CN103340849A - 柚皮素在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柚皮素的药物新用途。本发明所公开的新用途是柚皮素在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。所述产品包括药物和/或保健品。本发明采用两种与临床相关的腹主动脉瘤疾病模型：血管紧张素II(1000ng/kg/min)皮下埋泵诱导ApoE基因敲除小鼠和磷酸钙(0.5M)涂抹腹主动脉局部诱导的C57小鼠腹主动脉瘤。实验证明，将柚皮素口服灌胃，能明显抑制CaPO4涂抹和AngII埋泵诱导的小鼠腹主动脉瘤的发生发展，可用于治疗腹主动脉瘤的病人。

Description

柚皮素在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物中的应用
技术领域
本发明涉及柚皮素在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。
背景技术
腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm，AAA)是一种高致死性的心血管疾病。它是指腹主动脉壁的永久扩张，如果管壁扩张大于临近部位直径的50％，或者直径超过3cm，就可以认为患有腹主动脉瘤(Johnston KW， Rutherford RB，Tilson MD，Shah DM，Hollier L，Stanley JC.Suggested standards for reporting on Subcommittee on ReportingStandards for Arterial Aneurysms，Ad Hoc Committee on Reporting Standards，Society forVascular Surgery and North American Chapter，International Society for CardiovascularSurgery.J Vasc Surg.1991；13(3)：452-458)。瘤体一旦破裂，病人将因大量大血而死亡，因此腹主动脉瘤又被称为“人体内的定时炸弹”。此病常见于老年人，尤其是男性，随着年龄的增长发病率逐渐上升，可高达8-10％，致死率更是达到了50％-80％。在美国，由腹主动脉瘤破裂导致的死亡分别排在所有死亡原因的第十五位和成年男性疾病死亡原因的第十位。而在中国，近30年以来，其发病率迅速上升了3倍，但是关于该病的发病机制和危险因素至今尚不十分清楚，因此也缺乏早期预防、早期预警和药物防治的有效方法。自从1951年DuBost首次成功地实施了腹主动脉瘤切除术和人造血管移植术后(DuBost C，Allary M，Oeconomos N.Resection of an aneurysm of the abdominalaorta：reestablishment of the continuity by a preserved human arterial graft，with result afterfive months.AMA Arch Surg.1952Mar；64(3)：405-8)，随着技术的不断发展和改进，血管修补术已经在世界范围内被广泛地接受和使用，成为了目前治疗腹主动脉瘤最为常见的方法。但是，手术的缺点也很多，譬如风险大，费用高，不能治本，难以普及。且对于小动脉瘤(small abdominal aortic aneurysm)的患者，即瘤体直径小于5.5cm时，瘤体破裂的风险可能小于手术的风险。可是目前没有有效的药物能够防治腹主动脉瘤，因此寻找治疗腹主动脉瘤的防治方法成为现在心血管研究的一个重点和热点。
研究显示腹主动脉瘤的发病机制主要是由于血管壁的氧自由基(Reactive OxygenSpecies，ROS)升高、炎症细胞的浸润和炎症因子的释放增多、基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase，MMP)的活性升高，使血管壁的炎症反应和基质的降解显著性地增加，从而导致腹主动脉瘤的发生(Daugherty A，Cassis LA.Mouse models of abdominalaortic aneurysms.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004Mar；24(3)：429-34)。这就提示如果使用抑制血管炎症反应或减少基质的降解的药物，就可能减轻或治疗腹主动脉瘤的发生发展。目前，尚缺乏明确的大规模临床随机对照研究支持的药物治疗方案。但曾有一些药物用于治疗腹主动脉瘤的小规模临床试验，如他汀类药物(Schouten D et al.Statins are Associated with a Reduced Infrarenal Abdominal Aortic Aneurysm Growth.EurJ Vasc Endovasc Surg.200632，21-26.)，大环内酯类抗菌素(Vammen S et al.Randomizeddouble-blind controlled trial of roxithromycin for prevention of abdominal aortic aneurysmexpansion.Br J Surg200188(8)：1066-1072)，β肾上腺素受体阻断剂(Gregory R et al.Abdominal aortic aneurysm expansion rate：Effect of size and beta-adrenergic blockade.JVasc Surg.1994Apr；19(4)：727-31)和强力霉素(Mosorin M et al.Use of doxycycline todecrease the growth rate of abdominal aortic aneurysms：a randomized，double-blind，placebo-controlled pilot study.J Vasc Surg200134(4)：606-610)等，都对患有腹主动脉瘤的病人有一定的治疗作用。此外，前列腺素合成酶的抑制剂(Walton LJ etal.Inhibition of prostaglandin E2synthesis in abdominal aortic aneurysms：implications forsmooth muscle cell viability，inflammatory processes，and the expansion of abdominalaortic aneurysms.Circulation.1999100(1)：48-54)和抗炎药吲哚美辛(Holmes DR et al.Indomethacin prevents elastase-induced abdominal aortic aneurysms in the rat.J Surg Res.1996Jun；63(1)：305-9.)也在诱导腹主动脉瘤的动物模型中取得了一定的效果。这些药物大多都能降低血管的炎症反应，或是抑制金属蛋白酶的活性，从而发挥作用。但是，有的药物在应用于临床试验时，产生了较为频发的副作用，如强力霉素(Baxter BT etal.Prolonged administration of doxycycline in patients with small asymptomatic abdominalaortic aneurysms：report of a prospective(Phase II)multicenter study.J Vasc Surg.2002Jul；36(1)：1-12)。如果能开发副作用更小的新药用于治疗腹主动脉瘤，将会具有更大的临床应用价值。
柚皮素是一种天然的黄酮类化合物，在柚子皮、橘子皮和土豆皮等橘柑类植物和中药中的黄酮类化合物中，如胡柚皮、桑黄、华中冬青等高表达。在动物实验中，已有报道，柚皮素能够降低血脂、减少血清中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL-C)的水平，从而减少动脉粥样硬化的发生和发展(Mulvihill E，Assini J，Sutherland B，DiMattia A，Khami M，Koppes J，Sawyez C，Whitman S，Huff M.in High-Fat-FedLow-Density Lipoprotein Receptor-Null Mice Naringenin Decreases Progression ofAtherosclerosis by Improving Dyslipidemia.Arterioscler Thromb Vasc Biol2010，30：742-748)。它还能调节免疫功能和抑制肿瘤生长(Lou C，Zhang F，Yang M，Zhao J，Zeng W，Fang X，Zhang Y，Zhang C，Liang W.Naringenin Decreases Invasiveness andMetastasis by Inhibiting TGF-β-Induced Epithelial to Mesenchymal Transition in PancreaticCancer Cells.PLoS ONE2012；7(12).)。此外，柚皮素也能在动物模型中治疗胰岛素抵抗和II型糖尿病(Mulvihill EE，Allister EM，Sutherland BG，Telford DE，Sawyez CG，Edwards JY，Markle JM，Hegele RA，Huff MW.Naringenin prevents dyslipidemia，apolipoprotein B overproduction，and hyperinsulinemia in LDL receptor-null mice withdiet-induced insulin resistance.Diabetes.2009；58(10)：2198-210)和肝病(Morcos PN，Brennan B，Smith PF.A grapefruit a day for patients infected with hepatitis C Hepatology.2008Jun；47(6)：2141-2)。但是，柚皮素在防治腹主动脉瘤发生方面的应用，还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供柚皮素的药物新应用。
本发明所提供的柚皮素的应用是它们在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。所述产品包括药物和/或保健品。
更进一步的所述柚皮素的应用还可包括下述至少一种：
1)在制备抑制腹主动脉弹力板破裂的药物中的应用；
2)在制备抑制腹主动脉血管壁炎症细胞的浸润的药物中的应用；所述炎症细胞可为巨噬细胞和/或白细胞；
3)在制备抑制血浆中IL-6和MCP-1的水平的药物中的应用；
4)在制备抑制腹主动脉血管壁中炎症因子表达的药物中的应用；所述炎症因子可为白介素IL-6和/或单核细胞趋化因子MCP-1；
5)在制备抑制腹主动脉血管壁基质金属蛋白酶的活性与表达的药物中的应用。
以柚皮素为活性成分制备的预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物也属于本发明的保护范围。
所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明采用两种与临床相关的腹主动脉瘤疾病模型：血管紧张素II(AngiotensinII)(1000ng/kg/min)皮下埋泵诱导ApoE基因敲除小鼠；和磷酸钙(0.5M)涂抹腹主动脉局部诱导的C57小鼠腹主动脉瘤。实验证明，将柚皮素口服灌胃，能明显抑制CaPO4涂抹和AngII埋泵诱导的小鼠腹主动脉瘤的发生发展，可能应用于治疗腹主动脉瘤的病人。
本发明提供的预防和/或治疗腹主动脉瘤的药品安全低毒，药理作用较强；其原料来源丰富、广泛、价廉，可以由柚皮苷(Naringin)粗品或者单体通过水解的方法得到，或者从含柚皮素的各种药材中提取得到，或者通过其他化学方法合成得到；治本成本低廉、工艺简单、得率高；且疗效确切，有效剂量低。本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究腹主动脉瘤疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为柚皮素(NGN)灌胃减少CaPO4涂抹肾下动脉的C57BL/6J小鼠腹主动脉瘤发生的血管照片，强力霉素(Dox)作为动物实验的阳性对照。
图2为柚皮素(NGN)灌胃减少CaPO4涂抹肾下动脉的C57BL/6J小鼠腹主动脉瘤的严重程度，强力霉素作为动物实验的阳性对照；
A为组织学染色鉴定NaCl涂抹喂水、CaPO4涂抹喂水、柚皮素或强力霉素的C57BL/6J小鼠肾下动脉直径及其统计情况；
B为组织学染色鉴定NaCl涂抹喂水、CaPO4涂抹喂水、柚皮素或强力霉素的C57BL/6J小鼠肾下动脉弹力板破裂程度及统计情况。
图3为柚皮素或强力霉素减少CaPO4涂抹的C57BL/6J小鼠肾下动脉血管的炎症反应；
A为免疫组化鉴定柚皮素或强力霉素灌胃减少C57BL/6J小鼠肾下动脉血管壁中炎症细胞(巨噬细胞和白细胞)的浸润；
B为免疫组化鉴定柚皮素或强力霉素灌胃减少C57BL/6J小鼠肾下动脉血管壁中炎症因子(白介素IL-6/单核细胞趋化因子MCP-1)的表达。
图4为柚皮素或强力霉素抑制磷酸钙涂抹的C57BL/6J小鼠肾下动脉血管壁基质金属蛋白酶的活性与表达；
A为原位酶谱方法验证柚皮素或强力霉素抑制CaPO4诱导的基质金属蛋白酶MMP的活性；
B为明胶酶谱方法验证柚皮素或强力霉素抑制CaPO4诱导的MMP2和MMP9的活性。
图5为柚皮素灌胃减少由血管紧张素II诱导的ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤的发生；
A为柚皮素灌胃的ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤发生情况的血管照片；
B为柚皮素灌胃的ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤发病率的统计。
图6为柚皮素灌胃减少血管紧张素II诱导的ApoE-/-小鼠主动脉瘤的严重程度；
A为组织学染色鉴定柚皮素或水灌胃的小鼠肾上主动脉最大直径及其统计；
B为组织学染色鉴定柚皮素或水喂养的小鼠肾上主动脉弹力板破裂程度及其统计。
图7为柚皮素灌胃减少血管紧张素II诱导的ApoE-/-小鼠肾上动脉血管壁的炎症程度；
A为免疫组化鉴定柚皮素灌胃减少血管紧张素II诱导的ApoE-/-小鼠小鼠血管壁中炎症细胞的浸润；
B为柚皮素灌胃减少血管紧张素II诱导的ApoE-/-小鼠血浆中炎症因子的表达；
C为柚皮素灌胃减少小鼠血管壁中炎症因子的释放。
图8为柚皮素灌胃减少血管紧张素II诱导的ApoE-/-小鼠肾上动脉血管壁中基质金属蛋白酶的活性；
A为原位酶谱方法验证柚皮素抑制血管紧张素II诱导的基质金属蛋白酶的活性；
B为明胶酶谱方法验证柚皮素抑制血管紧张素II诱导的MMP2和MMP9的活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、柚皮素灌胃减少CaPO4涂抹肾下动脉的C57BL/6J小鼠腹主动脉瘤发生
1、CaPO4涂抹小鼠肾下主动脉诱导腹主动脉瘤的模型
12周龄的雄性C57BL/6J的小鼠，腹腔注射0.1％的戊巴比妥钠(按照体重注射，6-7μl/g)麻醉。分离肾下腹主动脉，将浸泡在0.5M CaCl2溶液中的纱布(1cm宽×3cm长)包裹住分离好的肾下腹主动脉。10min后，将纱布取出，换成浸泡在PBS中的纱布包裹血管5min。CaCl2+PBS中的PO4 -3会形成CaPO4结晶，即相当于将血管涂抹CaPO4。用浸泡在NaCl中的纱布包裹血管10min后，换为PBS中的纱布5min，作为NaCl涂抹对照组。
2、柚皮素(NGN)或强力霉素(Dox)灌胃的模型
强力霉素作为阳性对照药。
术后第一天开始灌胃，每天给小鼠灌胃水、柚皮素(50mg/kg)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或强力霉素(100mg/kg)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。灌胃7天后取材。小鼠称重，并用毛细管内眦取血，6000转，10分钟离心后，取上清，测量血脂(中生北控公司购买的试剂盒)。然后小鼠用PBS灌流冲洗。分离血管，每组随机各取四只血管照相。结果如图1所示。其中，NaCl为涂抹NaCl组(n＝11)，CaPO4为涂抹CaPO4加喂水组(n＝12)，CaPO4+NGN为CaPO4涂抹加灌胃柚皮素组(n＝11)，CaPO4+Dox为CaPO4涂抹加灌胃强力霉素组(n＝11)。结果表明与NaCl涂抹组的小鼠相比，CaPO4涂抹的小鼠肾下部位血管有明显的膨出，而灌胃柚皮素或强力霉素能够减少膨出的发生率和程度。
将血管切片，H.E.染色鉴定小鼠肾下腹主动脉直径的变化情况。结果如图2A所示，与NaCl涂抹组相比，CaPO4涂抹能够明显增加小鼠肾下血管的直径(NaCl vs.CaPO4，0.77±0.06vs.1.40±0.19mm，P＜0.05)，但是每天灌药柚皮素或强力霉素能够明显减少CaPO4涂抹引起的血管扩张，而且柚皮素与强力霉素的作用效果相似(CaPO4+NGN vs.CaPO4+Dox，1.03±0.18vs.0.99±0.18mm)。图2A中的数据为平均值±标准差。
弹力板的破裂程度也是显示腹主动脉瘤严重程度的一个指标。弹力板的降解分为四个等级。第一级是指弹力板少于25％的降解，第二级是25％-50％，第三级是50％-75％，而第四级是多于75％的破裂。我们用Gomori染色鉴定小鼠肾下腹主动脉弹力板的破裂情况。结果如图2B所示，与NaCl涂抹相比，CaPO4涂抹显著性地增加小鼠肾下动脉弹力板的破裂情况，而灌胃柚皮素或强力霉素可以反转CaPO4的作用。图2B中的数据为平均值±标准差。
此外，柚皮素灌胃并不影响C57小鼠的体重和血脂水平，见表1。
表1、磷酸钙处理的C57小鼠的生化指标
在主动脉瘤的发生中，血管壁的炎症细胞浸润是很常见的特点。我们用组化染色鉴定浸润在血管壁的炎症细胞。Mac3为抗Mac3的特异性抗体进行免疫组化染色的结果，代表巨噬细胞，CD45为抗CD45的特异性抗体进行免疫组化染色的结果，代表白细胞。结果如图3A所示。CaPO4涂抹可以明显增加血管壁中巨噬细胞和白细胞在外膜的浸润，而灌胃柚皮素或强力霉素均可以降低这一效果。
IL-6和MCP-1是促炎的趋化因子/细胞因子，主要来自于血管壁。MCP-1可以通过招募白细胞，释放更多的基质金属蛋白酶来降解基质，介导了血管重塑和扩张(MacTaggart JN et al.Deletion of ccr2but not ccr5or cxcr3inhibits aortic aneurysmformation Surgery.2007；142：284-288；Ishibashi M et al.Bone marrow-derived monocytechemoattractant protein-l receptor ccr2is critical in angiotensin ii-induced acceleration ofatherosclerosis and aneurysm formation in hypercholesterolemic mice.Arterioscl thromvase biol.2004；24：e174-178)，而IL-6可以扩大MCP-1的效应来加重腹主动脉瘤的发生(Tieu BC et al.An adventitial il-6/mcpl amplification loop acceleratesmacrophage-mediated vascular inflammation leading to aortic dissection in mice.J ClinInvest.2009；119：3637-3651)。我们用组化染色鉴定血管壁上IL-6和MCP-1的表达。IL-6和MCP-1分别为抗IL-6和MCP-1特异性抗体的免疫组化结果(购自Abcam，Cambridge公司，UK)。结果如图3B所示。CaPO4涂抹可以明显增加血管壁中IL-6和MCP-1在外膜的表达，而灌胃柚皮素或强力霉素均能减少它们的表达。
腹主动脉瘤的发病机制之一就是基质金属蛋白酶的激活，活性升高，能显著增加基质的降解，从而导致腹主动脉瘤的发生。小鼠的主动脉用PBS灌注后，新鲜的组织直接用OCT包埋，放入液氮中冷冻，然后进行连续切片。先用PBS洗3min，3次。用荧光标记的DQ-明胶-FITC底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，37℃孵育1小时。在正常情况下，底物的荧光标签是被包裹住的，因此没有荧光，当有活性的明胶酶降解了明胶之后，绿色的荧光标签便会暴露出来。片子孵育后，用PBS洗3min，3次，然后封片。用免疫荧光共聚焦显微镜照射。荧光越强，意味着基质金属蛋白酶的活性越强。原位酶谱的结果如图4A所示，CaPO4涂抹明显增加基质金属蛋白酶的活性，而灌胃柚皮素或强力霉素可以降低CaPO4涂抹所诱导的基质金属蛋白酶的活性。
3、明胶酶谱
新鲜取下的小鼠腹主动脉的肾下部位血管清理淤血，去掉脂肪和结缔组织后，将血管剪成1em的环，放入24孔板中。用无血清的0.5ml高糖培养基培养血管24小时。将培养过的上清蛋白定量后，加入不含有β-巯基乙醇的蛋白上样缓冲液，-80℃冻存。用水将明胶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)配制成10mg/ml的浓度，按照1∶10的比例加入蛋白电泳的分离胶中，使明胶的终浓度为1mg/ml。以80V的电压4℃电泳。将胶放入0.25％Trixon-100的溶液中，30分钟洗两次。然后加入孵育液中(50mM Tris，0.2M NaCl，5mM CaCl2，0.02％叠氮钠)，37℃孵育24-48小时。孵育好的胶放入考马斯亮蓝中室温染色1-2小时，分别用甲醇30％，冰醋酸10％的溶液，甲醇20％，冰醋酸10％的溶液和甲醇10％，冰醋酸5％的溶液各洗30分钟，然后以Odyssey红外荧光扫描系统分析(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)。MMP2和MMP9都是明胶酶，能够降解明胶，明胶被降解的地方为白色，其余的仍为黑色。通常情况下，MMP2和MMP9是以酶原形式存在，而当其被激活后，酶原被切割成有活性的蛋白酶，因此MMP2和MMP9均为两条白色的条带，上面的均为酶原形式，下面的为有活性的金属蛋白酶。无论是有活性的或者酶原形式的MMP2或MMP9都能降解明胶，结果如图4B所示，灌胃柚皮素或强力霉素可以反转CaPO4涂抹造成的MMP2和MMP9的升高。
实施例2、柚皮素减少由血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤的发生。
首先16周雄性的ApoE/的小鼠随机分为两组，分为对照组(n＝16)和柚皮素组(n＝15)。然后用0.1％的戊巴比妥钠麻醉，皮下埋入迷你泵(model2004，Alzet，Cupertino，CA)，泵中加入用生理盐水溶解的血管紧张素II(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，使其能够以1000ng/kg/min的剂量持续给药四周。从术后第一天起，每天给小鼠定点灌胃，对照组灌水，柚皮素组灌柚皮素(50mg/kg)。灌胃28天后取材。小鼠用尾套法使用BP-89A血压计测量血压(北京软隆生物技术有限公司)并称重。小鼠内眦取血，血浆6000转，10分钟离心后取上清，测量小鼠的血脂水平。柚皮素减少了小鼠血浆中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平，和之前的报道一致，但是它并不影响小鼠的血压和体重，见表2。
表2、血管紧张素II埋泵的ApoE敲除小鼠的生化指标
Figure BDA00003420033800081
固定并分离小鼠的主动脉。AngII组为血管紧张素II埋泵，灌水的对照组。AngII+NGN组为血管紧张素II埋泵，灌柚皮素组。每组随机各取四只血管照相。结果如图5A所示，AngII组前两只血管在肾上部位均有明显的膨出，超过临近部位血管直径的50％，形成了动脉瘤。而柚皮素喂养组只有第一只血管在肾上部位有动脉瘤的形成，其余三只均没有，说明柚皮素灌胃可以减少血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤的形成。
接着，统计了所有的小鼠主动脉瘤的发生。在血管紧张素II埋泵，灌水的对照组中，16只小鼠，其中有一只小鼠在埋泵的前七天内因主动脉夹层破裂而死亡，另有一只在埋泵一周后，因为腹主动脉瘤的破裂而死亡，其余14只小鼠中，在埋泵第28天有6只产生腹主动脉瘤，因此血管紧张素II埋泵的对照组16只小鼠中共有8只小鼠发生了动脉瘤，即主动脉瘤的发病率为50％。而在血管紧张素II埋泵，灌注柚皮素组的15只小鼠中，有一只因为主动脉瘤的破裂死亡，剩下的在埋泵28天后仅有一只发生了腹主动脉瘤，因此血管紧张素II埋泵，柚皮素灌注组的15只小鼠中，只有两只发生了动脉瘤，即主动脉瘤的发病率为13.3％。这说明柚皮素灌胃能明显减少血管紧张素II介导的小鼠主动脉瘤的发生。见表3。动脉瘤发生情况的统计情况如图5B所示。
表3、由血管紧张素II介导的灌注水/柚皮素的ApoE-/-小鼠主动脉瘤的发生情况
Figure BDA00003420033800091
实施例3、柚皮素能减少主动脉瘤的严重程度
小鼠在取材后，主动脉被4％的多聚甲醛灌注固定，从膈肌到右侧的肾动脉分支的肾上主动脉被平均分为两段，用OCT包埋后放入液氮中30秒冷冻。进行连续切片，每一切片6μm厚，300μm的间距，每只老鼠都进行连续的16张切片。用H.E.染色确定小鼠腹主动脉的直径，测量直径，并从中选出最大直径。将最大直径和临近部位的直径做比较，如果超过临近部位的50％，就认为小鼠发生了腹主动脉瘤。图6A显示的是血管紧张素II埋泵后，柚皮素或水灌注的存活的小鼠肾上腹主动脉的最大直径，每组均为11只小鼠。结果显示，喂养柚皮素后小鼠腹主动脉的最大直径明显降低。
我们用Gomori染色确定了小鼠腹主动脉的弹力板破裂情况，并进行统计。结果如图6B所示，喂养柚皮素后小鼠腹主动脉的弹力板破裂情况减少，每组检测的小鼠均为6只。图中数据为平均值±标准差。
这些都说明柚皮素灌胃能明显降低血管紧张素II介导的小鼠腹主动脉瘤的发生及严重程度。
实施例4、柚皮素喂养能降低血管紧张素II介导的小鼠血管炎症反应
1.柚皮素抑制血管壁炎症细胞的浸润
CD45、Mac3分别为以抗CD45特异性抗体和抗Mac3特异性抗体进行免疫荧光染色的结果。结果如图7A所示，与灌水的对照组相比，柚皮素灌胃可以显著性地减少炎症细胞(巨噬细胞和白细胞)在外膜的浸润。
2.柚皮素减少血浆中IL-6和MCP-1的水平
小鼠摘眼球取血，血中加入20μl肝素，在6000转，4℃离心10分钟后吸取上清。取10μl上清，加入10μl珠子，在加入10μl PE，室温孵育2小时后，用洗液洗两次，再加入200μl洗液。混匀后上流式进行分选。(其中小鼠炎症因子的流式试剂盒购自BD公司)结果如图7B所示，灌注柚皮素后，血浆中IL-6和MCP-1的水平被明显的降低了(n＝11，P＜0.05)。与此同时，抑炎因子IL-10并没有明显变化，而TNF-α和IFN-γ也都没有变化。
3.柚皮素降低血管壁IL-6和MCP-1的表达
为了阐明柚皮素降低小鼠腹主动脉血管壁炎性反应的机制，用连续切片进行IL-6和MCP-1的免疫荧光染色，来分析它们在血管壁中的分布和表达。使用confocal荧光显微镜照射，绿光显示的是IL-6或MCP-1，蓝光显示的是细胞核。结果如图7C所示，当小鼠用柚皮素灌胃后，血管壁IL-6和MCP-1的产生明显的减少了，说明了柚皮素能够减少血管壁中IL-6和MCP-1的含量。
4、柚皮素灌胃降低小鼠的金属蛋白酶的活性与表达
结果如图8A所示，用血管紧张素II灌注后，中膜和外膜的金属蛋白酶的活性很强，而柚皮素喂养后，有活性的金属蛋白酶明显减少。
结果如图8B所示，用柚皮素喂养后，MMP9的酶原形式显著的减少，也就是说柚皮素抑制了MMP9的合成，但同时MMP9的活性形式和MMP2均没有明显的变化。

Claims (6)

1.柚皮素在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物和/或保健品。
3.柚皮素在制备下述产品中的应用：
1)在制备抑制腹主动脉弹力板破裂的药物中的应用；
2)在制备抑制腹主动脉血管壁炎症细胞的浸润的药物中的应用；所述炎症细胞可为巨噬细胞和/或白细胞；
3)在制备抑制血浆中白介素IL-6和/或单核细胞趋化因子MCP-1的水平的药物中的应用；
4)在制备抑制腹主动脉血管壁中炎症因子表达的药物中的应用；
5)在制备抑制腹主动脉血管壁基质金属蛋白酶的活性与表达的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述炎症因子为白介素IL-6和/或单核细胞趋化因子MCP-1。
5.一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的产品，其活性成分为柚皮素。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述产品为药物和/或保健品。
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