CN103333806A - 一种蛋白酶高产米曲霉及其产生的蛋白酶和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产蛋白酶米曲霉及其产生的蛋白酶酶系和应用，于2013年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7586，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株所产蛋白酶粗酶液对动物蛋白的水解度、小肽含量及鲜味氨基酸总量明显优于其他菌株。利用层析技术对该菌株所产蛋白酶酶系进行分离纯化，获得一种新型蛋白水解酶，其分子量约为45kDa，最适温度为45℃，最适pH为7.0，对-Glu-Ala-和-Pro-Lys-肽键有非常强的选择性，可应用于调味品制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种产蛋白酶安全菌株，特别是一种米曲霉及其产生的蛋白酶。
背景技术
蛋白酶由生物活性细胞产生，一般情况下不含有毒有害的物质，且酶解反应完成后，自身可以被灭活，故在调味品工业中有着广泛的应用。
微生物由于具有生长繁殖速度快、生长条件较简单、生化多样性广泛及其遗传可操作性等特点而成为蛋白酶的主要生产者。很多微生物都可以产生蛋白酶，用于生产调味品用蛋白酶的微生物还需考虑安全性。目前，通过各种遗传育种手段（基因工程育种、诱变育种等）已将微生物的产蛋白酶能力大大提高，但改造后菌株所产的蛋白酶作为食品添加剂在欧盟、日本等是遭到拒绝的，故食品上用蛋白酶生产菌株限于传统食品加工用的微生物和确认无害的菌株。
不同的蛋白酶作用于蛋白质肽链的不同位置，当不同的蛋白酶作用于同一底物时，会产生不同的氨基酸或小肽水解物，从而使蛋白水解物呈现不同的口味和功能特性。氨基酸由于其结构的不同而具有不同的口感，鲜味氨基酸一般包括Gly、Ala、Glu、Asp。蛋白水解不完全产生的疏水性氨基酸残基是引起苦味的主要因素，具有疏水特性的内切蛋白酶在水解过程中断开肽链内部疏水性氨基酸构成的肽键，一是可以降低肽链中疏水氨基酸的数量，二是使疏水性氨基酸暴露，有利于疏水性氨基酸的释放，能在一定程度上降低苦味。
动物蛋白水解液作为近年来出现的一种新型深加工产品，可用于生产各种香精、复合调味料、酱包等调味品，能充分提高肉类产品的附加值，也是动物蛋白开发利用和发展的一条新出路。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种蛋白酶高产米曲霉（Aspergillus oryzae ZG），于2013年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7586，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种米曲霉产生的蛋白酶，其能高效水解鸡肉蛋白产生生产小肽和鲜味氨基酸；水解鸡肉蛋白的最适作用条件，pH为7.0，温度为45℃，底物浓度为700U/g，底物水解3h可达最大水解度18.9%。
所述米曲霉对-Glu-Ala-和-Pro-Lys-肽键有非常强的选择性。
本发明还公开了一种纯化米曲霉产生的蛋白酶的方法，包括以下步骤：
（1）将发酵好的米曲霉培养物加入适量灭菌生理盐水，振荡过滤，滤液为粗酶液；分别采用40%、80%饱和度硫酸铵去除粗酶液中的杂蛋白及初步沉淀蛋白酶；
（2）将所述步骤（1）的沉淀蛋白脱盐后上样于DEAE-Sepharose FF柱，充分洗脱后，NaCl溶液线性梯度洗脱，收集电导为9.04-13.1cm/ms的酶活组分；
（3）将所述步骤（2）收集的酶活组分上样于Phenyl-Sepharose HP柱，Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，收集酶活组分并脱盐；
（4）将所述步骤（3）收集的酶活组分加样于Sepharose-G75凝胶柱，Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活组分。
采用本发明提供的米曲霉产生的蛋白酶水解鸡肉蛋白，其处理工艺为：pH为7.0，温度为45℃，底物浓度为700U/g，底物水解3h可达最大水解度18.9%。鸡肉蛋白中分子量大于10kDa的多肽所占的比例显著降低，由58.66%降至0.029%；鲜味氨基酸和疏水氨基酸所占的比例显著提高，分别提高了25.1%和35.26%。
具体实施方式
实施例1产蛋白酶菌株筛选方法
（1）采样：样品采自酒曲；
（2）样品处理：将少许样品放入250mL三角瓶中铺满底部，加适量蒸馏水浸过样品，混匀；
（3）纯化：将处理后的样品培养液在平板培养基（蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，氯化钠1.0%，琼脂2.0%）上涂布稀释进行分离纯化，30℃培养24h，挑单菌落进行染色镜检后接种于固体斜面培养基（蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，氯化钠1.0%，琼脂2.0%），分别编号为Prot-1，Prot-2，Prot-3……Prot-113；
（4）筛选：培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，脱脂奶粉0.3%，琼脂2.0%。测量水解圈与菌落直径比值，确定产蛋白酶能力强的菌株。
（5）酶活测定：1mL粗酶液40℃预热后加入1mL预热的酪蛋白（pH7.2的磷酸盐缓冲溶液配制），10min后以10%的TCA终止反应，20min后离心过滤，向1mL滤液中加人5mL0.4mol/L的碳酸钠溶液和1mL福林试剂，混匀，40℃保温20min后测定OD值。
酶活力=（A680×k×4）×n/10（k为吸光系数，4为反应试剂总体积，10为反应时间，n为稀释倍数）
表1 产蛋白酶菌株筛选结果
经过筛选获得一株米曲霉（Aspergillus oryzae ZG），于2013年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7586，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2不同菌株粗酶液酶解鸡肉蛋白效果
相同水解度下，将筛选到的米曲霉（Aspergillus oryzae ZG）与1株黑曲霉（Aspergillusniger），1株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
（1）小肽含量的测定：10%三氯乙酸沉淀大分子蛋白后，凯氏定氮法测得酸溶蛋白含量，然后扣除其所含游离氨基酸的含量。
（2）鲜味氨基酸测定：柱前衍生化高效液相色谱法；样品预处理：pH7.2缓冲液稀释酶解后样品200μL到1mL，超声2×20min后，加入1mL10%三氯乙酸沉淀2h后用双层滤纸过滤，8000r/min离心10min后取上清液测定游离氨基酸含量；色谱条件：色谱柱：ODSHYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：40℃；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：338nm；洗脱方式：梯度洗脱。
表2 不同酶解产物的酶解效果
实施例3米曲霉蛋白水解酶纯化方法
（1）将发酵好的培养物按1：3（W/V）加入灭菌生理盐水，37℃振荡1h，过滤，滤液为粗酶液；
（2）将所述步骤（1）中所得到的粗酶液采用40%饱和度硫酸铵去除杂蛋白，80%饱和度硫酸铵用于沉淀蛋白酶；
（3）将所述步骤（2）的沉淀蛋白脱盐后上样于pH7.50.02mol/L Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，充分洗脱后，0.5mol/L NaCl溶液线性梯度（0-30%）洗脱，收集电导为9.04-13.1cm/ms的酶活组分；
（4）将所述步骤（3）收集的酶活组分与3mol/L硫酸铵溶液等体积混和后，上样于1.5mol/L硫酸铵溶液平衡的Phenyl-Sepharose HP柱，0.02mol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液线性梯度（0-100%）洗脱，收集酶活组分并脱盐；
（5）将所述步骤（4）收集的酶活组分加样于Sepharose-G75凝胶柱，0.02mol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活组分。
实施例4蛋白水解酶的肽键选择性确定
利用缓冲液配制0.1mg/mL的牛胰岛素氧化B链，混匀后于40℃水浴酶解l h，沸水浴5min灭活。缓冲液稀释10倍上述水解液，然后用TOF-MS测定稀释水解液中小肽片断的分子量，将所得的结果与胰岛素B链随机片断的分子量比对，据此确定蛋白酶P1和P2在胰岛素B链上的酶切位点。
表3 胰岛素B链上的酶切位点
（表中箭头表示酶切位点，其粗细表示水解强度的大小：↑＞↑，如表3所示本发明提供的蛋白酶对对-Glu-Ala-和-Pro-Lys-肽键有非常强的选择性）
实施例5新型蛋白水解酶的应用
酶解反应：鸡肉蛋白按固液比=1：4加入蒸馏水调pH至7.0，匀浆1min，水解前加热至85℃热处理15min，按酶与底物700U/g加入一定量酶液，45℃震荡酶解反应5h，反应后沸水浴灭活酶15min。离心后取上清液。
（1）酶解产物多肽分子量分布：采用高效液相色谱法。色谱条件：色谱柱：TSKgel2000SWXL（300mm×7.8mm）；流动相：乙腈：水：三氟乙酸=45：55：0.1（V/V/V）；紫外检测波长：220nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
表4 鸡肉蛋白酶解前后多肽分子量分布及其所占比例
（2）酶解产物鲜味氨基酸的测定：同1中（2）。
表5 鸡肉蛋白酶解后鲜味氨基酸含量
Claims (6)
1.一种蛋白酶高产米曲霉（Aspergillus oryzae），于2013年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7586，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的米曲霉，其特征在于高产蛋白酶。
3.权利要求1所述的米曲霉产生的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶能高效水解鸡肉蛋白产生生产小肽和鲜味氨基酸。
4.权利要求3所述的蛋白酶，其特征在于对-Glu-Ala-和-Pro-Lys-肽键有非常强的选择性。
5.权利要求3所述的蛋白酶，其特征在于水解鸡肉蛋白的最适作用条件，pH为7.0，温度为45℃，底物浓度为700U/g，底物水解3h可达最大水解度18.9%。
6.权利要求3或4所述的蛋白酶的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法包括以下步骤：
（1）将发酵好的米曲霉培养物加入适量灭菌生理盐水，振荡过滤，滤液为粗酶液；分别采用40%、80%饱和度硫酸铵去除粗酶液中的杂蛋白及初步沉淀蛋白酶；
（2）将所述步骤（1）的沉淀蛋白酶脱盐后上样于DEAE-Sepharose FF柱，充分洗脱后，NaCl溶液线性梯度洗脱，收集电导为9.04-13.1cm/ms的酶活组分；
（3）将所述步骤（2）收集的酶活组分上样于Phenyl-Sepharose HP柱，Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，收集酶活组分并脱盐；
（4）将所述步骤（3）收集的酶活组分加样于Sepharose-G75凝胶柱，Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活组分。
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