CN103314782B - 一种制备红汁乳菇菌根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备红汁乳菇菌根的方法，其包括以下步骤：采用组织分离法，在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述PDA试管斜面培养基组织块儿上长出菌丝后，将其转接到WYA试管斜面培养基上进行避光培养，并通过培养后得到纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体菌剂，将上述纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体菌剂分别接种到一年苗龄的板栗无菌苗之根系上培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。在适宜的条件下通过培育板栗菌根苗获得红汁乳菇子实体，为人工栽培红汁乳菇菌根奠定了坚实的基础，方便了人工栽培。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌的制备方法，尤其涉及一种制备红汁乳菇菌根的方法。
背景技术
红汁乳菇属于担子菌门、伞菌亚门、伞菌纲、红菇目（Russulales）、红菇科、乳菇属（Lactarius）。其菌盖直径约30 - 100mm，幼时半球形，边缘内卷。渐变，中部下凹或变脐状，菌盖边缘展平，呈浅漏斗状；菌盖表面光滑，湿润时油腻稍粘，无毛，淡红褐色至浅紫红褐色，有水渍状斑点、白色到浅黄色的条纹可形成同心环纹，偶有暗绿色斑点。菌肉幼时淡粉色，略白，后变橙红色，伤后变暗绿色。菌褶稍延生，分叉，密，幅窄，与菌盖同色，伤后变绿色。乳汁量少，血红色或暗红色，变色为暗绿色。孢子大小 7.4-9.3 ×5.6-7.2 μm，呈广椭圆形，表面有网纹和疣状颗粒，无色，但孢子印呈浅黄色。红汁乳菇是珍惜野生食用菌，与多种树木形成外生菌根。但是将红汁乳菇与板栗进行人工菌根合成的技术尚未见诸报道。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备红汁乳菇菌根的方法，以人工合成的红汁乳菇菌根，方便菌根食用菌的人工栽培。
本发明的技术方案如下：
一种制备红汁乳菇菌根的方法，其包括以下步骤：
A、采用组织分离法，在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述PDA试管斜面培养基组织块上长出菌丝后，将所述菌丝的一部分转接到WYA试管斜面培养基上进行避光培养，然后用WYA试管斜面培养基上避光培养后，得到的纯净红汁乳菇菌丝，将WYA试管中的菌丝体通过液体培养后得到红汁乳菇液体菌剂；或者利用WAY试管菌种进行红汁乳菇的二级种培养，制成固体菌剂；
B、将上述纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体菌剂分别接种到一年苗龄的板栗无菌苗之根系上培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。
所述的方法，其中，所述步骤A具体的包括：待WYA试管斜面培养基长满红汁乳菇菌丝后，显然的也可以直接将其作为再生菌种菌剂备用；但一般采用直径0.5cm的打孔器在WYA试管斜面培养基上打孔，得到菌片，将菌片投入WY培养液中培养，在每250mLWY培养液中加入5-6个菌片，接种后静止24小时-48小时后，在温度为28℃，转速为160r/min的电子恒温震荡箱中，持续培养10天-15天后制得液体菌剂备用。
所述的方法，其中，所述步骤A具体的还包括：待WYA试管斜面培养基长满红汁菇菌丝后，将其接种到二级种培养袋中培养制得固体菌剂备用。
所述的方法，其中，所述步骤A中PDA试管斜面培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
马铃薯为100份-200份，葡萄糖10份-20份，琼脂粉15份-20份，水500份-1000份。
所述的方法，其中，所述步骤A中WYA培养基由葡萄糖、氯化铁、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、盐酸硫铵素、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
葡萄糖800份-1000份，氯化铁1份-10份，氯化钠2份-10份，氯化钙3份-10份，磷酸二氢钾10份-100份，磷酸氢二铵10份-50份，硫酸镁10份-30份，盐酸硫铵素0.1份-1份，琼脂粉1000份-2500份，水500份-2000份。
所述的方法，其中，所述步骤A中WY试管斜面培养基由葡萄糖、氯化铁、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁与盐酸硫铵素组成，其重量份分别为：
葡萄糖800份-1000份，氯化铁1份-10份，氯化钠2份-10份，氯化钙3份-10份，磷酸二氢钾10份-100份，磷酸氢二铵10份-50份，硫酸镁10份-30份，盐酸硫铵素0.1份-1份。
所述的方法，其中，所述步骤B具体的包括：
B1、将板栗种子用0.3-0.5%高锰酸钾浸泡6-8小时表面消毒，之后无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，然后将所述培养盘放置于25℃的培养箱内培养2天，每间隔10小时-14小时用无菌水对培养箱进行保湿。
所述的方法，其中，所述步骤B具体的还包括：
待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。
所述的方法，其中，所述步骤B具体的还包括：所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
本发明提供的一种制备红汁乳菇菌根的方法，通过在适宜条件下种植板栗菌根苗，获得红汁乳菇子实体，为人工栽培红汁乳菇菌根奠定了坚实的基础，方便了人工栽培。
附图说明
图1为本发明中制备红汁乳菇菌根方法的流程示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种制备红汁乳菇菌根的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种制备红汁乳菇菌根的方法，如图1所示的，其包括以下步骤：
步骤101：采用组织分离法，在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述PDA试管斜面培养基组织块儿上长出菌丝后，将其转接到WAY平板试管斜面或平板培养基上进行避光培养，然后通过进一步培养得到以下三种接种菌剂：用WYA平板培养基上避光培养后，得到的纯净红汁乳菇菌丝，直接制作再生菌种作为接种菌剂；将WYA试管中的菌丝体通过液体培养后得到红汁乳菇液体菌剂；利用WAY试管菌种进行红汁乳菇的二级种培养，制成固体菌剂；
步骤102：将上述纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体菌剂分别接种到一年苗龄的板栗无菌苗之根系上培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。通过在适宜条件下种植板栗菌根苗，获得红汁乳菇子实体，使人工栽培红汁乳菇成为可能。
更进一步的，所述步骤102具体的包括：待WYA平板培养基长满红汁乳菇菌丝后，用直径0.5cm的打孔器在WYA试管斜面培养基上打孔，得到菌片，将菌片投入WY培养液中培养，在每250mLWY培养液中加入5-6个菌片，接种后静止24小时-48小时后，在温度为28℃，转速为160r/min的电子恒温震荡箱中，持续培养10天-15天后制得液体菌剂备用。
更进一步的，所述步骤101中PDA试管斜面培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
马铃薯为100份-200份，葡萄糖10份-20份，琼脂粉15份-20份，水500份-1000份。
并且所述步骤101中WYA培养基由葡萄糖、氯化铁、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、盐酸硫铵素、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
葡萄糖800份-1000份，氯化铁1份-10份，氯化钠2份-10份，氯化钙3份-10份，磷酸二氢钾10份-100份，磷酸氢二铵10份-50份，硫酸镁10份-30份，盐酸硫铵素0.1份-1份，琼脂粉1000份-2500份，水500份-2000份。
在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤101中WYA培养基由葡萄糖、氯化铁、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁与盐酸硫铵素组成，其重量份分别为：
葡萄糖800份-1000份，氯化铁1份-10份，氯化钠2份-10份，氯化钙3份-10份，磷酸二氢钾10份-100份，磷酸氢二铵10份-50份，硫酸镁10份-30份，盐酸硫铵素0.1份-1份。
在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤102具体的包括：
将板栗种子用0.3-0.5%高锰酸钾浸泡6-8小时表面消毒，之后无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，然后将所述培养盘放置于25℃的培养箱内培养2天，每间隔10小时-14小时用无菌水对培养箱进行保湿。待其中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。
更进一步的，所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
为了更进一步的描述本发明的方法，其更为详尽的描述为。
实施例1
红汁乳菇子实体鉴别：红汁乳菇的菌盖直径约30 - 100mm，幼时半球形，边缘内卷。渐变，中部下凹或变脐状，菌盖边缘展平，呈浅漏斗状；菌盖表面光滑,湿润时油腻稍粘，无毛，淡红褐色至浅紫红褐色，有水渍状斑点、白色到浅黄色的条纹可形成同心环纹，偶有暗绿色斑点。菌肉幼时淡粉色，略白，后变橙红色，伤后变暗绿色。菌褶稍延生，分叉，密，幅窄，与菌盖同色，伤后变绿色。乳汁量少，血红色或暗红色，变色为暗绿色。孢子大小 7.4-9.3 ×5.6-7.2 μm，呈广椭圆形，表面有网纹和疣状颗粒，无色，但孢子印呈浅黄色。
红汁乳菇菌种分离、纯化：在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待PDA试管斜面培养基的组织块儿上长出菌丝，将其转接到新的WYA试管斜面培养基上，WYA培养基配方为：葡萄糖8g，氯化铁0. 01g，氯化钠0. 025g，氯化钙0.05g，磷酸二氢钾0. 5g，磷酸氢二铵0. 25g，硫酸镁0. 15g，盐酸硫铵素0. 1 mg，琼脂15-20g，水1000mL。
再生菌种菌剂：选用WYA固体培养基，温度28℃，湿度70-75%，避光培养，可以直接制作作为再生菌种菌剂进行接种。
无菌苗培养：用自来水冲洗表面，去除表面泥土、污垢等杂物，于0.3-0.5%高锰酸钾溶液中浸泡6-8h，后用无菌水冲洗三遍后置于无菌容器中催芽，2-3天后，可见板栗种子尖端处有轻微的鼓起，个别出现裂口，并伴有嫩白色芽点发生时，将其播种与事先经121℃，0.1MPa下灭菌120min的培养基质中。
其更为具体的是：待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
接种：将所述再生菌种菌剂接种到一年苗龄的板栗无菌苗根部，培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。
菌根形态观察：将新鲜红汁乳菇菌根置于有水的培养皿中，用MOTIC SMZ-140解剖镜观察外延菌丝并测量并记录。取人工接种3个月的新鲜菌根根尖若干个，固定于FAA固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿两种燃料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜观察红汁乳菇与板栗形成菌根细胞形态结构，并测量拍照。红汁乳菇的新鲜菌根的颜色呈暗橙红色至砖红色，顶部颜色较其他部位颜色略深，成暗红色。菌根呈弯曲或棍棒形，有简单不分枝和树状分枝。菌根系统最长可达53.2 mm，直径25.74 mm；外延菌丝明显，亮淡黄色，菌套明显，细胞不透明；未见菌索与菌核。从菌根横切面可观察到根部细胞外围有致密的菌丝层包被，菌套厚度0.45-1.00 mm，并向内在细胞间隙中延伸，将红汁乳菇菌根与天然红汁乳菇的细胞形态结构进行对比，其结果表明完全一致。
实施例2
红汁乳菇子实体鉴别：红汁乳菇的菌盖直径约30 - 100mm，幼时半球形，边缘内卷。渐变，中部下凹或变脐状，菌盖边缘展平，呈浅漏斗状；菌盖表面光滑,湿润时油腻稍粘，无毛，淡红褐色至浅紫红褐色，有水渍状斑点、白色到浅黄色的条纹可形成同心环纹，偶有暗绿色斑点。菌肉幼时淡粉色，略白，后变橙红色，伤后变暗绿色。菌褶稍延生，分叉，密，幅窄，与菌盖同色，伤后变绿色。乳汁量少，血红色或暗红色，变色为暗绿色。孢子大小 7.4-9.3 ×5.6-7.2 μm，呈广椭圆形，表面有网纹和疣状颗粒，无色，但孢子印呈浅黄色。
红汁乳菇菌种分离、纯化：在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待PDA试管斜面培养基的组织块儿上长出菌丝，将其转接到新的WYA试管斜面培养基上，WYA培养基配方为：葡萄糖8g，氯化铁0. 01g，氯化钠0. 025g，氯化钙0.05g，磷酸二氢钾0. 5g，磷酸氢二铵0. 25g，硫酸镁0. 15g，盐酸硫铵素0. 1 mg，琼脂粉15-20g，水1000mL。
液体菌剂制备：将长满WYA固体培养基的菌丝，用直径0.5cm的打孔器打孔得到菌片，在每250mL培养液中加入5-6个菌片，接种后静止24小时-48小时后放置于温度为28℃，160r/min电子恒温震荡箱中，持续培养10天-15天得到液体菌剂备用。所述培养液选用WY培养基，配方为：葡萄糖8g，氯化铁0. 01g，氯化钠0. 025g，氯化钙0.05g，磷酸二氢钾0. 5g，磷酸氢二铵0. 25g，硫酸镁0. 15g，盐酸硫铵素0. 1 mg。
无菌苗培养：用自来水冲洗表面，去除表面泥土、污垢等杂物，于0.3-0.5%高锰酸钾溶液中浸泡6-8h，后用无菌水冲洗三遍后置于无菌容器中催芽，2-3天后，可见板栗种子尖端处有轻微的鼓起，个别出现裂口，并伴有嫩白色芽点发生时，将其播种与事先经121℃，0.1MPa下灭菌120min的培养基质中。
其更为具体的是：待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
接种：将红汁乳菇液体菌剂接种到一年苗龄的板栗无菌苗根部，培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。
菌根形态观察：将新鲜红汁乳菇菌根置于有水的培养皿中，用MOTIC SMZ-140解剖镜观察外延菌丝并测量并记录。取人工接种3个月的新鲜菌根根尖若干个，固定于FAA固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿两种燃料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜观察红汁乳菇与板栗形成菌根细胞形态结构，并测量拍照。红汁乳菇的新鲜菌根的颜色呈暗橙红色至砖红色，顶部颜色较其他部位颜色略深，成暗红色。菌根呈弯曲或棍棒形，有简单不分枝和树状分枝。菌根系统最长可达53.2 mm，直径25.74 mm；外延菌丝明显，亮淡黄色，菌套明显，细胞不透明；未见菌索与菌核。从菌根横切面可观察到根部细胞外围有致密的菌丝层包被，菌套厚度0.45-1.00 mm，并向内在细胞间隙中延伸，将红汁乳菇菌根与天然红汁乳菇的细胞形态结构进行对比，其结果表明完全一致。
实施例3
红汁乳菇子实体鉴别：红汁乳菇的菌盖直径约30 - 100mm，幼时半球形，边缘内卷。渐变，中部下凹或变脐状，菌盖边缘展平，呈浅漏斗状；菌盖表面光滑，湿润时油腻稍粘，无毛，淡红褐色至浅紫红褐色，有水渍状斑点、白色到浅黄色的条纹可形成同心环纹，偶有暗绿色斑点。菌肉幼时淡粉色，略白，后变橙红色，伤后变暗绿色。菌褶稍延生，分叉，密，幅窄，与菌盖同色，伤后变绿色。乳汁量少，血红色或暗红色，变色为暗绿色。孢子大小 7.4-9.3 ×5.6-7.2 μm，呈广椭圆形，表面有网纹和疣状颗粒，无色，但孢子印呈浅黄色。
红汁乳菇菌种分离、纯化：在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待PDA试管斜面培养基的组织块儿上长出菌丝，将其转接到新的WYA试管斜面培养基上，WYA培养基配方为：葡萄糖8g，氯化铁0. 01g，氯化钠0. 025g，氯化钙0.05g，磷酸二氢钾0. 5g，磷酸氢二铵0. 25g，硫酸镁0. 15g，盐酸硫铵素0. 1 mg，琼脂15-20g，水1000mL。
固体培养：选取二级菌种栽培料，配方为：棉籽壳85g，麦麸13g，石膏2g。选择17×33cm的聚乙烯袋，栽培袋中装入60-80g二级菌种栽培料，相对湿度控制在65%左右，在121℃，0.1MPa下灭菌120min灭菌后，自然冷却后，在无菌条件下将WYA试管斜面培养基的菌种接种到二级菌种栽培料中，在温度28℃、空气湿度为80-90%的条件下避光培养30天-40天，待菌丝长满菌袋后即可作为固体菌剂备用。
无菌苗培养：用自来水冲洗表面，去除表面泥土、污垢等杂物，于0.3-0.5%高锰酸钾溶液中浸泡6-8h，后用无菌水冲洗三遍后置于无菌容器中催芽，2-3天后，可见板栗种子尖端处有轻微的鼓起，个别出现裂口，并伴有嫩白色芽点发生时，将其播种与事先经121℃，0.1MPa下灭菌120min的培养基质中。
其更为具体的是：待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
接种：将所述固体菌剂接种到一年苗龄的板栗无菌苗根部，培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。
菌根形态观察：将新鲜红汁乳菇菌根置于有水的培养皿中，用MOTIC SMZ-140解剖镜观察外延菌丝并测量并记录。取人工接种3个月的新鲜菌根根尖若干个，固定于FAA固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿两种燃料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜观察红汁乳菇与板栗形成菌根细胞形态结构，并测量拍照。红汁乳菇的新鲜菌根的颜色呈暗橙红色至砖红色，顶部颜色较其他部位颜色略深，成暗红色。菌根呈弯曲或棍棒形，有简单不分枝和树状分枝。菌根系统最长可达53.2 mm，直径25.74 mm；外延菌丝明显，亮淡黄色，菌套明显，细胞不透明；未见菌索与菌核。从菌根横切面可观察到根部细胞外围有致密的菌丝层包被，菌套厚度0.45-1.00 mm，并向内在细胞间隙中延伸，将红汁乳菇菌根与天然红汁乳菇的细胞形态结构进行对比，其结果表明完全一致。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种制备红汁乳菇菌根的方法，其包括以下步骤：
A、采用组织分离法，在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述PDA试管斜面培养基组织块上长出菌丝后，将所述菌丝的一部分转接到WYA试管斜面培养基上进行避光培养，然后用WYA试管斜面培养基上避光培养后，得到的纯净红汁乳菇菌丝，将WYA试管中的菌丝体通过液体培养后得到红汁乳菇液体菌剂；或者利用WAY试管菌种进行红汁乳菇的二级种培养，制成固体菌剂；
B、将上述纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体菌剂分别接种到一年苗龄的板栗无菌苗之根系上培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根;
所述步骤A中WYA试管斜面培养基由葡萄糖、氯化铁、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、盐酸硫铵素、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
葡萄糖800份-1000份，氯化铁1份-10份，氯化钠2份-10份，氯化钙3份-10份，磷酸二氢钾10份-100份，磷酸氢二铵10份-50份，硫酸镁10份-30份，盐酸硫铵素0.1份-1份，琼脂粉1000份-2500份，水500份-2000份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括：待WYA试管斜面培养基长满红汁乳菇菌丝后，可以直接作为再生菌种菌剂备用；待WYA试管斜面培养基长满红汁乳菇菌丝后，用直径0.5cm的打孔器在WYA试管斜面培养基上打孔，得到菌片，将菌片投入WY培养液中培养，在每250mLWY培养液中加入5-6个菌片，接种静止24小时-48小时后，在温度为28℃，转速为160r/min的电子恒温震荡箱中，持续培养10天-15天后制得液体菌剂备用；待WYA试管斜面培养基长满红汁乳菇菌丝后，将其接种到二级种培养袋中培养固体菌剂备用；
所述步骤A中WYA试管斜面培养基由葡萄糖、氯化铁、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁与盐酸硫铵素组成，其重量份分别为：
葡萄糖800份-1000份，氯化铁1份-10份，氯化钠2份-10份，氯化钙3份-10份，磷酸二氢钾10份-100份，磷酸氢二铵10份-50份，硫酸镁10份-30份，盐酸硫铵素0.1份-1份。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中PDA试管斜面培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
马铃薯为100份-200份，葡萄糖10份-20份，琼脂粉15份-20份，水500份-1000份。
4.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：
B1、将板栗种子用0.3-0.5%高锰酸钾浸泡6-8小时表面消毒，之后无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，然后将所述培养盘放置于25℃的培养箱内培养2天，每间隔10小时-14小时用无菌水对培养箱进行保湿。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤B具体的还包括：
待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B具体的还包括：所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
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