CN103304624A - 一种多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽的制备方法。该方法包括如下步骤：获得第一多肽片段-第一树脂、第二多肽片段-第二树脂、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段；脱除第二多肽片段-第二树脂中Glu和Lys的侧链保护基，经环化、第一裂解，获得第二多肽片段；依次将第二多肽片段、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得肽树脂，经第二裂解、纯化、冻干，即得。本发明提供的制备方法合成周期短，合成杂质少，易纯化，可提高最终产品的收率。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽的制备方法。
背景技术
脱发是指头发脱落的现象，包括生理性脱发和病理性脱发。生理性脱发是指处于退行期及休止期的毛发脱落的现象，由于进入退行期与新进入生长期的毛发不断处于动态平衡，故能维持正常数量的头发。病理性脱发是指头发异常或过度的脱落，主要原因是人体血液内的热毒排不出来，从而使人体出现某些病症，表现在头发上就是毛囊萎缩，头发脱落，易断，油多无弹性，较为严重的情况是普脱、全脱。按发病机制不同，病理性脱发主要分为神经性脱发、内分泌脱发、营养性脱发、物理性脱发、化学性脱发、感染性脱发、症状性脱发、先天性脱发、免疫性脱发、季节性脱发等。脱发会影响患者的形象，进而影响到人际关系和心理健康，给患者带来极大的痛苦。
目前，治疗脱发的药物主要有米诺地尔、非那雄胺等，但这两种药物均会引发严重的不良反应。其中，米诺地尔用于内服可起降血压的作用，如果外部大剂量使用，该药经皮肤吸收渗透到体内，易导致头痛、低血压；长期内服非那雄胺片治疗脱发可能会导致的副作用包括：男性胸部增大，乳头发育，男性阳痿，阴茎红肿，阴囊疼痛，较严重的是可能导致永久性的内生殖器官突变，影响精子质量，最终导致胎儿发育畸形，部分人长期服用后会产生抑郁症等副作用。因此，开发新型、安全的治疗脱发的药物依然是目前药学研究的热点。
Astressin B是新近发现的可预防和治疗脱发的多肽类药物，分子式为C199H298N52O49，分子量为3962.65，其结构如式I所示，其中，22位的Glu和25位的Lys通过侧链进行酰胺键环化。
Ac-Asp1-Leu2-Thr3-D-Phe4-His5-Leu6-Leu7-Arg8-Glu9-Val10-Leu11-Glu12-Nle1 3-Ala14-Arg15-Ala16-Glu17-Gln18-Cml19-Ala20-Gln21-cyclo(Glu22-Ala23-His24-Lys25)-Asn26-Arg27-Lys28-Leu29-Nle30-Glu31-Cm132-Ile33-NH2
式I
目前，有报道采用Rink Amide树脂，按照Astressin B的肽序逐个偶联，合成完全后再脱除赖氨酸和谷氨酸侧链保护基Alloc和OAll，经固相成环、裂解，得到Astressin B，收率为36%～42%；有报道采用Rink Amide树脂，按照Astressin B的肽序逐个偶联，完成环化结构位置Glu的偶联后，脱除赖氨酸和谷氨酸侧链保护基Alloc和OAll，固相成环，再偶联剩余氨基酸，裂解得到Astressin B；还有报道采用MBHA树脂，利用Boc策略合成AstressinB，收率为3.5%。但利用这几种方法合成Astressin B时，由于在环化过程中多肽片段易发生折叠弯曲，且所用脱除保护基的试剂不易从反应体系中除去，影响后续纯化效果，使最终产品的收率偏低。因此提供一种可提高最终产品收率的Astressin B制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种多肽的制备方法。该方法合成周期短，合成杂质少，易纯化，可提高最终产品的收率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤A：获得第一多肽片段-第一树脂、第二多肽片段-第二树脂、如SEQID NO:3所示的第三多肽片段、如SEQ ID NO:4所示的第四多肽片段、如SEQID NO:5所示的氨基端乙酰化的第五多肽片段；
步骤B：脱除第二多肽片段-第二树脂中Glu和Lys的侧链保护基，经环化、第一裂解，获得如SEQ ID NO:2所示的第二多肽片段；
步骤C：依次将第二多肽片段、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得肽树脂，经第二裂解、纯化、冻干，即得；
第一多肽片段-第一树脂中第一多肽片段的序列如SEQ ID NO:1所示；
其中，第5位氨基酸为Nle，第7位氨基酸为CmI。
在第三多肽片段中，第6位氨基酸为CmI。
在第四多肽片段中，第7位氨基酸为Nle。
在氨基端乙酰化的第五多肽片段中，第4位氨基酸为D-Phe。
多肽的序列如SEQ ID NO:6所示；
其中，第4位氨基酸为D-Phe；第13位氨基酸为Nle；第19位氨基酸为CmI；第30位氨基酸为Nle；第32位氨基酸为CmI；
多肽中22位的Glu和25位的Lys通过侧链进行酰胺键环化。
本发明中的多肽通过先合成五个多肽片段，再将五个多肽片段依次偶联获得，避免了逐个偶联合成方法的环化过程中多肽折叠弯曲的情况，可提高多肽的收率。
第一多肽片段-第一树脂的制备方法为将Fmoc-Ile-OH与树脂偶联得到Fmoc-Ile-树脂，经依次偶联Fmoc-Cml-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，即得；第一多肽片段-第一树脂中的第一多肽片段的序列如SEQ ID NO:1所示。
作为优选，第一多肽片段-第一树脂中的第一树脂为Sieber树脂。
作为优选，第一树脂的替代度为0.4～1.0mmol/g。
作为优选，第一多肽片段-第一树脂中的第一树脂与Ile偶联采用的偶联剂为HOBt与DIPCDI的混合物。
第二多肽片段-第二树脂的制备方法为将Fmoc-Lys(Dde)-OH与树脂偶联得到Fmoc-Lys(Dde)-树脂，经依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(ODMAB)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH，即得；第二多肽片段-第二树脂中第二多肽片段的序列如SEQ ID NO:2所示；
作为优选，第二树脂为2-CTC树脂；
作为优选，第二树脂的替代度为0.5～1.0mmol/g；
在合成第二多肽片段-第二树脂的过程中，依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(ODMAB)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH时，作为优选，偶联采用的偶联剂选自HOBt和DIC的混合物，PyBOP、HOBt和DIEA的混合物，TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
优选地，偶联采用的偶联剂为TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
作为优选，裂解采用的试剂为TFE和DCM的混合物，TFE与DCM的体积比为1:4。
如SEQ ID NO.3所示的第三多肽片段的制备方法为将Fmoc-Ala-OH与树脂偶联得到Fmoc-Ala-树脂，经依次偶联Fmoc-CmI-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH，获得第三多肽片段-树脂，经裂解，即得；
作为优选，树脂为2-CTC树脂；
作为优选，2-CTC树脂的替代度为0.5～1.0mmol/g；
在合成第三多肽片段的过程中，依次偶联Fmoc-CmI-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH时，作为优选，偶联采用的偶联剂选自HOBt和DIC的混合物，PyBOP、HOBt和DIEA的混合物，TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
优选地，偶联采用的偶联剂为TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
作为优选，裂解采用的试剂为TFE和DCM的混合物，TFE与DCM的体积比为1:4。
如SEQ ID NO.4所示的第四多肽片段的制备方法为将Fmoc-Nle-OH与树脂偶联得到Fmoc-Nle-树脂，经依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH，获得第四多肽片段-树脂，经裂解，即得；
作为优选，树脂为2-CTC树脂；
作为优选，2-CTC树脂的替代度为0.5～1.0mmol/g；
在合成第四多肽片段的过程中，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH时，作为优选，偶联采用的偶联剂选自HOBt和DIC的混合物，PyBOP、HOBt和DIEA的混合物，TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
优选地，偶联采用的偶联剂为TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
作为优选，裂解采用的试剂为TFE和DCM的混合物，TFE与DCM的体积比为1:4。
如SEQ ID NO.5所示的氨基端乙酰化的第五多肽片段的制备方法为将Fmoc-Leu-OH与树脂偶联得到Fmoc-Leu-树脂，经依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH，获得第五多肽片段-树脂，经裂解、乙酰化，即得；
作为优选，树脂为2-CTC树脂；
作为优选，2-CTC树脂的替代度为0.5～1.0mmol/g；
在合成氨基端乙酰化的第五多肽片段的过程中，依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH时，作为优选，偶联采用的偶联剂选自HOBt和DIC的混合物，PyBOP、HOBt和DIEA的混合物，TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
优选地，偶联采用的偶联剂为TBTU、HOBt和DIEA的混合物；
作为优选，裂解采用的试剂为TFE和DCM的混合物，TFE与DCM的体积比为1:4。
作为优选，步骤B中脱除采用的试剂为水合肼溶液。
作为优选，水合肼溶液的质量百分浓度为2%。
作为优选，步骤B中环化采用的环化剂选自PyBOP、HOBt和有机碱的混合物，HATU、HOAt和有机碱的混合物，TBTU、HOBt和有机碱的混合物，HBTU、HOBt和有机碱的混合物，HOAt和DIPCDI的混合物，HOBt和DIPCDI的混合物。
作为优选，有机碱选自DIPEA、NMM、TMG或TEA。
作为优选，步骤B中环化采用的溶剂为DMF和/或DCM。
作为优选，步骤B中第一裂解采用的试剂为TFE和DCM的混合物，TFE与DCM的体积比为1:4。
作为优选，步骤C中偶联采用的偶联剂选自PyBOP、HOBt和DIPEA的混合物，HOAt和DIPCDI的混合物，HOBt和DIPCDI的混合物，HATU、HOAt和DIPEA的混合物，TBTU、HOBt和DIPEA的混合物，HBTU、HOBt和DIPEA的混合物。
优选地，偶联的偶联剂为HOAt和DIPCDI的混合物。
作为优选，步骤C中偶联的反应溶剂为DCM、DMF、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
作为优选，步骤C中第二裂解采用的试剂选自TFA、TIS、EDT和H2O的混合物，TFA、PhOMe、TIS、EDT和H2O的混合物。
作为优选，第二裂解的试剂中TFA、PhOMe、TIS、EDT与H2O的体积比为（85～90）:（0～4）:（1～5）:（1～4）:（1～3）。
作为优选，纯化为反相高效液相色谱纯化。
本发明提供了一种多肽的制备方法。该方法包括如下步骤：获得第一多肽片段-第一树脂、第二多肽片段-第二树脂、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段；脱除第二多肽片段-第二树脂中Glu和Lys的侧链保护基，经环化、第一裂解，获得第二多肽片段；依次将第二多肽片段、第三多肽片段、第四多肽片段、氨基端乙酰化的第五多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得肽树脂，经第二裂解、纯化、冻干，即得。本发明提供的制备方法可同时合成几个短片段，缩短了合成周期；利用本发明合成的粗肽收率可达95%以上，精肽收率达45%以上，合成杂质少，易纯化，提高了最终产品的收率。由此可见，本发明提供的制备方法合成周期短，合成杂质少，易纯化，可提高最终产品的收率。
附图说明
图1示实施例24提供的粗肽的HPLC图谱；
图2示实施例24提供的精肽的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
本发明提供的多肽的制备方法中所用原料和试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1第一多肽片段-第一树脂的制备
称取替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Sieber树脂25g（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
称取7.1g Fmoc-Ile-OH（20mmol）和2.97g HOBt（22mmol）用20mLDMF溶解，冰水浴下加入3.4mL DIPCDI（22mmol）活化3min后，加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2h后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-Ile-Sieber树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取7.4g Fmoc-CmI-OH和2.97g HOBt，用25mL DMF溶解，冰水浴下加入3.42mL DIPCDI活化5min，加入到反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-CmI-Ile-Sieber树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，获得H-CmI-Ile-Sieber树脂。
按照上述偶联Fmoc-CmI-OH的方法，在H-CmI-Ile-Sieber树脂上依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)–OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。
当Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联结束后用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，得到第一多肽片段-第一树脂，其第一多肽片段的序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2第一多肽片段-第一树脂的制备
称取替代度为0.7mmol/g的Fmoc-Sieber树脂20g（14mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
称取9.9g Fmoc-Ile-OH（28mmol）和4.2g HOBt（30.8mmol）用30mLDMF溶解，冰水浴下加入4.8mL DIPCDI（30.8mmol）活化3min后，加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2h后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-Ile-Sieber树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取10.4g Fmoc-CmI-OH和4.2g HOBt，用25mL DMF溶解，冰水浴下加入4.8mL DIPCDI活化5min，加入到反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-CmI-Ile-Sieber树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，获得H-CmI-Ile-Sieber树脂。
按照上述偶联Fmoc-CmI-OH的方法，在H-CmI-Ile-Sieber树脂上依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。
当Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联结束后用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，得到第一多肽片段-第一树脂，其第一多肽片段的序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3第一多肽片段-第一树脂的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Fmoc-Sieber树脂20g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
称取14.2g Fmoc-Ile-OH（40mmol）和6.0g HOBt（44mmol）用20mLDMF溶解，冰水浴下加入6.8mL DIPCDI（44mmol）活化3min后，加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2h后，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-Ile-Sieber树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取14.8g Fmoc-CmI-OH和6.0g HOBt，用25mL DMF溶解，冰水浴下加入6.8mL DIPCDI活化5min，加入到反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-CmI-Ile-Sieber树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，获得H-CmI-Ile-Sieber树脂。
按照上述偶联Fmoc-CmI-OH的方法，在H-CmI-Ile-Sieber树脂上依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。
当Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联结束后用DMF洗涤树脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，得到第一多肽片段-第一树脂，其第一多肽片段的序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例4第二多肽片段-第二树脂的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂40g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，取21.3g Fmoc-Lys(Dde)-OH（40mmol）用80mL DMF溶解，冰水浴下加入14.1mL DIPEA（80mmol）活化3min后，加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2h后，加入15mL无水甲醇封闭0.5h。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，获得Fmoc-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。反应结束后，获得H-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
称取Fmoc-His(Trt)-OH24.8g和5.94g HOBt，用90mL DMF溶解，冰水浴下加入DIC6.85mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测法来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，获得H-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
按照上述偶联Fmoc-His(Trt)-OH的方法，在H-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂上偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(ODMAB)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH。用DMF洗涤树脂6次，获得第二多肽片段-第二树脂，其第二多肽片段的序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例5第二多肽片段-第二树脂的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂40g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，取21.3g Fmoc-Lys(Dde)-OH（40mmol）用80mL DMF溶解，冰水浴下加入14.1mL DIPEA（80mmol）活化3min后，加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2h后，加入15mL无水甲醇封闭0.5h。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，获得Fmoc-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。反应结束后，获得H-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
称取Fmoc-His(Trt)-OH24.8g、20.8g PyBOP和5.94g HOBt，用90mL DMF溶解，冰水浴下加入DIEA mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测法来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，获得H-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
按照上述偶联Fmoc-His(Trt)-OH的方法，在H-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂上偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(ODMAB)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH。用DMF洗涤树脂6次，获得第二多肽片段-第二树脂，其第二多肽片段的序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例6第二多肽片段-第二树脂的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂40g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，取21.3g Fmoc-Lys(Dde)-OH（40mmol）用80mL DMF溶解，冰水浴下加入14.1mL DIPEA（80mmol）活化3min后，加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2h后，加入15mL无水甲醇封闭0.5h。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，获得Fmoc-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。反应结束后，获得H-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
称取Fmoc-His(Trt)-OH24.8g、12.8g TBTU和5.94g HOBt，用90mL DMF溶解，冰水浴下加入DIEA mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测法来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，反应结束后，获得H-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂。
按照上述偶联Fmoc-His(Trt)-OH的方法，在H-His(Trt)-Lys(Dde)-2-CTC树脂上偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(ODMAB)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH。用DMF洗涤树脂6次，获得第二多肽片段-第二树脂，其第二多肽片段的序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例7第二多肽片段的制备
向实施例4提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取11.9g HOAt，用200mLDMF溶解，冰水浴下加入DIPCDI13.7mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应8h，反应终点采用茚三酮检测法来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到61.7g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的61.7g环化后的的第二多肽片段-第二树脂，加入到预先配制好的620mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体19.5g，即为序列如SEQID NO:2所示的第二多肽片段，收率80.6%，HPLC纯度为89.2%。
实施例8第二多肽片段的制备
向实施例5提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取33.4gHATU和11.9g HOAt，用200mLDMF溶解，冰水浴下加入DIPEA29mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应5h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到62.6g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的62.6g环化后的第二多肽片段-第二树脂，加入预先配制好的620mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体20.2g，即为序列如SEQ IDNO:2所示的第二多肽片段，收率83.5%，HPLC纯度为91.5%。
实施例9第二多肽片段的制备
向实施例6提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取33.4g HATU和11.9g HOAt，用200mLDMF溶解，冰水浴下加入TMG16.7mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应2.5h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到63.5g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的63.5g环化后的第二多肽片段-第二树脂，加入预先配制好的640mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体21.2g，即为序列如SEQ IDNO:2所示的第二多肽片段，收率87.8%，HPLC纯度为94.5%。
实施例10第二多肽片段的制备
向实施例4提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取41.6g PyBOP和11.9g HOBt，用200mLDMF溶解，冰水浴下加入17.9mL TEA活化5min，加入到反应柱中，室温反应2.5h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到62.9g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的62.9g环化后的第二多肽片段-第二树脂，加入预先配制好的630mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体20.5g，即为序列如SEQ IDNO:2所示的第二多肽片段，收率84.6%，HPLC纯度为92.6%。
实施例11第二多肽片段的制备
向实施例5提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取25.7g TBTU和11.9g HOBt，用160mL DCM溶解，冰水浴下加入NMM17.8mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应5h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到62.1g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的62.1g环化后的第二多肽片段-第二树脂，加入预先配制好的620mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体20.2g，即为序列如SEQ IDNO:2所示的第二多肽片段，收率83.4%，HPLC纯度为91.7%。
实施例12第二多肽片段的制备
向实施例6提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取30.4g HBTU和11.9g HOBt，用200mL DCM溶解，冰水浴下加入TMG20.1mL活化5min，加入到上述固相反应柱中，室温反应2.5h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到62.6g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的62.6g环化后的第二多肽片段-第二树脂，加入预先配制好的640mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体20.8g，即为序列如SEQ IDNO:2所示的第二多肽片段，收率85.8%，HPLC纯度为93.2%。
实施例13第二多肽片段的制备
向实施例4提供的第二多肽片段-第二树脂的固相反应柱中加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入50mL2%水合肼/DMF溶液，反应5min；加入100mL2%水合肼/DMF溶液，反应10min，采用茚三酮检测树脂是否有颜色，有颜色显示Lys的保护基Dde和Glu的保护基ODMAB已脱除。反应结束，DMF洗涤树脂6次，抽干。
称取11.9g HOBt，用80mL DMF和80mL DCM的混合液溶解，冰水浴下加入13.7mL DIPCDI活化5min，加入到反应柱中，室温反应2.5h，反应终点采用茚三酮检测来判断，反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗3次，甲醇收缩，抽干，得到61.3g环化后的第二多肽片段-第二树脂。
将得到的61.3g环化后的第二多肽片段-第二树脂，加入预先配制好的630mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体19.8g，即为序列如SEQ IDNO:2所示的第二多肽片段，收率81.7%，HPLC纯度为87.6%。
实施例14第三多肽片段的制备
称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂25g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，取13.2g Fmoc-Ala-OH（40mmol）用80mL DMF溶解，冰水浴下加入14.1mL DIPEA（80mmol）活化3min后，加入到上述固相反应柱中，反应2h后，加入15mL无水甲醇封闭0.5h。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，获得Fmoc-Ala-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取Fmoc-CmI-OH14.7g和5.94g HOBt，用90mLDMF溶解，冰水浴下加入DIPCDI6.85mL活化5min，加入到反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-CmI-Ala-2-CTC树脂。
加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。反应结束后，获得H-CmI-Ala-2-CTC树脂。
按照上述偶联Fmoc-CmI-OH的方法，在H-CmI-Ala-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH。用DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第三多肽片段-树脂37.2g。
将得到的第三多肽片段-树脂37.2g，加入预先配制好的380mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体24.6g，即序列如SEQ ID NO:3所示的第三多肽片段，收率81.5%，HPLC纯度为91.9%。
实施例15第四多肽片段的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂40g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，取14.2g Fmoc-Nle-OH（40mmol）用80mL DMF溶解，冰水浴下加入14.1mL DIPEA（80mmol）活化3min后，加入到上述固相反应柱中，反应2h后，加入15mL无水甲醇封闭0.5h。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，获得Fmoc-Ala-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH17.1g、12.8g TBTU和5.94g HOBt，用90mLDMF溶解，冰水浴下加入DIPCDI6.85mL活化5min，加入到反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-Glu(OtBu)-Nle-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。反应结束后，获得H-Glu(OtBu)-Nle-2-CTC树脂。
按照上述偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH的方法，在H-Glu(OtBu)-Nle-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH。用DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第四多肽片段-树脂65.6g。
将得到的第四多肽片段-树脂65.6g，加入预先配制好的660mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体24.4g（20mmol），即序列如SEQ ID NO:4所示的第四多肽片段，纯度95.2%，收率83.7%。
实施例16第五多肽片段的制备
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂20g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30min后，取14.2g Fmoc-Leu-OH（40mmol）用80mL DMF溶解，冰水浴下加入14.1mL DIPEA（80mmol）活化3min后，加入到上述固相反应柱中，反应2h后，加入15mL无水甲醇封闭0.5h。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，获得Fmoc-Leu-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取Fmoc-His(Trt)-OH24.8g和21.1g PyBOP和5.94g HOBt，用90mLDMF溶解，冰水浴下加入DIEA mL活化5min，加入到反应柱中，室温反应2h，反应终点采用茚三酮检测来判断（如果树脂无色透明，则反应完全；如果树脂显色则继续反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，获得Fmoc-His(Trt)-Leu-2-CTC树脂。
向上述固相反应柱中加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。反应结束后，获得H-His(Trt)-Leu-2-CTC树脂。
按照上述偶联Fmoc-His(Trt)-OH的方法，在H-His(Trt)-Leu-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH。偶联完毕后，加入吡啶（15.8g，200mmol）和乙酸酐（20.4g，200mmol），乙酰化反应3小时，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到第五多肽片段-树脂42.3g。
将得到的第五多肽片段-树脂42.3g，加入预先配制好的420mL裂解液中，裂解液的配比为TFE：DCM=1：4（V:V），室温裂解2.5h，过滤，30mL DCM洗涤树脂，合并滤液，减压浓缩至40mL，滴加到400mL正己烷析出白色固体，离心抽干得到白色固体19.67g（20mmol），即序列如SEQ ID NO:5所示的第五多肽片段，纯度95.23%，收率86.7%。
实施例17肽树脂的制备
将实施例1制得的第一多肽片段-第一树脂5mmol，加入到固相反应柱中。
称取12.1g实施例7制得的第二多肽片段和1.49g HOAt，用50mL DCM溶解，冰水浴下加入1.7mL DIPCDI活化3min，加入上述固相反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例14得到的15.2g第三多肽片段，HBTU3.8g，HOBt1.49g，用50mL DMF溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例15得到的14.6g第四多肽片段，PyBOP5.2g，HOBt1.49g，用50mL DMF溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入上述固相反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法来判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例16得到的11.2g第五多肽片段，TBTU3.2g，HOBt1.49g，用50mL DMF溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到肽树脂36.9g，树脂增重率为86.3%。
实施例18肽树脂的制备
将实施例2制得的第一多肽片段-第一树脂5mmol，加入到固相反应柱中。
称取12.1g实施例8制得的第二多肽片段和1.49g HOBt，用50mL DCM溶解，冰水浴下加入1.7mL DIPCDI活化3min，加入上述固相反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例14得到的15.2g第三多肽片段，HBTU3.8g，HOBt1.49g，用50mL NMP溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例15得到的14.6g第四多肽片段，PyBOP5.2g，HOBt1.49g，用50mL DMF溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入上述固相反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法来判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例16得到的11.2g第五多肽片段，TBTU3.2g，HOBt1.49g，用50mL DMF溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到肽树脂35.7g，树脂增重率为80.8%。
实施例19肽树脂的制备
将实施例3制得的第一多肽片段-第一树脂5mmol，加入到固相反应柱中。
称取12.1g实施例9制得的第二多肽片段和1.49g HOBt，用50mL DCM和DMSO的混合液溶解，冰水浴下加入1.7mL DIPCDI活化3min，加入上述固相反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例14得到的15.2g第三多肽片段，HBTU3.8g，HOBt1.49g，用50mL NMP和DMF的混合液溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例15得到的14.6g第四多肽片段，PyBOP5.2g，HOBt1.49g，用50mL DMF溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入上述固相反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法来判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100mL，进行2次脱保护，脱保护的时间分别为5min和10min，反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，采用茚三酮检测树脂是否有颜色。
称取实施例16得到的11.2g第五多肽片段，TBTU3.2g，HOBt1.49g，用50mL DMF、NMP和DMSO的混合液溶解，冰水浴下加入3.49mL DIPEA活化3min，加入反应柱中，室温反应3h，反应终点采用茚三酮检测法判断。反应结束后，用DMF洗涤树脂6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，抽干，得到肽树脂36.9g，树脂增重率为86.3%。
实施例20肽树脂的制备
按照实施例19提供的方法，依次将实施例10提供的第二多肽片段、实施例14提供的第三多肽片段、实施例15提供的第四多肽片段、实施例16提供的第五多肽片段依次偶联到实施例1提供的第一多肽片段-第一树脂上，得到肽树脂35.7g，树脂增重率为80.8%。
实施例21肽树脂的制备
按照实施例19提供的方法，依次将实施例11提供的第二多肽片段、实施例14提供的第三多肽片段、实施例15提供的第四多肽片段、实施例16提供的第五多肽片段依次偶联到实施例1提供的第一多肽片段-第一树脂上，得到肽树脂37.2g，树脂增重率为87.0%。
实施例22肽树脂的制备
按照实施例19提供的方法，依次将实施例12提供的第二多肽片段、实施例14提供的第三多肽片段、实施例15提供的第四多肽片段、实施例16提供的第五多肽片段依次偶联到实施例1提供的第一多肽片段-第一树脂上，得到肽树脂35.9g，树脂增重率为84.1%。
实施例23肽树脂的制备
按照实施例19提供的方法，依次将实施例13提供的第二多肽片段、实施例14提供的第三多肽片段、实施例15提供的第四多肽片段、实施例16提供的第五多肽片段依次偶联到实施例1提供的第一多肽片段-第一树脂上，得到肽树脂36.3g，树脂增重率为85.1%。
实施例24多肽的制备
将实施例17得到的肽树脂36.9g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:PhOMe:TIS:EDT:H2O=86:2:5:4:3（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽19.5g，HPLC纯度为80.9%，HPLC图谱如图1所示，图谱数据如表1所示；粗肽收率98.48%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽9.56g，HPLC纯度为99.03%，HPLC图谱如图2所示，图谱数据如表2所示；精肽收率48.2%。
表1粗肽的HPLC检测结果
表2精肽的HPLC检测结果
实施例25多肽的制备
将实施例18制得的肽树脂35.7g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:PhOMe:TIS:EDT:H2O=90:3:3:3:1（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽19.2g，HPLC纯度为85.4%，粗肽收率97.5%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽8.96g，HPLC纯度为99.1%，精肽收率45.1%。粗肽与精肽的HPLC图谱与实施例24提供的图谱相似。
实施例26多肽的制备
将实施例19制得的肽树脂36.9g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:PhOMe:TIS:EDT:H2O=85:4:1:1:2（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽19.4g，HPLC纯度为84.8%，粗肽收率98.0%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽9.18g，HPLC纯度为99.0%，精肽收率46.3%。粗肽与精肽的HPLC图谱与实施例24提供的图谱相似。
实施例27多肽的制备
将实施例20制得的肽树脂35.7g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:TIS:EDT:H2O=88:2:2:2（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽20.1g，HPLC纯度为81.3%，粗肽收率101.5%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽9.02g，HPLC纯度为99.2%，精肽收率45.6%。粗肽与精肽的HPLC图谱与实施例24提供的图谱相似。
实施例28多肽的制备
将实施例21制得的肽树脂37.2g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:PhOMe:TIS:EDT:H2O=87:1:4:1.5:1.5（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽19.7g，HPLC纯度为83.48%，粗肽收率99.5%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽9.74g，HPLC纯度为99.01%，精肽收率49.2%。粗肽与精肽的HPLC图谱与实施例24提供的图谱相似。
实施例29多肽的制备
将实施例22制得的肽树脂35.9g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:PhOMe:TIS:EDT:H2O=89:2.5:2.5:2.5:3（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽19.5g，HPLC纯度为81.3%，粗肽收率98.5%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽9.48g，HPLC纯度为99.0%，精肽收率47.8%。粗肽与精肽的HPLC图谱与实施例24提供的图谱相似。
实施例30多肽的制备
将实施例23制得的肽树脂36.3g，加入到500mL烧瓶中，配制370mL裂解液，裂解液的配比为TFA:PhOMe:TIS:EDT:H2O=90:3:4.5:4:2.5（V:V），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3700mL无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到粗肽18.9g，HPLC纯度为80.5%，粗肽收率95.5%。MALDI-TOF：(M+H)+=3963.5。将得到的粗肽经过RP-HPLC纯化，冻干，得到Astressin B精肽9.1g，HPLC纯度为99.0%，精肽收率45.9%。粗肽与精肽的HPLC图谱与实施例24提供的图谱相似。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：获得第一多肽片段-第一树脂、第二多肽片段-第二树脂、如SEQID NO:3所示的第三多肽片段、如SEQ ID NO:4所示的第四多肽片段、如SEQID NO:5所示的氨基端乙酰化的第五多肽片段；
步骤B：脱除所述第二多肽片段-第二树脂中Glu和Lys的侧链保护基，经环化、第一裂解，获得如SEQ ID NO:2所示的第二多肽片段；
步骤C：依次将所述第二多肽片段、所述第三多肽片段、所述第四多肽片段、所述氨基端乙酰化的第五多肽片段与所述第一多肽片段-第一树脂偶联，获得肽树脂，经第二裂解、纯化、冻干，即得；
所述第一多肽片段-第一树脂中第一多肽片段的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述多肽的序列如SEQ ID NO:6所示；
所述多肽中22位的Glu和25位的Lys通过侧链进行酰胺键环化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一多肽片段-第一树脂中的第一树脂为Sieber树脂。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一多肽片段-第一树脂中的第一树脂与Ile偶联采用的偶联剂为HOBt与DIPCDI的混合物。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中所述环化采用的环化剂选自PyBOP、HOBt和有机碱的混合物，HATU、HOAt和有机碱的混合物，TBTU、HOBt和有机碱的混合物，HBTU、HOBt和有机碱的混合物，HOAt和DIPCDI的混合物，HOBt和DIPCDI的混合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述有机碱选自DIPEA、NMM、TMG或TEA。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中所述环化采用的溶剂为DMF和/或DCM。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中所述偶联采用的偶联剂选自PyBOP、HOBt和DIPEA的混合物，HOAt和DIPCDI的混合物，HOBt和DIPCDI的混合物，HATU、HOAt和DIPEA的混合物，TBTU、HOBt和DIPEA的混合物，HBTU、HOBt和DIPEA的混合物。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中所述偶联的反应溶剂为DCM、DMF、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中所述第二裂解采用的试剂选自TFA、TIS、EDT和H2O的混合物，TFA、PhOMe、TIS、EDT和H2O的混合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述第二裂解的试剂中所述TFA、所述PhOMe、所述TIS、所述EDT与所述H2O的体积比为（85～90）:（0～4）:（1～5）:（1～4）:（1～3）。
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