CN103319465A

CN103319465A - 一种汉奇酯衍生物及其制备和应用

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Publication number: CN103319465A
Application number: CN2013102563995A
Authority: CN
Inventors: 李敏峰; 马素芳; 龚兵; 何兰
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-25
Also published as: CN103319465B

Abstract

本发明属于杂环有机化合物领域，提出一种汉奇酯衍生物，其具有式I的结构式：

本发明还提出所述汉奇酯衍生物作为NO荧光探针的应用。根据本发明提出的技术方案，利用汉奇酯衍生物与一氧化氮的特异性作用，生成相应吡啶衍生物类的性质，来实现荧光探针对一氧化氮的响应。通过检测作用前后荧光性质的改变来实现对一氧化氮的检测。方法简单可控，灵敏度高。

Description

一种汉奇酯衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明属于杂环有机化合物领域，具体涉及一种吡啶衍生物及其制备和应用。

背景技术

一氧化氮分子（NO）作为生物体内一种重要的信使分子和神经调质,参与了调控多个系统的生理功能。已有证据显示一氧化氮也与多种疾病，如糖尿病、帕金森症和阿兹海默症等有关。因此NO供体药物作为潜在的心血管、抗肿瘤、新型抗炎和抗阿尔兹海默病药物，引起了广泛的关注。然而NO作为气体自由基在生物体内极不稳定，因此在生物体内检测NO的方法一直是相关研究的一个的热点、难点。NO是自由基性的气体分子，能与其他物质快速结合而发生化学反应，其在生物体能快速扩散并与其他生物体结合，因此，需要有快速检测NO的方法。目前NO的检测方法有荧光法、电化学法、化学发光法等，其中荧光法灵敏度高、简单易行，效果最好。

“荧光探针”一般是指能选择性地与其它特定物质相互作用而使其结构发生变化，导致其荧光性质（强度、激发/发射波长或荧光寿命等性质）发生改变的化合物，即在一定条件下能对特定物质发生特异性荧光响应的化合物。利用这一性质，可通过荧光检测方法对特定物质进行定性、定量的研究。目前应用最为广泛、备受关注的一类NO荧光分子探针邻苯二胺类，由于受自身结构特点及作用机理的限制，仍然存在许多诸如灵敏度受介质pH的影响、自氧化现象的存在，特异性不够高等问题，使其使用受到限制。其他荧光探针如丹磺酰铜配合物、硼二吡咯甲基衍生物、二氯荧光素等，存在有制备困难、会对生物体造成损伤等不足之处，本领域技术人员仍致力研究更灵敏且更易于制备的荧光探针。

发明内容

本发明的目的是提出一种“汉奇酯衍生物”，可实现选择性地与一氧化氮相互作用，发生结构变化（分子结构的芳构化），从而导致其荧光性质变化（例如荧光发射强度增强）。

本发明的另一目的是提出所述汉奇酯衍生物的制备方法。

本发明的第三个目的是提出汉奇酯衍生物与NO反应的产物。

本发明的第四个目的是提出汉奇酯衍生物作为荧光探针的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种汉奇酯衍生物，其具有如式I的结构式：

I式中，R1=-CO₂Me、-CO₂Et、F、Cl、Br或CN；

R₂=荧光染料分子；

R₃=H、Bn、Ph、Me、Et、Pr、i-Pr或CN。

其中，所述荧光染色分子选自下组中的一种：

优选地，所述汉奇酯衍生物为

本发明提出的汉奇酯衍生物与NO反应得到的产物。

一种制备汉奇酯衍生物的方法，基于sonogashira反应，其包括步骤：

1)以7-羟基香豆素香豆素衍生物为起始原料，在七号位引入烷基基团；

2）三号位引入卤素基团；

3）在有钯/铜催化剂存在条件下引入1,4二氢吡啶环，取代卤素基团。

或，本发明提出的制备方法包括步骤：

以带有苯环的醛为起始原料，通过碘代物和端基炔烃的偶联，引入1,4-二氢吡啶环；或醛发生Hantzsch反应引入1,4-二氢吡啶环。

以所得产物为式II化合物为例，其合成路线为：

合成得到的7-MC-DHP与NO反应为

上述路线中NO探针的结构式如式7-MC-DHP。而7-MC-1、7-MC-2均为香豆素类荧光剂，它们实际上是NO探针7-MC-DHP的前体，在结构上与7-MC-DHP具有一定的共同点。7-MC-Py为NO探针7-MC-DHP与NO作用后生成的产物，是具有极强荧光的香豆素类荧光剂。

或，合成产物为7-OMe-3d时，合成路线为式（3）:

本发明提出的汉奇酯衍生物作为NO荧光探针的应用。

所述应用是将所述汉奇酯衍生物在pH值4-9条件下，与NO反应，得到产物，在紫外光照射下发出荧光。

优选地，所述反应的pH值为6.5-7.5。因为荧光探针多用于生物体内自由基NO的检测，本优选pH值适用于对生物体的检测。

其中，所述反应是在溶剂中进行，所述溶剂选自乙腈、乙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷中的一种。

本发明的有益效果在于：

根据本发明提出的技术方案，利用汉奇酯衍生物与一氧化氮的特异性作用（芳构化，导致探针分子内电子的结构分布、分子的构象变化等），生成相应吡啶衍生物类的性质，来实现荧光探针对一氧化氮的响应。通过检测作用前后荧光性质的改变（荧光发射强度变化、荧光发射波长变化、荧光发射寿命变化等）来实现对一氧化氮的检测。方法简单可控，灵敏度高。

附图说明

图1a为7-甲氧基香豆素(7-MC-1)的紫外吸收光谱，图1b为7-甲氧基香豆素(7-MC-1)荧光光谱。

图2a为7-甲氧基-3-碘代香豆素(7-MC-2)的紫外吸收光谱，图2b为7-甲氧基-3-碘代香豆素(7-MC-2)的荧光光谱。

图3a为基于香豆素荧光染料分子的一氧化氮荧光探针(7-MC-DHP)的紫外吸收光谱，图3b为7-MC-DHP与NO作用前的荧光光谱。

图4a为香豆素荧光染料分子的一氧化氮荧光探针与一氧化氮作用后的产物(7-MC-Py)的紫外吸收光谱，图4b为作用产物7-MC-Py的荧光光谱。

图5a为荧光探针(7-MC-DHP，实线)与一氧化氮作用产物(7-MC-Py，虚线)的紫外吸收光谱对比，图5b为荧光探针(7-MC-DHP实线)与NO作用产物(7-MC-Py，虚线)的荧光光谱对比。

图6a为荧光探针(7-OMe-3d，实线)与一氧化氮作用产物(7-OMe-3e，虚线)的紫外吸收光谱对比（图6）；图6b为荧光探针(7-OMe-3d,实线)与NO作用产物(7-OMe-3e，虚线)的荧光光谱对比。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

实施例中的7-羟基香豆素、N-碘代丁酰亚胺、碘甲烷等均购于北京试剂公司，其余试剂均购于北京化工厂。

实施例1：基于sonogashira反应的香豆素类衍生物的合成

1、7-甲氧基香豆素(7-MC-1)的合成

合成路线如式（1）。将7-羟基香豆素(1g,6.2mmol)用30mL丙酮溶解，加入无水碳酸钾(1.7g,12.35mmol)，室温搅拌10min。再加入碘甲烷(1.05g,7.41mmol)，加热回流反应5h，停止加热，趁热过滤，将滤液旋干，乙醇重结晶的白色晶体0.8g，产率73%。1H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:7.67(d,1H,J=9.4Hz),7.38(d,1H,J=8.52Hz),6.87(m,2H,J=2.3Hz),6.26(d,1H,J=9.4Hz),3.89(s,3H)。

2、7-甲氧基-3-碘代香豆素(7-MC-2)的合成

将7-MC-1(1g,5.68mmol)、对甲基苯磺酸(TsOH0.98g,5.68mmol)溶于30mL THF（四氢呋喃）中，剧烈搅拌下，缓慢向其中滴加20mL THF的NIS(N-碘代丁二酰亚胺1.5g,6.82mmol)溶液。加热回流反应10h，停止加热，恢复室温，将溶剂旋干，固体用二氯甲烷/石油醚=1:1柱层析分离，得白色固体0.12g，产率70%。1H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:8.28(s,1H),7.34(d,1H,J=8.6Hz),6.87(q,1H,J=2.3Hz),6.83(d,1H,J=2.2Hz),3.90(s,3H).。

3、7-MC-DHP的合成

先在重蒸好的四氢呋喃和三乙胺（Et₃N）中通氮气30min，在氮气保护下，将7-MC-2（0.1g,0.33mmol）和含二氢吡啶的炔（0.08g,0.33mmol）用10mL THF溶解，加入2mL三乙胺，搅拌10min后，再加入Pd₂(dba)₃(15mg,0.017mmol)、CuI(13mg,0.049mmol)、PPh₃(三苯基磷6mg,0.033mmol)。加热回流反应4h，停止加热，冷却至室温，将溶剂旋干，用乙酸乙酯/石油醚（1:1）柱层析得白色固体0.06g,产率45%。1H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:7.75(s,1H),7.34(d,1H,J=8.6Hz),6.85(q,1H,J=2.3Hz),6.80(d,1H,J=4.6Hz),6.12(s,1H),5.06(s,1H),3.89(s,3H),3.81(s,6H),2.37(s,6H)。

4、7-MC-Py的合成

将7-MC-DHP(20mg,0.05mmol)溶于2mL二氯甲烷中，室温下通NO气体，反应3h后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，饱和氯化钠溶液洗涤1次，二氯甲烷萃取有机层，无水硫酸钠干燥。将二氯甲烷旋干，用乙酸乙酯/石油醚（1:1）柱层析得黄色固体19mg，产率93%。1H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:7.86(s,1H),7.44(d,1H,J=8.7Hz),6.91(q,1H,J=2.3Hz),6.84(d,1H,J=2.2Hz),4.06(s,6H),3.92(s,3H),2.63(s,6H)。

实施例2：香豆素类衍生物及荧光探针的紫外、荧光性质

1、香豆素衍生物自身的紫外、荧光性质：

如图1所示，溶剂均为含体积比例20%DMSO的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，溶液的pH值为7.4，7-甲氧基香豆素7-MC-1的紫外吸收光谱如图1a，浓度c=5.0×10^-6mol·L^-1,摩尔吸光系数ε=4.84×10⁴L·mol^-1·cm^-1（横坐标是波长，纵坐标是吸光度。下同）及7-甲氧基香豆素7-MC-1（图1b，c=5.0×10^-6mol·L^-1,λ_ex=324nm,λ_em=394nm）的荧光光谱（横坐标是波长，纵坐标是荧光强度。下同）。

如图2所示，7-甲氧基-3-碘代香豆素7-MC-2的紫外吸收光谱（图2a，c=5.0×10^-6mol·L^-1,ε=5.10×10⁴L·mol^-1·cm^-1）及7-甲氧基-3-碘代香豆素7-MC-2的荧光光谱（图2b，c=5.0×10^-6mol·L^-1,λ_ex=342nm,λ_em=417nm），溶剂均为含20%DMSO的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液。

如图1、图2所示，7-甲氧基-香豆素的3号位上不同的取代基对其自身的荧光性质影响并不显著。

2、基于香豆素荧光染料分子的一氧化氮荧光探针（7-MC-DHP）及其与一氧化氮作用的产物（7-MC-Py）的紫外、荧光性质：

如图3所示为基于香豆素荧光染料分子的一氧化氮荧光探针(7-MC-DHP)的紫外吸收光谱（图3a，c=5.0×10^-6mol·L^-1,ε=3.54×10⁴L·mol^-1·cm^-1），以及与NO作用前的荧光光谱（c=5.0×10^-6mol·L^-1,λ_ex=370nm,λ_em=440nm），溶剂均为含20%DMSO的K₂HPO4-KH₂PO₄缓冲溶液。如图所示，7-甲氧基-香豆素通过C-C键枝接到1,4-二氢吡啶衍的4号位，导致其紫外吸收降低（图3a），同时荧光染料分子的荧光急剧衰减（几乎完全淬灭）（图3b），表现为探针分子几乎没有荧光。

如图4所示为基于香豆素荧光染料分子的一氧化氮荧光探针与一氧化氮作用后的产物(7-MC-Py)的紫外吸收光谱（图4a，c=5.0×10^-6mol·L^-1,ε=5.71×10⁴L·mol^-1·cm-¹）；以及与NO作用产物(7-MC-Py)的荧光光谱（图4b，c=5.0×10^-6mol·L^-1,荧光激光波长λ_ex=380nm,发射波长λ_em=460nm），溶剂均为含20%DMSO的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液。如图所示，荧光探针（7-MC-DHP）与一氧化氮作用后,其紫外吸收明显增强，同时探针分子的荧光急剧增加（增加值>300倍）（图5b）。

3、基于香豆素荧光染料分子的一氧化氮荧光探针(7-MC-DHP)及其与一氧化氮作用产物(7-MC-Py)的紫外、荧光性质对比：

图5显示荧光探针(7-MC-DHP，实线)与一氧化氮作用产物(7-MC-Py，虚线)的紫外吸收光谱对比（图5a），以及，荧光探针(7-MC-DHP,实线)与NO作用产物(7-MC-Py，虚线)的荧光光谱对比（图5b），溶剂均为含20%DMSO的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液。如图所示，荧光探针（7-MC-DHP）与一氧化氮作用后,其紫外吸收明显增强，同时探针分子的荧光急剧增加（增加值>300倍）（图5b）。在本实施例实验条件下，一氧化氮检出限为26nmol/L。

本实施例的结果表明1,4-二氢吡啶可对一氧化氮实现特异性响应，发生芳构化（由非芳香性二氢吡啶结构变为芳香性的吡啶结构），由此引起通过荧光探针分子的电子结构、分布的变化，导致探针（过共价键连接荧光染料-1,4-二氢吡啶制得）的荧光性质变化（从基本无荧光到较强的荧光）。这一原理可用于开发新型一氧化氮荧光探针，将可用于细胞内一氧化氮的原位检测、成像，将对生物体内NO的产生、传导、及其在生物功能调节中的作用，以及相关的疾病诊断、新药开发等方面的研究提供有效的研究手段、检测方法。

实施例3：基于Hantzsch反应的香豆素类衍生物的合成

合成路线如式（3）。式（4）是与NO反应的反应式。

1、7-羟基-3-甲基香豆素(7-OMe-3a)的合成

将(3.0g,26.6mmol)2,4-二羟基苯甲醛、(4.5g,46.8mmol)丙酸钠和(7.5mL,58.5mmol)丙酸酐加入反应瓶中，搅拌下缓慢滴加(3mL，26.6mmol)三乙胺，滴加完毕，回流反应12小时，停止加热，恢复室温，将反应液倒入100mL水中，有粉色沉淀析出，抽滤，固体用乙酸乙酯/石油醚=1:2柱层析分离，得白色纯品7.7g,产率92%。¹H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:9.89(s,1H),7.58(s,1H)，7.57(d,1H,J=8.0Hz)，6.76(d,1H,J=2.1Hz)，6.62(s,1H)，2.43(s,3H).

2、7-甲氧基-3-甲基香豆素（7-OMe-3b）的合成

将(3.0g,14.61mmol)7-OMe-3a用50mL丙酮将其溶解，加入(4.03g,29.22mmol)碳酸钾，搅拌10min，再加入(3.12g,22mmol)碘甲烷，回流反应6h，停止加热，热过滤。将滤液旋干，得白色固体，乙醇重结晶的5.45g纯品，产率87%。¹H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:7.45(s,1H)，7.30(d,1H,J=8.2Hz)，6.83(d,1H,J=2.4Hz)，6.81(s,1H)，3.86(s,3H)，2.17(d,3H,J=0.8Hz).

3、7-甲氧基-3-醛基香豆素(7-OMe-3c)的合成

将(0.66g，3.47mmol)7-OMe-3b用20mL无水四氯化碳溶解，加入(1.3g，7.29mmol)N-溴代琥珀酰亚胺和微量的过氧苯甲酰，加热回流反应8h，将溶剂旋干，再向反应瓶中加入(1.67g，20.82mmol)无水乙酸钠和20mL冰醋酸，加热回流反应12h，加入10mL稀盐酸，加热搅拌30min，恢复室温，继续搅拌12h,除去溶剂，二氯甲烷/石油醚=1:1柱层析，得0.3g黄色固体，产率52%。¹H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:10.23(s,1H)，8.41(s,1H)，7.60(s,1H)，6.94(d,2H,J=2.8Hz)，3.59(s,3H)。

4、7-OMe-3d的合成

在装有回流冷凝管、干燥管的250mL圆底烧瓶中加入(0.2g，0.98mmol)7-OMe-3c、(0.46g，3.92mmol)乙酰乙酸甲酯、(0.46g，5.88mmol)乙酸铵、20mL乙醇，搅拌并回流反应4h，停止加热，冷却至室温，蒸去乙醇，固体用乙酸乙酯/石油醚=1:2柱层析分离，得黄色纯品0.11g，产率43%。¹H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:7.60(s,1H),7.36(d,1H,J=8.3Hz),6.87(s,1H),6.80(d,1H,J=8.1Hz),6.27(s,1H),5.08(s,1H),3.85(s,3H),3.49(s,6H),2.29(s,6H).

5、7-OMe-3e的合成

在一个小的反应瓶中，加入(0.02g,0.05mmol)7-OMe-3d，用1mL二氯甲烷溶解，通入一氧化氮气体，反应一段时间后，溶液用饱和食盐水洗涤3次，再用二氯甲烷萃取有机相，无水硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到纯的黄色固体7-OMe-3e。¹H NMR(400Hz CDCl₃)δppm:7.60(s,1H),7.43(d,1H,J=8.5Hz),6.91(d,1H,J=2.1Hz),6.88(d,1H,J=4.8Hz),3.92(s,3H),3.76(s,6H),2.69(s,6H).

实施例4：香豆素类衍生物的紫外、荧光光谱性质

化合物7-OMe-3d和7-OMe-3e的紫外吸收光谱（图6a）和荧光发射光谱(图6b)。化合物浓度、所用溶剂及测试条件均与实施例2相同。

图6显示荧光探针(7-OMe-3d，实线)与一氧化氮作用产物(7-OMe-3e，虚线)的紫外吸收光谱对比（图6a），以及，荧光探针(7-OMe-3d,实线)与NO作用产物(7-OMe-3e，虚线)的荧光光谱对比（图6b）（λ_ex=342nm,λ_em=418nm），如图所示，荧光探针（7-OMe-3d）与一氧化氮作用后,其紫外吸收明显增强，同时探针分子的荧光急剧增加（增加值>20倍）（图6b）。在本实施例实验条件下，一氧化氮检出限为43nmol/L。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种汉奇酯衍生物，其特征在于，具有如式I的结构式：

I式中，R₁=-CO₂Me、-CO₂Et、F、Cl、Br或CN；

R₂=荧光染料分子；

R₃=H、Bn、Ph、Me、Et、Pr、i-Pr或CN。

2.根据权利要求1所述的汉奇酯衍生物，其特征在于，所述荧光染色分子选自下组中的一种：

3.根据权利要求1所述的汉奇酯衍生物，其特征在于，所述汉奇酯衍生物为

4.权利要求1-3任一所述的汉奇酯衍生物与NO反应得到的产物。

5.制备权利要求1-3任一所述的汉奇酯衍生物的方法，其特征在于，包括步骤：

1)以7-羟基香豆素为起始原料，在七号位引入烷基基团；

2）三号位引入卤素基团；

3）在有钯/铜催化剂存在条件下引入1,4-二氢吡啶环，取代卤素基团。

6.制备权利要求1-3任一所述的汉奇酯衍生物的方法，其特征在于，包括步骤：

7.权利要求1-3任一所述的汉奇酯衍生物作为NO荧光探针的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其是将所述汉奇酯衍生物在pH值4-9条件下，与NO反应，得到产物，在紫外光照射下发出荧光。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反应的pH值为6.5-7.5。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述反应是在溶剂中进行，所述溶剂选自乙腈、乙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷中的一种。