CN103335969B - 一种17-羟皮质类固醇的比色测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种17-羟皮质类固醇的比色测定方法，属于临床检验领域，所述方法包括：去除受检尿液颜色：受检尿液预处理：在受检尿液中加入色素吸附剂，所述色素吸附剂的加入量为0.1-0.7g/ml尿液,然后振摇、分离，留取清液用于制备所述受检尿液的测定样，所述色素吸附剂在所述受检尿液中的停留时间为4-12min；采用分光光度法测定吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量。本发明不含三氯甲烷、氯仿等有毒试剂，操作过程安全可靠，无需使用无水硫酸铵及无水硫酸钠，节约试剂；用受检尿液制备备用试液的步骤简单易操作，大大节省了测定时间。

Description

一种17-羟皮质类固醇的比色测定方法

技术领域

本发明属于临床检验领域，特别是涉及一种尿液中17-羟皮质类固醇的比色测定方法。

背景技术

17-羟皮质类固醇为尿中由肾上腺皮质所分泌的激素及其代谢产物，主要有皮质醇、四氢皮质醇、皮质素、四氢皮质素等。17-羟皮质类固醇含量可以反映肾上腺皮质分泌皮质醇的情况，有助于某些内分泌疾病的诊断。

目前常用的17-羟皮质类固醇的检测方法为比色测定法。该方法原理为：在酸性条件下，尿液中的17-羟皮质类固醇与盐酸苯肼作用，生成黄色苯肼衍生物，此结果减去硫酸与其它非17-羟皮质类固醇显色物所产生的空白颜色，与标准液同样处理比色即可求其含量。该方法检测步骤包括：（1）采集受检尿液；(2)抽提17-羟皮质类固醇样品；（3）制备比色测定试样；(4)进行显色反应；（5）比色，读取吸光度，根据吸光度计算17-羟皮质类固醇含量。

上述检测方法中需用到三氯甲烷--正丁醇混合液进行抽提，该试剂具有麻醉作用及刺激性，是可疑致癌物，并且在光的作用下能被空气中的氧氧化成氯化氢和有剧毒的光气，给操作人员及环境带来危害。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种临床检验标本的降粘方法。所述技术方案如下：

提供了一种17-羟皮质类固醇的比色测定方法，所述方法包括：

在受检尿液中加入色素吸附剂，所述色素吸附剂的加入量为0.1-0.7g/ml尿液,然后振摇、分离，留取清液用于制备所述受检尿液的测定样，所述色素吸附剂在所述受检尿液中的停留时间为4-12min；采用分光光度法测定吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量。优选，所述的色素吸附剂为丙烯酸系树脂。

具体的，收集受检者24h尿液，向所述尿液中加入5-10ml浓盐酸，得所述的受检尿液。

具体的，所述方法包括：受检尿液预处理：取5ml受检尿液放入10ml具塞器皿中，加入0.1ml质量分数为56%的硫酸溶液，混匀，然后加入1g色素吸附剂，振摇3min，在3000r/min下离心5min，留取上清液用于制备所述受检尿液的测定样；制备所述测定样及其他比色测定所需试样；对所述测定样和其他所述试样进行显色反应；测定所述测定样和其他所述试样的吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量。

具体的，所述的测定样，由1ml所述上清液、1ml无水乙醇及2ml质量分数为56%的硫酸溶液组成；所述的其他比色测定所需试样，包括：空白样，由1ml蒸馏水、1ml无水乙醇及2ml质量分数为56%的硫酸溶液组成；试剂空白样，由1ml蒸馏水、1ml无水乙醇及2ml盐酸苯肼硫酸液组成；标准样，由0.05ml氢化可的松标准品、1ml蒸馏水、1ml无水乙醇及2ml盐酸苯肼硫酸液组成；以及测定空白样，由1ml所述上清液、1ml无水乙醇及2ml质量分数为56%的硫酸溶液组成。

具体的，所述的盐酸苯肼硫酸液，其制备方法包括：称取盐酸苯肼65mg，溶于100ml质量分数为56%的硫酸溶液中，加入氯化钠2g即得。

进一步的，所述的盐酸苯肼通过以下方法精制而成：称取分析纯盐酸苯肼10g，放入400ml无水乙醇中，隔水加热至溶解，得混合溶液；将所述混合溶液冷却至室温后置冰箱冷藏室内1-2小时，析出结晶；用布氏漏斗过滤出所述结晶，将滤液重新放回冰箱冷藏室重复上述结晶、过滤步骤2-3次，直至无水乙醇无色，得到白色晶体；在37°C下烘干所述白色晶体，并保存于棕色瓶中备用。

具体的，所述显色反应的条件为：56℃下温浴45min。

所述的测定所述测定样和其他所述试样的吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量，具体包括：所述测定样和其他所述试样显色后冷却至室温，取适量试液在410nm波长下进行比色，读取吸光度。

进一步的，受检者在收集尿液的前三天不使用改变体内17-羟皮质类固醇含量的药物及影响显色的药物。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

不含三氯甲烷、氯仿等有毒试剂，操作过程安全可靠，无需使用无水硫酸铵及无水硫酸钠，节约试剂；

用受检尿液制备备用试液的步骤简单易操作，大大节省了测定时间。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

提供了一种17-羟皮质类固醇的比色测定方法，具体包括以下内容：

测定所用试剂：

丙烯酸系树脂：购买自杭州天创净水环境科技股份有限公司的阴、阳离子混合树脂，其参数如下：外观：呈金黄至棕褐色球状颗粒，含量：≥98（％），颗粒尺度：0.315-0.125，有效粒径0.40-0.60mm，使用时参考指标：pH范围：1～14，最高使用温度：≤100℃；

质量分数为56%的硫酸溶液；

通过下述方法制备的盐酸苯肼硫酸液：

称取盐酸苯肼65mg，溶于100ml质量分数为56%的硫酸溶液中，加入氯化钠2g，得盐酸苯肼硫酸液，本实施例优选精制的盐酸苯肼，精制方法如下：称取分析纯盐酸苯肼10g，放入400ml无水乙醇中，隔水加热至溶解，得混合溶液；将所述混合溶液冷却至室温后置冰箱冷藏室内1-2小时，析出结晶；用布氏漏斗过滤出所述结晶，将滤液重新放回冰箱冷藏室，重复上述结晶、过滤步骤2-3次，直至无水乙醇无色，得到白色晶体；在37℃下烘干所得白色晶体，并保存于棕色瓶中备用。通过精制可以有效去除盐酸苯肼中的杂质，既避免了杂质对色素吸附剂吸附作用产生的干扰又避免了杂质对显色反应的不利影响，使测量结果更加精准；

200ug/ml的氢化可的松标准品：氢化可的松购买自天津金耀氨基酸有限公司，用无水乙醇稀释至200ug/ml；

无水乙醇：乙醇的质量分数≥99.7%。

所述方法包括以下步骤:

步骤101：采集受检尿液，具体包括：

收集受检者24h尿液，向所述尿液中加入5-10ml浓盐酸防腐，得到受检尿液；

由于17-羟皮质类固醇的测定受不少治疗药物的影响，如水合氯醛、利眠宁、奎宁、秋水仙碱等药物可使17-羟皮质类固醇增高；雌激素、避孕药等可使17-羟皮质类固醇降低。因此，为了尽可能保证测定结果的准确性，在收集24小时尿液的前三天，受检者不能使用例如上述种类的改变体内17-羟皮质类固醇含量的药物，也不能使用影响显色的药物，如中药、维生素C、维生素B2及其他影响显色的药物和激素。

步骤102：受检尿液预处理，得到备用试液，具体包括：

根据测定需要取适量所述受检尿液放入具塞容器中，然后向所述具塞容器中加入适量酸溶液调节尿液的pH值为1-2，该pH下易于显色，为防止使用过多药品对显色反应造成的不利影响，调节pH值时优选质量分数为56%的硫酸溶液，之后根据尿液的颜色深浅及具体色素吸附剂的性能等加入适量色素吸附剂，振摇几分钟除去尿液样本中的颜色；由于色素吸附剂对待检测物也具有一定的吸附作用，因而当色素吸附剂加入量过大或者色素吸附剂在尿液中的停留时间过长时，都会对测定结果产生一定的影响。经研究发现，当色素吸附剂的用量为0.1-0.7g/ml尿液，在尿液中的停留时间为4-12min时，色素吸附剂在完全吸附肌酐、尿酸、药物等含量较高的有色物质的同时几乎不吸附17-羟皮质类固醇。

本实施例中取5ml所述受检尿液放入10ml容量瓶中，向所述容量瓶中加入0.1ml质量分数为56%的硫酸溶液，摇匀，然后加入1g丙烯酸系树脂，振摇3min，然后放入离心机在3000r/min下离心5min，离心分离后留取上清液用于制备所述受检尿液的测定样；

步骤103：制备所述测定样及其他比色测定所需试样：

比色测定方法通常需要用于调零的空白样、用于定量计算待测物质含量的试剂空白样、标准样、测定空白样及受检尿液的测定样等比色测定试样，上述试样的具体制备方法如下：

取5支具塞试管，分别编号1、2、3、4、5，向1号试管中加入1ml蒸馏水、1ml无水乙醇，摇匀，再加入2ml质量分数为56%的硫酸溶液，摇匀，得到空白样；向2号试管中加入1ml蒸馏水、1ml无水乙醇，摇匀，再加入2ml盐酸苯肼硫酸液，摇匀，得到试剂空白样；向3号试管中加入0.05ml氢化可的松标准品、1ml蒸馏水、1ml无水乙醇，摇匀，再加入2ml盐酸苯肼硫酸液，摇匀，得到标准样；向4号试管中加入1ml所述上清液、1ml无水乙醇，摇匀，再加入2ml质量分数为56%的硫酸溶液，摇匀，得到测定空白样；向5号试管中加入1ml所述上清液、1ml无水乙醇，摇匀，再加入2ml质量分数为56%的硫酸溶液，摇匀，得到受检尿液的测定样。

步骤104：对所述测定样和其他所述试样进行显色反应，具体为：

显色反应的温度一般为56℃-60℃及显色时间通常为25-45分钟。本实施例中将1-5号具塞试管置于水浴中，于56℃下温浴45min显色。

步骤105：测定所述测定样和其他所述试样的吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量，具体包括：

所述测定样和其他所述试样显色后冷却至室温，取适量试液，用722型可见分光光度计测定其吸光度，测定时用空白样调零，在410nm波长下进行比色，读取吸光度，计算17-羟皮质类固醇含量。本实施例中计算24h17-羟皮质类固醇的量，具体计算公式如下：

M=（A-A1-A2）/（A3-A2）*200*0.05*n/1000；

其中各字母示意如下：

M：24h17-羟皮质类固醇的质量，单位mg/24h；A：测试样吸光度；A1：测定空白样吸光度；A2：测定空白样吸光度；A3为标准样吸光度；n=24小时尿液体积ml/1ml。

对比例

传统17-羟皮质类固醇的比色测定方法，具体包括以下内容：

所用试剂：

质量分数为56%的硫酸溶液；

通过下述方法制备的盐酸苯肼硫酸液：称取精制的盐酸苯肼65mg，溶于100ml质量分数为56%的硫酸溶液中，加入氯化钠2g；

200ug/ml的氢化可的松标准品：氢化可的松购买自天津金耀氨基酸有限公司，用无水乙醇稀释至200ug/ml；

无水乙醇，分析纯；

正丁醇，分析纯；

氯仿，分析纯；

无水硫酸铵，分析纯；

无水硫酸钠，分析纯。

所用仪器：

离心机，水浴锅及722型可见分光光度计。

所述方法包括以下步骤:

步骤101’:与实施例1中的步骤101相同；

步骤102’:抽提17-羟皮质类固醇，得到备用试液，具体包括以下步骤：

a:取3ml受检尿液于带塞三角烧瓶内，向所述三角烧瓶内加入质量分数为56%的硫酸0.1ml，混匀，然后向所述三角烧瓶内加无水硫酸铵2.5g，振摇溶解；

b：按照正丁醇：氯仿的体积比为1:12分别量取正丁醇和氯仿，混合制成抽提剂；

c：向所述三角烧瓶内加入所述抽提剂21ml，加塞振摇3分钟，放置数分钟，待分层后，将下层液体全部吸出于另一支不带塞的三角烧瓶内；

d：向所述的不带塞的三角烧瓶内加入无水硫酸钠2g，轻摇脱水，将透明液体吸出用于制备所述受检尿液的测定样；

步骤103’：制备所述测定样和其他所述试样，具体包括：

取5支具塞试管，分别编号1、2、3、4、5，向1号试管中加入7ml抽提剂，4ml56%硫酸液，得到空白样；向2号试管中加入7ml抽提剂，4ml盐酸苯肼硫酸液，得到试剂空白样；向3号试管中200ug/ml的氢化可的松0.05ml，7ml抽提剂，4ml盐酸苯肼硫酸液，得到标准样；向4号试管中7ml尿抽提液，4ml56%硫酸液，得到测定空白样；向5号试管中加入7ml尿抽提液，4ml盐酸苯肼硫酸液，得到受检尿液的测定样。

步骤104’：与实施例1相同；

步骤105’：与实施例1相同。

用实施例1和对比例提供的方法，分别对9位受检者进行24h17-羟皮质类固醇测定，测定结果见表1。

表1实施例1及对比例提供的两种方法的测定结果表

由表1可知，实施例1提供的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其测定结果与对比例提供的传统方法测定结果相近。

本发明实施例与对比例相比，具有以下优点：

1、不含三氯甲烷、氯仿等有毒试剂，操作过程安全可靠，无需使用无水硫酸铵及无水硫酸钠，节约试剂；

2、通过将传统的抽提备用试液改进成去除色素后直接利用上清液，大大简化了受检尿液制备成备用试液的步骤，测定方法简单易操作，大大节省了测定时间。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，所述方法包括：

受检尿液预处理：在受检尿液中加入色素吸附剂，所述色素吸附剂的加入量为0.1-0.7g/ml尿液,然后振摇、分离，留取清液用于制备所述受检尿液的测定样，所述色素吸附剂在所述受检尿液中的停留时间为4-12min；

采用分光光度法测定吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量。

2.根据权利要求1所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于：所述的色素吸附剂为丙烯酸系树脂。

3.根据权利要求1、所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，收集受检者24h尿液，向所述尿液中加入5-10ml浓盐酸，得所述的受检尿液。

4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，所述方法包括：

受检尿液预处理：取5ml受检尿液放入10ml具塞器皿中，加入0.1ml质量分数为56%的硫酸溶液，混匀，然后加入1g色素吸附剂，振摇3min，在3000r/min下离心5min，留取上清液用于制备所述受检尿液的测定样；

制备所述测定样及其他比色测定所需试样；

对所述测定样和其他所述试样进行显色反应；

测定所述测定样和其他所述试样的吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量。

5.根据权利要求4所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于：

所述的测定样，由1ml所述上清液、1ml无水乙醇及2ml质量分数为56%的硫酸溶液组成；

所述的其他比色测定所需试样，包括：

空白样，由1ml蒸馏水、1ml无水乙醇及2ml质量分数为56%的硫酸溶液组成；

试剂空白样，由1ml蒸馏水、1ml无水乙醇及2ml盐酸苯肼硫酸液组成；

标准样，由0.05ml氢化可的松标准品、1ml蒸馏水、1ml无水乙醇及2ml盐酸苯肼硫酸液组成；以及

测定空白样，由1ml所述上清液、1ml无水乙醇及2ml质量分数为56%的硫酸溶液组成。

6.根据权利要求5所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，所述的盐酸苯肼硫酸液，其制备方法包括：称取盐酸苯肼65mg，溶于100ml质量分数为56%的硫酸溶液中，加入氯化钠2g即得。

7.根据权利要求6所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，所述的盐酸苯肼通过以下方法精制而成：

称取分析纯盐酸苯肼10g，放入400ml无水乙醇中，隔水加热至溶解，得混合溶液；

将所述混合溶液冷却至室温后置冰箱冷藏室内1-2小时，析出结晶；

用布氏漏斗过滤出所述结晶，将滤液重新放回冰箱冷藏室重复上述结晶、过滤步骤2-3次，直至无水乙醇无色，得到白色晶体；

在37°C下烘干所述白色晶体，并保存于棕色瓶中备用。

8.根据权利要求5-7任一项权利要求所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，所述显色反应的条件为：56℃下温浴45min。

9.根据权利要求8所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，所述的测定所述测定样和其他所述试样的吸光度，根据所述吸光度计算17-羟皮质类固醇含量，具体包括：

所述测定样和其他所述试样显色后冷却至室温，取适量试液在410nm波长下进行比色，读取吸光度。

10.根据权利要求3所述的17-羟皮质类固醇的比色测定方法，其特征在于，受检者在收集尿液的前三天不使用改变体内17-羟皮质类固醇含量的药物及影响显色的药物。