CN103333827A - 一种处理橡胶废气菌种的筛选分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，涉及微生物菌株筛选技术领域。筛选步骤包括样品采集、增菌培养、驯化培养、菌种纯化和鉴定菌种，在驯化过程中采用固体、液体交替驯化，能够高效快速、定向分离出废气处理的菌种，分离出的菌种在处理大气量、低浓度轮胎厂废气具有显著的除臭效果，设备投入少。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌株筛选技术领域，具体是一种处理橡胶废气菌种的筛选分离方法。
背景技术
橡胶恶臭废气排放主要来自于橡胶制品过程中的硫化、炼胶等工序，废气排放量约占橡胶制品生产排放总量的60%以上。这类废气具有气量大、温度高、成分复杂、浓度低等特点，且呈恶臭味，给周边环境及车间内操作工人的身体健康造成危害。
橡胶废气的主要成分是甲苯、二甲苯等，这些恶臭污染物在橡胶制品生产过程中的排放系数都很大，因此必须对其进行严格控制。我国目前对橡胶废气采取的净化措施主要有吸收法、吸附法、燃烧法和冷凝法等。虽然这些方法有不少的优点，但也存在着很大的不足:吸收法和吸附法一般都需要对吸收剂和吸附剂进行再生，而这既增加了工艺的复杂性和设备的投资额，还使运行操作变得复杂。燃烧法还可能由于废气燃烧不完全而会产生有害的燃烧产物，若燃烧温度过高，可能会产生一氧化氮污染并且能耗大；对于催化燃烧法还有需要防止催化剂的中毒和老化问题，另外，燃烧设备运转时还存在一定的安全隐患。冷凝法要获得高回收率需要较高的压力和较低的温度，设备费用和操作费用较高，适用于高沸点和高浓度废气回收，一般与其它方法（吸附、吸收法）联合使用。这些方法对于低浓度的有机废气净化来说，净化效果不佳，而且会产生二次污染。
与常规的有机废气处理技术相比，生物法处理技术主要优点有:（1）去除效果好（2）工艺设备简单（3）投资及运行费用低，生物过滤的优势在于初期投资、操作和维护费用低。（4）安全性能好，无二次污染生物法处理反应条件温和，常温、常压和中性条件。（5）能耗少，生物过滤器能耗约1.8-2.5kw·h/1000m3，与其它气态有机物染物控制技术相比能耗低很多。综上所述，生物法处理有机废气技术具有非常突出的有点，尤其在处理大气量、低浓度(<3000mg/m3)甲苯类废气时更显示出其优越性。
生物法处理橡胶废气采用的菌种为好氧性菌种，且营养物质是甲苯和二甲苯，这种方法的主要问题是，如何获得降解甲苯和二甲苯的优势菌种，从而提高处理效率。
从混杂群体中分离特定微生物常用的方法有：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的pH、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件、对样品进行特殊处理等。常用的纯种分离方法有平板划线分离法、简单平板分离法、稀释分离、涂布分离法、毛细管分离法、显微操作单细胞分离法等。本发明采用控制分离培养基的营养成分和平板划线分离法对微生物进行筛选分离。在筛选过程中，由于甲苯、二甲苯易于挥发，采用固体培养时会减少菌落对甲苯和二甲苯的吸收，故在筛选菌落时我们采用液体、固体、液体交替选择培养。
发明内容
为解决现有技术中废气处理技术投资费用高，对低浓度废气处理效果差的不足，本发明提供一种橡胶废气菌种的筛选分离方法，该方法可有效地筛选分离出以橡胶废气为碳源的微生物菌种。
所述的处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，包括以下步骤：
（1）样品采集：用无菌取样瓶采集橡胶生产厂的底泥，放入恒温箱中待用，温度为25℃~35℃。
（2）增菌培养：在好氧条件下，向底泥中加入10g/L的葡萄糖进行恒稳培养，温度为25℃~35℃，培养时间为2~3天。
（3）驯化培养：取底泥分装到装有液体富集培养基的锥形瓶中，然后分别加入甲苯、二甲苯，甲苯、二甲苯的加入量为10mL/L~12 mL/L，在25℃~35℃温度下摇床恒温培养驯化，培养是将为3~5天。
在驯化的培养液中用接种环提取培养液，接种到固体富集培养基中培养，培养2~3天后，将固体富集培养基上长出的细菌采用影印法将其接种到以甲苯、二甲苯、甲苯和二甲苯的混合为唯一碳源的固体选择培养基上培养，培养3~5天后观察其菌落，挑取不同形态的单菌落在液体选择培养基上培养，再次进行驯化，按上述驯化方法，连续驯化2~3次后接种到固体富集培养基上。
（4）菌种纯化：在驯化好的固体富集培养基上挑取不同形态的单菌落在固体富集培养基上划线纯化，培养温度为25℃~35℃，培养时间2~3天，然后将纯化菌落接至分别以甲苯、二甲苯、甲苯和二甲苯混合为唯一碳源的固体选择培养基内进行恒温培养，培养温度为25℃~35℃，培养时间3~5天，不断地进行选择、富集培养，最终将纯化的菌落移接到斜面培养基中，从所分离的可以处理橡胶废气的菌种中，把其中的每一个菌种都采用相同的方法，平行接种于含有废气的固体培养基中，如果平行接种的菌落都能在废气中存活并处理废气，则为可选用的菌种之一，否则淘汰。
（5）鉴定菌种：用MIDI脂肪酸鉴定系统提供的萃取、鉴定方法鉴定纯化出的菌落。
所述的液体富集培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨3g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、尿素0.2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、葡萄糖15 g，调PH值为7.0。
所述的固体富集培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨3g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、尿素0.2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、葡萄糖15 g、琼脂15 g，调PH值为7.0。
所述的固体选择培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入甲苯12mL（或二甲苯12mL）、MgCl2·6H2O 3.0 g、KH2PO4 1.5 g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、NH4Cl 2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、琼脂15g、调PH值为7.0。
所述的液体选择培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入甲苯12mL（或二甲苯12mL），MgCl2·6H2O 3.0 g、KH2PO4 1. 5 g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、NH4Cl 2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g ，调PH值为7.0。
所述的斜面培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨1g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、葡萄糖 6g、琼脂15g，调PH值为7.0。
本发明的有益效果：利用本发明所述的方法能够快速、定向分离出废气处理的菌种，分离出的菌种在处理大气量、低浓度轮胎厂废气具有显著的除臭效果，设备投入少。
说明书附图
图1 本发明分离出的菌种对甲苯的处理效率图，
图2 本发明分理出的菌种对二甲苯的处理效率图。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明，可以对本发明有更进一步的了解。
1、样品采集：用无菌取样瓶采集橡胶生产厂的底泥，作标记送回实验室，放入25℃~35℃恒温箱中1小时后待用。
2、增菌培养：用曝气装置对采集的底泥进行充氧，向底泥中加入10g/L的葡萄糖进行恒稳培养，温度为25℃~35℃，培养时间为2~3天。
3、驯化培养：取1mL底泥分装到装有100ML液体富集培养基的锥形瓶中，然后分别加入甲苯、二甲苯，甲苯、二甲苯的加入量为10mL/L~12 mL/L，在25℃~35℃温度下的摇床恒温培养驯化，培养是将为3~5天。
在驯化的培养液中用接种环提取培养液，接种到固体富集培养基中培养，培养2~3天后，将固体富集培养基上长出的细菌采用影印法将其接种到以甲苯、二甲苯、甲苯和二甲苯的混合为唯一碳源的固体选择培养基上培养，培养3~5天后后观察其菌落，挑取不同形态的单菌落在液体选择培养基上培养，再次进行驯化，按上述驯化方法，连续驯化2~3次后接种到固体富集培养基上。
4、菌种纯化：在驯化好的固体富集培养基上挑取不同形态的单菌落在固体富集培养基上划线纯化，培养温度为25℃~35℃，培养时间2~3天，然后将纯化菌落接至分别以甲苯、二甲苯、甲苯和二甲苯混合为唯一碳源的固体选择培养基内进行恒温培养，培养温度为25℃~35℃，培养时间3~5天，不断地进行选择、富集培养，最终将纯化的菌落移接到斜面培养基中，并且每天观察细菌对废气的处理情况，从所分离的可以处理橡胶废气的菌种中，把其中的每一个菌种都采用相同的方法，平行接种于含有废气的固体培养基中，如果平行接种的菌落都能在废气中存活并处理废气，则为可选用的菌种之一，否则淘汰。
5、鉴定菌种：用脂肪酸鉴定系统鉴定纯化出的菌落，鉴定方法是依据MIDI脂肪酸鉴定系统提供的萃取、鉴定方法，得到的菌种应用于处理橡胶废气。
所述的液体富集培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨3g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、尿素0.2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、葡萄糖15 g，调PH值为7.0。
所述的固体富集培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨3g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、尿素0.2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、葡萄糖15 g、琼脂15 g，调PH值为7.0。
所述的固体选择培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入甲苯12mL（或二甲苯12mL）、MgCl2·6H2O 3.0 g、KH2PO4 1.5 g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、NH4Cl 2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、琼脂15g、调PH值为7.0。
所述的液体选择培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入甲苯12mL（或二甲苯12mL），MgCl2·6H2O 3.0 g、KH2PO4 1. 5 g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、NH4Cl 2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g ，调PH值为7.0。
所述的斜面培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨1g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、葡萄糖 6g、琼脂15g，调PH值为7.0。
按上述实施方式获得四种处理橡胶废气效果较好的菌种，按顺序编号为A蜡样芽孢杆菌、B缺陷假单胞菌、C巨大芽孢杆菌、D短小芽孢杆菌。
A菌落呈乳白色，不规则形状，为杆状，革兰氏染色为阳性；B菌落呈乳白色，菌落光滑，不规则形状，革兰氏染色为阴性；C菌落呈黄色，为杆状，革兰氏染色为阳性；D菌落呈微黄色，粗糙，不透明，为椭圆形，革兰氏染色为阳性。这四种菌种在好氧条件下都能以甲苯和二甲苯为碳源的培养基（其成分包括微量元素、氮源）中生长繁殖，具有降解橡胶废气的能力。
获得的这四种菌种，驯化后在培养基中存活的比例为：A菌落占43%，B菌落占35%，C菌落占15%，D菌落占7%。这4个菌种都能在30℃条件下生长良好，40℃也能生长，但超过50℃不能生长。
将四种混合菌配制成菌悬液，在25℃~35℃温度下的摇床进行培养增菌，培养2天，然后将菌悬液直接注入液体培养箱中，采用生物滴滤塔处理橡胶废气，实验结果表明复合菌种处理橡胶废气得到了较好的效果，处理结果如下：
如图1所示，当甲苯浓度为300mg/m3时，甲苯能够完全处理，当高于300mg/m3时，随着浓度的增加降解效率下降，但达到1000 mg/m3时，降解效率仍能达到95%，说明此菌种的降解效果很好。
如图2所示，此菌种对二甲苯的降解效果较好，在1000mg/m3内，对二甲苯的降解效率基本为100%。
Claims (6)
1.一种处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，其特征在于：包括以下步骤，
（1）样品采集：用无菌取样瓶采集橡胶生产厂的底泥，放入恒温箱中待用，温度为25℃~35℃；
（2）增菌培养：在好氧条件下，向底泥中加入10g/L的葡萄糖进行恒稳培养，温度为25℃~35℃，培养时间为2~3天；
（3）驯化培养：取底泥分装到装有液体富集培养基的锥形瓶中，然后分别加入甲苯、二甲苯，甲苯、二甲苯的加入量为10mL/L~12 mL/L，在25℃~35℃温度下摇床恒温培养驯化，培养是将为3~5天；
在驯化的培养液中用接种环提取培养液，接种到固体富集培养基中培养，培养2~3天后，将固体富集培养基上长出的细菌采用影印法将其接种到以甲苯、二甲苯、甲苯和二甲苯的混合为唯一碳源的固体选择培养基上培养，培养3~5天后观察其菌落，挑取不同形态的单菌落在液体选择培养基上培养，再次进行驯化，按上述驯化方法，连续驯化2~3次后接种到固体富集培养基上；
（4）菌种纯化：在驯化好的固体富集培养基上挑取不同形态的单菌落在固体富集培养基上划线纯化，培养温度为25℃~35℃，培养时间2~3天，然后将纯化菌落接至分别以甲苯、二甲苯、甲苯和二甲苯混合为唯一碳源的固体选择培养基内进行恒温培养，培养温度为25℃~35℃，培养时间3~5天，不断地进行选择、富集培养，最终将纯化的菌落移接到斜面培养基中，从所分离的可以处理橡胶废气的菌种中，把其中的每一个菌种都采用相同的方法，平行接种于含有废气的固体培养基中，如果平行接种的菌落都能在废气中存活并处理废气，则为可选用的菌种之一，否则淘汰；
（5）鉴定菌种：用MIDI脂肪酸鉴定系统提供的萃取、鉴定方法鉴定纯化出的菌落。
2.根据权利要求1所述的处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，其特征在于：所述的液体富集培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨3g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、尿素0.2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、葡萄糖15 g，调PH值为7.0。
3.根据权利要求1所述的处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，其特征在于：所述的固体富集培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨3g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、尿素0.2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、葡萄糖15 g、琼脂15 g，调PH值为7.0。
4.根据权利要求1所述的处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，其特征在于：所述的固体选择培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入甲苯12mL（或二甲苯12mL）、MgCl2·6H2O 3.0 g、KH2PO4 1.5 g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、NH4Cl 2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g 、琼脂15g、调PH值为7.0。
5.根据权利要求1所述的处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，其特征在于：所述的液体选择培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入甲苯12mL（或二甲苯12mL），MgCl2·6H2O 3.0 g、KH2PO4 1. 5 g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、NH4Cl 2g、FeSO4·7 H2O 0.002 g、MnSO4·7H2O 0.003 g、ZnSO4·7 H2O 0.003 g、CoSO4·7 H2O 0.001 g ，调PH值为7.0。
6.根据权利要求1所述的处理橡胶废气菌种的筛选分离方法，其特征在于：所述的斜面培养基的配置比例为：1000ML培养基中加入KH2PO4 1.5g、MgCl2·6H2O 3.0 g、蛋白胨1g、(NH4)2SO4 1g、NaH2PO4·3H2O 1. 0g、葡萄糖 6g、琼脂15g，调PH值为7.0。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131002 |