CN103329896A - 苏云金芽胞杆菌原毒素微胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苏云金芽胞杆菌微胶囊，采用自组装方法制备而成，其特征在于：微胶囊内为苏云金芽胞杆菌蛋白，其微胶囊壁由聚烯丙基胺（PAH）及苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白（Cry）依次吸附而成。装载后的微胶囊在pH为6.0时可以长期保持对苏云金芽胞杆菌的稳定包封，保护蛋白，延长其持效期，而在pH为6.5以上的环境下可发挥控释作用。由于很多苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的靶昆虫幼虫中场环境pH差异较大，比如鳞翅目幼虫中肠液pH在8.0到10.5，鞘翅目pH在6.5到7.5，双翅目pH在7.0到8.0，因此此微胶囊可控释的应用范围广泛，种种特性表明该微胶囊对Cry杀虫蛋白的进一步实际应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物药剂领域，特别是涉及一种苏云金芽胞杆菌原毒素微胶囊及其制备方法。
背景技术
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在形成芽胞的同时能够产生具有杀虫活性的晶体蛋白，称为Cry蛋白。这类晶体在碱性条件下溶解成可溶性的原毒素，之后在昆虫中肠环境下由蛋白酶作用后激活成为活性毒素蛋白。由于其对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性，并且对人畜安全，不污染环境，目前已成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。然而较短的持效性成为了制约Cry蛋白制剂应用的重要因素，外界环境下种种不确定性因素都会导致晶体蛋白的失活，因而为Cry蛋白寻找一种保护的载体成为应用的重要环节。其中，微胶囊剂型即为一种可抵御环境压力的有效方法。微胶囊是通过成膜物质将囊内空间与囊外空间隔离而形成的特定几何结构，它的特点在于囊内空间与囊外空间隔离，因而可以分别对囊内和囊外空间的物理化学性质进行调控。
LBL技术即将带正、负电荷的物质通过静电引力层层交替沉积(layer by layer,LbL)于某模板上以制备薄膜和微胶囊的自组装技术，与其它方法相比，显著优越性在于能够在纳米尺度上对囊壁的组成、厚度、结构形态、表面状态进行准确的控制。此外，自提出聚合物阴阳离子静电作用的层层自组装概念之后,科学家们将这一技术不断地拓展和深入,开发了其他作用力的层层自组装过程，例如氢键、共价键、生物亲和作用、电荷转移等等。用于构筑薄膜的物质种类和数量也越来越多。很多生物大分子如：蛋白质、脂质、DNA、病毒，很多结构的高分子聚电解质，如聚烯丙基胺（PAH）、聚苯乙烯磺酸钠（PSS）、聚丙烯酸（PAA）等已经被应用于制备功能化的微胶囊中。其中，聚烯丙基胺（PAH）与聚苯乙烯磺酸钠（PSS）是经常被用于制作微胶囊的一种组合。某些有机微粒比如聚苯乙烯和三聚氰胺甲醛，无机微粒比如CaCO3、MnCO3、CdCO3经常用于作为微胶囊的核心模板物质。
近年来，随着微胶囊在生物医学、化妆品、食品等方面的应用价值提升，利用LbL法制备生物兼容性的微胶囊引起了研究者广泛的关注。CaCO3微粒因粒径分布窄、大小尺寸可控、制备成本极其低廉，对生物体没有毒害作用等特点而倍受关注。本申请人前期曾利用PAH与PSS的层层沉积作用制作了一种空微胶囊，可以载入特定的蛋白如苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白（申请号为2012102576596，发明名称为“一种空微胶囊、可酸性或碱性控释的微胶囊及其制备方法”）。该微胶囊采用两种聚合物作为壁材料，实现了对苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的中性条件保存，碱性（pH 10）条件释放，具有一定的抗高温和抗干燥的能力，对装载的杀虫蛋白具有很好的保护作用，但是其成本较高，而且缓释的pH范围较窄。
发明内容
针对上述领域中的不足，本发明提供一种苏云金芽胞杆菌原毒素的微胶囊，其壁材采用PAH与苏云金芽胞杆菌原毒素蛋白层层组装而成，具有制作成本低，包封率高的特点，同时本微胶囊可控释的pH范围更为广泛，应用前景相对有一定优势，同时，该微胶囊对包裹的原毒素蛋白在面临蛋白酶K降解时有一定的保护作用。
同时本发明还提供该微胶囊的制备方法。
苏云金芽胞杆菌原毒素微胶囊，采用自组装方法制备而成，其特征在于：微胶囊内为苏云金芽胞杆菌原毒素蛋白，其微胶囊壁由聚烯丙基胺（PAH）及苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白（Cry）依次吸附而成。
所述微胶囊壁共五层，其结构方式从里至外为PAH-Cry-PAH-Cry-PAH。
该微胶囊的制备方法，包括如下步骤：（1）以掺杂聚苯乙烯磺酸钠（PSS）的CaCO3微粒制备成核心，（2）于pH 6.5，将核心自组装上第一层囊壁PAH，然后再组装上第二层囊壁Cry；（3）再重复第（2）自组装上第三、第四层，以此循环至所需层数；（4）用pH 7.0的EDTA加入第三步得到的微胶囊中，去核心得到空微胶囊，（5）于pH=3下将Cry蛋白装入空微胶囊中。
所述步骤（1）采用如下方法制得：将等量CaCl2/PSS溶液和Na2CO3溶液混合后快速搅拌混合，离心，去除上清，沉淀水洗得到。
所述步骤（2）采用如下方法制得：取定量的1mg/mL PAH溶液与核心混匀，震荡，离心，去除上清，沉淀水洗，组装上第一层囊壁，再取同样容量的1mg/mL Cry蛋白原毒素溶液与组装完第一层囊壁的沉淀混匀，震荡，离心，沉淀水洗，组装上第二层囊壁。
采用本发明以掺杂聚苯乙烯磺酸钠（PSS）的CaCO3微粒为模板，在pH为6.5时用聚烯丙基胺（PAH）及苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白原毒素（等电点为3.5到5.5）为壁材层层吸附其上制备了一种新的微胶囊。该微胶囊具有良好的分散性，在出除核心后仍能保持良好的形态，并且能够在pH为3.0时进行后续包装杀虫蛋白。装载后的微胶囊在pH为6.0时可以长期保持对苏云金芽胞杆菌的稳定包封，保护蛋白，延长其持效期，而在pH为6.5以上的环境下可发挥控释作用。由于很多苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的靶昆虫幼虫中场环境pH差异较大，比如鳞翅目幼虫中肠液pH在8.0到10.5，鞘翅目pH在6.5到7.5，双翅目pH在7.0到8.0，因此此微胶囊可控释的应用范围广泛，种种特性表明该微胶囊对Cry杀虫蛋白的进一步实际应用具有重要意义。
该申请与之比较，制作方法上直接采用蛋白做为壁材的一部分，并且在去核心模板后可以继续包装杀虫蛋白，在某些程度上降低了制作微胶囊的成本，将包封率从原来的81.8%（申请号为2012102576596申请中包封率）提高到了117.1%，总包封率提高了35.3%，而且制作条件、保护环境也不尽一致。另外，本微胶囊可控释的pH范围更为广泛，应用前景相对有一定优势，同时，该微胶囊对包裹的杀虫蛋白在面临蛋白酶K降解时有一定的保护作用，延长了该微胶囊的保藏保质期限。
附图说明
图1扫描下微胶囊形态
其中a、b为所制微胶囊在扫描电镜下的形态，c为去核以后在扫描电镜下的形态，可看出其大小约为2um。
图2为包封检测SDS-PAGE结果
其中M为Marker，1为装载前Cry蛋白原毒素，2为制备好的空载微胶囊，3为2所示微胶囊装载Cry蛋白原毒素后电泳结果。可看出3条带的样品明显比2条带的样品蛋白含量高。
图3包封结果观察
其中a和d图为暗场下观察效果，b和e图为明场下观察效果，C和f图为叠加场下观察效果。
图4微胶囊体外释放SDS-PAGE结果
泳道1、8、15、22、30为蛋白Mark，2、9、16、23为胶囊在pH为6.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，3、10、17、24为胶囊在pH6.5时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，4、11、18、25为胶囊在pH7.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，5、12、19、26为胶囊在pH7.5时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，6、13、20、27为胶囊在pH8.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，7、14、21、28为胶囊在pH10.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，29为微胶囊悬浮液，用于对照观察。30、31、32、33、34、35、36分别为微胶囊在pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、10.0环境下放置3天后内部蛋白电泳结果。
图5微胶囊贮存期SDS-PAGE结果
泳道1、4为蛋白Mark，2、5为微胶囊放置10天、30天后离心上清电泳结果，3、6为微胶囊悬浮液在放置10天、30天后取样电泳结果，
图6微胶囊对蛋白酶K的抗性SDS-PAGE结果
其中1-4为包裹杀虫蛋白原毒素的微胶囊在蛋白酶与蛋白质量比为1:10、1:20、1:30、1:40下的消化结果，5为微胶囊原样，7-10为原毒素蛋白在同比条件下的消化结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明。
1 材料与方法
1．1 材料：
CaCl2/PSS溶液：称取0.29g CaCl2·2H2O与0.25g PSS混合溶解于10mL蒸馏水中；
Na2CO3溶液：称取0.21g Na2CO3溶液溶于10mL蒸馏水中；
Tris-HCL缓冲液、PBS缓冲液、Na2CO3缓冲液
1mg/mL PAH(pH6.5):20mg PAH溶于100mM Tris中，用浓盐酸调节pH至6.5；
1mg/mL Cry蛋白(pH6.5):20mg Cry蛋白 溶于50mM Na2CO3中，用Tris-HCL缓冲液调节pH至6.5；
0.15M EDTA溶液，NaOH溶液调节pH至7.0
1．2 微胶囊制备方法
1)制备CaCO3核心
将已配置的等量CaCl2/PSS溶液(0.1M)和Na2CO3溶液(0.1M)各10mL混合后使用磁力搅拌快速混合30min；离心，5500rpm,15min,去除上清。将沉淀水洗后离心，5500rpm,15min，弃上清，重复3次。
2)自组装法制备胶囊壁
第一层：取10ml 1mg/mL PAH溶液与CaCO3沉淀混匀，震荡20min。离心，5500rpm，15min，去除上清。将沉淀水洗后离心，5500rpm，15min，弃上清，重复3次。
第二层：取10ml1mg/mL Cry蛋白溶液与上步中沉淀混匀，震荡20min。离心，5500rpm,15min，去除上清。将沉淀水洗后离心，5500rpm，15min，弃上清，重复3次。
第三至第五层为按照上述方法依次组装：PAH-Cry蛋白-PAH。
3）微胶囊的去核及后续包装蛋白
将20ml EDTA（pH7.0）加入离心后得到的微胶囊中，轻微震荡2h，离心，5500rpm,15min，去除上清。将沉淀水洗后离心，5500rpm，15min，弃上清，重复3次。将15ml Cry蛋白与去核后的微胶囊在pH为3.0时混合，震荡30min，离心，5500rpm,15min，去除上清。将沉淀水洗后离心，5500rpm，15min，弃上清，重复3次。
1．3 微胶囊包封蛋白效果研究
取上述2)中微胶囊悬浮于15ml水中，取20uL样品，后将去核重新包裹蛋白的微胶囊悬浮于15ml水中，取20uL样品，SDS-PAGE间接反映各样品蛋白含量。FITC标记蛋白制成PAH-（FITC-Cry蛋白）-PAH-（FITC-Cry蛋白）-PAH确认蛋白作为壁材制成微胶囊，FITC标记蛋白进入去核后的微胶囊确认后续包装成功。
1．4 微胶囊释放蛋白情况研究
将2）中微胶囊悬浮液等量放入不同pH的PBS缓冲液中，不同时间SDS-PAGE检测释放情况。将2）中微胶囊放入三蒸水中（pH6.0）中，取10天，30天后的微胶囊悬浮液和离心后的上清20uL，SDS-PAGE检测微胶囊在三蒸水中的释放情况和对蛋白的保护作用。
1．5 微胶囊对蛋白酶K的抗性研究
将包裹杀虫蛋白原毒素的微胶囊和没有任何载体包被的杀虫蛋白原毒素与蛋白酶K按照不同的质量比（1：10到1：40）进行混合，37℃，5min后，SDS-PAGE检测消化情况。
2 结果
2．1 扫描电镜下微胶囊形态
见图1。其中a和b为所制微胶囊在扫描电镜下的形态，c为去核以后在扫描电镜下的形态，可看出其大小约为2um。
2．2 微胶囊所含蛋白量检测
见图2。其中M为Marker，1为装载前Cry蛋白原毒素，2为制备好的空载微胶囊，3为2所示微胶囊装载Cry蛋白原毒素后电泳结果。可看出3条带的样品明显比2条带的样品蛋白含量高，说明实现了高的装载率。
经BandScan 4.5 of Glyko（http://www.glyko.com/BandScan/Features.html）扫描条带，分析结果表明因为微胶囊壁材中已经含有了Cry蛋白原毒素，使包封率从以前的81.8%（申请人己公开的申请号为2012102576596专利中的包封率）提高到117.1%。
2．3 激光共聚焦显微镜观察确认包封结果
见图3。其中a和d图为暗场下观察效果，b和e图为明场下观察效果，C和f图为叠加场下观察效果，由a、b、c可见Cry蛋白能作为壁材制作微胶囊，不影响原来的电荷分布。由d、e、f可看出制成的微胶囊在去核后仍能进行后续包装杀虫蛋白。
2．4 体外释放研究
见图4。其中泳道1、8、15、22、30为蛋白Mark，2、9、16、23为胶囊在pH为6.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，3、10、17、24为胶囊在pH6.5时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，4、11、18、25为胶囊在pH7.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，5、12、19、26为胶囊在pH7.5时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，6、13、20、27为胶囊在pH8.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，7、14、21、28为胶囊在pH10.0时分别置放5小时、1天、2天、3天后的离心上清电泳结果，29为微胶囊悬浮液，用于对照观察。30、31、32、33、34、35、36分别为微胶囊在pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、10.0环境下放置3天后内部蛋白电泳结果。可见微胶囊随着所处溶液pH的升高，对内部Cry杀虫蛋白释放的越多，且释放的蛋白量随着时间的延长而增加，在pH为10时，5小时基本完全释放，释放的蛋白随着时间的延长而降解，内部的蛋白则相对保持完好。
见图5。泳道1、4为蛋白Mark，2，5为微胶囊放置10天、30天后离心上清电泳结果，3、6为微胶囊悬浮液在放置10天、30天后取样电泳结果。可见微胶囊在pH为6.0时可以长期保存Cry杀虫蛋白，延长其持效性。
2．5 微胶囊对蛋白酶K的抗性研究
见图6。其中1-4为包裹杀虫蛋白原毒素的微胶囊在蛋白酶与蛋白质量比为1:10、1:20、1:30、1:40下的消化结果，5为微胶囊原样，7-10为杀虫蛋白在同比条件下的消化结果，可以看出，几乎所有的游离的杀虫蛋白原毒素都被降解，而微胶囊能为蛋白提供一定的保护作用，在一定程度上防止降解。
Claims (5)
1.苏云金芽胞杆菌微胶囊，采用自组装方法制备而成，其特征在于：微胶囊内为苏云金芽胞杆菌原毒素蛋白，其微胶囊壁由聚烯丙基胺（PAH）及苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白（Cry）原毒素依次吸附而成。
2.根据权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌原毒素微胶囊，所述微胶囊壁共五层，其结构方式从里至外为PAH-Cry-PAH-Cry-PAH。
3.权利要求1或2所述的苏云金芽胞杆菌原毒素微胶囊的制备方法，包括如下步骤：（1）以掺杂聚苯乙烯磺酸钠（PSS）的CaCO3微粒制备成核心，（2）于pH 6.5，将核心自组装上第一层囊壁PAH，然后再组装上第二层囊壁Cry原毒素；（3）再重复第（2）自组装上第三、第四层，以次循环至所需层数；（4）用pH 7.0的EDTA加入第三步得到的微胶囊中，去核心得到空微胶囊，（5）于pH=3下将Cry蛋白装入空微胶囊中。
4.根据权利要求3所述的方法，所述步骤（1）采用如下方法制得：将等量CaCl2/PSS溶液和Na2CO3溶液混合后快速搅拌混合，离心，去除上清，沉淀水洗得到。
5.根据权利要求3所述的方法，所述步骤（2）采用如下方法制得：取定量的1mg/mLPAH溶液与核心混匀，震荡，离心，去除上清，沉淀水洗，组装上第一层囊壁，再取同样容量的1mg/mL Cry蛋白原毒素溶液与组装完第一层囊壁的沉淀混匀，震荡，离心，沉淀水洗，组装上第二层囊壁。
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