CN103341176A - 一种疫苗的冻干保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冻干保护剂，是由如下质量体积百分比浓度的物质组成的：2.4～4%NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、20～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%水解明胶；余量为水。本发明的冻干保护剂采用的原料成本低，操作简单，可以大规模生产，疫苗在2～8℃条件下保存24个月后，疫苗效价均≥10^5.7TCID₅₀/头份（国标），从而有效的延长了疫苗的保存期限。

Description

一种疫苗的冻干保护剂

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种疫苗的冻干保护剂。

背景技术

目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物疫苗中，活疫苗占相当大的比例，但国内疫苗企业常用的冻干保护剂组方简单，保护性能差，如果在2～8℃条件下保存，保存期只有短短的3～6个月，大多需要在-15℃条件下保存。而低温保存的需求使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门和用户缺乏必要的冷冻和冷藏设施，很容易因疫苗保存温度不当而使其效价大打折扣，最终导致免疫失败。。本发明提供的冻干保护剂冻干的疫苗，可在2～8℃条件下长期保存，保存期可长达24个月，病毒含量均高于《中华人民共和国兽药典》规定的标准，解决了兽医生物制品长久以来一直存在的疫苗因储存、运输、使用过程中温度升高而造成的效价损失问题，也解决了生物制品的储存和运输所必需的低温环境带来的高成本问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种疫苗的冻干保护剂及其制备方法，即一种可以在2～8℃条件下长期保存仍能保持疫苗效价的冻干型家畜用疫苗的冻干保护剂配方及制备方法。

本发明的冻干保护剂，是由如下质量体积百分比浓度的物质组成的：2.4～4% NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、20～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%水解明胶；余量为水。

上述的冻干保护剂还加入了青霉素和链霉素，其终浓度分别为青霉素100IU/ml，链霉素80μg/ml。

本发明的冻干冻干保护剂，其制备方法如下：

1）首先称取NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖和水解乳蛋白，溶解后过滤除菌制成过滤液；

2）称取水解明胶加入到沸水中，搅拌至完全溶解，高压灭菌制成明胶溶液；

3）将步骤1）制备的过滤液和步骤2）的明胶溶液混合后，制成冻干保护剂。

其中步骤1）的过滤除菌是用0.22μm滤膜过滤除菌。

本发明的冻干保护剂采用的原料成本低，操作简单，可以大规模生产，疫苗在2～8℃条件下保存24个月后，疫苗效价均≥10^5.7TCID₅₀/头份（国标），从而有效的延长了疫苗的保存期限。

具体实施方式

在疫苗的冻干保护剂制备领域中，保护剂组分的选择及配比对疫苗的保存效果具有重要的影响。申请人对本发明冻干保护剂的组分进行了长期的研究，并优化了彼此间的配比浓度，从而使各组分之间具有最大的复配效果。

对于本发明冻干保护剂所使用的组分描述如下：

1、NZ胺（NZ amine casein hydrolysate），又称为酪蛋白的酶促水解物；

2、谷氨酸单钾盐：是一种表面活性剂，可降低界面的张力，在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂作用。

3、水解乳蛋白又称水解乳清蛋白，是蛋白酶水解浓缩乳清蛋白或乳白蛋白的产物，含足量的必须氨基酸。

4、蔗糖具有渗透作用，能抑制有害微生物生长，延长产品保藏期，具有很好的水溶性。可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，可防止活性组分变性。

5、水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为-12℃，对微生物有保护作用，可促进其升华形成冻干骨架阻断热传导和热辐射，能防止有效物质随水蒸气一起升华飞散并使之成形。对微生物的保护作用高出普通明胶10％以上。

上述的组分可以选购自市场上出售的产品，例如，NZ-胺购自SIGMA公司，谷氨酸单钾盐购自SIGMA，水解乳蛋白购自GIBCO，蔗糖购自德国默克，明胶购自SIGMA。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

冻干冻干保护剂的配方及配制方法：分A液和B液两部分。

1）A液配制： 取NZ胺3g、谷氨酸单钾盐0.375g、蔗糖25g、水解乳蛋白1.875g，将以上成分按顺序溶于100ml注射用水中，充分溶解后摇匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，2～8℃保存备用。

2）B液配制：取水水解明胶20g，用70～80℃的注射用水100ml充分溶解后，121℃、15磅高压灭菌30分钟，灭菌后保存在37℃。

3）将A液与B液按4：1的比例进行配比，混合均匀即为冻干冻干保护剂，其中各组分的质量体积百分比浓度如下： 2.4% NZ-胺、0.3%谷氨酸单钾盐、20%蔗糖、1.5%水解乳蛋白、4%水解明胶。

制备使用本发明冻干保护剂的疫苗

1、猪乙型脑炎病毒液的制备

①BHK-21细胞的复苏、培养：从液氮中取出冻存的BHK-21细胞(购自美国ATCC细胞库)冻存管，迅速放在37℃水浴中使其快速融化。将每个冻存管中的细胞转移至盛有5ml细胞生长液的离心管中，500r/min离心5分钟，弃去上清液，用10ml细胞生长液（含10%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素的MEM营养液）重悬细胞，将细胞移入一次性进口细胞培养瓶中吹打均匀，置37℃、5%CO2培养箱中静止培养。48～72小时形成良好单层后，弃去生长液，用PBS洗细胞面2次，用细胞消化液（0.25%胰酶-0.02%EDTA）将细胞消化下来，待细胞面出现针尖大小的缝隙时，吸弃细胞消化液，轻拍细胞瓶，细胞沿瓶壁均与脱落，此时用吸管吸取细胞生长液，轻轻吹打分散细胞，使细胞分散为单个细胞，将分散的细胞悬液按1：3～1：4的比例进行扩大培养。

②病毒的增殖：当细胞长满瓶壁的80%～90%时，将猪乙型脑炎病毒接种到细胞单层上，补足细胞维持液（MEM营养液中含2%小牛血清，100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素，pH7.4～7.6）置35℃～36℃培养，每天观察细胞病变，待细胞病变达到75%～80%时，收获猪乙型脑炎病毒培养液，-20℃冷库中保存备用。

2、将收获的乙脑病毒经无菌检验和病毒含量测定，合格的病毒液与制备的保护剂按体积比4：1的比例进行混合，按比例加入青、链霉素，使其终浓度分别为青霉素100IU/ml、链霉素80ug/ml，充分摇匀，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3、将分装好的病毒液装入冻干机箱内，选取预冻温度为-50℃、预冻时低温保持时间为2h、预冻前期控制在-15℃，待产品释放解吸热后快速冷冻：升华阶段产品温度为-33℃、板层温度设定为-8℃、升华时间为11h；解吸温度为26℃、解吸时间为4h,冻干全过程为24h，加塞出箱，得到冻干型猪乙型脑炎活疫苗。

实施例2

1、冻干冻干保护剂的配方及配制方法：分A液和B液两部分。

1）A液配制： NZ-胺4wt%、谷氨酸单钾盐 0.5 wt%、蔗糖 25 wt%、水解乳蛋白2.5 wt%（wt表示重量体积比g/ml）；将以上成分按顺序加入到注射用水中，充分溶解后摇匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，2～8℃保存备用。

2）B液配制：水解明胶6 wt%，用70～80℃的注射用水充分溶解后，121℃、15磅高压30分钟，灭菌后保存在37℃。

3）将A液与B液按1:1的比例进行配比，混合均匀后即可作为冻干保护剂。

2、疫苗的制备

1）、猪乙型脑炎病毒经培养后，进行无菌检验和病毒含量测定，将合格的病毒液和本实施例配制好的冻干保护剂按4：1的比例混合后，按比例加入青、链霉素，使其终浓度分别为青霉素100IU/ml、链霉素80ug/ml，充分摇匀，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥。

2）、将分装好的病毒液装入冻干机箱内，选取预冻温度为-45℃、预冻时低温保持时间为3h、预冻前期控制在-18℃，待产品释放解吸热后快速冷冻：升华阶段产品温度为-35℃、板层温度设定为-10℃、升华时间为12h；解吸温度为24℃、解吸时间为3h,冻干全过程为24h，加塞出箱，得到冻干型猪乙型脑炎活疫苗。

实施例制备的冻干产品的各项指标测试

1、冻干前后病毒含量测定  将成品疫苗用细胞维持液稀释至10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度（实施例1-3疫苗组），分别接种已长成单层的BHK-21细胞96孔细胞板，每个稀释度接种6孔， 每孔0.1ml，在含5%CO₂、37℃条件下培养箱培养5～7日，用Reed-Muench法计算TCID₅₀，每头份病毒含量应≥10^5.7TCID₅₀，同时与对照组病毒含量作比较，结果见表1。

表1：冻干冻干保护剂活疫苗冻干前后病毒含量（TCID5₀/头份）变化

组别	冻干前	冻干后
			实施例1疫苗组	107.9	107.7
实施例2疫苗组	108.1	107.9
			实施例3疫苗组	108.0	107.8
常规疫苗对照组	108.0	107.6

由表1可见，采用本发明冻干保护剂制备的猪乙型脑炎活疫苗冻干前后病毒含量损失少，不超过0.2个滴度；而用牛奶蔗糖冻干的常规疫苗病毒含量损失较大，为0.4个滴度。说明本发明冻干保护剂较常规保护剂对乙脑病毒有更好的保护作用。

2、疫苗保存期试验  将三个实施例中制备的疫苗连同常规疫苗分别放置-15℃、2～8℃、37℃条件下保存，定期取出几瓶，测定其性状、真空度、剩余水分和病毒含量，详细结果见表2。

表2 ：冻干样品37℃保存下时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

表3：冻干样品2～8℃保存下时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

表4 ：冻干样品-15℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

从以上试验结果可以看出，本发明的冻干冻干保护剂对猪乙型脑炎病毒有很好的保护作用，从性状、剩余水分、真空度和效价几个方面保护效果明显优于用普通保护剂冻干的常规疫苗。

3、免疫持续期和抗体消长规律检测

3.1  母猪免疫持续期和抗体消长规律检测  用6~7月龄健康易感后备母猪10，随机分成2组，每组5头，分别肌肉注射保存于2～8℃24个月的本发明冻干保护剂疫苗和对照组常规疫苗，每头猪肌肉注射疫苗1ml （含1头份），分别于免疫后2周、3周、4周、以及2个月、4个月、6个月、7个月各采一组血液分离血清，用血清中和试验测定中和抗体效价，进行免疫持续期及抗体消长规律检测。

试验结果：本发明实施例2制备的疫苗免疫健康易感后备母猪，2周后血清抗体2/5阳性（中和指数≥10），4周抗体全部阳性，至7个月抗体阳性率仍为5/5；而常规疫苗对照组血清抗体免后4周只有1/5为阳性，至7个月时阳性率为0/5。结果详见表5。

表5 ：两种疫苗接种母猪免疫持续期试验结果

注：当中和抗体≥10时，抗体呈阳性；当中和抗体<10时，为阴性，记为0。

3.2  仔猪免疫持续期和抗体消长规律检测  用28～35日龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头，分别肌肉注射保存于2～8℃24个月的本发明冻干保护剂疫苗和对照组常规疫苗，每头猪肌肉注射疫苗1ml （含1头份），分别于免疫后2周、3周、4周、2、4、6、7个月各采一组血液分离血清，用血清中和试验测定中和抗体效价，进行免疫持续期及抗体消长规律检测。

试验结果  用本发明实施例2疫苗免疫健康易感仔猪，2周后血清抗体1/5阳性（中和指数≥10），3周3/5抗体阳性，4周5/5抗体阳性，至7个月抗体阳性率仍为5/5；而常规疫苗对照组血清抗体3周仅1/5阳性，至7月阳性率仅为1/5。结果详见表6。

表6  两种疫苗接种仔猪的免疫持续期试验结果

注：当中和抗体≥10时，抗体呈阳性；当中和抗体<10时，为阴性，记为0。

试验结果表明，本发明冻干保护剂疫苗在2～8℃条件下保存24个月，疫苗仍有很好的免疫原性，免疫效果确实，抗体产生快，抗体阳性率高，母猪和仔猪免后4周即可100%产生抗体，免疫持续期长，抗体持续长达7个月之久，免疫效果明显优于常规疫苗对照组。

4、后备母猪攻毒保护试验  用6~7月龄健康易感后备母猪10头，随机分成2组，每组5头，每头肌肉注射1ml。28日后配种并采血，分离血清，用血清中和试验测定血清抗体。怀孕30~45日后，每头猪肌肉注射乙脑强毒P3株 2ml，观察直至分娩。攻毒后7、14日采血，检测乙脑病毒。分娩时记录所产健仔数和异常仔数（弱仔数、死胎和木乃伊胎），每头异常仔采脐带血或组织，PCR检测乙脑病毒。以每头母猪所产仔猪至少有1头乙脑病毒阳性，判该母猪发病。结果详见表7。

表7  两种疫苗初产母猪攻毒保护试验结果

 试验结果表明，本发明冻干保护剂疫苗在2～8℃条件下保存24个月，免疫猪100%能产生很高的抗体水平，免疫猪能很好地抵抗强毒的攻击；而常规疫苗对照组在2～8℃条件下保存24个月，免疫效果差，只有20%猪产生抗体并能抵抗强毒的攻击。该试验说明本发明冻干保护剂冻干的疫苗免疫效果明显优于常规疫苗对照组。

综上所述，本发明冻干保护剂对病毒的保护效果明显高于普通冻干保护剂。

Claims (6)

1.一种疫苗的冻干保护剂，所述的冻干保护剂的组分包含有NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖、水解乳蛋白和明胶。

2.如权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，由如下浓度的物质组成的：2.4～4% NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、20～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%明胶；余量为水。

3.权利要求1或2所述的冻干保护剂中加入青霉素和链霉素，其终浓度分别为青霉素100IU/ml，链霉素80μg/ml。

4.权利要求1或2所述的冻干保护剂，其制备方法如下：

1）首先称取NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖和水解乳蛋白，溶解后过滤除菌制成过滤液；

2）称取明胶加入到沸水中，搅拌直至完全溶解，高压灭菌制成明胶溶液；

3）将步骤1）制备的过滤液和步骤2）的明胶溶液混合后，制成冻干保护剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1）的过滤除菌是用0.22μm滤膜过滤除菌。

6.权利要求1所述的冻干保护剂在制备疫苗中的应用。