CN103342665B - 一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物及其制备方法，该化合物包括两类异羟肟酸类和苯甲酰胺类化合物。所提供的化合物是新型的具有抗组蛋白去乙酰化酶活性的化合物，其体外对组蛋白去乙酰化酶有很好的抑制活性；可用于抗肿瘤药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种抗肿瘤的化合物，特别涉及一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康，威胁人类生命的主要疾病之一。世界卫生组织的统计资料显示，目前全世界每年约有数百万人死于恶性肿瘤，其已经成为仅次于心脑血管疾病的第二大人类疾病杀手。化学药物治疗作为治疗肿瘤的重要手段之一，在近三十年已经有了巨大的发展和进步，得到了一大批具有不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但是抗肿瘤药仍存在许多不足之处，例如毒副作用不可以控制，快速产生耐药性等等，这些都导致化学药物无法达到预期的治疗效果。因此新的抗肿瘤药物的研究与开发是目前药学领域的热点和难点问题之一。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物及其制备方法，包括异羟肟酸类和苯甲酰胺类，作为组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)抑制剂，在体外体现出很好的抗肿瘤活性，能够应用于抗肿瘤药物的制备。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种化合物，其化学结构式为：
其中，R1为卤素、三氟甲基或甲氧基，R2为羟胺、2-氨基苯胺或4-甲基-2-氨基苯胺。
所述的R1为双取代，取代基为卤素、三氟甲基中的一种或两种。
所述的双取代的取代基相邻或相间。
所述的R1为单取代，取代基为卤素、三氟甲基中的一种。
所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：
1）阿魏酸与甲醇发生酯化反应，得到阿魏酸甲酯；
2）取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺发生成醚反应，得到相应的取代的阿魏酸甲酯；
4）将取代的阿魏酸甲酯溶于有机溶剂，加入NH2OK/KOH的甲醇溶液反应制备异羟肟酸，待充分反应后得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。
进一步，具体包括以下步骤：
1）将阿魏酸溶于甲醇，在浓硫酸催化作用下发生酯化反应，得到阿魏酸甲酯；
2）在冰浴条件下，取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后，室温搅拌充分反应；反应完全后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）在有机溶剂中阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺充分混合，无水碳酸钾存在条件下，加热回流发生成醚反应，反应完成后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到相应的取代的阿魏酸甲酯；
4）将取代的阿魏酸甲酯溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入NH2OK/KOH的甲醇溶液，室温搅拌充分反应，反应完全后加入冰水并调pH至2.0；抽滤，收集滤饼，然后硅胶柱色谱分离，得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。
所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：
1）阿魏酸与邻苯二胺或4-甲基邻苯二胺发生缩合反应，生成相应的苯甲酰胺；
2）取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）步骤1）制备的苯甲酰胺与取代的氯乙酰苯胺发生成醚反应，具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的苯甲酰胺类化合物。
进一步，具体包括以下步骤：
1）将阿魏酸溶解于有机溶剂后，加入N,N'-羰基二咪唑作为催化剂，然后加入邻苯二胺或4-甲基邻苯二胺，室温充分反应后，蒸除反应溶剂后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到相应的苯甲酰胺；
2）在冰浴条件下，取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后，室温搅拌充分反应；反应完全后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）在有机溶剂中，步骤1）制备的苯甲酰胺与取代氯乙酰苯胺充分混合，无水碳酸钾存在条件下，加热回流发生成醚反应，反应完成后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的苯甲酰胺类化合物。
所述的化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。
所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物，包括两类：异羟肟酸类和苯甲酰胺类化合物，所提供的化合物是新型的具有抗组蛋白去乙酰化酶活性的化合物，其体外对组蛋白去乙酰化酶有很好的抑制活性；而鉴于组蛋白去乙酰化酶在许多种癌症中过度表达及其在癌细胞的周期、分化、凋亡、侵袭和转移和血管生成过程中发挥的重要作用，以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤作用，而且所提供的化合物表现出了相应的抗肿瘤作用，所提供的化合物可用于抗肿瘤药物的制备。
本发明提供的具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物的制备方法，具有原料来源易得，反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜易得的优点。
附图说明
图1为异羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成路线图；
图中标注的具体为：a:无水甲醇,浓硫酸；b:无水二氯甲烷,三乙胺;c:无水碳酸钾,无水丙酮；d:羟胺钾/氢氧化钾,无水甲醇，无水N,N-二甲基甲酰胺。
图2为苯甲酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成路线图；
图中标注的具体为：e:N,N-羰基二咪唑,无水四氢呋喃,邻苯二胺或3,4-二氨基甲苯,三氟乙酸;f:无水二氯甲烷，三乙胺；g:无水碳酸钾，无水丙酮。
其中，化合物1为阿魏酸，化合物2为阿魏酸甲酯，化合物3为取代的苯胺，化合物4为氯乙酰氯，化合物5为取代氯乙酰胺，化合物6为取代的丙烯酸酯，化合物为7为异羟肟酸。化合物8为(2E)-N-(2-氨基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺或(2E)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺，化合物9为苯甲酰胺系列目标化合物。
具体实施方式
本发明提供一种具有抗肿瘤活性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，包括异羟肟酸类和苯甲酰胺类，这些化合物在体外体现出组蛋白去乙酰化酶抑制活性，能够应用于抗肿瘤药物的制备。下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供的具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的化合物，其化学结构式为：
其中，R1为卤素、三氟甲基或甲氧基，R2为羟胺、2-氨基苯胺或4-甲基-2-氨基苯胺。
具体的R1为单取代或双取代，当R1为双取代时取代基相邻或相间。
根据取代基的不同上述的化合物可以分为异羟肟酸类和苯甲酰胺类，下面分别对其制备和活性进行具体的说明。
实施例1
该化合物的结构式中的R1、R2分别为3，5-二三氟甲基和羟胺，通过以下步骤制备（参见图1）：
1)阿魏酸通过酯化反应制备阿魏酸甲酯
将6.8g(35mmol)阿魏酸置于250mL的圆底烧瓶中，加入80mL无水甲醇，冰浴条件下缓慢滴加2mL浓硫酸，加热回流反应；待反应完全后，减压蒸除溶剂，加入100mL冰水，用固体碳酸氢钠调pH至6，用乙酸乙酯提取，合并有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除乙酸乙酯，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体阿魏酸甲酯6.54g，产率89.7％。理化性质为：mp：62～63℃。
2)3，5-二三氟甲基苯胺和氯乙酰氯制备2-氯-N-(3,5-二三氟甲基苯基)乙酰胺
将3，5-二三氟甲基苯胺9.2g(40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入70mL无水二氯甲烷，20mL无水三乙胺，冰浴搅拌30min后，逐滴加入3.84mL(48mmol)氯乙酰氯的无水二氯甲烷溶液，撤掉冰浴，室温搅拌反应；待反应完全后，加入150mL二氯甲烷溶液稀释，分别用饱和氯化钠，2mol/L盐酸溶液，水，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去二氯甲烷，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得浅黄色固体2-氯-N-(3,5-二三氟甲基苯基)乙酰胺9.75g，产率76.87%。
3)阿魏酸甲酯与2-氯-N-(3,5-二三氟甲基苯基)乙酰胺通过成醚反应制备N-(3,5-二三氟甲基苯基)-2-{2-甲氧基-4-[(1E)-3-氧代丁烯基]苯氧基}乙酰胺
将阿魏酸甲酯2.08g(10mmol)置于250mL的圆底烧瓶中，加入70mL无水丙酮将其溶解，加入4.14g(30mmol)无水碳酸钾，再加入化合物N-(3,5-二三氟甲基苯基)-2-氯乙酰胺3.36g(11mmol)，加热回流反应；待反应完全后，过滤除去无水碳酸钾，减压蒸去丙酮，用乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去乙酸乙酯，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体N-(3,5-二三氟甲基苯基)-2-{2-甲氧基-4-[(1E)-3-氧代丁烯基]苯氧基}乙酰胺3.55g，产率72.75%。
理化性质为：mp：167-168°C，MS(EI)[M]+:m/z=477.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.13(s,2H),7.68(s,1H),7.66(d,J=8Hz,1H),7.17(d,J=8Hz,1H),7.15(s,1H),7.02(d,J=8Hz,1H),6.39(d,J=16Hz,1H),4.73(s,2H),4.03(s,3H),3.84(s,3H).
4)N-(3,5-二三氟甲基苯基)-2-{2-甲氧基-4-[(1E)-3-氧代丁烯基]苯氧基}乙酰胺制备(2E)-3-(4-{2-[(3,5-二三氟甲基苯基)氨基]-2-氧代乙氧基}-3-甲氧基苯基)-N-羟基丙烯酰胺
将化合物N-(3,5-二三氟甲基苯基)-2-{2-甲氧基-4-[(1E)-3-氧代丁烯基]苯氧基}乙酰胺2.39g(5mmol)置于圆底烧瓶中，加入7mL无水DMF溶解，加入新配制的NH2OK/KOH的甲醇溶液（其配制为：将盐酸羟胺1.74g(25mmol)溶于9.8mL的无水甲醇中，再加入氢氧化钾2.8g(50mmol)的7.5mL甲醇溶液），室温搅拌反应72小时，待反应完全后，加入冰水，用2mol/L的盐酸溶液调pH至2，有黄色固体析出，抽滤，滤饼烘干，滤液用乙酸乙酯提取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，与滤饼合并，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得浅黄色固体1.2g，产率49.18%。
所得化合物的结构如图所示：
其理化性质为：mp：183-185℃，MS(EI)[M]+:m/z=478.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.17(s,1H),8.04(s,1H),7.69(s,1H),7.41(d,J=16Hz,1H),7.23(s,1H),7.11(d,J=8Hz,1H),6.96(d,J=8Hz,1H),6.37(d,J=16Hz,1H),4.78(s,2H),3.84(s,3H).
实施例2
该化合物的结构式中的R1、R2分别为3-氯-4-氟和羟胺，制备方法为：
将实施实例1中的3，5-二三氟甲基苯胺用3-氯-4氟甲基苯胺替换，其他制备方法相同。
所得中间体为N-(3-氯-4-氟苯基)-2-{2-甲氧基-4-[(1E)-3-氧代丁烯基]苯氧基}乙酰胺，该化合物的结构如图所示：
理化性质：mp：156-158°C，MS(EI)[M]+:m/z=393.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.80(d,J=8Hz,1H),7.66(d,J=16Hz,1H),7.43(d,J=12Hz,1H),7.29(s,1H),7.17(s,1H),7.14(d,J=8Hz,1H),6.98(d,J=8Hz,1H),6.39(d,J=16Hz,1H),4.69(s,2H),4.00(s,3H),3.84(s,3H).
目标化合物为(2E)-3-(4-{2-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-2-氧代乙氧基}-3-甲氧基苯基)-N-羟基丙烯酰胺，化合物的结构如图所示：
理化性质：mp：177-179℃，MS(EI)[M]+:m/z=394.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.95(d,J=8Hz,1H),7.54(d,J=8Hz,1H),7.41(d,J=8Hz,1H),7.38(s,1H),7.22(s,1H),7.11(d,J=8Hz,1H),6.97(d,J=8Hz,1H),6.37(d,J=16Hz,1H),4.74(s,2H),3.84(s,3H).
实施例3
该化合物的结构式中的R1、R2分别为3-溴-5-三氟甲基和2-氨基苯胺，通过以下步骤制备（参见图2）：
1)阿魏酸与邻苯二胺通过缩合反应制备(2E)-N-(2-氨基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺
将5.83g(30mmol)阿魏酸置于250mL的圆底烧瓶中，加入120mL的无水四氢呋喃溶解，逐滴加入溶于无水四氢呋喃的N,N'-羰基二咪唑（CDI，作为催化剂）5.35g(33mmol)，室温搅拌1h，再加入邻苯二胺25.96g(240mmol)，室温反应16h；待反应完全后，减压蒸除溶剂，用300mL乙酸乙酯提取，合并有机相，分别用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压整除乙酸乙酯，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体6.87g，产率80.53％。
理化性质为：mp：164-166℃，MS(EI)[M]+:m/z=284.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.70(d,J=16Hz,1H),7.35(s,1H),7.12–7.09(m,2H),7.08(d,J=12Hz,1H),6.95(d,J=8Hz,1H),6.86(d,J=4Hz,2H),6.49(d,J=8Hz,1H),3.96(s,3H).
2)3-溴-5-三氟甲基苯胺制备2-氯-N-(3-溴-5-三氟甲基苯基)乙酰胺
将3-溴-5-三氟甲基苯胺9.6g(40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入70mL无水二氯甲烷，20mL无水三乙胺，冰浴搅拌30min后，逐滴加入3.84mL(48mmol)氯乙酰氯的无水二氯甲烷溶液，撤掉冰浴，室温搅拌反应；待反应完全后，加入150mL二氯甲烷溶液稀释，分别用饱和氯化钠，2mol/L盐酸溶液，水，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去二氯甲烷，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体2-氯-N-(3-溴-5-三氟甲基苯基)乙酰胺10.54g，产率83.26％。
3)(2E)-N-(2-氨基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺与2-氯-N-(3-溴-5-三氟甲基苯基)乙酰胺发生成醚反应，制备(2E)-N-(2-氨基苯基)-3-[3-甲氧基-4-(2-氧-2-{[3-溴-5-三氟甲基苯基]氨基}乙氧基)苯基]丙烯酰胺
将1)中所得(2E)-N-(2-氨基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺1.43g(5mmol)置于250mL的圆底烧瓶中，加入70mL无水丙酮将其溶解，加入2.07g(15mmol)无水碳酸钾，再加入2)所得化合物，加热回流反应；待反应完全后，过滤除去无水碳酸钾，减压蒸去丙酮，用乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去乙酸乙酯，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体1.67g，产率56.41％。
所得化合物的结构如图所示：
理化性质：mp：209-211°C，MS(EI)[M]+:m/z=563.0。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.18(s,1H),8.05(s,1H),7.69(s,1H),7.51(d,J=16Hz,1H),7.32(d,J=16Hz,2H),7.16(s,1H),7.01–6.92(m,2H),6.79(d,J=16Hz,2H),6.58(d,J=4Hz,1H),4.81(s,2H),3.87(s,3H).
实施例4
该化合物的结构式中的R1、R2分别为4-甲氧基和2-氨基苯胺，制备方法为：
将实施实例3中的3-溴-5-三氟甲基苯胺用4-甲氧基苯胺替换，其他制备方法相同。
所得化合物为(2E)-N-(2-氨基苯基)-3-[3-甲氧基-4-(2-氧-2-{[4-甲氧基苯基]氨基}乙氧基)苯基]丙烯酰胺，结构如图所示：
理化性质：189-191°C，MS(EI)[M]+:m/z=447.1.
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.54(d,J=12Hz,2H),7.51(d,J=12Hz,1H),7.35(d,J=8Hz,1H),7.28(s,1H),7.18(d,J=8Hz,1H),7.01–6.95(m,2H),6.91(d,J=8Hz,2H),6.80(d,J=16Hz,2H),6.65(d,J=8Hz,1H),4.72(s,2H),3.88(s,3H),3.73(s,3H).
实施例5
该化合物的结构式中的R1、R2分别为3-三氟甲基和4-甲基-2-氨基苯胺，制备方法为（参见图2）：
1)阿魏酸与4-甲基邻苯二胺通过缩合反应制备(2E)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺
将5.83g(30mmol)阿魏酸置于250mL的圆底烧瓶中，加入120mL的无水四氢呋喃溶解，逐滴加入溶于无水四氢呋喃的N,N'-羰基二咪唑（CDI，作为催化剂）5.35g(33mmol)，室温搅拌1h，再加入4-甲基邻苯二胺29.4g(240mmol)，室温反应16h；待反应完全后，减压蒸除溶剂，用300mL乙酸乙酯提取，合并有机相，分别用水，饱和NaHCO3，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压整除乙酸乙酯，柱色谱分离，得白色固体7.1g，产率79.32％。
理化性质为：mp：174-176°C，MS(EI)[M]+:m/z=298.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.44(d,J=16Hz,1H),7.19(d,J=8Hz,1H),7.18(s,1H),7.05(d,J=8Hz,1H),6.82(d,J=8Hz,1H),6.69(d,J=16Hz,1H),6.56(s,1H),6.39(d,J=8Hz,1H),3.83(s,3H),2.17(s,3H).
2)3-三氟甲基苯胺和氯乙酰氯制备2-氯-N-(3-三氟甲基苯胺苯基)乙酰胺
将3-三氟甲基苯胺6.5g(40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入70mL无水二氯甲烷，20mL无水三乙胺，冰浴搅拌30min后，逐滴加入3.84mL(48mmol)氯乙酰氯的无水二氯甲烷溶液，撤掉冰浴，室温搅拌反应；待反应完全后，加入150mL二氯甲烷溶液稀释，分别用饱和氯化钠，2mol/L盐酸溶液，水，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去二氯甲烷，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体2-氯-N-(3-三氟甲基苯基)乙酰胺7.81g，产率82.36％。
3)(2E)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺与2-氯-N-(3-三氟甲基苯基)乙酰胺发生成醚反应，制备(2E)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)-3-(4-{2-[(3-三氟甲基苯基)氨基]-2-氧代乙氧基}-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺
将1)中所得(2E)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺1.50g(5mmol)置于250mL的圆底烧瓶中，加入70mL无水丙酮将其溶解，加入2.07g(15mmol)无水碳酸钾，再加入2)所得化合物，加热回流反应；待反应完全后，过滤除去无水碳酸钾，减压蒸去丙酮，用乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去乙酸乙酯，称取等量的硅胶拌样，柱色谱分离，得白色固体1.36g，产率54.31％。
所得化合物的结构如图所示：
理化性质为：mp：200-202°C，MS(EI)[M]+:m/z=499.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.84(d,J=8Hz,1H),7.77(d,J=8Hz,1H),7.60(d,J=8Hz,1H),7.58(d,J=8Hz,1H),7.51(s,1H),7.28(s,1H),7.17(d,J=12Hz,1H),7.08–7.05(m,1H),7.00(d,J=8Hz,1H),6.78(d,J=16Hz,1H),6.56(s,1H),6.39(d,J=8Hz,1H),4.76(s,2H),3.85(s,3H),2.17(s,3H).
实施例6
该化合物的结构式中的R1、R2分别为2-氟和4-甲基-2-氨基苯胺，制备方法为：将实施实例5中的3-三氟甲基苯胺用2-氟苯胺替换，其他制备方法相同。
所得目标化合物为(2E)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)-3-(4-{2-[(2-氟苯基)氨基]-2-氧代乙氧基}-3-甲氧基苯基)丙烯酰胺，结构如图所示：
理化性质：mp：187-189°C，MS(EI)[M]+:m/z=449.1。
氢谱核磁共振数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.96(s,1H),7.49(d,J=16Hz,2H),7.33–7.28(m,2H),7.20(d,J=8Hz,2H),7.18(d,J=8Hz,1H),7.03(d,J=8Hz,1H),6.79(d,J=16Hz,1H),6.56(s,1H),6.39(d,J=8Hz,1H),4.83(s,2H),3.88(s,3H),2.17(s,3H).
实施例7测定化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性：
测定方法具体如下：
选用Enzo Life Sciences公司的HDAC抑制活性紫外检测试剂盒(Color-de-LysTM HDAC colorimetric activity assay kit-BML-AK501)检测目标化合物的抑酶活性，操作方法按照试剂盒说明进行。首先将酶，底物和显色剂用缓冲液分别稀释2倍，100倍，40倍以备使用。将样品和阳性对照药(SAHA)用缓冲液分别制备20μg/mL，4μg/mL，0.8μg/mL，0.16μg/mL的浓度梯度。于96孔板上每孔依次加入10μL缓冲液，10μL样品溶液，5μL酶溶液和25μL底物溶液;空白孔加25μL缓冲液和25μL底物溶液；对照孔加20μL缓冲液，5μL酶溶液和25μL底物溶液。加毕，37℃下孵育30min；加入显色剂50μL，再在37℃下孵育15min，静置后在酶标仪上波长为405nm下读取吸光值，计算化合物对HDAC的抑制率和IC50。
化合物对组蛋白去乙酰化酶抑制活性的结果，如表1所示：
表1.目标化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性结果(IC50)
HDACs各亚型在许多种癌症中过度表达及其在癌细胞的周期、分化、凋亡、侵袭和转移和血管生成过程中发挥的重要作用，证明HDACs与癌症的发生发展密切相关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过抑制HDACs的活性能够有效地抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞分化和凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。
实施例8组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗肿瘤活性筛选
采用MTT法检验待测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤细胞的生长抑制活性：
本发明提供的组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有抗肿瘤作用，对肿瘤细胞有体外抑制增殖活性，在乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，乳腺癌细胞(MCF-7)，宫颈癌细胞(Hela)细胞系中具有抑制肿瘤细胞的增殖活性，可以用于对这些癌症的治疗；与阳性药SAHA相比，个别化合物显示了更高的抑制肿瘤细胞增殖活性。
将处于对数生长期的乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，乳腺癌细胞(MCF-7)，宫颈癌细胞(Hela)，用0.25%的胰酶消化3～5分钟，吹打均匀后稀释成浓度为5×103～1×104个/mL的单细胞悬液，平行接种于96孔培养板中，每孔接种体积为200μL；于37℃，5%CO2培养箱中培养24个小时；
孔中加入20uL不同浓度化合物的培养基，使孔中化合物的终浓度为：200ug/mL;50ug/L;12.5ug/L;3.125ug/L，每个浓度设3个复孔，加细胞不加化合物的孔作对照孔，SAHA作化合物阳性对照，继续培养48个小时；
洗掉孔中培养基，向孔中加入100uLMTT，使孔中MTT的终浓度0.5mg/mL，37℃培养箱孵育4小时后取出，小心吸弃培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡15min，酶联免疫法检测仪测量各孔490nm处紫外吸收值(OD值)，然后计算细胞抑制率，并根据抑制率求出IC50值；细胞抑制率的计算公式为：
抑制率%=(对照孔平均OD值-用药组平均OD值)/对照孔平均OD值×100%
检测结果显示：与阴性对照组相比，所得的组蛋白去乙酰化酶抑制剂对上述3种肿瘤细胞具有不同程度的体外抑制作用。
表2.SAHA和新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂对不同细胞株的IC50(μM)
结果显示部分化合物对肿瘤细胞的抑制和阳性SAHA相当，甚至有一些活性要高于阳性对照。说明新型的对肿瘤细胞的增殖抑制效果比较明显。
Claims (10)
1.一种化合物，其特征在于，其化学结构式为：
其中，R1为卤素、三氟甲基或甲氧基，R2为羟胺、2-氨基苯胺或4-甲基-2-氨基苯胺。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R1为双取代，取代基为卤素、三氟甲基中的一种或两种。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述的双取代的取代基相邻或相间。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R1为单取代，取代基为卤素、三氟甲基中的一种。
5.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）阿魏酸与甲醇发生酯化反应，得到阿魏酸甲酯；
2）取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺发生成醚反应，得到相应的取代的阿魏酸甲酯；
4）将取代的阿魏酸甲酯溶于有机溶剂，加入NH2OK/KOH的甲醇溶液反应制备异羟肟酸，待充分反应后得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。
6.如权利要求5所述的化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）将阿魏酸溶于甲醇，在浓硫酸催化作用下发生酯化反应，得到阿魏酸甲酯；
2）在冰浴条件下，取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后，室温搅拌充分反应；反应完全后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）在有机溶剂中阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺充分混合，无水碳酸钾存在条件下，加热回流发生成醚反应，反应完成后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到相应的取代的阿魏酸甲酯；
4）将取代的阿魏酸甲酯溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入NH2OK/KOH的甲醇溶液，室温搅拌充分反应，反应完全后加入冰水并调pH至2.0；抽滤，收集滤饼，然后硅胶柱色谱分离，得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。
7.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）阿魏酸与邻苯二胺或4-甲基邻苯二胺发生缩合反应，生成相应的取代的阿魏酸酰苯胺；
2）取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）步骤1）制备的取代的阿魏酸酰苯胺与取代的氯乙酰苯胺发生成醚反应，得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的权利要求1所述的化合物。
8.如权利要求7所述的化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）将阿魏酸溶解于有机溶剂后，加入N,N'-羰基二咪唑作为催化剂，然后加入邻苯二胺或4-甲基邻苯二胺，室温充分反应后，蒸除反应溶剂后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到相应的取代的阿魏酸酰苯胺；
2）在冰浴条件下，取代基为R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后，室温搅拌充分反应；反应完全后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到取代基为R1的取代氯乙酰苯胺；
3）在有机溶剂中，步骤1）制备的取代的阿魏酸酰苯胺与取代氯乙酰苯胺充分混合，无水碳酸钾存在条件下，加热回流发生成醚反应，反应完成后洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离，得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的权利要求1所述的化合物。
9.权利要求1所述的化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。
10.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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