作药物溶剂的1.5%DMSO。其它组最初也都各自由10只动物组成。每天监控经过治疗的动物和对照动物；在感染后的前五天，每天为小鼠进行称重，然后每隔一天进行。通过以下的三个标准确定药物在诱发的流感肺炎中的化疗活性，即：与对照组相比，免于致死性病毒感染的百分比保护、平均寿命的延长以及用药物治疗的动物组的体重损失的减少。

与病毒对照相比，用富勒烯氨基己酸的治疗在降低小鼠的流感肺炎引起的死亡率以及减少体重损失和延长平均寿命方面是有效的。这种治疗的功效取决于药物的剂量和治疗方案。结果显示在表10和11中。

根据所有三个参数(百分比死亡保护、平均寿命和体重损失)，用富勒烯多(氨基己酸)进行的肌内给药治疗是最有效的；在以100和200mg/kg/天的剂量给药时，这种治疗防止了60～70%的受感染动物死亡和它们的体重损失，并且它们的寿命还延长近两倍。用富勒烯多(氨基己酸)进行的腹膜内给药治疗只在50和100mg/kg/天的剂量是有效的。用200mg/kg/天剂量的富勒烯多(氨基己酸)进行的腹膜内给药治疗时，小鼠死亡率、平均寿命的显著缩短和体重的显著降低暗示这种治疗方法采用这一剂量对于受感染的小鼠而言是毒性的。

实施例8.富勒烯多(氨基己酸)(编号1的药物)在可移植的L1210白血病、乳房腺癌Ca-755和Lewis癌肿瘤中的抗肿瘤活性研究。

这些研究是2006年在圣彼得堡的毒理学研究所，根据“药理物质的抗肿瘤活性研究指南”(“新的药理物质的实验（临床前）研究操作手册”，俄罗斯联邦公共卫生部，莫斯科，2000年，第319-325页)进行的。

L1210白血病、乳房腺癌Ca-755和莱维（Lewis）癌(3LL)肿瘤细胞株购自Petrov肿瘤学研究所，俄罗斯联邦公共卫生部(圣彼得堡)。

这些研究使用了以下的试验系统：

移植了L1210白血病细胞的DBA/2系小鼠。小鼠年龄：6～8周龄；体重：19～25g。

移植了Ca-755细胞的C 57 BL/6J系雄性小鼠。小鼠年龄：6～8周龄；体重：19～25g。

移植了3LL细胞的C 57 BL/6J系雄性小鼠。小鼠年龄：6～8周龄；体重：18～24g。

通过以下参数确定抗肿瘤作用：

-随着动物体重增加的腹水累积；

-动物的寿命；以及

-肿瘤生长。测量肿瘤的较大维度(长度)和与之垂直的较小维度(宽度)。计算肿瘤体积并通过公式计算肿瘤生长的抑制。确定标准是每个个体肿瘤达到500mm³的体积的日子。

所述药物对L1210白血病的发展的作用结果显示在表12中。

表13示出了带有L1210白血病的可移植肿瘤的动物以及对照组的平均寿命，以及以百分比表示的与对照组相比的寿命延长。

从表13可见，带有移植的L1210白血病细胞的对照组小鼠的平均寿命是6.0±0.21天。所述药物的给药显著地延长小鼠寿命到10.7±0.37天和10.60±0.37天。对于100mg/kg和200mg/kg的药物剂量，与对照相比的寿命百分比增加分别是78.33%和76.67%；然而，实验组之间的差异似乎是统计上不显著的。

在实验期间，每天称重动物，目的是评价腹水累积和研究用这种方法比较的药物。

体重增加评价的结果显示在表14中。从表14可见，试验药物显著地减少了带有移植的L1210白血病肿瘤的小鼠中的腹水累积。接受试验药物的小鼠的体重增加显著地低于对照组。此外，在接受250mg/kg剂量试验药物的动物中，平均体重增加显著地(1.5倍)低于接受100mg/kg剂量药物的动物中的相同参数。

因此，上述结果提示，所述药物具有明确的抗肿瘤活性并抑制小鼠中L1210白血病肿瘤的生长，其体现在100和250mg/kg剂量分别引起的显著的寿命延长(分别为78.33%和76.67%)，以及实验动物中腹水累积的显著抑制(78～43%)。在给予试验药物的背景下没有检测到中毒迹象。对结果进行的检查显示，在100mg/kg剂量和250mg/kg剂量之间有显著的差异：所述药物剂量的增加导致实验动物中腹水累积的显著减少。

对于其它参数，反差(较早接受不同剂量试验药物的组的平均值的差异)处于自然变异引起的误差水平之内。

所述药物对乳房腺癌Ca-755的发展的作用结果显示在表15中。

表16示出了带有可移植的乳房腺癌Ca-755肿瘤的动物以及对照组动物的平均寿命，以及以百分比表示的与对照组相比的寿命延长。

从表16可见，带有移植的乳房腺癌Ca-755肿瘤细胞的对照组小鼠的平均寿命是37.9+0.74天。药物的施用显著地延长小鼠的寿命到71.9±2.58天和73.4+0.92天；对于100mg/kg和200mg/kg的药物剂量，与对照相比的寿命延长百分比分别是89.71%和93.67%；然而，实验组之间的差异似乎是统计上不显著的。

因此，上述结果提示，所述药物具有显著的抗肿瘤作用并抑制小鼠的乳房腺癌Ca-755肿瘤细胞的生长，体现在100和250mg/kg剂量引起的显著的寿命延长（89.71%和93.67%）。在给予试验药物的背景下没有检测到中毒迹象。

在移植之后的不同日子确定所述药剂对莱维癌肿瘤的平均体积的影响。在对照组中，在26只小鼠中的21只中发展出肿瘤(80.8%)；第一批肿瘤出现在移植后的第7天并观察直到第40天。在接受100mg/kg剂量的药物的组中，在移植后的第7天观察到第一批肿瘤并观察直到第60天；在接受250mg/kg剂量的药物的组中，第一批肿瘤出现在移植后的第8天并观察直到第60天。所述药物对于莱维肺癌的发展具有突出的抗肿瘤作用；与对照组相比，在接受100mg/kg剂量药物的组中，在第10天至第17天的百分比抑制显著地是71.77%和58.5%；在接受250mg/kg剂量药物的组中，与对照组相比，在第10天至第17天的百分比抑制分别是84.37%和54.2%。

表17示出了药物对莱维肺癌生长的影响；所分析的参数是肿瘤达到500mm³大小的时间；在对照组中，这个参数为12～20天，而在实验组中，为17～28天。从这个表中可见，与对照相比，所述药物使这个参数显著地增加22～27%。

在对照组小鼠中，由于主要病灶的进行性肿瘤生长和由于肺的广泛转移性损害，小鼠发生死亡。对照组小鼠的个体寿命为28～39天；在接受药物的小鼠组中，个体的寿命为51～60天。表18示出了所述药物对肿瘤移植后小鼠的平均寿命的影响。从表18可见，与对照组相比，所述药物使平均寿命显著地增加大约70%；试验组之间的差异是统计上不显著的。

表19中显示了对比之下对照组小鼠和接受所述药物的试验组小鼠的肺重量和肺转移瘤数目的个体数值。

从表19可见，所述药物显著地使肺重量和肺中的转移瘤的数目减少1.5～2倍。试验组之间的差异是统计上不显著的。

表1.在人类类淋巴母细胞模型中研究的所述药物的细胞毒性

表2.在HIV-1感染的人细胞模型上研究的所述药物的抗病毒活性

表3.富勒烯多(氨基己酸)样品对Vero细胞培养物的细胞毒性作用

注释：以用于溶解的浓度存在的DMSO对细胞不产生细胞毒性作用。

表4.富勒烯多(氨基己酸)样品在感染100TCD₅₀/0.2mL剂量的疱疹病毒的Vero细胞培养物中的抗疱疹活性

注释：在添加样品后一小时感染细胞。

表5.所述药物对以100TCD₅₀的剂量进行病毒感染的1型疱疹病毒的破坏作用的保护作用

表6.富勒烯多(氨基己酸)样品在感染1000TCD₅₀/0.2mL剂量的疱疹病毒的Vero细胞培养物中的抗疱疹活性

注释：在添加样品后一小时感染细胞。

表7.编号1的药物对以1000TCD₅₀的剂量进行病毒感染的1型疱疹病毒的细胞致病作用的保护作用

表8.编号1的药物针对流感病毒A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1的活性数值

两次试验的数值之间的差异取决于MDCK细胞培养物的病毒感染复数。

表9.所述药物对流感病毒A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1的活性数值，平均值

表12.所述药物对带有可移植的L1210白血病肿瘤的小鼠的寿命的影响

表13.所述药物对带有可移植的L1210白血病肿瘤的动物的平均寿命的影响

组的名称	以天数表示的ALT，M±m	ILT,%
			对照	6.0±0.21
编号1的药物，100mg/kg	10.7±37*	78.33
			编号1的药物，250mg/kg	10.60±0.37*	76.67

注释：^*相对于对照有显著差异(p<0.05)。

表14.所述药物对带有可移植的L1210白血病肿瘤的小鼠的腹水发展的影响

注释：^*相对于对照有显著差异(p<0.05)。

表15.所述药物对带有可移植的白血病肿瘤CA-755的小鼠的寿命的影响

表16.所述药物对带有可移植的乳房腺癌肿瘤Ca-755的动物的平均寿命的影响

注释：^*相对于对照有显著差异(p<0.05)。

表17.所述药剂对莱维癌大小的影响(达到V=10 500mm³)

注释：^*相对于对照有显著差异(p<0.05)。

表18.在移植莱维癌之后所述药物对小鼠寿命的影响

注释：^*相对于对照有显著差异(p<0.05)。

表19.所述药物对在小鼠中Lewis癌转移的影响

注释：^*相对于对照有显著差异(p<0.05)。

Claims (7)

1.通式C₆₀(H)_x{NH(CH₂)_nCOO-}_x{NH₃ ⁺(L)COOH)}_x的富勒烯的均聚(氨基酸)衍生物和杂多(氨基酸)衍生物，其中n=2～5、х=3、L=-(СН₂)_m，其中m=1～5，或-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2，其特征在于所述化合物包含共价结合的氨基酸基团和极性离子形式的氨基酸。

2.根据权利要求1的富勒烯衍生物，其特征在于所述氨基酸基团是通式NH(CH₂)_nCOOH的脂肪族氨基酸的部分，其中n=2～5。

3.根据权利要求1的富勒烯衍生物，其特征在于所述极性离子形式的氨基酸是通式NH₂(CO)(CH₂)_kCH(NH₂)COOH的二羧酸氨基酸酰胺的部分，其中k=1～2。

4.制备根据权利要求1的富勒烯衍生物的方法，其特征在于如下制备该富勒烯衍生物：使富勒烯与十倍摩尔过量的通式NH₂(CH₂)_nCOOK的氨基酸的无水钾盐在芳香族有机溶剂介质中反应，其中n=2～5，包括在搅拌并加热到不高于60～80℃的温度下向得到的悬浮液中添加相转移催化剂，直到溶液完全脱色并形成固体沉淀物，然后分离所述沉淀物，之后用有机酸或无机酸的1N溶液处理富勒烯多(氨基酸)钾盐的水溶液，随后引入通式NH₂(L)COOH在极性溶剂中的溶液，其中L=-(СН₂)_m，其中m=1～5，或者-CO(CH₂)_kCH(NH₂)-，其中k=1～2，搅拌除去溶剂、洗涤并干燥沉淀物。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于使用细分散状态的新制备的氨基酸的无水钾盐，且通过过滤、乙醇洗涤和干燥进行富勒烯多(氨基酸)的钾盐的分离。

6.根据权利要求4和5任一项的方法，其特征在于所述的相转移催化剂是分子量为200、400或500的甲基聚氧化乙烯酯。

7.药物组合物，其特征在于活性剂是根据权利要求1的富勒烯衍生物。