CN103299825B - 纳他霉素及其组合物在纯化被污染的食用菌菌种上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纳他霉素及其药物组合物在纯化被污染的食用菌菌种上的应用，属于食用菌菌种纯化领域。本发明还公开了含纳他霉素的药物组合物的组成为1ml水中含有纳他霉素4～10μg/ml、细菌类抗生素25～100μg/ml。本发明还公开了纯化被污染的食用菌菌种的方法，即将制备的本发明药物组合物均匀涂布于培养基上，然后在培养皿中央接种被污染的食用菌菌种，在20～28℃下避光培养至菌落直径2～5cm时，观察，用无菌接种针挑无杂菌的尖端菌丝，转移到PDA斜面培养基试管培养5～10天，然后观察没有杂菌的即纯化成功。本发明纳他霉素对被霉菌、酵母等真菌污染的食用菌菌种纯化效果好。其次，本发明方法简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于食用菌菌种提纯方法领域，具体涉及纳他霉素在纯化被污染食用菌菌种上的应用；以及含有纳他霉素的药物组合物在纯化被污染食用菌菌种上的应用。本发明还涉及利用含有纳他霉素的药物组合物纯化被污染食用菌菌种的方法。
背景技术
在我国，食用菌是排在粮、棉、油、菜后的第五大作物，2011年全国总产量达到2571万吨。食用菌栽培过程中，母种(即试管种)是源头，母种必须是无杂菌的，若母种被霉菌、酵母或细菌等任何一类杂菌污染，都会造成惨重的损失。食用菌母种因保藏不当会存在一定比例的杂菌污染现象，杂菌种类包括细菌、酵母、霉菌等。对于细菌污染，通过添加一定量的细菌抗生素(如青霉素、链霉素)后转管，即可以达到纯化目的。但是，对于酵母、霉菌，却常常是束手无策，因为酵母、霉菌和食用菌都属于真菌，通常能抑制酵母、霉菌生长的杀真菌剂，对食用菌菌丝生长也有很强的抑制作用。例如氢氧化铜、多菌灵、代森孟锌、异菌脲、百菌清等，在杀死部分真菌杂菌同时，对香菇、平菇、金针菇菌丝生长均有较强的抑制性（蒋冬花.浙江大学学报，2001，27(3)：321-324），而且对某些真菌(如红曲霉、链霉菌、酵母)抑制效果很差。新洁尔灭、硫酸铜、复合酚、高锰酸钾、煤油、柴油等杀真菌剂有些对链霉菌有一作用，有些没有作用(王波等.食用菌.1998，4：34-35)。7种消毒剂对平菇霉菌抑制效果的研究（王慧阳.中国食用菌，2006，25(3)：29-31)表明甲醛对霉菌抑制效果最好，多菌灵效果次之，之后是克霉灵；而百菌清、甲基托布津、甲霜灵、代森锰锌均不太适宜在平菇生产中当作防霉剂使用。以上试剂(或杀菌剂)要么将食用菌和霉菌、酵母全部一齐杀死，要么对链孢霉、酵母等无抑制效果。
采集野生菌株，通过野生食用菌组织分离是获得食用菌新品种的主要方式。对于子实体比较小或子实体含水量大的种类，如金针菇、木耳、银耳、滑子菇、茶树菇等，在子实体分离纯化食用菌菌丝过程中污染杂菌的机率比较大，因此，这类食用菌迫切需要菌种纯化的方法。
对于细菌类杂菌，常用的抗生素为青霉素类、四环素类、氯霉素等。其中常用的青霉素类药物有：青霉素G、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素（阿莫西林、阿莫仙）或苯唑青霉素等；主要用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性球菌、螺旋体，放线菌感染，对革兰氏阴性杆菌不敏感。常用的四环素类抗生素主要为金霉素、土霉素、四环素及甲烯土霉素、强力霉素或二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架；四环素类是主要抑制细菌蛋白质合成的广谱抗生素，高浓度时具杀菌作用，除了常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌外，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体也对本品敏感。常用的氯霉素（其分子式为C11H12Cl2N2O5）是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，属抑菌性广谱抗生素。敏感菌有肠杆菌科细菌及炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌、李斯特氏菌、葡萄球菌等；衣原体、钩端螺旋体、立克次体也对本品敏感。
对于被霉菌、酵母等真菌污染的食用菌母种，还没有有效的提纯方法。
纳他霉素（英文名称:Natamycin）又称为游链霉素、匹马菌素(Pimaricin)或海松素，是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，它对几乎所有的酵母菌和霉菌都有抗菌活性。纳他霉素是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌、霉菌、丝状真菌抑制剂。因此，纳他霉素通常用于食品的表面防腐。在医学上，纳他霉素被用于治疗真菌感染，包括假丝酵母、曲霉菌、镰刀霉等。经检索，没有发现纳他霉素用于纯化被污染的食用菌菌种的报道。
发明内容
本发明目的在于提供纳他霉素在纯化被污染的食用菌菌种上的用途。
本发明另一目的在于提供一种含有纳他霉素的药物组合物。
本发明第三目的在于提供上述含有纳他霉素的药物组合物在纯化被污染的食用菌菌种上的用途。
本发明第四目的在于提供利用上述含有纳他霉素的药物组合物纯化被污染食用菌菌种的方法。
为实现上述目的，实现本发明的技术方案如下：
纳他霉素在纯化被污染的食用菌菌种上的应用。
所述的纳他霉素（英文名称：Natamycin）又称为游链霉素、匹马菌素(Pimaricin)或海松素，是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，为无色、无味的结晶粉末，其分子式为C33H47NO13。
所述的纳他霉素的化学式为：
上述应用中所述的食用菌是指滑菇(Pholiota nameko)、灵芝(Ganodermalucidum)、肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)、茶树菇(Agrocybecylindracea)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、黑木耳(Auriculariaauricula)、香菇（Lentinus edodes）、白灵菇（）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、金针菇（Flammulina velutipes）、草菇（Volvariella volvacea）、毛木耳（Auricularia polytricha）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、鸡腿菇（Coprinus comatus）或猴头菇（Hericium erinaceum）等食用菌。
上述应用中所述的污染是指真菌污染或真菌与细菌共同污染。
上述应用中所述的真菌是指木霉（Trichoderma spp.）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）或酶母等真菌。
本发明一种含有纳他霉素的药用组合物，由纳他霉素、细菌类抗生素和水组成。
上述含有纳他霉素的药物组合物中，纳他霉素与水之间的质量体积比为4～10μg/ml，细菌类抗生素与水之间的质量体积比为25～100μg/ml。
上述含有纳他霉素的药用组合物中所述的细菌类抗生素是指青霉素类抗生素、四环素类抗生素、氯霉素三类抗生素中之一种或两种以上的组合。
上述含有纳他霉素的药用组合物中所述的青霉素类抗生素是指青霉素G、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素（阿莫西林、阿莫仙）或苯唑青霉素等之一种。
上述含有纳他霉素的药用组合物中所述的四环素类抗生素是指金霉素、土霉素、四环素及甲烯土霉素、强力霉素或二甲胺基四环素等之一种。
上述含有纳他霉素的药用组合物在纯化被污染的食用菌菌种上的应用。
上述应用中所述的污染是指真菌污染或真菌与细菌共同污染。
上述含有纳他霉素的药物组合物的制备方法，包括在室温下，按照质量体积比为4～10μg/ml的比例向无菌水中加入纳他霉素，同时按照质量体积比为25～100μg/ml的比例向无菌水中加入细菌类抗生素，摇匀。于4℃避光保存，备用。
上述含有纳他霉素的药物组合物的使用方法，在使用前临时配制该药物组合物，然后涂抹于PDA培养基上。例如，在培养皿为直径9cm的PDA培养基上涂布上述含有纳他霉素的药物组合物100～200μL，然后在培养基上接种被污染的食用菌菌种，按照常规方法培养。所述的PDA培养基的原料组成成分及其制备方法属于本领域技术人员熟知的常识。
利用上述含有纳他霉素的药物组合物纯化被污染食用菌菌种的方法，包括如下步骤：
（1）、制备含有纳他霉素的药物组合物在室温下，按照质量体积比为4～10μg/ml的比例向无菌水中加入纳他霉素，同时按照质量体积比为25～100μg/ml的比例向无菌水中加入细菌类抗生素，摇匀，得含有纳他霉素的药物组合物，于4℃避光保存，备用；
（2）、在无菌条件下，吸取（1）中制备的含纳他霉素的药物组合物均匀涂布于PDA培养基上；
（3）、将被杂菌污染的直径为3～5mm的食用菌菌种块接种于步骤（2）的PDA培养基中央，在20～28℃下避光培养；当食用菌生长至菌落直径2～5cm时，在10倍物镜下观察菌落边缘菌丝，用火焰灼烧过的无菌接种针挑无杂菌的尖端菌丝，转移到PDA斜面培养基试管中，每个食用菌菌种转接3～5支试管，在20～28℃下培养5～10天，然后观察萌发的食用菌菌丝是否带杂菌，没有杂菌的即纯化成功。
上述方法步骤（2）中所述的涂布的比例为在直径为9cm的培养皿上涂布含纳他霉素的药物组合物100-200μL。
上述方法中所述的PDA培养基、PDA斜面培养基属于本领域技术人员熟知的常识，两者的组成成分及其比例相同。如上述方法中所述PDA培养基的原料组成及其重量比可以为：马铃薯200～300g，葡萄糖10～20g，琼脂15～20g，水1000ml。
上述方法中所述的PDA培养基的制备方法，包括取去皮土豆200～300g，切成直径约1cm的小方块，加水煮沸后保持30min，至土豆块软化，用4层纱布取汁；加入葡萄糖10～20g，琼脂15～20g，补水到1000ml，121℃灭菌30min，冷却至50℃～60℃时倒培养皿，凝固待用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果为：（1）本发明将纳他霉素用于纯化被污染的食用菌菌种，纳他霉素对酵母、霉菌之类的真菌抑制作用很强，而对食用菌的生长抑制作用较弱，解决了被酵母和霉菌等真菌污染的食用菌菌种的纯化问题。（2）本发明将纳他霉素和细菌类的抗生素结合，可以同时解决被细菌和真菌污染的食用菌的纯化问题。（3）本发明被污染食用菌菌种的纯化方法将纳他霉素和PDA培养基结合，将被酵母或霉菌污染的食用菌母种接种到含纳他霉素的PDA培养基上，在20℃～28℃下进行培养，食用菌生长速度很快，而霉菌、酵母生长很慢或基本上不生长，因此菌落边缘的尖端菌丝是无杂菌的纯食用菌菌丝，将尖端菌丝转移到新的PDA斜面，可达到纯化食用菌菌种的目的。（4）本发明方法简单，成本低。
附图说明
图1.为未添加纳他霉素的PDA培养基上接种糙皮侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为糙皮侧耳；3、4为产黄青霉。
图2.为添加4μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种糙皮侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为糙皮侧耳；3、4为产黄青霉
图3.为添加6μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种糙皮侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为糙皮侧耳；3、4为产黄青霉。
图4.为添加8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种糙皮侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为糙皮侧耳；3、4为产黄青霉。
图5.为未添加纳他霉素的PDA培养基上接种肺形侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为肺形侧耳；3、4为产黄青霉。
图6.为添加4μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种肺形侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为肺形侧耳；3、4为产黄青霉。
图7.为添加6μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种肺形侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为肺形侧耳；3、4为产黄青霉。
图8.为添加8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种肺形侧耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为肺形侧耳；3、4为产黄青霉。
图9.为未添加纳他霉素的PDA培养基上接种滑菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为滑菇；3、4为产黄青霉。
图10.为添加4μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种滑菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为滑菇；3、4为产黄青霉。
图11.为添加6μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种滑菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为滑菇；3、4为产黄青霉。
图12.为添加8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种滑菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为滑菇；3、4为产黄青霉。
图13.为未添加纳他霉素的PDA培养基上接种茶树菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为茶树菇；3、4为产黄青霉。
图14.为添加4μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种茶树菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为茶树菇；3、4为产黄青霉。
图15.为添加6μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种茶树菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为茶树菇；3、4为产黄青霉。
图16.为添加8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种茶树菇、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为茶树菇；3、4为产黄青霉。
图17.为未添加纳他霉素的PDA培养基上接种黑木耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为黑木耳；3、4为产黄青霉。
图18.为添加4μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种黑木耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为黑木耳；3、4为产黄青霉。
图19.为添加6μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种黑木耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为黑木耳；3、4为产黄青霉。
图20.为添加8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种黑木耳、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为黑木耳；3、4为产黄青霉。
图21.为未添加纳他霉素的PDA培养基上接种灵芝、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为灵芝；3、4为产黄青霉。
图22.为添加4μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种灵芝、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为灵芝；3、4为产黄青霉。
图23.为添加6μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种灵芝、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为灵芝；3、4为产黄青霉。
图24.为添加8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上接种灵芝、产黄青霉的菌落形态照片；其中1、2为灵芝；3、4为产黄青霉。
图25.为添加或未添加纳他霉素的PDA培养基上接种哈茨木霉、绿色木霉、产黄青霉、酿酒酵母的菌落对比照片；其中培养皿1为添加纳他霉素的；1(a)为哈茨木霉，1(b)为绿色木霉，1(c)为产黄青霉,1(d)为酿酒酵母；培养皿2为未添加纳他霉素的，接种的菌株和位置与培养皿1相同。
图26.为添加或未添加纳他霉素的PDA培养基上接种黑曲霉、黑根霉、总状毛霉、好食脉孢菌的菌落(对比照片；其中培养皿1为添加纳他霉素的，其中1(a)为黑曲霉，1(b)为总状毛霉，1(c)为好食脉孢菌,1(d)为黑根霉；培养皿2为未添加纳他霉素的，其接种的菌株和位置与培养皿1相同。
图27.为添加纳他霉素的PDA培养基上平菇(含霉菌)菌落边缘菌丝的显微照片，其中1为平菇的纯菌丝尖端。
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明作进一步说明，但是不对本发明构成任何限制。下述实施例中，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均为自常规生化试剂商店可以购买得到；下述实施例中涉及的各种食用菌、霉菌和酵母菌等均很容易通过购买或其他公开途径得到。
实施例1不同浓度水平的纳他霉素和氨苄青霉素的PDA培养基制备
按照如下方法进行：
（1）、制备PDA培养基：取去皮土豆200g，切成直径约1cm的小方块，加入约800ml水，煮沸后保持30min，至土豆块软化，用4层纱布取汁，加入葡萄糖20g，琼脂20g，补水到1000ml，121℃灭菌30min，冷却至50℃～60℃时倒培养皿，培养皿直径为9cm，凝固待用。
（2）、制备含有纳他霉素和细菌类抗生素的药物组合物：2个大小为150ml的三角瓶中各装入100ml水，10mm×100mm空试管3支，灭菌后降至室温备用；称取4mg纳他霉素倒入100ml无菌水中，振荡混匀后得到浓度为40μg/ml的纳他霉素溶液，在3支空试管中分别加入9ml、8.5ml、8ml无菌水，依次加入浓度40μg/ml的纳他霉素溶液1ml、1.5ml、2ml，振荡混匀，分别得到浓度为4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml的纳他霉素溶液，再在10ml的0、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml的纳他霉素溶液各加入1mg氨苄青霉素（质量体积比为100μg/ml），摇匀，得含有纳他霉素的药物组合物。于4℃避光保存。
（3）、无菌操作下，向步骤（1）所得的不同PDA培养皿上分别涂布步骤（2）所制备的4种含有纳他霉素的药物组合物200μL，得4种质量体积比水平不同的纳他霉素和氨苄青霉素的PDA培养基；其分别为（a）0μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素；（b）4μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素；（c）6μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素；（d）8μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素。备用。
实施例2纳他霉素对糙皮侧耳和产黄青霉的抑制作用对比试验
按照如下方法进行：
试验方法：取实施例1制备的4种不同浓度水平的纳他霉素的PDA培养基，在相距约3cm的两点接种糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)同一菌株，接种块直径大小为3-5mm，同时在垂直方向相距3cm的两点接种产黄青霉(Penicillium chrysogenum)ACCC30524菌株；在25℃培养5d，观察菌落形态。
结果发现在未添加纳他霉素的PDA培养基上，糙皮侧耳（见图1（1）、图1（2））生长正常，产黄青霉（见图1（3）、图1（4））已经萌发，菌落呈现灰黄色，说明产黄青霉的生长没有受到抑制。在添加4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上，糙皮侧耳（见图2（1）、图2（2）；图3（1）、图3（2）；图4（1）、图4（2））为大的白色菌落，相对于未添加纳他霉素的对照，糙皮侧耳菌丝受到轻微的抑制；产黄青霉（见图2（3）、图2（4）；图3（3）、图3（4）；图4（3）、图4（4））接种点呈现白色，说明产黄青霉未萌发，产黄青霉的生长在3种纳他霉素浓度水平下完全受到抑制。
上述结果说明了纳他霉素浓度水平为4μg/ml时就能完全抑制产黄青霉的生长，而纳他霉素对糙皮侧耳的菌丝生长基本上没有影响。
实施例3纳他霉素对肺形侧耳和产黄青霉菌的抑制作用对比试验
试验方法：取实施例1制备的4种不同浓度水平的纳他霉素的PDA培养基，在相距约3cm的两点接种肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)同一菌株，接种块直径大小为3-5mm，同时在垂直方向相距3cm的两点接种产黄青霉(Penicillium chrysogenum)ACCC30524菌株；在25℃培养5d，观察菌落形态。
结果未添加纳他霉素的PDA培养基上，肺形侧耳（见图5（1）、图5（2））生长正常，产黄青霉（见图5（3）、图5（4））菌丝为灰色，显示产黄青霉已经萌发，菌落呈现灰黄色，说明产黄青霉的生长没有受到抑制。在添加4μg/ml、6μg/ml或8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上，肺形侧耳（见图6（1）、图6（2）；图7（1）、图7（2）；图8（1）、图8（2））为大的白色菌落，相对于未添加纳他霉素的对照，肺形侧耳菌丝受到轻微抑制；产黄青霉（见图6（3）、图6（4）；图7（3）、图7（4）；图8（3）、图8（4））接种点呈现白色，说明产黄青霉未萌发；在纳他霉素浓度水平为4μg/ml、6μg/ml或8μg/ml时，产黄青霉完全受到抑制。
上述结果说明纳他霉素浓度为4μg/ml时就能完全抑制产黄青霉的生长，而纳他霉素对肺形侧耳的菌丝生长基本上没有影响。
实施例4纳他霉素对滑菇和产黄青霉的抑制作用对比试验
试验方法：取实施例1制备的4种不同浓度水平的纳他霉素和氨苄青霉素的PDA培养基，在相距约3cm的两点接种滑菇(Pholiota nameko)同一菌株，接种块直径大小为3-5mm，同时在垂直方向相距3cm的两点接种产黄青霉(Penicillium chrysogenum)ACCC30524菌株；在25℃培养5d，观察菌落形态。
结果在未添加纳他霉素的PDA培养基上，滑菇（见图9（1）、图9（2））表现为白色菌丝，生长正常，产黄青霉（见图9（3）、图9（4））表现为灰色菌丝，产黄青霉已经萌发，菌落呈现灰黄色，说明产黄青霉的生长没有受到抑制。在添加4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上，滑菇（见图10（1）、图10（2）；图11（1）、图11（2）；图12（1）、图12（2））表现为大的白色菌落，相对于未添加纳他霉素的对照，滑菇菌丝受到轻微抑制；产黄青霉（见图10（3）、图10（4）；图11（3）、图11（4）；图12（3）、图12（4））接种点呈现白色，说明产黄青霉未萌发，说明在纳他霉素浓度水平为4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml时，产黄青霉完全受到抑制。
上述结果说明纳他霉素浓度为4μg/ml时就能完全抑制产黄青霉的生长，而纳他霉素对滑菇的菌丝生长基本上没有影响。
实施例5纳他霉素对茶树菇和产黄青霉的抑制作用对比试验
试验方法：取实施例1制备的4种不同浓度水平的纳他霉素和氨苄青霉素的PDA培养基，在相距约3cm的两点接种茶树菇(Agrocybe cylindracea)同一菌株，接种块直径大小为3-5mm，同时在垂直方向相距3cm的两点接种产黄青霉(Penicillium chrysogenum)ACCC30524菌株；在25℃培养5d，观察菌落形态。
结果在未添加纳他霉素的PDA培养基上，茶树菇（见图13（1）、图13（2））表现为白色菌丝，生长正常。产黄青霉（见图13（3）、图13（4））表现为灰色菌丝。产黄青霉已经萌发，菌落呈现灰黄色，说明产黄青霉的生长没有受到抑制。在添加浓度为4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上，茶树菇（见图14（1）、图14（2）；图15（1）、图15（2）；图16（1）、图16（2））为大的白色菌落，相对于未添加纳他霉素的对照，茶树菇菌丝受到轻微抑制；产黄青霉（见图14（3）、图14（4）；图15（3）、图15（4）；图16（3）、图16（4））接种点呈现白色，说明产黄青霉未萌发，在纳他霉素浓度水平为4μg/ml、6μg/ml或8μg/ml时，产黄青霉完全受到抑制。
上述结果说明纳他霉素浓度为4μg/ml时就能完全抑制产黄青霉的生长，而纳他霉素对茶树菇的菌丝生长基本没有影响。
实施例6纳他霉素对黑木耳和产黄青霉的抑制作用对比试验
试验方法：取实施例1制备的4种不同浓度水平的纳他霉素和氨苄青霉素的PDA培养基，在相距约3cm的两点接种黑木耳(Auricularia auricula-judae)同一菌株，接种块直径大小为3-5mm，同时在垂直方向相距3cm的两点接种产黄青霉(Penicillium chrysogenum)ACCC30524菌株；在25℃培养5d，观察菌落形态。
结果在未添加纳他霉素的PDA培养基上，黑木耳（见图17（1）、图17（2））表现为白色菌丝，生长正常，产黄青霉（见图17（3）、图17（4））表现为灰色菌丝，产黄青霉已经萌发，菌落呈现灰黄色，说明产黄青霉的生长没有受到抑制。在添加4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上，黑木耳（见图18（1）、图18（2）；图19（1）、图19（2）；图20（1）、图20（2））表现为大的白色菌落，相对于未添加纳他霉素的对照，黑木耳菌丝受到轻微抑制；产黄青霉（见图18（3）、图18（4）；图19（3）、图19（4）；图20（3）、图20（4））接种点呈现白色，说明产黄青霉未萌发，在纳他霉素浓度水平为4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml时，产黄青霉的生长完全受到抑制。
上述结果说明纳他霉素浓度为4μg/ml时就能完全抑制产黄青霉的生长，而纳他霉素对黑木耳的菌丝生长基本上没有影响。
实施例7纳他霉素对灵芝和产黄青霉的抑制作用对比试验
试验方法：取实施例1制备的4种不同浓度水平的纳他霉素和氨苄青霉素的PDA培养基，在相距约3cm的两点接种灵芝(Ganoderma lucidum)同一菌株，接种块直径大小为3-5mm，同时在垂直方向相距3cm的两点接种产黄青霉(Penicillium chrysogenum)ACCC30524菌株；在25℃培养5d，观察菌落形态。
结果在未添加纳他霉素的PDA培养基上，灵芝（见图21（1）、图21（2））表现为白色菌丝，生长正常；产黄青霉（见图21（3）、（4））表现为灰色菌丝。产黄青霉已经萌发，菌落呈现灰黄色，说明产黄青霉的生长没有受到抑制。在添加4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml纳他霉素的PDA培养基上，灵芝（见图22（1）、图22（2）；图23（1）、图23（2）；图24（1）、图24（2））表现为大的白色菌落，相对于未添加纳他霉素的对照，灵芝菌丝受到轻微抑制；产黄青霉（见图22（3）、图22（4）；图23（3）、图23（4）；图24（3）、图24（4））接种点呈现白色，说明产黄青霉未萌发，在纳他霉素浓度水平为4μg/ml、6μg/ml和8μg/ml时，产黄青霉的生长完全受到抑制。
上述结果说明纳他霉素浓度为4μg/ml时就能完全抑制产黄青霉的生长，而纳他霉素对灵芝的菌丝生长基本上无影响。
实施例8纳他霉素对哈茨木霉等4种食用菌上常见霉菌和酵母菌的抑制作用对比试验
试验方法：在实施例1中制备的涂布有“4μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素”溶液200μL的PDA培养基上同时接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，以涂布浓度为100μg/ml氨苄青霉素溶液200μL的PDA培养基作为对照。
结果（见图25）只涂布“100μg/ml氨苄青霉素溶液”200μL的PDA培养基（图25（2））上很快长满霉菌，而涂布“4μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素溶液”200μL的PDA培养基上，哈茨木霉（图25（1a））、绿色木霉（图25（1b））、产黄青霉（图25（1c））和酿酒酵母（图25（1d））生长均完全受到抑制。
上述结果说明纳他霉素对哈茨木霉、绿色木霉、产黄青霉、酿酒酵母有很强的抑制作用。
实施例9纳他霉素对黑曲霉等4种食用菌上常见霉菌的抑制作用对比试验
试验方法：在涂布“4μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素溶液”200μL的PDA培养基上同时接种黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopusstolonifer var.solonifer)、总状毛霉(Mucor racemosus f.racemosus)、好食脉孢菌(Neurospora sitophila)，以涂布“100μg/ml氨苄青霉素溶液”200μL的PDA培养基作为对照（见图26），25℃培养5d，观察结果。
结果只涂布“100μg/ml氨苄青霉素溶液”200μL的PDA培养基（见图26（2））很快长满霉菌菌种；而涂布“4μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素溶液”200μL的PDA培养基上，黑曲霉（见图26（1a））、黑根霉（见图26（1d））、总状毛霉（见图26（1b））、好食脉孢菌（见图26（1c））生长均受到抑制。
上述结果说明纳他霉素对黑曲霉、黑根霉、总状毛霉、好食脉孢菌有较强的抑制作用。
实施例10用含有纳他霉素的药物组合物纯化被污染的平菇菌种的试验
按照如下方法进行：
（1）按照实施例1中所述方法制备PDA培养基，凝固后涂布含有纳他霉素的药物组合物（其组成为：4μg/ml纳他霉素＋100μg/ml氨苄青霉素的水溶液）200μL；将大小为3-5mm的平菇菌丝块，与哈茨木霉、绿色木霉、产黄青霉、酿酒酵母、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉、好食脉孢菌接触后，接种到培养皿的中央，25℃下培养5d。
（2）在10倍的物镜下，观察菌落尖端菌丝（见图27），用火焰灼烧过的接种针挑无杂菌的尖端菌丝，接种到5支PDA斜面试管中。
（3）将5支试管在25℃培养7～15d，从菌丝萌发开始，观察是否带杂菌。首先剔除有颜色（如黑、红、黄、青、绿等）的试管；将菌丝为纯白色的试管保存，并将菌丝转接到PDA培养皿上，插上无菌的盖玻片，25℃培养；等菌丝爬上盖玻片后，在显微镜下观察菌丝形态，有锁状联合，无霉菌形态的菌丝基本上可认为是无杂菌的平菇菌丝。将以上菌丝接种至PDA培养皿上，接种块大小3～5mm，25℃培养，7～9天长满培养皿的，为正常的平菇菌丝。
以上结果说明利用上述方法将被霉菌和酵母菌污染的平菇菌种纯化，得到无杂菌的平菇菌种。
Claims (1)
1.利用含有纳他霉素的药用组合物纯化被污染食用菌菌种的方法，包括如下步骤：
(1)、在室温下，按照质量体积比为4～10μg/ml的比例向无菌水中加入纳他霉素，再向已加入纳他霉素的无菌水中按照质量体积比为25～100μg/ml的比例加入细菌类抗生素，摇匀，得含有纳他霉素的药物组合物，于4℃避光保存；
(2)、在无菌条件下，吸取(1)中制备的含纳他霉素的药物组合物均匀涂布于PDA培养基上；
(3)、将被杂菌污染的直径为3～5mm的食用菌菌种块接种于步骤(2)的PDA培养基中央，在20～28℃下避光培养；当食用菌生长至菌落直径2～5cm时，在10倍物镜下观察菌落边缘菌丝，用火焰灼烧过的无菌接种针挑无杂菌的尖端菌丝，转移到PDA斜面培养基试管中，每个食用菌菌种转接3～5支试管，在20～28℃下培养5～10天，然后观察萌发的食用菌菌丝是否带杂菌，没有杂菌的即纯化成功。
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