CN103320426A - angiogenin基因作为猪免疫性状的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记由angiogenin基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1和图2所述。在附图2和序列表SEQ ID NO：1的第41bp处有一个G41-T41的碱基突变，导致ApaI-RFLP多态性，这个碱基突变位于angiogenin基因第2外显子中，导致氨基酸序列改变，由甘氨酸变为缬氨酸。本发明还公开了扩增angiogenin基因第2外显子部分序列所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

angiogenin基因作为猪免疫性状的分子标记

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。本发明的分子标记与angiogenin基因有关。 

背景技术

作为主要的动物性蛋白来源，猪的养殖在我国畜牧业中占有举足轻重的地位。数十年来，对猪的遗传改良主要集中于生产性状，其中重点是对胴体性状、生长性状与繁殖性状的选择。由于以往单纯的追求生产性状的改良，导致了猪的抵抗力逐步的降低，以及目前集约化的生产模式使疾病成为了现代猪生产的重要限制因素。疾病尤其是病毒性传染病严重的影响着猪的健康，导致猪的死亡、生产效率降低、医药费用增加等一系列问题，最终造成养猪业的巨大经济损失；它甚至会严重影响和降低猪的遗传育种进程。 

随着遗传学的不断发展，人们已将分子标记技术应用于畜禽抗病育种方面，并且确定了一些与猪疾病抗性有关的候选基因及主效基因。跨越7号染色体着丝粒的猪淋巴细胞抗原(SLA)复合体(Smith TP，Rohrer GA，Alexander LJ，Troyer DL，Kirby-Dobbels KR，Janzen MA，Cornwell DL，Louis CF，Schook LB，Beattie CW.Directed integration of the physical and genetic linkage maps of the swine chromosome 7 reveals that SLA spans the centromere.Genome Research，1995，5：259-271)，即猪主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)是一组与免疫应答和抗性密切相关的基因家族。在宿主的免疫反应中，对细菌、病毒、寄生虫的遗传控制有重要作用。一些学者对SLA单倍型或等位基因与免疫应答、抗性的关系进行了研究：Rothschild M F等(Rothschild M，Jacobson C，Vaske D，Tuggle C，Wang L，Short T，Eckardt G，Sasaki S，Vincent A，McLaren D，Southwood O，van der Steen H，Mileham A，Plastow G.The setrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs[J].Proc Natl Acad Sci，1996，93：201-205)发现微型猪单倍型SLAa/a对感染支气管败血性波氏杆菌高反应存在关联；Hruban V等(Hruban V，Horak V，Fortyn K..Presence of specific MHC haplotype in melano-blstomabearing minipigs.Animal Genetics，1994，25(supp1.2，C1))则观察到SLA I等位基因与恶性黑色素瘤的出现存在关联。位于猪15号染色体q2.3-2.6的NRAMP1基因(Sun HS，Wang L，Rothschild MF，Tuggle CK.Mapping of the natural resistance-associated macrophage protein1(NRAMP1)gene to pig chromosome 15.Animal Genetics.1998，29：138-140)，属于天然抗性相关的巨噬蛋白基因家族，Guolong Zhang等(Guolong Zhang，Hua Wu，Christopher R.Ross，J.Ernest Minton，and Frank Blecha.Cloning of Porcine NRAMP1 and Its Induction by Lipopolysaccharide， Tumor Necrosis Factor Alpha，and Interleukin-1β：Role of CD14 and Mitogen-Activated Protein Kinases[J].Infection And Immunity，2003，3：1086-1093)通过对猪NRAMP1基因的mRNA表达研究发现其在细胞核特异性组织中都可表达，但在巨噬细胞中表达量最高，推测其可能通过消耗含有胞内病原生物的吞噬体中二价金属离子如镁、亚铁、锌等离子使病原微生物缺乏增殖必需的离子而达到抵抗胞内微生物的作用。Kramer J等(Kramer J，Malek M，Lamont SJ.Association of twelve candidate gene polymorphisms and response to challenge with Salmonella enteritidis in poultry.Anim Genet，2003，34：339-348)发现NRAMP1等位基因与鸡沙门氏菌感染反应存在关联。干扰素(interferon，IFN)作为机体最重要的细胞因子之一，因其具有广谱抗病毒、免疫调节、增强功能及其它生物活性而被人们广泛研究。体外重组β-干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒的感染(曹瑞兵等.猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究[J].中国病毒学，2004，19(4)：364-368)；体内注射猪瘟疫苗和干扰素可增强对猪瘟病毒的防御能力(Suradhat S，Intrakamhaeng M，Damrongwatanapokin S.The correlation of virus-specific interferon-gamma production and protection against classieal swine fever virus infection.Vet Immunol Immunopathol.2001，83(3-4)：177-189)。 

Angiogenin是核糖核酸酶A超家族成员，但结构上有所不同，是tRNA特异核糖核酸酶。Fett J W等(Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，Bethune JL，Riordan JF，Vallee BL.Isolation and characterization of angiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cells.Biochemistry，1985，24：5480-5486)于1985年首次分离了人的angiogenin(ANG)并发现其具有刺激血管生长的功能。随后，Olson K A等(Olson KA，Verselis SJ，Fett JW.Angiogenin is regulated in vivo as an acute phase protein.Biochem Biophys Res Commun.1998，242：480-483)观察到肺炎ANG mRNA的表达量升高；急变期时，血清中的ANG蛋白表达量也有所上升，于是推测angiogenin基因可能与宿主防御有关。 

由于微生物的选择压力，导致了angiogenin基因变异较大。Hooper L V等(Hooper LV，Stappenbeck TS，Hong CV，Gordon JI.Angiogenins：a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity.Nature Immunology.2003，4：269-273)对鼠Ang1、Ang4和人ANG进行了研究，发现Ang4定位于小肠中的潘氏细胞分泌粒而非其它的上皮细胞和间质细胞。实验证明：Ang4经由细菌脂多糖刺激潘氏细胞而产生，其蛋白对粪肠球菌或单核细胞增多性李氏杆菌具有很强的抑制作用；Ang1和ANG的蛋白对白色念球菌、肺炎链球菌有强烈的杀伤力，因而提出这些angiogenin基因对系统先天免疫很重要。但Svetlana V A等(Avdeeva SV，Chernukha MU，Shaginyan IA，Tarantul VZ，Naroditsky BS.Human Angiogenin Lacks Specific Antimicrobial Activity.Current Microbiology Vol.2006，53：477-478)却对Hooper L V等关于人ANG的研究结果有异议。 

尽管在抗病育种方面的研究中取得了一定的进展，但仍然存在不足：(1)现在已识别的抗病基因数目极为有限，而且能够应用于实际生产的基因更少；(2)抗病性的遗传机制极其复杂，涉及到的生理生化过 程亦相当的复杂；(3)某些生产性状和抗性性状之间存在着一定程度的相关，甚至是负相关，单纯的对生产性状进行选择可能导致抗病性降低，并且抗性性状和生产性状之间关系的实验证据还很缺乏，再者对一种疾病的抗性选择可能导致对另一种疾病的易感性增高。 

发明内容

本发明的目的在于从angiogenin基因中克隆一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记，揭示其制备方法与在猪标记辅助选择中的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

申请人从报道的猪基因angiogenin克隆得到与猪免疫性状相关基因的部分DNA片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1和附图2所述。在序列表SEQ ID NO：1的第41bp处有一个G41-T41的碱基突变，导致ApaI-RFLP多态性。这个碱基突变位于angiogenin基因第2外显子中，导致翻译的氨基酸序列改变，由甘氨酸变为缬氨酸。 

本发明所述的分子标记的制备方法是： 

用猪angiogenin基因序列(GenBank收录号：NM 001044573)为模板设计引物；提取基因组DNA，设计引物，该引物的DNA序列如下所示：正向5’-GCCGAGGAGCCTTTGTT-3’，反向5’-AGGCCTCGTTGCTTCATT-3’。 

PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 

应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：1所示的第41位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。 

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因angiogenin的部分DNA序列，序列全长为200bp，在该序列的的第41bp处有一个G41-T41的碱基突变。 

图1：是本发明技术流程图。 

图2：是本发明中猪angiogenin基因的部分DNA序列，图中加下划线的是部分外显子2序列，突变位点用加粗及斜体标出，引物序列用斜体加粗及阴影表示。 

图3：是本发明中猪angiogenin基因基因组扩增电泳结果，图中标记：M：DL2000。 

图4：是本发明中猪angiogenin基因第2外显子的ApaI-RFLP的三种基因型(TT TG GG)电泳结果，图中标记：M：DL2000。 

具体实施方式

实施例1：猪angiogenin基因部分DNA序列的扩增 

(1)利用苯酚抽提法提取长白猪肌肉组织总DNA 

1)将长白猪(来自湖北省武汉市华中农业大学精品猪场常规品种)的肌肉组织在液氮中磨碎，加入 等体积1×SET溶液(1ml)，蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度200μg/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴摇床中温育过夜消化。 

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。 

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。 

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。 

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。 

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。 

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。 

(2)引物设计： 

以报道的猪angiogenin序列(GenBank收录号：NM 001044573)为模板，利用生物学引物设计软件Primer Premier 5.0，设计扩增angiogenin基因第2外显子的引物，该引物对的DNA序列如下： 

angiogenin：正向引物：5’-GCCGAGGAGCCTTTGTT-3’，(对应于序列表SEQ ID NO：1的第1-17位)， 

            反向引物：5’-AGGCCTCGTTGCTTCATT-3’(对应于序列表SEQ ID NO：1的第183-200位)； 

该引物的DNA序列扩增片段长度为200bp。 

(3)PCR扩增反应： 

PCR反应：反应总体积为10μl，其中猪基因组DNA模板0.7μl，双蒸水7.42μl，10×buffer 1μl，10mM引物前后各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.08μl(5U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。 

(4)PCR产物的纯化和测序 

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自新长江生物科技(北京)有限公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物，具体步骤是按照100mg胶块加入400μl Gel-Shift结合缓冲液(GS Buffer)的比例加入GS缓冲液，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一 个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(DNA溶液)置于-20℃保存备用。 

(5)DNA序列测定：序列测定由深圳华大基因科技有限公司完成，基因片段测正反两个反应。 

实施例2：PCR-RFLP诊断方法建立 

(1)PCR-RFLP引物序列(该引物也是扩增angiogenin基因第2外显子的引物)。 

angiogenin SNP：正向5’-GCCGAGGAGCCTTTGTT-3’，(对应于序列表SEQ ID NO：1的第1-17位)， 

                反向5’-AGGCCTCGTTGCTTCATT-3’。(对应于序列表SEQ ID NO：1的第183-200位)； 

该引物扩增片段长度为200bp。 

(2)PCR扩增条件 

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×缓冲液1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(5U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸15s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。 

(3)RFLP检测 

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物3μl，双蒸水5.9μl，10×缓冲液1μl，限制性内切酶ApaI为0.1μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用4％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。 

用angiogenin正向引物和angiogenin反向引物扩增猪基因组DNA得到了200bp特异性扩增片段，测序结果发现该片段在第41位发现一个G-T转换，位于外显子2中(详见图2)，造成一个ApaI酶切位点 

其中第43bp处为多态性切点，酶切产生三种基因型，基因型TT型只有200bp一条带，GG型有157bp和43bp两条带，杂合子TG型有200bp，157bp和43bp的三条带，如图4所述。 

实施例3：本发明的分子标记各基因型在长白猪群中的分布情况 

利用PCR-RFLP技术检测了angiogenin基因G41-T41位点在广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场长白(为国内外报道的常规品种)猪群(n＝289)的基因型频率和基因频率，并进行了卡方检验(Chi-squre test)。如表1所示，angiogenin基因各基因型在长白猪中均有分布，其中GG基因型数最少，TT基因型数和TG基因型数相差不大，T等位基因占优势；卡方检验的结果显示，该基因被检测位点的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)，也就是群体的选育对该基因没有造成影响。 

表1 ApaI-RFLP基因型在长白猪群的分布 

实施例4：本发明的分子标记在猪免疫性状关联分析中的应用 

在广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群中对猪angiogenin基因第2外显子ApaI-RFLP多态性位点与部分免疫性状进行关联分析(如表2所示)，所分析的性状是：0日龄平均红细胞体积、0日龄平均血红蛋白量、0日龄血小板体积、0日龄大血小板比率和32日龄平均红细胞体积。 

由表2可知，GG基因型的0日龄平均红细胞体积、0日龄平均血红蛋白量和0日龄大血小板比率极显著高于TT基因型(P＜0.01)；GG基因型的0日龄血小板体积显著大于TT基因型(P＝0.0135)；TG基因型的32日龄平均红细胞体积显著大于TT基因型(P＝0.0122)。 

表2  不同angiogenin基因ApaI-RFLP基因型与部分免疫性状的关联分析 

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。 

Claims (4)

1.一种克隆的与猪免疫性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

GCCGAGGAGCCTTTGTTGGAAGAGATGGTGATATTGCTGGKCCCCCTGCTGTTGGT

CTTCATGCTGGGTCTGGGTCTGGCCCCGCTGAGCCTGGCTAAGGATGAAGACAGG

TACACACACTTCCTGACCCAGCACTACGATGCCAAACCAAAGGGCCGGGATGGCA

GATACTGTGAAAGCATAATGAAGCAACGAGGCCT

上述序列中的K是G或T，导致ApaI-RFLP多态性。

2.一种检测如权利要求1所述的分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-GCCGAGGAGCCTTTGTT-3′，

反向引物：5′-AGGCCTCGTTGCTTCATT-3′。

3.权利要求1所述的分子标记在猪免疫性状标记辅助选择中的应用。

4.权利要求2所述引物对在猪免疫性状标记辅助选择中的应用。

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