CN103298465B - 升麻消旋体a和其相关化合物用于治疗炎症和调节免疫应答的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可作为5‑脂氧合酶（5‑l.OX）活性和多种促炎介导物如脂氧素、白三烯（例如LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄和LTE₄）、前列腺素和血栓烷的抑制剂使用的升麻消旋体A和其相关化合物。本发明还提供了可用于治疗炎症和炎性病症包括变应性反应、与细胞增殖有关的疾病、新血管发生和心血管疾病的治疗方法和组合物。

Description

升麻消旋体A和其相关化合物用于治疗炎症和调节免疫应答 的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2010年7月30日提交的编号为61/369,428的美国临时申请的权益，所述临时申请以引用的方式全文——包括所有图、表和序列——纳入本文。

本申请的序列表被标记为“As-filed_ST25.txt”，该序列表创建于2011年7月26日，大小2 KB。全部内容均以引用的方式全文纳入本文。

背景技术

主要在白细胞（包含单核细胞和巨噬细胞）中表达的5-脂氧合酶（5-LOX）是促炎的白三烯脂质介导物生物合成中的限速酶。已发现白三烯涉及许多炎性疾病、变应原性反应、与细胞增殖有关的疾病、新血管发生和心血管疾病^2-9。白三烯的生物合成始于5-LOX将花生四烯酸转化为称为白三烯A₄（LTA₄）的环氧化物，白三烯A₄（LTA₄）随后被转化为其他白三烯如白三烯B₄（LTB₄）、白三烯C₄（LTC₄）、白三烯D₄（LTD₄）和白三烯E₄（LTE₄）⁴²。

白三烯是一组可主动募集嗜酸性粒细胞并刺激血浆外渗的局部作用激素，它们是强促炎介导物^20,43。LTB₄——一种不含半胱氨酸的二羟基白三烯——是巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的强化学引诱物⁴⁴。LTB₄引起白细胞的黏附和趋化运动并刺激嗜中性粒细胞的聚集、酶释放及超氧化物产生²。半胱氨酰白三烯（cysLT），例如LTC₄、LTD₄和LTE₄，可引起粘液分泌、细胞迁移、炎性细胞浸润、血管通透性增加、组织水肿、纤毛cliren损伤和支气管狭窄¹⁵。白三烯也可提高结肠黏膜中氯化物的分泌⁴⁵并在许多组织（包括结肠）中引起平滑肌收缩⁴⁶。

据很多文献记载，阻断白三烯的效应将有利于一系列疾病³³。最近发表的研究和病例报告已表明，抗白三烯剂可改善哮喘和非哮喘相关疾病通常伴有的症状，所述哮喘相关疾病包括运动诱发性哮喘、鼻炎、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、慢性荨麻疹、特应性皮炎、变应性真菌病、鼻息肉病和鼻旁窦疾病；所述非哮喘相关疾病包括偏头痛、呼吸道合胞病毒后细支气管炎、系统性肥大细胞增多症、囊性纤维化病、胰腺炎、外阴阴道念珠菌病、癌症、动脉粥样硬化、嗜酸性粒细胞性膀胱炎、中耳炎、包膜挛缩和嗜酸性胃肠道障碍^2-9,13-33。

抑制白三烯还可用于治疗疾病，包括伴有变态反应和炎症的呼吸系统、胃肠系统及皮肤系统的变应原性疾病⁴；肿瘤和癌症如泌尿系统肿瘤（如肾细胞癌、膀胱肿瘤、前列腺癌⁶和睾丸癌）³⁴、胰腺癌⁵；脂肪组织炎症；脑血管和心血管疾病如新血管发生、心肌梗死⁸、急性心肌梗死⁴⁷、中风⁸、动脉粥样硬化⁹、血栓形成、冠状动脉血管成形²⁰、主动脉动脉瘤²⁰、血管炎症²⁰、内膜增生²⁰、高血脂依赖主动脉动脉瘤⁸；囊肿性纤维化肺病²⁷；睡眠障碍性呼吸症²⁴；阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）²⁴、慢性炎性肠病⁴⁸；克罗恩病⁴⁹；变应性鼻炎³³；骨折¹⁶；关节炎；和慢性阻塞性肺病（COPD）^13-15。

白三烯用作强促炎介导物的能力促进了抗白三烯剂的开发，所述抗白三烯剂公认是多种疾病的很具潜力的治疗物。抗白三烯剂分为两个主要类别：白三烯受体拮抗物和合成抑制物³³。虽然白三烯受体拮抗物药物如孟鲁司特、扎鲁司特、普仑司特代表了重要的治疗物进展，特别是在哮喘的治疗中，但是临床研究已表明，这些白三烯受体拮抗物可引起副作用如胃肠功能紊乱、超敏反应、睡眠障碍、出血倾向增加、血管炎疹、肺部症状恶化和心脏并发症。使用孟鲁司特也被报道与Churg-Strauss综合征的高发病率和神经精神紊乱风险的增加有关，其中所述神经精神紊乱包括失眠、激动、攻击性、焦虑、梦异常、幻觉、抑郁症和自杀念头。因此，需要开发有效性和安全性改善的替代抗白三烯剂。

中国人对中医已有2-3千年的实践。中医涉及病理学以及疾病的诊断、治疗和预防。中药药材被记载于很多药典中。草药的经典参考书之一是李时珍于14世纪晚期写的《本草纲目》。该书包括约2500条草药和其他生成物，包括动物和矿物。

在中国、韩国和日本医学中，升麻属的多个种已被用作炎症的治疗物。在亚洲国家，包括中国、日本和韩国，总状升麻（Cimicifuga racemosa，也被称为黑升麻）和其相似物大三叶升麻（Cimicifuga heracleifolia）、升麻（Cimicifuga foetida）和兴安升麻（Cimicifuga dahurica）已被用作中草药来治疗发烧、疼痛和炎症。在美国和加拿大，升麻属种也具有长久且不同的药用历史。因此，几个世纪以来已对人用的草药的毒性及其化学成分的毒性进行了很多测试。

升麻消旋体A——异阿魏酸和3-(30,40-二羟基苯基)-2-酮基-丙醇之间形成的酯——是一种天然存在的化合物，该化合物可从多个升麻属物种包括总状升麻中分离出来。本发明人已鉴定升麻消旋体A可抑制LPS诱导的人巨噬细胞中的TNF-α，并且可抑制LPS诱导的MAP激酶活性¹²。升麻消旋体A可具有额外的健康益处，包括可用作活性氧清除剂³⁵。然而，升麻消旋体A和其相关化合物以前没有被报道过在抑制5-脂氧合酶（5-LOX）活性或白三烯生物合成中发挥作用。

发明内容

本发明涉及式Ⅰ的化合物及包含这些化合物的组合物用作5-脂氧合酶（5-LOX）抑制剂和抗白三烯剂的新用途。所述化合物具有以下结构：

其中

R₁是烷基；

R₂是H或烷基；

R₃、R₄和R₅独立地是-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

R₆是-O或-NH；

R₇是-H、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基或卤素；

R₈、R₉和R₁₂独立地是-H、酰基、卤素、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

R₁₀是H或烷基；并且

R₁₁是H或烷基。

本发明的化合物和组合物可用于治疗炎性疾病、变应原反应、与细胞增殖有关的疾病、新血管发生和心血管疾病。在一些实施方案中，由于这些化合物对5-脂氧合酶和TNF-α的调节效应，它们具有与炎症非特异性相关的免疫调节活性。

本发明的一个实施方案涉及升麻消旋体A的用途。另一个实施方案是从草药例如升麻属种分离出来的升麻消旋体A的用途。有利地，升麻消旋体A强效抑制5-脂氧合酶的活性，并阻断脂氧素、白三烯（如LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄和LTE₄）、前列腺素和血栓素的生物合成。

本发明还涉及药物组合物，所述组合物包括可药用的载体和式I的化合物。在优选的实施方案中，所述组合物包括作为活性成分的式I的化合物。

在一些实施方案中，本发明的化合物和药物组合物可用于治疗或缓解疾病，例如哮喘、运动诱发性哮喘、鼻炎、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、慢性荨麻疹、特应性皮炎、变应性真菌病、鼻息肉病、鼻旁窦疾病、偏头痛、呼吸道合胞病毒后细支气管炎、系统性肥大细胞增多症、囊性纤维变性、胰腺炎、外阴阴道念珠菌病、癌症、动脉粥样硬化、嗜酸性粒细胞性膀胱炎、中耳炎、包膜挛缩和嗜酸性胃肠道障碍。

附图说明

图1A-B示出升麻消旋体A对5-脂氧合酶（5-LOX）和白三烯B₄（LTB₄）产生的抑制效应。

图2示出从总状升麻提取升麻消旋体A（B22EES1-8-3）的方案。将总状升麻（1.8kg）研磨，并通过连续超声处理以500 ml milli-Q水提取1小时。然后，将收集的上清液用乙酸乙酯（EtOAc）（1:1）分级（partition）。将所生成的干燥过的EtOAc提取物重新配制，然后依次用己烷（n-C₆H₁₄）、EtOAc和丁醇（BuOH）进行分级。用生物测定引导分级方案，将对LPS诱导的TNF-α产生显示抑制效应的级分进行硅胶60A（35-75μm）色谱层析和使用梯度洗脱进行反相高效液相色谱层析，直到得到具有抗炎活性的单化合物。

图3A和3B示出B22EES1-8-3的HPLC色谱图和UV吸光度。以1ml min^-1的流速使用25％-90％的乙腈的梯度洗脱，通过反相HPLC纯化所述化合物。（A）使用光电二极管阵列检测器在254、210和280nm下检测单峰值。B22EES1-8-3在约9.4分钟被洗脱。（B）B22EES1-8-3的UV吸光度在290和325 nm下最大，这表明它有共轭芳香系。

图4示出B22EES1-8-3的¹H NMR谱（上图）和¹³C NMR谱（下图）。以氘代甲醇为溶剂，通过Bruker 500 MHz DRX NMR光谱仪在500 MHz（对于¹H NMR）和125.765 MHz（对于¹³CNMR）下操作，来揭示B22EES1-8-3的结构。

图5A和5B示出总状升麻的生物测定指导的级分。以100 μg/ml的不同总状升麻级分处理原代血巨噬细胞（PBMac）持续24小时，然后加入20 ng/ml的LPS维持3小时。随后，进行TNF-α和GAPDH的RT-PCR（A）和定量RT-PCR（B）测定。所示结果代表至少三次独立实验，细胞获自不同的供体。*与相应对照相比P<0.05。

图6A-6B示出B22EES1-8-3和地塞米松对LPS诱导的TNF-α产生的抑制。以（A）140 μΜ B22EES1-8-3或（B）1.3或5.1 μΜ地塞米松（Dex）孵育PBMac 24小时，然后加入1 ng/ml和10 ng/ml LPS再维持24小时。收集培养上清液，并且通过ELISA测定TNF-α。所示结果是6次独立实验的平均值±标准差（S.D.），细胞获自不同的供体。*与相应对照相比P<0.05。

图7A-7C示出升麻消旋体A（B22EES1-8-3）对LPS诱导的ERK1/2和p38 MAP激酶的磷酸化（磷酸基-）及NF-κB p65的核移位的效应。以B22EES1-8-3（140 μΜ）孵育PBMac 24小时，然后加入10 ng/ml LPS另外维持15分钟。收集细胞质蛋白（A、B）和核蛋白（C），用于蛋白质免疫印迹：（A）细胞质蛋白：磷酸-ERK1/2和总ERK1/2。（B）细胞质蛋白：磷酸-p38和总p38激酶。（C）核蛋白：上图，NF-κΒ p65和核纤层蛋白B；下图，显示NF-κΒ P65的凝胶照片中相应带的强度。所示结果代表至少三次独立实验，细胞获自不同的供体。*与相应对照相比P<0.05。

图8A-8B示出CF22EES1-8（A）和CH22EES1-8（B）的HPLC色谱图。依照总状升麻的提取步骤，提取草药升麻和大三叶升麻。将它们的提取物（CF22EES1-8和CH22EES1-8）注入至使用与B22EES1-8-3相同条件的HPLC，并记录色谱图。所述色谱图显示存在保留时间约9.4分钟的化合物（标有*）。

图9A-9C示出（A）B22EES1-8-3、（B）CF22EES1-8和（C）CH22EES1-8的UPLC色谱图和HRESI-MS谱。依照总状升麻的提取步骤，提取草药升麻和大三叶升麻。将它们的级分（CF22EES1-8和CH22EES1-8)注入至使用与B22EES1-8-3相同条件的UPLC偶联的高分辨率ESI-TOF-MS。所述色谱图显示存在保留时间约6分钟、离子峰在357m/z的化合物（标有*）。

序列表说明

SEQ ID NO:1是可用于本发明的引物。

SEQ ID NO:2是可用于本发明的引物。

SEQ ID NO:3是可用于本发明的引物。

SEQ ID NO:4是可用于本发明的引物。

具体实施方式

本发明涉及式I的化合物和含有这些化合物的组合物用作5-脂氧合酶（5-LOX）抑制剂和抗白三烯剂的新用途。本发明的化合物和组合物可用于治疗或改善炎性疾病、变应原反应、与细胞增殖有关的疾病、新血管发生和心血管疾病。本文具体举例的是升麻消旋体A（CimA）的治疗用途。

化合物

本发明提供式I的治疗性化合物，所述化合物是强5-脂氧合酶（5-LOX）抑制剂和抗白三烯剂。所述化合物具有如下结构：

式I

其中

R₁是烷基；

R₂是H或烷基；

R₃、R₄和R₅独立地是-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

R₆是-O或-NH；

R₇是-H、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基或卤素；

R₈、R₉和R₁₂独立地是-H、酰基、卤素、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

R₁₀是H或烷基；并且

R₁₁是H或烷基。

“烷基”是指1-8个碳原子的直链饱和单价基团或3-8个碳原子的支链饱和单价基团。它可包括1-4个或1-3个碳原子的烃基，所述烃基可以是直链的。实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。

“酰基”是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基或环烷基或杂环烷基。实例包括甲酰基、乙酰基、乙羰基等。

“卤素”是指氟、氯、溴或碘，如溴和氯。

“卤代烷基”是指被一个或多个相同或不同卤原子取代的烷基，例如-CH₂Cl、-CH₂Br、-CF₃、-CH₂CH₂Cl、-CH₂CCl₃等。

“氨基”意指基团-NH₂。

“烷基氨基”是指基团-NHR或-NR₂，其中每个R独立地是烷基。实例包括甲氨基、(1-甲基乙基)氨基、甲氨基、二甲氨基、甲基乙基氨基、二(1-甲基乙基)氨基等。

“羟基”意指基团-OH。

“羟基烷基”是指被一个或多个（优选一个、两个或三个）羟基取代的本文所定义的烷基。代表性实例包括但不限于，羟甲基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-(羟甲基)-2-甲基丙基、2-羟丁基、3-羟丁基、4-羟丁基、2,3-二羟丙基、2-羟基-1-羟甲基乙基、2,3-二羟丁基、3,4-二羟丁基和2-(羟甲基)-3-羟基-丙基，优选2-羟乙基、2,3-二羟丙基、1-(羟甲基)-2-羟乙基。

“烷氧基”意指基团-OR_a，其中R_a是烷基。示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

本发明还涉及分离的对映体化合物。本发明化合物的分离的对映体形式基本上彼此不包含（即，对映体过量）。换言之，“R”形式的化合物基本上不含“S”形式的化合物，因此其相对于“S”形式为对映体过量。相反，“S”形式的化合物基本上不含“R”形式的化合物，因此其相对于“R”形式为对映体过量。在本发明的一个实施方案中，所述分离的对映体化合物至少约80%对映体过量。在优选的实施方案中，所述化合物至少约90%对映体过量。在更优选的实施方案中，所述化合物至少约95%对映体过量。在甚至更优选的实施方案中，所述化合物至少约97.5%对映体过量。在最优选的实施方案中，所述化合物至少约99%对映体过量。在上下文中，发明人以引用的方式全文纳入本文国际申请No. PCT/IB 2009/055970。

在一个实施方案中，本发明涉及分离化合物的用途。式I的化合物可从药用植物例如升麻属种——包括总状升麻、大三叶升麻和升麻——分离。

本文使用的“分离的”是指已离开其天然存在的任何环境的化合物。例如，分离的升麻消旋体A不是指存在于升麻属种（如总状升麻）中的升麻消旋体A化合物。在优选的实施方案中，本发明的化合物纯度是至少75%，优选纯度是至少90%，更优选纯度大于95%，最优选纯度大于99%（基本纯的）。

在一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物的治疗用途，其中R₂是H，R₃是H，R₄是H。在另一个实施例中，本发明涉及式I的化合物的治疗用途，其中R₁是甲基。

在具体的实施方案中，本发明涉及升麻消旋体A（Cim A）的治疗性用途，所述升麻消旋体A具有如下结构：

出人意料地，现已发现升麻消旋体A和其相关化合物可高效抑制5-LOX的活性并阻断白三烯如LTB₄的生物合成。已报道5-LOX抑制可阻断多种促炎介导物的生物合成和活性，所述促炎介导物包括脂氧素、白三烯、前列腺素和血栓烷²。尤其地，有很多文献记载抑制5-LOX可阻断白三烯的生物合成。因此，本发明的化合物可用于预防、逆转或改善白三烯诱导的病理病症。

此外，升麻消旋体A和其相关化合物可以抑制醛糖还原酶、环氧合酶、HIV整合酶、肾上腺素（β1）和磷脂酶A2的活性。升麻消旋体A还可用于降低cAMP和CGMP的水平。

此外，本发明人已发现升麻消旋体A可抑制TNF-α诱导并消除MAP激酶和NF-κB活化¹²。TNF-α、MAP激酶和NF-κB是在产生细胞因子和调节很多免疫应答中起到关键作用的介导物。因此，升麻消旋体A也可用于调节TNF-α的下游效应物。

本发明人还已发现，升麻消旋体A对细胞因子调节的效应是通过其在调节信号激酶和转录因子活性中的活性来实现的。升麻消旋体A可抑制促分裂原诱导的炎性应答，这使该分子可用于治疗多种临床病症。因为TNF-α的过量产生是有毒的，并可导致严重的并发症，所以限制所述主要炎性应答有利于临床治疗的患者。

可使用本发明人开发的独特的分离和生物测定指导的步骤从升麻属种（例如总状升麻、大三叶升麻和升麻）分离升麻消旋体A（实施例3-4）¹²。

治疗炎性疾病和/或免疫障碍

本发明提供了用于治疗或改善炎性疾病和/或免疫障碍的方法，尤其是与5-脂氧合酶活性和/或白三烯过量产生相关的疾病或障碍。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或改善炎性疾病和/或免疫障碍的方法，所述疾病和障碍未被公开作为依照国际申请No.PCT/IB2009/055970教导治疗的疾病。

在一些实施方案中，本发明的化合物和组合物可用于治疗或改善病症，所述病症包括但不限于，炎症、变应原性反应、与细胞增殖有关的疾病、新血管发生和心血管疾病。所述方法包括对需要这种治疗的受试者给予有效量的本发明的化合物和组合物。

本发明的化合物和组合物尤其可用于治疗或改善其中抑制脂氧素、白三烯（例如，LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄和LTE₄）、前列腺素和血栓烷的合成和活性对其治疗有益的疾病。

本文使用的术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病症或者能够产生预期治疗效果的量。在一些实施方案中，有效量使5-LOX活性降低5%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%和100%。另外地或可选择地，有效量使脂氧素、白三烯（例如，LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄和LTE₄）、前列腺素和/或血栓烷的水平和/或生物合成降低5%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%和100%。

本文使用的术语“受试者”描述可对其提供本发明的组合物进行治疗的生物体（包括哺乳动物例如灵长类）。可以从所公开的治疗方法受益的哺乳动物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴子；及家养动物如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

本发明的化合物和药物组合物可以用于治疗或改善免疫和/或炎症抑制对其有利的任意疾病、病症或障碍中的炎性症状。可使用本发明的化合物和组合物抑制其中不需要的免疫反应和炎症的炎性疾病、病症和障碍包括但不限于关节炎（包括但不限于类风湿性关节炎）以及免疫和/或炎症抑制对其有利的关节或肌肉骨骼系统的其他疾病、病症或障碍。

本发明的化合物和药物组合物可用于治疗和改善哮喘和哮喘相关疾病，例如运动诱发性哮喘、鼻炎、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、慢性荨麻疹、特应性皮炎、变应性真菌病、鼻息肉病和鼻旁窦疾病。

此外，本发明的化合物和药物组合物可用于治疗或改善非哮喘相关疾病，包括偏头痛、呼吸合胞病毒后细支气管炎、系统性肥大细胞增多症、囊性纤维变性、胰腺炎、外阴阴道念珠菌病、癌症、动脉粥样硬化、嗜酸性粒细胞性膀胱炎、中耳炎、包膜挛缩、嗜酸性胃肠障碍。

此外，本发明的化合物和药物组合物可用于治疗和改善疾病，所述疾病包括伴有变态反应和炎症的呼吸系统、胃肠系统及皮肤系统的变应原性疾病；脂肪组织炎症；慢性炎性肠病；克罗恩病；变应性鼻炎；骨折；关节炎；肿瘤和癌症，如泌尿系统肿瘤（例如，肾细胞癌、膀胱肿瘤、前列腺癌和睾丸癌）、新血管发生和胰腺癌。

此外，本发明的化合物和药物组合物可用于治疗和改善疾病，包括脑血管和心血管疾病如心肌梗死、急性心肌梗死、中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠状动脉血管成形、主动脉动脉瘤、血管炎症、内膜增生、高血脂依赖主动脉动脉瘤；囊性纤维化肺病；睡眠障碍性呼吸症、阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）；和慢性阻塞性肺病（COPD）。

此外，本发明的化合物和药物组合物可用于治疗或改善疾病，包括肺障碍,包括的疾病如哮喘，慢性支气管炎和相关的气道阻塞性疾病；变态反应和变应性反应如变应性鼻炎、接触性皮炎、变应性结膜炎等；炎症如关节炎或炎性肠病；疼痛；皮肤障碍如银屑病、特应性湿疹等；心血管障碍如心绞痛、心肌缺血、高血压、血小板聚集等；免疫或化学（环孢菌素）病因诱导的缺血导致的肾机能不全；偏头痛或丛集性头痛；眼部病症如葡萄膜炎；化学、免疫学或感染刺激所导致的肝炎；创伤或休克状态如烧伤、内毒素血症等；同种异体移植物排斥；慢性肺病如囊性纤维化、支气管炎和其他小气道和大气道疾病和胆囊炎。

此外，所述化合物和组合物可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：动脉粥样硬化；动脉硬化；动脉粥样硬化心脏疾病；再灌注损伤；心脏停搏；心肌梗死；血管炎性障碍包括脑血管疾病（中风）；呼吸窘迫综合征及免疫和/或炎症抑制对其有利的其他心肺疾病、病症或障碍。

此外，所述化合物和组合物可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：消化性溃疡；溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠应激综合征、其他炎性肠病以及免疫炎症抑制对其有利的其他胃肠道疾病、病症或障碍；肝纤维化；肝硬化和免疫和/或炎症抑制对其有利的其他肝脏疾病、病症或障碍；甲状腺炎以及免疫和/或炎症抑制对其有利的其他腺疾病、病症或障碍；肾小球性肾炎以及免疫和/或炎症抑制对其有利的其他肾脏和泌尿系统疾病、病症或障碍。

此外，所述化合物和组合物可用于治疗或改善与以下疾病相关的炎症：创伤后炎症；败血症性休克；免疫和/或炎症抑制对其有利的传染性疾病；免疫和/或炎症抑制对其有利的手术炎性并发症和副作用；免疫和/或炎症抑制对其有利的骨髓移植和其他移植并发症和/或副作用；基因治疗的炎性和/或免疫并发症和副作用，例如由于病毒载体感染；和与获得性免疫缺陷综合征（AIDS）相关的炎症。

而且，所述化合物和组合物还用于抑制与炎症不相关的免疫应答方面相关的巨噬细胞或T细胞。所述化合物和组合物能抑制巨噬细胞或T细胞活性，这些活性包括但不限于巨噬细胞抗原呈递活性、巨噬细胞细胞因子产生、T细胞细胞因子产生、T细胞粘附活性、T细胞增殖等。因此，所述肽、肽衍生物和组合物可用于压抑或抑制体液免疫应答和/或细胞免疫应答。

所述化合物和组合物还可用于通过减少单核细胞和淋巴细胞的量而治疗或改善单核细胞和白细胞的增生性疾病，如白血病。

本发明的化合物和药物组合物还可用于预防和/或治疗以下情况的移植物排斥：移植天然或人工细胞、组织和器官，如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然和人工皮肤组织等。

所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：超敏反应、变应性反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病或者免疫和/或炎症抑制对其有利的其他自身免疫疾病、病症或障碍。

所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：耳炎和免疫和/或炎症抑制对其有利的其他耳鼻咽喉疾病、病症或障碍；皮炎和免疫和/或炎症抑制对其有利的其他皮肤疾病、病症或障碍；牙周病和免疫和/或炎症抑制对其有利的其他牙科疾病、病症或障碍。

此外，所述化合物和组合物还可用于治疗和改善与以下疾病相关的炎症：后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症如视网膜炎和囊样黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、视网膜色素变性、退行性眼底病的免疫和炎性部分、眼外伤的炎性部分、感染引起的眼部炎症、增生性玻璃体视网膜病变、急性缺血性视神经病变、过度疤痕形成例如青光眼滤过手术后的过度疤痕形成、针对眼植入物及免疫和/或炎症抑制对其有利的其他免疫和炎性相关的眼疾病、病症或障碍的免疫和/或炎症反应。

而且，所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病相关的炎症：在中枢神经系统（CNS）以及在任何其他器官中免疫和/或炎症抑制对其有利的自身免疫性疾病、病症或障碍；帕金森病；帕金森病治疗导致的并发症和/或副作用；AIDS相关痴呆复合病（HIV相关脑病）；德维克病；西德纳姆舞蹈病；阿尔茨海默病和免疫和/或炎症抑制对其有利的其他中枢神经系统退行性疾病、病症或障碍；中风的炎性部分；小儿麻痹后期综合征；精神疾病的免疫和炎性部分；脊髓炎；脑炎；亚急性硬化性全脑炎；脑脊髓炎；急性神经病变；亚急性神经病变；慢性神经病变；格林-巴利（Guillain-Barrc）综合征；西德纳姆舞蹈病；重症肌无力；假性脑瘤；唐氏综合征；亨廷顿氏病；肌萎缩脊髓侧索硬化症；中枢神经系统（CNS）压迫、CNS创伤或脑血管意外（中风）或CNS感染或缺氧缺血的炎性部分；肌萎缩和营养不良的炎性部分；以及免疫和/或炎症抑制对其有利的中枢和外周神经系统疾病、病症和障碍。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可用于在已失去免疫赦免的免疫赦免部位（例如脑、眼和睾丸）恢复免疫赦免。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括：确定受试者中一个或多个生物标志物（例如5-LOX、白三烯（如LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄、和LTE₄）、前列腺素、脂氧素、血栓烷、TNF-α、LPS、NF-κB、cAMP、CGMP和MAP激酶）的水平；并且，如果所述一个或多个生物标志物的水平降低可产生有益的治疗效果，就给受试者开具本发明的化合物和组合物。

治疗组合物和制剂

本发明还提供包含可与可药用载体结合形式的本发明化合物的治疗组合物或药物组合物。在上下文中，所述化合物可以是例如分离的或基本纯的。术语“载体”是指与所述化合物一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油如矿物油；植物油如花生油、大豆油、芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射的溶液。对于治疗或改善中枢神经系统的炎症来说，特别优选的药用载体是可穿透血/脑屏障的载体。本文使用的载体不包括以其天然状态存在的天然植物材料。

本发明还涉及所述化合物的前药和代谢物的用途。本文使用的术语“前药”是指本发明化合物的代谢前体或其可药用形式。一般来说，前药包括化合物的功能衍生物，其在被给予至受试者时可以是无活性的，但是在体内可以很容易转换成活性代谢物化合物。用于选择和制备适合前药衍生物的常规方法描述在如，"Design of Prodrugs",ed.H.Bundgaard, Elsevier, 1985中。优选地，本发明的前药可提高本发明的化合物的期望品质，所述品质包括但不限于溶解度、生物利用度和稳定性。因此，如果需要，本发明的方法中使用的化合物可以以前药形式送递。本发明使用的所述化合物的前药可以通过如下方式制备：修饰存在于所述化合物中的官能团，使得修饰物可在常规操作中或在体内被裂解成母体化合物。

术语“代谢物”是指药理活性产物，包括例如通过在受试者中体内代谢本发明化合物产生的活性中间体或终产物。代谢物可以由例如所给予的化合物在受试者体内的合成代谢过程和/或分解代谢过程产生，所述过程包括但不限于氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱脂化、酶解等。

代谢物通常通过如下方法鉴定：制备放射性标记（例如，¹⁴C或³H）同位素的本发明化合物；以可检测的剂量（例如，大于约0.5 mg/kg）将其肠胃外给予动物如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人；给予足够的时间进行代谢（通常约30秒至约30小时），从尿、血液或其他生物样本中分离其转化产物。这些产物是很容易分离的，因为它们是被标记的（其他产物通过使用能结合代谢物中残存表位的抗体来分离）。可用常规方式例如通过MS、LC/MS或NM分析来确定代谢物的结构。一般来说，依照药物代谢研究领域技术人员所熟知的技术可进行代谢物的分析。

合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。根据需要，所述治疗组合物还可包含少量的润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物的形式可以是溶液、悬液、乳剂、片剂、胶囊、粉剂、持续释放的制剂等。所述组合物可以用传统的粘合剂和载体（例如甘油三酯）配制。适合的药物载体的实例描述在 E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。这类组合物包含治疗有效量的治疗组合物与适合量的载体，以便提供适合向患者给予的形式。所述制剂应适合给药方式。

在一个实施方案中，所述组合物是依照常规方法配制成适于对人局部注射给药的药物组合物。通常，用于局部注射给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，所述组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。一般来说，所述成分被单独地提供，或以单位剂型混合在一起，例如为在标示活性剂的量的熔封容器如安瓿或囊中的冻干粉或无水浓缩物。当通过注射给予所述组合物时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以便在给予前混合所述成分。

本发明的治疗性组合物或药物组合物可以配制成中性形式或盐形式。可药用盐包括与游离氨基形成的盐，例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；和与游离的羧基形成的盐，例如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

本发明还提供对所述化合物的修饰，使得所述化合物一旦被给予受试者后更加稳定，即，一旦被给予，其与未修饰的化合物相比具有更长的有效时间。这类修饰（例如微胶囊化等）是本领域的技术人员公知的。在治疗具体疾病、病症或障碍中有效的本发明的治疗组合物或药物组合物的量取决于所述疾病、病症或障碍的性质，可以通过标准临床技术来测定。一般来说，所述剂量范围为约0.001 mg/kg至约500 mg/kg。此外，任选可用体外测定来帮助确定最佳的剂量范围。应用于所述制剂中的精确剂量还取决于给药途径和疾病、病症或障碍的严重度，应该根据医师的判断和每个患者的状况来决定。可以从来自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线外推测有效剂量。例如，为了从基于大鼠研究生成的数据获得用于人的有效mg/kg剂量，将大鼠的有效mg/kg剂量除以6。

例如，合适的单位剂量可以在约0.01至约500 mg、约0.01至约300 mg、约0.01至约200 mg、约0.01至约100 mg、约0.01至约50 mg、约0.01至约30 mg、约0.01至约20 mg、约0.01至约10 mg、约0.01至约5 mg、约0.01至约3 mg、约0.01至约1 mg或约0.01至约0.5 mg之间。这种单位剂量一天可以给药一次以上，例如一天两次或三次。

本发明还提供一种包含一个或多个容器的药包或试剂盒，所述容器装有本发明的药物组合物的一种或多种成分，如化合物、载体。

本发明的化合物也可根据传统的中医药方法配制。通过标准临床技术，在治疗具体疾病、病症或障碍中有效的制剂的组成和剂量将取决于所述疾病、病症或障碍的性质。

处方量的中药易于制成任何适于给予人或动物的药物形式。合适的形式包括，例如酊剂、煎剂和干提取物。这些形式可以口服，也可通过静脉注射或粘膜施用。所述活性成分也可配制成胶囊、颗粒、粉剂、片剂、锭剂、栓剂、口服液、巴氏杀菌的胃肠混悬注射剂、少量或大量注射剂、冷冻的粉末注射剂、巴氏杀菌的粉末注射剂等。所有上述方法对于本领域技术人员都是已知的，记载在书籍中并通常被草药医师使用。

在优选的实施方案中，本发明的化合物可制备成离散单位，例如颗粒（例如，湿颗粒、干颗粒）、胶囊、扁囊剂或片剂，每个离散单位含有预定量的活性成分。

可与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量可以变化，取决于病症类型和待治疗的受试者。一般来说，治疗组合物包含约5%到95%的有效成分（w/w）。更具体的说，治疗组合物包括约20% (w/w)到约80%或约30%到约70%的活性成分(w/w)。

酊剂可通过将药草悬浮在醇溶液（例如葡萄酒或饮料酒）中来制备。悬浮一段时间后，可将所述液体（醇溶液）给药，例如每天两次或三次，一次一茶匙。

煎剂是中药制剂的一种常见形式。煎剂传统上在陶壶中制备，但也在玻璃容器、釉质容器或不锈钢容器中制备。将所述制剂在水中浸泡一段时间，然后使之沸腾并慢沸至水量减少例如一半。

提取物是草药必要组分的浓缩制品。通常，通过将所述草药悬浮在适当选择的溶剂中来从所述草药提取必要组分，所述溶剂通常为水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有机溶剂。提取步骤可借助浸渍、渗滤、再渗滤、逆流萃取、涡流萃取或二氧化碳超临界（温度/压力）萃取被进一步促进。在过滤除去草药碎片后，可借助喷雾干燥、真空烘箱干燥、流体床干燥或冷冻干燥，将所述提取液进一步蒸发并因此浓缩来得到软提取物（浓稠浸出物）和/或最终的干提取物——干燥浸膏。所述软提取物和干提取物可被进一步溶解在合适的液体中至所需的给药浓度或被加工成如丸剂、胶囊、注射剂等的形式。

材料和方法

植物材料

总状升麻购自Glenbrook Farms Herbs and Such，Campbellsville，肯塔基州。大三叶升麻、升麻和兴安升麻购自草药市场并随后通过Purapharm就其真伪进行鉴定。

生物活性成分的提取和分离

植物提取的步骤如图2所示。简言之，将总状升麻（1.8 kg）研磨，匀浆，然后悬浮在milli-Q水（1:5）中，以连续超声处理1小时。通过分析滤纸过滤上清液，然后以乙酸乙酯（EtOAc）（1：1）分级三次。将所得的EtOAc提取物在真空下（35℃）浓缩至干燥，得到暗棕色剩余物14.97克。将所述剩余物重新配制于甲醇（MeOH）中，然后通过与己烷（n-C₆H₁₄）分级进行级分。将所得MeOH级分浓缩并将其重新配制于水中，然后依次用EtOAc和丁醇（n-BuOH）分级。获得了四个级分，即n-C₆H₁₄、EtOAc、n-BuOH和H₂O。

将对LPS诱导的TNF-α产生显示抑制效应的级分使用n-C₆H₁₄、EtOAc和MeOH进行另外的硅胶60A（35-75 μm）色谱层析，产生6个级分。通过反相高效液相层析(HPLC)(Lichrospher 100 RP C18 EC5μ，250×4.6mm ID)，使用流速1ml min^-1的25％至90％的乙腈(CH₃CN)梯度洗脱，进一步纯化所述活性级分。

使用Agilent 1200系列快速扫描光电二极管阵列检测器，在254、210和280 nm下进行峰值检测。在200 nm和300 nm之间以1 nm间隔扫描洗脱峰值，来测定吸光度的最大值和最小值。

通过使用HPLC重复所述纯化步骤，在约9.4分钟洗脱得到单个化合物，所述化合物在290nm和325nm下具有最大UV吸光度，这表明所述化合物有共轭芳香系。该化合物(B22EES1-8-3)显示了抗炎活性。

分子结构的阐明

所生成的纯化合物(B22EES1-8-3)的结构通过如下方式阐明：使用氘代甲醇作为溶剂，使用Bruker 500 MHz DRX NMR核磁共振仪，对于¹H NMR在500 MHz下操作，对于¹³CNMR在125.765 MHz下操作。无畸变极化转移增强(DEPT)实验使用135°的转移脉冲来进行以获得对于CH和CH₃的阳性信号和对于CH₂的阴性信号。

HR-ESI-MS在micrOTOF II 411 ESI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)上进行。以阴性电喷雾(ESI)模式，在100至1600 m/z的扫描区间下，以2 Hz的采样速率获得数据集。ESI参数如下：毛细管，3.2kV；雾化器压力，4bar；干燥415气体流速，8L/min；干燥气体温度，200℃。

所述化合物¹³C NMR谱在下列位点显示信号：δ 68.6(t，C-1)，204.6(s，C-2)，46.4(t，C-3)，126.1(s，C-4)，117.7(d，C-5)，146.7(s，C-6)，145.8(s，C-7)，116.7(d，C-8)，122.1(d，C-9)，168.3(s，C-1’)，115.3(d，C-2’)，147.6(d，C-3’)，128.9(s，C-4’)，114.9(d，C-5’)，148.2(s，C-6’)，151.8(s，C-7’)，112.6(d，C-8’)，123.1(d，C-9’)，和56.5(q，MeO-7’).

此外，在其HR-ESI-MS中，所述化合物在m/z 357.0952显示了【M】-离子峰，这与分子式C19H17O7(计算值357.0974)一致。

使用HPLC-UV和UPLC-TOF-MS测定升麻和大三叶升麻中B22EES 1-8-3的存在情况

依照上文描述的总状升麻的提取步骤提取草药升麻和大三叶升麻。依照分离B22EES1-8-3使用的色谱条件，将草药升麻和大三叶升麻的提取物（CF22EES1-8和CH22EES1-8）注入装配有PDA检测器的HPLC。记录单个样品的色谱图。将CF22EES1-8和CH22EES1-8分别注入装配有Xterra MSC18柱（150*2.1 mmID，3.5522 μm）的Acquity UPLC系统（Waters，美国）。以流速200μl/min，使用25%乙腈（CH₃CN）至90%CH₃CN梯度洗脱来进行色谱分离。用micrOTOF II ESI-TOF质谱仪（Bruker Daltonics）检测洗脱的化合物。以阴性电喷雾（ESI）模式，在100至1600m/z扫描区间下，以2Hz的采样速率获得数据集。ESI参数如下：毛细管，3.2kV；雾化器压力，4bar；干燥气体流速，8L/min；干燥气体温度，200℃。

通过与B22EES 1-8-3的标准物比较其峰值，确定了升麻和大三叶升麻提取物中B22EES 1-8-3的存在情况。

化学试剂

来自大肠杆菌的内毒素（lipopolysacharride，LPS）购自Sigma，并被用作TNF-α表达的诱导物。地塞米松（Sigma）被用作对照药物来抑制TNF-α的LPS诱导。

细胞培养和原代血巨噬细胞分离

通过发明人先前报道中所述的Ficoll-Paque（Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ）密度梯度离心^36-38，从香港红十字会提供的健康供体血液的血沉棕黄层分离出人外周血单核细胞（PBMC）。简言之，以每分钟3000转（rpm）离心所述血沉棕黄层15分钟来分离血细胞和血浆。将热灭活的血清过滤备用。

用磷酸盐缓冲盐水（PBS）以1:1的比例稀释细胞层。将所述稀释的细胞缓慢覆盖于Ficoll-Paque上，并以2300rpm离心20分钟以分开红细胞和单核细胞。将所得单核细胞层移出，并用RPMI 1640培养基洗涤直至上清液清澈。

最后，将所述细胞重悬在补充有5％自体血清的RPMI 1640培养基中，并培养1小时。随后除去非粘附细胞，并将剩下的粘附细胞在37℃、5%二氧化碳(CO₂)下进一步再孵育24h。

使所述粘附单核细胞脱离并将其接种到组织培养平板上，再孵育7-14天，以使原代血单核细胞分化为原代血巨噬细胞（PBMac）。

RNA的分离和反转录

用TRIzol(Invitrogen)提取用或未用总状升麻级分处理的原代血巨噬细胞的总RNA。通过使用Superscript II系统(Invitrogen)依照制造商的说明书将信使RNA(mRNA)反转录(RT)成互补DNA(cDNA)。

聚合酶链式反应(PCR)和实时RT-PCR

靶基因的半定量PCR测定在25 μl的反应混合物中进行，所述混合物包括1.5mMMgCl₂、0.2mM的每种脱氧核苷三磷酸、0.25μM的每种引物、2单位的Taq聚合酶(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和1μl cDNA。为TNF-α和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)设计的引物如下：

TNF-α(上游：5′-GGCTCCAGGCGGTGCTTGTCC-3′(SEQ ID NO：1)；下游：5′-AGACGGCGATGCGGCTGATG-3′(SEQ ID NO：2))，和GAPDH(上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(SEQ ID NO：3)；

下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(SEQ ID NO：4).

PCR热循环条件是94℃维持30秒；6℃维持30秒和72℃维持1分钟。所述循环反应重复24个循环以上。

使用Applied BiosystemsUniversal Master Mix依照制造商的说明书进行定量RT-PCR。探针购自Applied Biosystems，将18s RNA用作内部对照。在每个定量RT-PCR测定中，对样品进行三次重复。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

以不同的时间间隔收集LBS处理的PBMac(经或未经B22EES1-8-3预处理)的培养物上清，并储存在-70℃。用对TNF-α特异的ELISA试剂盒(R&D system，Minneapolis，MN)测定所分泌的TNF-α的水平。

细胞提取物的制备

为了收集全细胞裂解物，用冷的PBS洗涤PBMac，并在冷裂解缓冲液(50 mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-C1)(pH7.4)；150 mM氯化钠(NaCl)；50 mM氟化钠(NaF)；10 mM的β-磷酸甘油；0.1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)；10％甘油；1％Triton X-100；1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)；1 mM原钒酸钠；2μg/ml胃酶抑制剂A；2μg/ml抑肽酶;和2 μg/ml亮抑蛋白酶肽）中孵育20分钟。然后，将所述裂解物在4℃离心20分钟。收集上清并将其储存在-70℃下直至使用。

为了收集细胞核蛋白提取物，用PBS洗涤处理过的细胞，并重悬于缓冲液A（10 mM4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（pH7.9），10 mM氯化钾（KCl），0.1 mM EDTA，0.1 mM乙二醇四乙酸（EGTA）。1 mM二硫苏糖醇（DTT），0.5 mM苯甲磺酰氟或苯甲基磺酰氟（PMSF），2 μg抑肽酶，1 mM原钒酸钠，2 μg/ml胃酶抑制剂A，2 μg/ml亮抑蛋白酶肽和50 mM氟化钠）中维持15分钟。之后，加入NP-40至终浓度为0.625％，并剧烈混合进行细胞裂解。

离心所述细胞裂解物并收集含有细胞质蛋白的上清，储存于-70℃。用缓冲液C（20mM HEPES（pH 7.9），0.4 M NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1 mM DTT和1 mM PMSF）重悬细胞核片状沉淀物，在冰上维持15分钟以完成核膜的裂解。然后，离心细胞核裂解物，收集含有细胞核蛋白的上清液并储存于-70℃。

蛋白质免疫印迹分析

将全细胞裂解物（20 μg）或细胞核蛋白（2 μg）通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转移到硝酸纤维素上，用于分别使用磷酸化形式的或完整形式的ERK1/2和p38 MAPK特异性抗体（Cell Signaling Technology，Beverly, MA）、磷酸化形式的或完整形式的NF-κB p65蛋白和核纤层蛋白B特异性抗体（Santa CruzBiotechnology.Santa Cruz,CA）探测过夜。将所述膜与偶联辣根过氧化物酶的相应二抗（BD Transduction Lab, San Diego, CA）孵育。信号可通过使用增强的化学发光试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech公司）显示。为了量化蛋白质免疫印迹的结果，将胶扫描并用BioRad的计算机程序Quantity One分析条带的强度。

5-LOX抑制剂的筛选测定

5-LOX抑制测定使用Cayman的脂氧合酶抑制剂筛选测定试剂盒（Cayman ChemicalCompany，Ann Arbor,MI）依照制造商的说明书来进行。在DMSO（对照）和浓度为12.5-50 μg/ml的升麻消旋体A的存在下，将5-LOX酶和亚油酸（底物）一起加入。孵育5分钟后，加入显影剂。用酶标仪在波长490 nm处，检测和定量过氧化氢物的产生。5-LOX的酶活以nmol/min/ml计算。

活化的人血单核细胞中白三烯B₄的产生

将新鲜分离的人血单核细胞（PBMC）（1 × 10⁷）用0.05%的DMSO或升麻消旋体A（25或50 μg/ml）预处理1小时，然后加入5 μΜ钙离子载体A23187（Sigma Aldrich，St. Louis,MO）处理30分钟。离心1分钟后，收集上清。用LTB₄参数测定试剂盒（R＆D Systems，Minneapolis, MN）检测白三烯B₄（LTB₄）的水平。

本发明的范围不限于本文中相关的具体实施例以及建议的步骤和用途，原因是本领域的技术人员可根据本说明书提供的信息在这个范围内作出修改。

对本发明更完整的理解可以通过参考本发明的化合物、组合物和方法的以下具体实施例获得。如下实施例说明了实施本发明的步骤。这些实施例不应被解释为限制。对本发明技术人员来说很清楚的是，所述实施例涉及使用可市购获自已知来源（例如化学品库房）的材料和试剂，因此未提供关于它们的详细信息。

实施例1—升麻消旋体A作为脂氧合酶抑制剂的预测

相似性集成方法（SEA）——美国加州大学旧金山分校（UCSF）药物化学系的Shoichet实验室提供的一个搜索工具——基于其配体之间的步进（set-wise）相似性定量地将靶蛋白药理学分组并关联靶蛋白药理学^1-10。配体之间的相似性值用期望值（E-值）表示，该值可用来补充BLAST产生的化学相似性的值^1,10-11。

用升麻消旋体A作为查询化合物进行SEA搜索，产生升麻消旋体A和所述靶蛋白的配体之间的E-值。还计算了化学相似性的Tanimoto系数（Tc）。E-值小于1×10^-10表明显著的相似性，而E-值大于1.0表明不显著的相似性。Tc值在0到0.5之间表明不明显的相似性，而Tc大于0.5表明明显的相似性。

SEA结果表明，升麻消旋体A对葡萄糖醛酸酶（β）、脂氧合酶（LOX）、醛糖还原酶、环氧合酶、HIV整合酶，肾上腺素（β1）和磷脂酶A2具有抑制效应。具体地，升麻消旋体A作为葡萄糖醛酸酶（β）抑制剂和脂氧合酶抑制剂的E-值分别是2.23×10^-16和8.65×10^-9（表1），表明升麻消旋体A与葡萄糖醛酸酶之间及与脂氧合酶抑制剂之间有显著的相似性。脂氧合酶抑制剂的Tc值是0.53——为所有蛋白抑制剂的最大Tc值（表1），也表明升麻消旋体A是脂氧合酶的抑制剂。

实施例2—升麻消旋体A对5-脂氧合酶活性的抑制效应的确定

本实施例证明了升麻消旋体A强抑制5-LOX活性。简言之,5-LOX抑制测定通过使用Cayman的脂氧合酶抑制剂筛选测定试剂盒（Cayman Chemical Company，Ann Arbor, MI）依照制造商的说明书来进行。将5-LOX和亚油酸（底物）同时分别加入二甲基亚砜（DMSO）（对照）或浓度为12.5、25和50 μg/ml的升麻消旋体A中。孵育5分钟后，加入5-LOX抑制测定的显影剂。用酶标仪在波长490 nm下测量过氧化氢物产生。5-LOX的酶活以nmol/min/ml计算。结果显示升麻消旋体以剂量依赖的方式强抑制5-LOX活性（图1A）。

实施例3—升麻消旋体A对LTB₄产生的抑制效应的确定

本实施例研究了升麻消旋体A对LTB₄产生的效应。简言之，将新鲜分离的人血单核细胞（PBMC）（1×10⁷）用0.05%的DMSO或升麻消旋体A（25或50 μg/ml）预处理1小时，然后加入浓度5 μΜ的钙离子载体A23187（Sigma Aldrich，St.Louis,MO）处理30分钟。离心1分钟后，收集上清液。使用LTB₄测定试剂盒（R＆D Systems，Minneapolis,MN）测量白三烯B₄（LTB₄）的水平。结果（如图1B所示）证明，升麻消旋体A以剂量依赖的方式抑制LTB₄的产生。

实施例4—从升麻属种提取升麻消旋体A

通过反复分级从总状升麻根茎制备的EtOAc级分并随后在硅胶柱和反相HPLC上进行层析，得到浅棕色粉末。详细步骤总结在图2中。

使用HPLC，在大约9.4分钟洗脱所述化合物，其为在波长254、210和280 nm下具有UV吸光度的单化合物（图3A）。在图3B中，所述化合物的UV吸光度在290和325 nm最大，这表明它具有共轭芳香系。所述化合物在其HR-ESI-MS中显示m/z 357.0952的[M]^-离子峰。与¹H和¹³C谱数据（图4）一块，它被阐明为升麻消旋体A（B22EES1-8-3）。

实施例5—生物测定

确认了总状升麻中抑制LPS诱导的TNF-α表达的化合物。LPS是已知的强TNF-α诱导物，不使用细胞毒性试剂不容易抑制它的效应。

在原代巨噬细胞中，细菌内毒素（脂多糖，LPS）对TNF-α诱导的刺激被用作炎性疾病的模型，因为TNF-α的产生是关键免疫应答的标志。

将从总状升麻分离出来的单个提取物与PBMac孵育24小时，然后加入LPS再维持3小时。将所处理样品的总RNA分离，并用特异性人TNF-α引物进行RT-PCR测定。结果显示，级分B22EES1可抑制LPS诱导的TNF-α mRNA的表达（图5A，泳道2和4）。在B22EES1的亚级分中，只有B22EES1-4和B22EES1-8保留了对于TNF-α诱导的抑制活性（图5A，泳道12和20）。

实施例6—升麻消旋体A对LPS诱导的细胞因子产生的效应

在鉴定B22EES1-8对TNF-α的抑制效应后，上述B22EES1-8亚级分的活性被分离和分析。单分子，即升麻消旋体A（B22EES1-8-3）被发现是草药提取物中具有抗炎效应的活性化合物。

为了确认升麻消旋体A在抑制TNF-α产生中的活性，将升麻消旋体A与PBMac孵育24小时，然后加入浓度1 ng/ml和10 ng/ml的LPS维持24小时。收集培养上清液，并通过ELISA检测分泌的TNF-α的水平。

在1 ng/ml和10 ng/ml的LPS浓度下，升麻消旋体A分别抑制了LPS诱导的TNF-α蛋白产生47±19%和58±30%（图6A，泳道4与泳道5相比，泳道6与泳道7相比）。

为了进一步比较升麻消旋体A与现有药物的有效性，将地塞米松（一种强免疫抑制性皮质类固醇）用作原型。将PBMac用地塞米松处理24小时，然后加入浓度1 ng/ml和l0 ng/ml的LPS 维持24小时。

结果证明，在1.3和1.5 μΜ的浓度下，地塞米松分别导致LPS诱导的TNF-α产生被显著抑制32±7.5%和25±6.3%（图6B）。

实施例7—升麻消旋体A下调细胞因子的分子机制

阐明了升麻消旋体A抑制LPS诱导的TNF-α产生中涉及的分子通路。已经有文献很好的证明，在LPS处理的细胞中，细胞因子产生的活化被LPS结合到其受体起始³⁹。在结合到所述受体后，信号激酶的级联被活化。在被活化的激酶中，MAP激酶在LPS诱导的细胞因子产生中起到关键作用。以前的研究表明，由LPS和其他病原体诱导TNF-α需要ERK1/2和p38MAPK的磷酸化和活化^36,38,40。

为了研究MAP激酶在升麻消旋体A抑制TNF-α产生中的作用，将PBMac以升麻消旋体A处理24小时，然后加入LPS维持15分钟。随后收集蛋白质样品并进行蛋白质免疫印迹。

结果表明，LPS处理导致了两种不同MAP激酶（即ERK1/2和p38 MAPK）的磷酸化（图7，泳道2）。以升麻消旋体A预处理，LPS诱导的ERK1/2的磷酸化被抑制（图7A，泳道2与泳道4相比），而LPS诱导的P38 MAPK的磷酸化未被抑制（图7B，泳道2与泳道4相比）。

这些结果证明，升麻消旋体A的抗炎活性可能部分地由于其对ERK1/2磷酸化的抑制。

在对LPS处理的反应中MAP激酶调节的信号传递通路中，转录因子NF-κB的活化在诱导促炎细胞因子（包括TNF-α）中起关键作用⁴¹。NF-κB的活化涉及其特异性抑制剂IκB的降解以及NF-κB亚基从细胞质到细胞核的移位。根据本发明，加入升麻消旋体A维持24小时后加入LPS减少了NF-κB p65亚基移位进入细胞核。

结果表明，将升麻消旋体A加入PBMac维持24小时后加入LPS减少了细胞核级分中p65NF-κB的量（图7C，泳道2与泳道4相比），表明p65NF-κB移位到细胞核被升麻消旋体A抑制。一般而言，升麻消旋体A可抑制LPS诱导的激酶活性及它们随后对用于TNF-α转录的核转录因子的活化。因此，本发明的化合物可用于调节与炎性病症相关的细胞事件级联（cascade）中NF-κB和/或ERK1/2下游的细胞内和/或细胞外活性。

实施例8—使用HPLC-UV确定升麻和大三叶升麻中升麻消旋体A的存在

在相同HPLC条件下，将升麻消旋体A的保留时间和UV吸光度与CF22EES1和CH22EES1-8色谱图中的特征峰进行比较。在图8A和B中，两个样品都具有保留时间约9.4分钟的峰，并且它们各自的UV吸光度与升麻消旋体A的UV吸光度相同（图3A和B）。这些结果表明，包括升麻和大三叶升麻的草药含有升麻消旋体A。

实施例9—使用UPLC-TOF-MS测定升麻和大三叶升麻中升麻消旋体A的存在

在相同UPLC和ESI-MS条件下，将B8-3（升麻消旋体A）的保留时间和质荷比与CF22EES 1-8和CH22EES1-8色谱图和谱中的特征峰进行比较。在图9B和C中，两个样品都具有保留时间约6分钟的峰，具有在m/z 357的离子峰，这些均与升麻消旋体A相同（图9A）。这些结果表明，包括升麻和大三叶升麻的草药含有B8-3（升麻消旋体A）。

参考文献

1.Keiser，M.J.et al.，“Relating protein pharmacology by ligandchemistry，”Nature Biotechnol.February 7，2007，pp.197-206，Vol.25，No.2.

2.Samuelsson，B.，“Leukotrienes：Mediators of Immediate HypersensitivityReactions and Inflammation，”Science，May 6，1983，pp.568-575，Vol.220，No.4597.

3.Weissmann，G.，“Prostaglandins as Modulators Rather than Mediators ofInflammation”J.LipidMediators，March-April 1993，pp.275-286，Vol.6，Nos.1-3.

4.Jampilek，J.；Dolezal，M.；Opletalova，V.；Hartl，J.，“5-Lipoxygenase，Leukotrienes Biosynthesis and Potential Antileukotrienic Agents，”Curr.Med.Chem.，January 15，2006，pp.117-129，Vol.13，No.2.

5.Ding，X.-Z.；Hennig，R.；Adrian，T.E.，“Lipoxygenase and cyclooxygenasemetabolism：new insights in treatment and chemoprevention of pancreaticcancer，”Mol.Cancer，January 7，2003，pp.1-12，Vol.2，No.10.

6.Pommery，N.；Taverne，T.；Telliez，A.；Goossens，L.；Charlier，C.；Pommery，J.；Goossens，J.-F.；Houssin，R.；Durant，F.；He’nichart，J.-P.，“New COX-2/5-LOXInhibitors：Apoptosis-Inducing Agents Potentially Useful in Prostate CancerChemotherapy，”J. Med.Chem.，October 30，2004，pp.6195-6206，Vol.47，No.25.

7.Mehrabian，M.；Allayee，H.，“5-Lipoxygenase and atherosclerosis，”Curr.Opin.Lipidol.October 2003，pp.447-457，Vol.14，No.5.

8.Zhao，L.；Funk，C.D.，“Lipoxygenase Pathways in Atherogenesis，”TrendsCardiovasc.Med.，July 2004，pp.191-195，Vol.14，No.5.

9.Dwyer，J.H.；Allayee，H.；Dwyer，K.M.；Fan，J.；Wu，H.；Mar，R.；Lusis，A.J.；Mehrabian，M.，“Arachidonate 5-Lipoxygenase Promoter Genotype，DietaryArachidonic Acid，and Atherosclerosis，”N.Engl.J. Med. January 1，2004，pp.29-37，Vol.350，No.1.

10.Altschul，S.F.；Gish，W.；Miller，W.；Myers，E.W.；Lipman，D.J.，“Basiclocal alignment search tool，”J.Mol.Biol.，October 5，1990，pp.403-410，Vol.215，No.3.

11.Hert，J.；Keiser，M.J.；Irwin，J.J.；Oprea，T.I.；Shoichet，B.K.，“Quantifying the Relationships among Drug Classes，”J.Chem.Inf.Model，March 13，2008，pp.755-765，Vol.48，No.4.

12.Yang CL，Chik SC，Li JC，Cheung BK，Lau AS.“Identification of thebioactive constituent and its mechanisms of action in mediating the anti-inflammatory effects of black cohosh and related Cimicifuga species on humanprimary blood macrophages，”J.Med.Chem.，November 12，2009，pp.6707-6715，Vol.52，No.21.

13.Gueli N，Verrusio W，Linguanti A，De Santis W，Canitano N，Ippoliti F，Marigliano V，Cacciafesta M.，“Montelukast therapy and psychological di stressin chronic obstructive pulmonary disease(COPD)：A preliminary report，”ArchGerontolGeriatr.，May 15，2010PMID：20478636

14.Interactive inhibitory effects of formoterol and montelukast onactivatedhuman neutrophils.Gravett CM，TheronAJ，Steel HC，Tintinger GR，CockeranR，Feldman C，Anderson R.Eur Respir J.2010 Apr 22.[Epub ahead ofprint]PMID：20413544

15.Targeting leukotrienes for the treatment of COPD？Drakatos P，Lykouras D，Sampsonas F，Karkoulias K，Spiropoulos K.Inflamm Allergy Drug Targets.2009 Sep；8(4)：297-306.PMID：19754414

16.Enhanced fracture repair by leukotriene antagonism ischaracterized by increased chondrocyte proliferation and early boneformation：a novel role of the cysteinyl LT-1receptor.Wixted JJ，Fanning PJ，Gaur T，O′Connell SL，SilvaJ，Mason-SavasA，Ayers DC，Stein GS，Lian JB.J CellPhysiol.2009 Oct；221(1)：31-9.PMID：19544365.

17.Cysteinyl leukotrienes enhance the degranulation of bone marrow-derived mast cells through the autocrine mechanism.Kaneko I，Suzuki K，MatsuoK，Kumagai H，Owada Y，Noguchi N，Hishinuma T，OnoM.Tohoku J Exp Med.2009 Mar；217(3)：185-91.PMID：19282653

18.15-lipoxygenase metabolites play an important role in thedevelopment of a T-helper type 1 allergic inflammation induced by double-stranded RNA.Jeon SG，Moon HG，Kim YS，Choi JP，Shin TS，Hong SW，Tae YM，Kim SH，ZhuZ，Gho YS，Kim YK.Clin Exp Allergy.2009 Jun；39(6)：908-17.Epub 2009 Feb 25.PMID：19260872

19.Montelukast inhibits neutrophil pro-inflammatory activity by acyclic AMP-dependent mechanism.Anderson R，Theron AJ，Gravett CM，Steel HC，Tintinger GR，Feldman C.Br J Pharmacol.2009 Jan；156(1)：105-15.Epub 2008 Dec6.PMID：19068077

20.Leukotriene modifiers in the treatment of cardiovasculardiseases.Riccioni G，Capra V，D′Orazio N，Bucciarelli T，Bazzano LA.J LeukocBiol.2008 Dec；84(6)：1374-8.Epub 2008Sep 15.Review.PMID：18794213

21.ATP-dependent transport of leukotrienes B4 and C4 by the multidrugresistance protein ABCC4(MRP4).Rius M，Hummel-Eisenbeiss J，Keppler D.JPharmacol Exp Ther.2008Jan；324(1)：86-94.Epub 2007 Oct 24.PMID：17959747

22.Prophylactic potential of montelukast against mild colitis inducedby dextran sulphate sodium in rats.Holma R，Salmenper？P，Virtanen I，VapaataloH，Korpela R.J Physiol Pharmacol.2007 Sep；58(3)：455-67.PMID：17928642

23.Blockade of avidity and focal clustering of beta 2-integrin bycysteinyl leukotriene antagonism attenuates eosinophil adhesion.Meliton AY，Munoz NM，Leff AR.J Allergy Clin Immunol.2007 Dec；120(6)：1316-23.Epub 2007 Sep29.PMID：17904626

24.What′s new in paediatric sleep？Fauroux B.Paediatr Respir Rev.2007Mar；8(1)：85-9.Epub 2007 Mar 21.Review.PMID：17419982

25.The role of leukotrienes in the pathophysiology of inflammatorydisorders：is there a case for revisiting leukotrienes as therapeutic targets？Sharma JN，Mohammed LA.Inflammopharmacology.2006 Mar；14(1-2)：10-6.Review.PMID：16835707

26.Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury inrats.Sener G.et al.，Pharmacol Res.2006 Jul；54(1)：65-71.Epub 2006 Mar 2.PMID：16584888

27.Leukotriene receptor antagonists in children with cystic fibrosislung disease：anti-inflammatory and clinical effects.Schmitt-Groh？S，ZielenS.Paediatr Drugs.2005；7(6)：353-63.

28.Montelukast：new therapeutic option in patients with nasal polypsassociated to respiratory allergic disease，Almeida Arvizu V et al.，Rev AlergMex.2005 Jul-Aug；52(4)：1 51-8.PMID：16268183

29.Effect of montelukast on exhaled leukotrienes and quality of lifein asthmatic patients.Biernacki WA，Kharitonov SA，Biernacka HM，BarnesPJ.Chest.2005 Oct；128(4)：195863.PMID：16236841

30.Differential effect of zileuton，a 5-lipoxygenase inhibitor，againstnociceptive paradigms in mice and rats.Singh VP，Patil CS，KulkarniSK.Pharmacol Biochem Behav.2005Jul；81(3)：433-9.PMID：15935457

31.Leukotriene modifier therapy for mild sleep-disordered breathingin children.Goldbart AD，Goldman JL，Veling MC，Gozal D.Am J Respir Crit CareMed.2005 Aug 1；172(3)：364-70.Epub 2005 May 5.PMID：15879419

32.Exhaled breath condensate cysteinyl leukotrienes are increased inchildren with exercise-induced bronchoconstriction.Carraro S，Corradi M，Zanconato S，Alinovi R，Pasquale MF，Zacchello F，Baraldi E.J Allergy ClinImmunol.2005 Apr；115(4)：764-70.PMID：15805996

33.Antileukotriene drugs：clinical application，effectiveness andsafety.Riccioni G，Bucciarelli T，Mancini B，Di llio C，D′Orazio N.，Curr.Med.Chem.2007：14(18)：1966-77.

34.Matsuyama et al.，The target of 5-lipoxygenase is a novel strategyover human urological tumors than the target of cyclooxygenase-2，Drug TargetInsights 2008：3 137-151.

35.Burdette JE，Chen SN，Lu ZZ，Xu H，White BE，Fabricant DS，Liu J，FongHS，Farnsworth NR，Constantinou Al，Van Breemen RV，Pezutto JM，Bolton JL.Blackcohosh (Cimicifuga racemosa L.)protects against menadione-induced DNAdamagethrough scavenging of reactive oxygen species：bioassay-directed isolation andcharacterization of active principles.JAgric Food Chem 2002，50：7022-7028.

36.Li JC，Lee DC，Cheung BK，LauAS.Mechanisms for HIV Tat upregul ationof IL-10and other cytokine expression：kinase signaling and PKR-mediatedimmune response.FEBS Lett.2005；579：3055-3062.

37.Lee DC，Cheung CY，Law AH，Mok CK，Peiris M，Lau AS.p38 mitogen-activated protein kinase-dependent hyperinduction of tumor necrosis factoralpha expression in response to avian influenza virus H5N1.J Virol.2005；79：10147-10154.

38.Cheung BK，Lee DC，Li JC，Lau YL，Lau AS.A Role for Double-StrandedRNA-Activated Protein Kinase PKR in Mycobacterium-Induced CytokineExpression.J Immunol.2005；175：7218-7225.

39.Lu YC，Yeh WC，Ohashi PS.LPS/TLR4 signal transductionpathway.Cytokine.2008；42：145-151.

40.Kim SH，Kim J，Sharma RP.Inhibition of p38 and ERK MAP kinasesblocks endotoxin-induced nitric oxide production and differentially modulatescytokine expression.Pharmacol Res.2004；49：433-439.

41.Blackwell TS，Christman JW.The role of nuclear factor-kappa B incytokine gene regulation.Am J Respir Cell Mol Biol.1997；17：3-9.

42.Funk CD.Prostaglandins and leukotrienes Advances in eicosanoidbiology.Science 2001；294：1871-1875.

43.Wang Y，Mitchell J，Sharma M，Gabriel A，Moriyama K，PalmerPP.Leukotrienes mediate 5-hydroxytryptamine-induced plasma extravasation inthe rat knee joint via CysLT-type receptors.Inflamm Res.2004；53：66-71.44.

44.Tager AM，Dufour JH，Goodarzi K，Bercury SD，von Andrian UH，LusterAD.BLTR mediates leukotriene B(4)-induced chemotaxis and adhesion and plays adominant role in eosinophil accumulation in a murine model ofperitonitis.JExp Med.2000；192：439-46.

45.Jett MF，Marshall P，Fondacaro JD，Smith PL.Action ofpeptidoleukotrienes on ion transport in rabbit distal colon in vitro.JPharmacol Exp Ther.1991；257：698-705.

46.Goldenberg MM，Subers EM.The reactivity of rat isolatedgastrointestinal tissues to leukotrienes.Eur J Pharmacol.1982；78：463-6.

47.Helgadottir A，Manolescu A，Thorleifsson G，Gretarsdottir S，Jonsdottir H，Thorsteinsdottir U，Samani NJ，Gudmundsson G，Grant SF，ThorgeirssonG，Sveinbjornsdottir S，Valdimarsson E.M，Matthiasson SE，Johannsson H，Gudmundsdottir O，Gurney M E，S ainz J，Thorhallsdottir M，Andresdottir M，F riggeML，Topol EJ，Kong A，Gudnason V，Hakonarson H，Gulcher JR，Stefansson K.The geneencoding 5-lipoxygenaseactivating protein confers risk of myocardialinfarction and stroke.Nat Genet.2004；36：233-9.

48.Wallace JL，MacNaughton WK，Morris GP，Beck PL.Inhibition ofleukotriene synthesis markedly accelerates healing in a rat model ofinflammatory bowel disease.Gastroenterology 1989；96：29-36.

49.Fretland DJ，Widomski D，Tsai BS，Zemaitis JM，Levin S，Djuric SW，ShoneRL，Gaginella TS.Effect of the Leukotriene-B4 Receptor Antagonist Sc-41930 onColonic Inflammation in Rat，Guinea-Pig and Rabbit.J Pharmacol Exp Ther.1990；255：572-576.

Claims (10)

1.分离的化合物或其盐在制备用于降低需要其的受试者中5-脂氧合酶(5-LOX)活性的药物中的用途，其中所述化合物具有下式：

其中

R₁是C_1-8直链烷基；

R₂是H；

R₃、R₄和R₅独立地是-H；

R₆是-O；

R₇是-H；

R₈、R₉和R₁₂独立地是-H；

R₁₀是H；并且

R₁₁是H；

其中，所述药物用于治疗疾病或病症，所述疾病或病症选自慢性阻塞性肺病。

2.权利要求1的用途，其中所述受试者是人。

3.权利要求1的用途，其中R₁是甲基。

4.权利要求3的用途，其中所述分离的化合物是：

5.权利要求1的用途，其中所述药物用于减少LTA₄、LTB₄、LTC₄、LTD₄和/或LTE₄的生物合成。

6.权利要求5的用途，其中所述药物用于减少LTB₄的生物合成。

7.权利要求1的用途，其中所述药物用于降低cAMP或CGMP水平。

8.权利要求1的用途，其中所述药物用于降低醛糖还原酶、环氧合酶、HIV整合酶、肾上腺素β1和/或磷脂酶A2的活性。

9.权利要求1的用途，其中所述药物用于减少前列腺素或血栓烷的生物合成。

10.权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗慢性阻塞性肺病。