CN103282043B

CN103282043B - 无脑回畸形治疗剂

Info

Publication number: CN103282043B
Application number: CN201180064328.4A
Authority: CN
Inventors: 广常真治
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2031-11-28
Also published as: CN103282043A; WO2012074120A1; JP2016185965A; US20130244945A1; JP6016638B2; EP2647386A1; US9371359B2; EP2647386A4; EP2647386B1; JPWO2012074120A1

Abstract

本发明的课题在于提供治疗无脑回畸形患者的药剂和方法。本发明提供一种无脑回畸形治疗或预防剂，其含有通式（Ⅰ）所示的化合物。式中，R1表示被低级烷氧基取代的低级烷基、被杂环基取代的低级烷基、杂环基或式（Ⅱa）（式中，R4表示低级烷基，R5表示低级亚烷基，m表示1～6的整数。）所示的基团，R2表示可以被苯基取代的低级烷基，R3表示可以被卤素、低级烷氧基或苯基取代的低级烷基、缩合多环式烃基或氢原子。

Description

无脑回畸形治疗剂

技术领域

本发明涉及一种无脑回畸形治疗剂。更详细地涉及含有通式（Ⅰ）所示的化合物的无脑回畸形治疗剂。

式中，R¹表示被低级烷氧基取代的低级烷基、被杂环基取代的低级烷基、杂环基或式（Ⅱa）所示的基团，

R²表示可以被苯基取代的低级烷基。R³表示低级烷基（也可以被卤素、低级烷氧基或苯基取代）、缩合多环式烃基或氢原子，

式中，R⁴表示低级烷基，R⁵表示低级亚烷基，m表示1～6的整数。

背景技术

无脑回畸形（lissencephaly）是以脑的表面无脑回、平滑、表现出神经细胞层结构异常为特征的发育不全。无脑回畸形患者表现出重度的精神发育迟滞和癫痫发病等，生命预后不良。在新生儿～幼儿期死亡较多，但也有存活超过5岁的情况。发生频率为1万5千人有1人左右。临床诊断可以由MRI或CT的图像诊断进行。专科医生从图像读出脑回形态的异常，进行诊断。

可以认为约60％无脑回畸形的原因是伴随Pafah1b1（LIS1）基因杂合突变的神经细胞的异常迁移。具体地，可以认为因LIS1蛋白表达量下降，顺行性的细胞质动力蛋白的移动受到抑制，因细胞质动力蛋白局部存在于中心体，而引起神经细胞迁移障碍的结果，在中枢神经系统的层结构中产生异常（即，无脑回畸形发病）。

无脑回畸形是不存在治疗方法的绝症，但近年来，作出了被期待能够成为治疗方法的线索的划时代的报告（非专利文献1）。在该报告中记载了在使用向LIS1基因杂合突变（Lis1+/-）的细胞的实验中，用作为钙蛋白酶抑制剂的ALLN（CALPAIN INHIBITOR I：结构是N-乙酰基–Leu-Leu-Nle-CHO（Calbiochem:208719-25MG））处理细胞时，发现LIS1蛋白增加，神经细胞的迁移也恢复。另外，通过将ALLN对怀有LIS1+/-胎鼠的小鼠进行腹腔内给药，显示出该胎鼠的脑的无脑回畸形症状能够被改善的可能性。

但是，该报告只是以细胞水平或胚胎水平显示能够改善无脑回畸形的可能性，在实际的临床现场利用依然很困难。之所以这样，是因为在人中，无脑回畸形多是由突然变异引起的散发病例，几乎没有遗传给下一胎的可能性，因此几乎都是在出生后才被诊断为无脑回畸形，必须在出生后进行治疗。

另外，ALLN原本是强毒性化合物，即使考虑这一点，以治疗目的使用也很困难。

因此，依然迫切希望有还能够治疗Lis1+/-的无脑回畸形新生儿～幼儿（即，出生后也能够治疗）的药剂和方法。

另外，上述通式（Ⅰ）所示的化合物及其制造方法被记载在专利文献1中，也记载着能够将该化合物作为钙蛋白酶抑制剂使用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006-76989号

非专利文献

非专利文献1：Masami Yamada et.al.,Nature Medicine15,1202-1207（2009）

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供预防或治疗无脑回畸形患者（特别是出生后的无脑回畸形患者）的药剂和方法。

用于解决课题的方法

本发明的发明人等意外地发现通过将上述通式（Ⅰ）所示的化合物进行给药，不仅胎儿期而且即使是出生后也能够治疗无脑回畸形，并且发现该化合物毒性也小，进一步反复改良，从而完成了本发明。

即，本发明例如包括下述项中记载的无脑回畸形治疗或预防剂等。

项A-1.

一种无脑回畸形治疗或预防剂，其含有通式（Ⅰ）所示的化合物，

［式中，R¹表示被低级烷氧基取代的低级烷基、被杂环基取代的低级烷基、杂环基或式（Ⅱa）所示的基团，

式中，R⁴表示低级烷基，R⁵表示低级亚烷基，m表示1～6的整数。］。

项A-2.

在项A-1中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其中，

R¹为式（Ⅱa）所示的基团，

项A-3.

在项A-1中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其中，

R¹为式（Ⅱb）所示的基团，

式中，n表示1～6的整数。

项A-4.

在项A-1中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其中，在R¹所示的低级烷基上取代的杂环基为可以具有低级烷基的吡啶基。

项A-5.

在项A-1中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其中，R¹所示的杂环基的杂原子为氧原子。

项A-6.

在项A-1～项A-5的任一项中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其中，R³所示的低级烷基为环丙基。

项A-7.

在项A-1中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其中，通式（Ⅰ）所示的化合物为：

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯、

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯、

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸8-甲氧基-3,6-二氧杂辛酯、

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸-11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一烷酯、或

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（吡啶-2-基）乙酯。

项A-8.

在项A-1～项A-7的任一项中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其为口服剂、注射剂或点滴剂。

项A-9.

在项A-1～项A-8的任一项中记载的无脑回畸形治疗或预防剂，其特征在于，以对于无脑回畸形患者或孕妇每2～5天给药1次的方式，使用约50～约1200mg通式（Ⅰ）所示的化合物。

项B-1.

一种无脑回畸形治疗方法或无脑回畸形预防方法，其中，该无脑回畸形治疗方法包括将通式（Ⅰ）所示的化合物向无脑回畸形患者或怀有无脑回畸形胎儿的孕妇给药的工序，该无脑回畸形预防方法包括将通式（Ⅰ）所示的化合物向怀有无脑回畸形胎儿的孕妇给药的工序，

项B-2.

在项B-1中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，

R¹为式（Ⅱa）所示的基团，

项B-3.

在项B-1中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，

R¹为式（Ⅱb）所示的基团，

式中，n表示1～6的整数。

项B-4.

在项B-1中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，在R¹所示的低级烷基上取代的杂环基为可以具有低级烷基的吡啶基。

项B-5.

在项B-1中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，R¹所示的杂环基的杂原子为氧原子。

项B-6.

在项B-1～项B-5的任一项中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，R³所示的低级烷基为环丙基。

项B-7.

在项B-1中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，通式（Ⅰ）所示的化合物为：

项B-8.

在项B-1～项B-7的任一项中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其中，给药为口服给药或经血管给药（优选为经静脉给药）。

项B-9.

在项B-1～项B-8的任一项中记载的无脑回畸形治疗方法或预防方法，其特征在于，以对于无脑回畸形患者每2～5天给药1次的方式，使用约50～约1200mg通式（Ⅰ）所示的化合物。

项C-1.

一种用于在无脑回畸形治疗或预防中使用的化合物或包含该化合物的医药组合物，其中，该化合物由通式（Ⅰ）表示，

项C-2.

在项C-1中记载的化合物或医药组合物，其中，

R¹为式（Ⅱa）所示的基团，

项C-3.

在项C-1中记载的化合物或医药组合物，其中，

R¹为式（Ⅱb）所示的基团，

式中，n表示1～6的整数。

项C-4.

在项C-1中记载的化合物或医药组合物，其中，在R¹所示的低级烷基上取代的杂环基为可以具有低级烷基的吡啶基。

项C-5.

在项C-1中记载的化合物或医药组合物，其中，R¹所示的杂环基的杂原子为氧原子。

项C-6.

在项C-1～项C-5的任一项中记载的化合物或医药组合物，其中，R³所示的低级烷基为环丙基。

项C-7.

在项C-1中记载的化合物或医药组合物，其中，通式（Ⅰ）所示的化合物为：

项C-8.

在项C-1～C-7的任一项中记载的化合物或医药组合物，其是通过口服给药或经血管给药（优选经静脉给药）而被给药的。

项C-9.

在项C-1～C-8的任一项中记载的化合物或医药组合物，其特征在于，以对于无脑回畸形患者或孕妇每2～5天给药1次的方式，使用约50～约1200mg通式（Ⅰ）所示的化合物。

项D-1.

通式（Ⅰ）所示的化合物在用于无脑回畸形的治疗或预防的医药品的制造中的使用，

项D-2.

在项D-1中记载的使用，其中，

R¹为式（Ⅱa）所示的基团，

项D-3.

在项D-1中记载的使用，其中，

R¹为式（Ⅱb）所示的基团，

式中，n表示1～6的整数。

项D-4.

在项D-1中记载的使用，其中，在R¹所示的低级烷基上取代的杂环基为可以具有低级烷基的吡啶基。

项D-5.

在项D-1中记载的使用，其中，R¹所示的杂环基的杂原子为氧原子。

项D-6.

在项D-1～D-5的任一项中记载的使用，其中，R³所示的低级烷基为环丙基。

项D-7.

在项D-1中记载的使用，其中，通式（Ⅰ）所示的化合物为：

项D-8.

在项D-1～D-7的任一项中记载的使用，其中，

医药品为口服剂、注射剂或点滴剂。

项D-9.

在项C-1～C-8的任一项中记载的使用，其中，该医药品是具有如下特征的医药品，该特征为以对于无脑回畸形患者或孕妇每2～5天给药1次的方式，使用约50～约1200mg通式（Ⅰ）所示的化合物。

另外，（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯也被称为SNJ-1945。

发明的效果

通过使用本发明的无脑回畸形治疗剂，不仅对子宫中的胎儿而且即使在出生后也能够治疗至今治疗困难的无脑回畸形。具体地，本发明的无脑回畸形治疗剂，不仅对母体，而且对出生后的无脑回畸形患者给药时，也能够抑制无脑回畸形患者的LIS1蛋白减少，因此，神经细胞的迁移恢复，能够改善无脑回畸形的症状。

另外，通过出生前基因诊断等，确认到LIS1基因的杂合突变，判断胎儿无脑回畸形会发病的可能性高时，通过将上述通式（Ⅰ）所示的化合物对母体给药，也能够预防或治疗无脑回畸形的发病。另外，在出生前不论确认到或没有确认到胎儿的LIS1基因杂合突变，以及不论确认到或没有确认到其他关于无脑回畸形发病因子的存在，为了预防孩子发生无脑回畸形，也能够将上述通式（Ⅰ）所示的化合物对母体给药。即，上述通式（Ⅰ）所示的化合物，与胎儿患无脑回畸形的可能性无关，为了预防无脑回畸形也可以在子宫中给药使用。

另外，本发明的无脑回畸形治疗或预防剂，因为通过1次给药能够至少持续3日或其以上的效果，所以能够减轻给药对象（母体或无脑回畸形患者）的负担。因此，也能够期待服药依从性的提高。

附图说明

图1表示研究SNJ-1945对细胞内LIS蛋白量影响的结果。a表示由免疫印迹检测各蛋白质的图，b表示将在a中检测出的条带强度（intensity）图表化的图。可知由SNJ-1945，LIS蛋白量恢复。

图2表示研究SNJ-1945对细胞的LIS蛋白的定位（localization）影响的结果。可知由SNJ-1945，LIS蛋白的定位恢复。

图3表示研究SNJ-1945对细胞的细胞质动力蛋白的定位影响的结果。可知由SNJ-1945，细胞质动力蛋白的定位恢复。

图4表示研究SNJ-1945对细胞的细胞质β-COP的定位影响的结果。可知由SNJ-1945，细胞质β-COP的定位恢复。

图5表示研究SNJ-1945对神经细胞（小脑颗粒神经细胞）迁移能力影响的结果。a是用荧光显微镜观察孵育（incubate）神经细胞的凝集块时细胞迁移的图。另外，b是将迁移的神经细胞按照移动距离累计并图表化的图。可知由SNJ-1945，神经细胞的迁移能力恢复。

图6表示研究SNJ-1945对胎鼠脑的LIS蛋白量影响的结果（100μg/g：IP、胚胎期E12、n=6）。a表示由免疫印迹检测LIS蛋白的图，b表示将在a中检测出的条带的强度图表化的图。

图7表示研究SNJ-1945对新生鼠脑的LIS蛋白量影响的结果（200μg/g：PO、新生鼠P1、n=6）。a表示由免疫印迹检测LIS蛋白的图，b表示将在a中检测出的条带的强度图表化的图。

图8表示研究SNJ-1945对成体鼠脑的LIS蛋白量影响的结果（100μg/g：IP、出生后3周、n=6）。a表示由免疫印迹检测LIS蛋白的图，b表示将在a中检测出的条带的强度图表化的图。

图9表示研究SNJ-1945对胎鼠脑的细胞凋亡影响的结果。a表示由TUNNEL法进行的脑的染色结果图。b表示累计在a中被染色的细胞数，算出被染色细胞的比例并图表化的图。

图10表示利用转棒试验（Rota Rod Test）研究通过SNJ-1945给药，无脑回畸形模型小鼠的运动学习能力是否改善的结果。具体地表示随着各组小鼠重复转棒试验的试行，滞留时间如何变化的曲线图。

图11表示利用转棒试验研究通过SNJ-1945给药，无脑回畸形模型小鼠的运动学习能力是否改善的结果。具体地，表示比较各组小鼠的合计滞留时间的图表。

图12表示利用步态分析（Gait Analysis）研究通过SNJ-1945给药，无脑回畸形模型小鼠的运动功能是否改善，对于％摆动（swing）评价的结果。

图13表示利用步态分析研究通过SNJ-1945给药，无脑回畸形模型小鼠的运动功能是否改善，对于摆动对支撑之比（Swing-to-stance-ratio）评价的结果。

图14表示人无脑回畸形患者的基因诊断结果（碱基序列的变化）。

图15表示由荧光免疫染色检测正常人成纤维细胞和来自人无脑回畸形患者的成纤维细胞中的LIS1的结果。

图16表示基于图15的结果，从核边缘部到细胞边缘部以相等间隔、直线状测定10点的荧光强度，解析LIS1的细胞内定位的结果。

图17表示利用荧光免疫染色检测正常人成纤维细胞和来自人无脑回畸形患者的成纤维细胞中的细胞质动力蛋白的结果。

图18表示基于图17的结果，从核边缘部到细胞边缘部以相等间隔、直线状测定10点的荧光强度，解析细胞质动力蛋白的细胞内定位的结果。

图19表示利用荧光免疫染色检测正常人成纤维细胞和来自人无脑回畸形患者的成纤维细胞中的β-COP小泡的结果。

图20表示基于图19的结果，从核边缘部到细胞边缘部以相等间隔、直线状测定10点的荧光强度，解析β-COP小泡的细胞内定位的结果。

图21表示由免疫印迹检测正常人成纤维细胞和来自人无脑回畸形患者的成纤维细胞内的LIS1和β-肌动蛋白的图。

图22表示将在图21中检测出的条带的强度图表化的图。

图23表示研究在将SNJ-1945以外的钙蛋白酶抑制剂对无脑回畸形模型小鼠进行给药时，LIS1蛋白表达量是否恢复的结果。（a）表示免疫印迹的结果。（b）表示将由免疫印迹检测出的条带的强度图表化的图。

图24表示研究SNJ-1945、E64d和ALLN的各钙蛋白酶抑制剂的细胞毒性的结果。

具体实施方式

以下，进一步详细地说明本发明。

上述通式（Ⅰ）中，R¹可以为被低级烷氧基取代的低级烷基或被杂环基取代的低级烷基。即，R¹可以表示低级烷基，其中，该低级烷基被低级烷氧基或杂环基取代。作为该低级烷基，优选碳原子数1～6（1、2、3、4、5或6）的直链状或支链状烷基，具体地，可以例示甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1,2-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基或1,1,2-三甲基丙基等。更优选为碳原子数2或3的直链状或支链状烷基。特别优选乙基。

作为在R¹所示的低级烷基上取代的低级烷氧基，优选碳原子数1～6（1、2、3、4、5或6）的低级烷氧基。即，作为R¹所示的被低级烷氧基取代的低级烷基，优选被碳原子数1～6的低级烷氧基取代的低级烷基。作为该碳原子数1～6的低级烷氧基，可以例示甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、1,2-二甲基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、3,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基或1,1,2-三甲基丙氧基等，其中，优选甲氧基、乙氧基。

烷氧基既可以进一步在构成烷氧基的碳原子上取代低级烷氧基，也可以在后者的低级烷氧基中再取代低级烷氧基。该取代可以重复多次。即，R¹也可以为式（Ⅱa）所示的基团，

另外，作为更优选的基团，可以列举式（Ⅱb）所示的基团，

式中，n表示1～6的整数。

上述式（Ⅱa）的R⁴所示的低级烷基，优选为碳原子数1～6（1、2、3、4、5或6）的直链状或支链状烷基，可以例示甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基等。优选为甲基、异丙基或叔丁基，更优选为甲基。

作为上述式（Ⅱa）的R⁵所示的低级亚烷基，优选为碳原子数1～4（1、2、3或4）的亚烷基，具体地，可以例示亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。更优选为亚乙基。R⁵所示的低级亚烷基可以具有取代基。作为该取代基，可以列举低级烷基（特别是碳原子数1～6的直链状或支链状烷基），例如，可以例示甲基或乙基等。

上述式（Ⅱa）的m为1～6的整数（1、2、3、4、5或6），优选为2～5的整数。上述式（Ⅱb）的n为1～6的整数（1、2、3、4、5或6），优选为1～5的整数、更优选为2～5的整数。

作为在上述R¹所示的低级烷基上取代的杂环基，优选可以具有低级烷基（即，可以被低级烷基取代）的吡啶基。即，作为上述R¹所示的被杂环基取代的低级烷基，优选被可以具有低级烷基的吡啶基取代的低级烷基。作为吡啶基，例如，可以列举2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基。作为该吡啶基可以具有的低级烷基，优选碳原子数1～3的低级烷基，可以列举甲基、乙基、丙基或异丙基。虽然没有特别限制，但在该吡啶基具有该低级烷基时，优选在该吡啶基的5位或6位具有该低级烷基（即，该吡啶基的5位或6位的氢原子被该低级烷基取代）。

另外，R¹可以为杂环基。R¹所示的杂环基，例如，表示包含1～3个选自硫原子、氧原子和氮原子中的原子的5～7元芳香族、或部分或者完全还原型的饱和杂环基，例如为：呋喃基、噻吩基、吡咯基、氮吖庚因基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、三唑基、四唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、吡唑烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基或四氢苯硫基等，优选为饱和杂环基，更优选为包含氧原子的5～6元饱和再换基，更加优选为1-、2-或3-四氢呋喃基、或1-、2-、3-或4-四氢吡喃基，特别优选为3-四氢呋喃基或4-四氢吡喃基。

作为R²所示的低级烷基，可以例示与上述R¹所示的被低级烷氧基取代的低级烷基或被杂环基取代的低级烷基中的低级烷基相同的低级烷基，但优选为甲基、乙基或异丁基。R²所示的低级烷基，优选被苯基取代。R²所示的被苯基取代的低级烷基的优选例子为苄基或苯乙基。

作为R³所示的低级烷基，优选碳原子数1～6（1、2、3、4、5或6）的直链状或支链状烷基，具体地，可以例示甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1,2-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基或1,1,2-三甲基丙基等。更优选为碳原子数2或3的直链状或支链状烷基。另外，R³所示的低级烷基也可以为环烷基。作为环烷基，可以例示环丙基、环丁基、环戊基或环己基等，优选为环丙基或环丁基。

作为可以在该低级烷基上取代的卤素，可以列举氟、氯或溴等，优选为氟。在该低级烷基被卤素取代时，R³优选为三氟甲基或2,2,2-三氟乙基。

R³所示的被低级烷氧基取代的低级烷基，与在R¹中说明的被低级烷氧基取代的低级烷基相同。其中，优选被甲氧基或乙氧基取代的碳原子数1～6（1、2、3、4、5或6）的低级烷氧基。另外，R³所示的被苯基取代的低级烷基，与在R²中说明的被苯基取代的低级烷基相同。

作为R³所示的缩合多环式烃基，例如，可以列举茚满基、茚基、萘基、蒽基、并环戊二烯基或薁基等，但优选茚满基。

另外，本发明的无脑回畸形治疗或预防剂含有的化合物，还可以是上述化合物的各种溶剂化物、结晶多型物质和前药。

上述化合物例如能够用以下的方法合成。另外，上述化合物中的几种化合物为公知（参照上述专利文献1）。

（式中，R表示保护基，其它基团与上述表示相同意思。）

工序a是在式（Ⅲ）所示的氨基酸的氨基上添加保护基，将其制成混合酸酐后，用还原剂还原，得到式（Ⅴ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅴ）］的工序。上述保护基的添加、除去能够由公知的方法进行。作为上述保护基，例如，可以使用甲酰基或可以分别具有取代基的C_1-6烷基羰基（例如，乙酰基、丙酰基等）、苯基羰基、C_1-6烷氧基羰基（例如，甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基等）、苯氧基羰基或C_7-10芳烷氧基羰基（例如，苄氧基羰基等苯基-C_1-4烷氧基羰基等）等。作为这些取代基，可以使用卤原子（例如，氟、氯、溴、碘等）或硝基等，取代基数为1～3个左右。作为该保护基，最优选的是叔丁氧基羰基（Boc）。

作为在上述反应中可以使用的还原剂，例如，可以列举氢化铝锂、硼氢化钠或双（2-甲氧基乙氧基）氢化铝钠等。优选为硼氢化钠。反应温度是从-40℃至30℃，优选为从-20℃至0℃。

化合物（Ⅴ）也能够通过在式（Ⅳ）所示的氨基醇中同样地加成上述氨基的保护基而得到（工序a’）。

工序b是在二甲基亚砜（DMSO）的活化剂存在下，通过DMSO氧化化合物（Ⅴ），得到式（Ⅵ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅵ）］的工序。DMSO氧化能够由公知的方法进行，例如，在DMSO单独或在DMSO和不抑制氧化反应的溶剂（例如，四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、苯、醚等）的混合溶剂中溶解，相对于1摩尔化合物（Ⅴ），通常添加约1～约10倍摩尔的二异丙基乙胺。上述的DMSO的使用量，相对于1g化合物（Ⅴ）为约1～约20mL。作为上述DMSO的活化剂，例如，能够有利地使用三氧化硫吡啶配位化合物、草酰氯、二环己基碳二亚胺或乙酸酐等，三氧化硫吡啶配位化合物特别适合。

工序c是在以亚硫酸氢钠处理化合物（Ⅵ）后，使之与氰化钠反应成为氰醇体，将其不纯化地在酸或碱催化剂存在下水解，将α-羟基-β-氨基酸制成与非对映异构体的混合物，接着，在该α-羟基-β-氨基酸的氨基上再次同样地加成上述氨基的保护基，作为非对映异构体的混合物得到式（Ⅶ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅶ）］的工序。

该水解与酸（盐酸、硫酸、乙酸、甲酸等）或碱（氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡等）一起在加热或加热回流下进行。加热温度为约50～约100℃左右。溶剂能够优选使用有机溶剂（例如，二噁烷、四氢呋喃等）和水的混合溶剂。

工序d是使化合物（Ⅶ）与各种胺缩合、得到式（Ⅷ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅷ）］的工序。

作为胺，根据目的化合物适当选择理想的胺即可，例如，可以列举乙胺、丙胺、环丙胺、丁胺、环丁胺、甲氧基乙胺、2-苯氧基乙胺、2-氨基茚或2,2,2-三氟乙胺等。

上述缩合优选在1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N,N-二环己基碳二亚胺等的脱水缩合剂的存在下进行。作为在缩合反应中使用的有机溶剂，可以列举N,N-二甲基甲酰胺、DMSO、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、乙醇、苯、甲苯、乙酸乙酯或它们的混合溶剂等，优选为N,N-二甲基甲酰胺。反应温度在从冰冷下到室温的范围。

工序e是在盐酸酸性下，将化合物（Ⅷ）由氨基保护基的脱离反应，得到式（Ⅸ）所示的氨基盐酸盐［以下称为化合物（Ⅸ）］的工序。氨基保护基的脱离反应，能够由公知的方法进行。例如，能够通过在通常所使用的有机溶剂中溶解、在酸的存在下进行搅拌的方法使氨基保护基脱离。作为酸，可以列举盐酸、三氟乙酸或对甲苯磺酸等。另外，也可以使用市售的盐酸的乙酸乙酯溶液或二噁烷溶液等进行脱离。反应温度在从冰冷下到室温的范围。

工序f是在三乙胺的存在下，通过使化合物（Ⅸ）与式（Ⅹ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅹ）］缩合，得到式（Ⅺ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅺ）］的工序。

上述化合物（Ⅹ），例如，能够按照下述的一般反应路线制造。

（式中，各记号与上述意义相同。）

通过使式（ⅩⅢ）所示的醇［以下称为化合物（ⅩⅢ）］与碳酸二（N-琥珀酰亚胺）反应，成为式（ⅩⅣ）所示的混合碳酸酯体，将其在三乙胺存在下，与L-亮氨酸乙酯盐酸盐缩合，就可以得到式（ⅩⅤ）所示的化合物。通过用碱将该化合物皂化，可以得到式（ⅩⅥ）所示的化合物［以下称为化合物（ⅩⅥ）］。另外，化合物（ⅩⅥ）也可以通过使L-亮氨酸与氯甲酸酯直接反应而得到。使所得到的化合物（ⅩⅥ）与羟基琥珀酰亚胺（HOSu）反应，能够制造式（Ⅹ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅹ）］。

工序g是通过氧化化合物（Ⅺ）得到式（Ⅻ）所示的化合物［以下称为化合物（Ⅻ）］的工序。作为该氧化方法，例如，可以使用被分类为铬酸氧化的重铬酸吡啶鎓（PDC）氧化、氯铬酸吡啶鎓（PCC）氧化、琼斯（Jones）氧化、柯林斯（Collins）氧化或被分类为DMSO氧化的斯文（Swern）氧化、通过DMSO-三氧化硫吡啶配位化合物的氧化、通过DMSO-二环己基碳二亚胺的氧化、通过DMSO-草酰氯的氧化或使用戴斯-马丁试剂（Dess-Martin periodinane）的戴斯-马丁氧化、通过次卤酸的氧化、通过N-卤代羧酸酰胺的氧化等公知的方法，但特别优选戴斯-马丁氧化。使用戴斯-马丁氧化进行氧化时，能够在通常使用的有机溶剂中溶解化合物（Ⅺ），加入戴斯-马丁试剂而进行。作为通常使用的有机溶剂，例如，可以列举二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、DMSO、四氢呋喃、甲醇、乙醇、苯、甲苯或乙酸乙酯等那样的对反应没有不良影响的常用溶剂或它们的混合溶剂，但优选为二氯甲烷。相对于化合物（Ⅺ），戴斯-马丁试剂的使用量为约1～约20倍摩尔当量，优选为约1～约3倍摩尔当量。反应温度没有特别限定，在从冰冷下到室温附近。这样操作得到的化合物（Ⅻ），例如，能够由浓缩、减压浓缩、溶剂提取、结晶、再结晶、溶移（solution transfer）或色谱等公知的手段分离纯化。化合物（Ⅻ）为通式（Ⅰ）所示的化合物。

上述各工序可以在通常使用的对反应没有不良影响的常用溶剂或它们的混合溶剂的存在下进行。作为对反应没有不良影响的溶剂，例如，可以列举二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、DMSO、四氢呋喃、甲醇、乙醇、苯、甲苯或乙酸乙酯。

在由上述方法制造的通式（Ⅰ）所示的化合物中，作为在本发明的无脑回畸形治疗或预防剂中包含的优选化合物，例如，可以列举（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物1）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物2）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸四氢-4H-吡喃-4-基酯（化合物3）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物4）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物5）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸四氢-4H-吡喃-4-基酯（化合物6）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物7）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丁基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物8）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-丁基氨基-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物9）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（2,2,2-三氟乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物10）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（2-茚满基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物11）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（2-甲氧基乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物12）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-乙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物13）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-乙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物14）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-环丙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物15）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-环丙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物16）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯（化合物17）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸8-甲氧基-3,6-二氧杂辛酯（化合物18）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷酯（化合物19）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷酯（化合物20）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-1-（2-甲基丙基）-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物21）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-1-（2-甲基丙基）-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯（化合物22）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1RS）-3-氨基-1-苄基-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯（化合物23）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（吡啶-2-基）乙酯（化合物24）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（6-甲基吡啶-2-基）乙酯（化合物25）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（5-乙基吡啶-2-基）乙酯（化合物26）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-叔丁氧基乙酯（化合物27）、（在下面表示结构式）

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-异丙氧基乙酯（化合物28）、（在下面表示结构式）

等。更优选为化合物4、化合物17、化合物18、化合物19、化合物24，更加优选为化合物17。

另外，关于化合物1～28，在上述专利文献1（日本特开2006-76989号）中记载着具体的制造方法和物性值。

这些化合物如专利文献1所示具有优异的钙蛋白酶抑制活性，可以优选作为本发明的无脑回畸形治疗或预防剂的有效成分使用。

通过使用本发明的无脑回畸形治疗或预防剂，不仅对于子宫中的胎儿，而且即使出生后，也能够治疗至今治疗困难的无脑回畸形。具体地，本发明的无脑回畸形治疗剂，不论是对母体，还是对出生后的无脑回畸形患者给药时，都能够抑制无脑回畸形患者的LIS1蛋白的减少，因此，神经细胞的迁移恢复，能够改善无脑回畸形的症状。

另外，在通过出生前基因诊断等，确认LIS1基因的杂合突变，判断胎儿会发生无脑回畸形的可能性高时，通过将上述通式（Ⅰ）所示的化合物向母体给药，也能够预防或治疗无脑回畸形的发病（在能够诊断出胎儿发生无脑回畸形时为“治疗”，在不能诊断时为“预防”。但是，因为难以诊断胎儿是否发生无脑回畸形，所以，通常认为将上述通式（Ⅰ）所示的化合物对母体给药是“预防”。）。另外，在出生前不论确认到还是没有确认到胎儿的LIS1基因的杂合突变，另外，不论确认到还是没有确认到其它关于无脑回畸形发病的因子的存在，为了预防孩子发生无脑回畸形，都能够将上述通式（Ⅰ）所示的化合物向母体给药。即，上述通式（Ⅰ）所示的化合物也可以不管胎儿罹患无脑回畸形的可能性，而为了预防无脑回畸形在子宫中给药使用。

本发明的无脑回畸形治疗或预防剂，不仅人，也可以对人以外的哺乳动物（例如，大鼠、小鼠、兔、牛、猪、犬、猫等）使用。

另外，上述化合物的组织转移性和吸收性优异，还能够通过血脑屏障且毒性也非常低，安全性也优异，因此对无脑回畸形的治疗或预防有利，从而含有该化合物的本发明的无脑回畸形治疗或预防剂有利。本发明的无脑回畸形治疗或预防剂能够全身或局部给药。全身给药中，在口服给药以外，还能够静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射等非口服地给药。局部给药中可以在皮肤、粘膜、鼻或眼中给药。

本发明的无脑回畸形治疗或预防剂，既可以只由上述化合物构成，也可以是该化合物和药学上可接受的载体或添加剂等配合而成的医药组合物。即，本发明也包括上述化合物和含有药学上可接受的载体或添加剂等的医药组合物。在该医药组合物中，在不损害本发明效果的程度内，也可以配合其它药理活性物质、药学上可接受的任意成分。这样的载体、添加剂、任意成分、其它药理活性物质等，本领域技术人员可以根据目的适当选择，另外，添加量等的条件也可以适当设定。

本发明的无脑回畸形治疗或预防剂为医药组合物时，其制剂形态没有特别限制，可以例示粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或栓剂等固体制剂和糖浆剂、注射剂、点滴剂、点眼剂或点鼻剂等液体制剂等。在这些中，优选能够口服的制剂（口服剂）、注射剂、点滴剂。这些能够由公知的方法制造。

例如，在作为颗粒剂和片剂进行制造时，能够通过使用药学上可接受的添加剂，例如，赋形剂（乳糖、白糖、葡萄糖、淀粉、结晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素等）、润滑剂（硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸钙等）、崩解剂（淀粉、羧甲基纤维素钠、碳酸钙等）或粘合剂（淀粉糊液、羟丙基纤维素液、羧甲基纤维素液、阿拉伯胶液、明胶液、藻酸钠液等）等，制造任意的剂形。另外，在颗粒剂和片剂中，可以用适当的包衣剂（明胶、白糖、阿拉伯胶、巴西棕榈蜡等）或肠溶性包衣剂（例如，邻苯二甲酸乙酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素等）等施加包衣。

在作为胶囊剂制造时，可以适当选择公知的赋形剂例如用于提高流动性和润滑性的硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉或轻质二氧化硅、用于加压流动性的结晶纤维素或乳糖、或者上述崩解剂等，与本发明化合物均等地混合或造粒，或者制成为粒状以适当的包衣剂施加包衣，然后在胶囊中填充，或者根据需要也可以在适当的胶囊基剂（明胶等）中加入甘油或山梨糖醇，用增加了塑性的胶囊基剂包被成形。根据需要，这些胶囊剂中可以加入着色剂、保存剂［例如，二氧化硫、对羟基苯甲酸酯（paraben）类（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等）］等。在通常的胶囊剂以外，也可以制成肠溶性包衣胶囊剂、胃内抗性胶囊剂或释放控制胶囊剂。制成肠溶性胶囊剂时，可以在通常的胶囊中填充以肠溶性包衣剂包覆的本发明化合物或在本发明化合物中添加上述适当赋形剂得到的混合物。或者，可以在以肠溶性包衣剂包覆的胶囊或在以肠溶性高分子作为基剂成形的胶囊中，填充本发明化合物或在本发明化合物中添加上述适当赋形剂得到的混合物。

在作为栓剂制造时，可以适当选择栓剂基剂（可可脂、聚乙二醇等）使用。

在作为糖浆剂制造时，例如，可以适当选择稳定剂（乙二胺四乙酸钠等）、助悬浮剂（阿拉伯胶、羧甲基纤维素等）、矫味剂（单糖浆、葡萄糖等）或芳香剂使用。这样的任意成分，本领域技术人员可以根据目的适当选择，另外，添加量等的条件也可以适当设定。

在作为注射剂、点滴剂、点眼剂或点鼻剂制造时，可以通过在适当添加了药学上可接受的添加剂，例如：等渗剂（氯化钠、氯化钾、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、葡萄糖、丙二醇等）、缓冲剂（磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、谷氨酸缓冲液、ε-氨基己酸缓冲液等）、保存剂（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、乙二胺四乙酸钠、硼酸、硼砂等）、增粘剂（羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇等）、稳定剂（亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等）或pH调整剂（盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等）的溶液中，溶解或分散上述化合物来制造。这样的药学上可接受的添加剂，本领域技术人员可以根据目的适当选择，另外，添加量等的条件也可以适当设定。

在上述注射剂、点眼剂或点鼻剂中的添加剂的添加量，根据添加的添加剂种类、用途等而不同，添加能够达到添加剂目的的浓度即可。

本发明的无脑回畸形治疗或预防剂的给药量根据作为对象的无脑回畸形患者的疾病进展程度、年龄、给药方法等而不同，在该治疗剂中所包含的作为有效成分的上述化合物量，可以例示每1天约0.1～约2000mg、优选约1～约1500mg。特别在口服给药或经血管（优选经静脉）给药时，可以例示每1天约10～约1500mg、优选约20～约1500mg、更优选约50～约1200mg、更加优选约100～约1000mg。给药例如可以分为1天数次（优选1、2或3次）进行。另外，本发明的无脑回畸形治疗或预防剂，在出生后给药时（即，出生后作为无脑回畸形治疗剂使用时），可以在刚出生后～死亡的任意时期给药，但从治疗效果方面考虑，优选尽可能在早期（如果可能，从刚被诊断为无脑回畸形后）开始给药。另外，在向母体给药、治疗胎儿（或预防胎儿发病）时，也同样地从胎儿被诊断为无脑回畸形（或成为无脑回畸形的可能性大）的时间开始，希望尽可能在早期开始给药。在没有进行胎儿是否患无脑回畸形的检查而以预防目的给药时，在确认妊娠后开始给药即可。关于向母体的给药量，例如，能够与上述给药量同样，另外，本领域技术人员在上述范围内，可以结合患者或母体的条件适当选择。

另外，本发明的无脑回畸形治疗或预防剂，也具有投药一次则持续比较长时间效果的特征。例如，可以认为将包含约50～约1200mg、优选包含约100～约1000mg上述化合物的制剂在2天～5天（优选3天）中仅给药1次就可以得到效果。

另外，在本发明的无脑回畸形治疗或预防剂中包含的作为有效成分的上述化合物量，没有特别限制。例如，相对于该治疗或预防剂整体，能够包含0.01～100重量％、优选包含0.1～99重量％的上述化合物。

如上所述，本发明也提供以将本发明的无脑回畸形治疗剂在无脑回畸形患者或母体中给药为特征的无脑回畸形治疗或预防方法。该方法，具体地通过将上述的本发明的无脑回畸形治疗或预防剂进行给药来实施。另外，在该方法中的给药对象、给药方法、给药时期，作为有效成分的上述化合物的给药量等的各项条件如上所述。

另外，在本发明的无脑回畸形治疗或预防剂中含有的上述化合物，在相比于其它钙蛋白酶抑制剂，毒性特别低，副作用比较低的方面有利。另外，其它钙蛋白酶抑制剂，因为即使在出生后给药也不能通过血脑屏障，所以几乎得不到无脑回畸形治疗效果，而即使在这方面，本发明的无脑回畸形治疗剂也很优异。

实施例

以下，具体地说明本发明，但本发明不被下述的例子限定。另外，在以下的研究中，关于基本的操作等，可以适当参考在该领域中有名的教科书（例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold SpringHarbor Laboratory Press）、共聚焦显微镜活用プロトコール（译文：共聚焦显微镜利用规程）（羊土社）、タンパク质实验ハンドブック（译文：蛋白质实验手册）（羊土社）、脑-神经研究の进めかた（译文：脑-神经研究的进展）（羊土社）等。

各化合物的合成

按照在上述引用文献1中记载的方法，合成上述化合物1～28，得到结晶。

具体地，如下操作合成。另外，在以下的化合物的分析值中，熔点使用Yanaco公司生产的MP-500V型（无校正）测定。核磁共振光谱（NMR）使用Varian公司生产的Gemini2000型（300MHz）测定。基质辅助离子化-飞行时间型质谱（MALDI-TOF MS）使用PerSeptive公司生产的Voyager DE质量分析装置测定，质量数以标准物质（α-氰基-4-羟基肉桂酸）校正。比表示体积比。

［参考例1］

N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）在2M氢氧化钠水溶液（0.12L）中溶解L-亮氨酸（25g、0.19mol），在该溶液中，在冰冷条件下同时缓慢加入氯甲酸2-甲氧基乙酯（30g、0.22mol）和1M氢氧化钠水溶液。在室温将该溶液搅拌18小时后，加水（600mL）稀释，以乙醚（2×200mL）清洗。以冰浴冷却水层，加入6M盐酸调整到pH3。以乙酸乙酯（5×150mL）提取该溶液，将有机层以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩，作为无色油状物得到N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸（41g、92％）。

（2）在四氢呋喃（200mL）中溶解N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸（20g、86mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（13g、0.11mmol），在其中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）羰基二亚胺盐酸盐（21g、0.11mmol）的二氯甲烷（200mL）悬浊液。在室温搅拌该溶液18小时后，减压浓缩。以乙酸乙酯（300mL）溶解残渣，以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗该溶液，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩，作为无色油状物得到标题化合物（27g、95％）。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.6），0.93（d，3H，J＝6.6），1.57－1.84（m，3H），2.81（s，4H），3.26（s，3H），3.51（t，2H，J＝4.7），4.10（t，2H，J＝4.7），4.40（m，1H），8.04（d，1H，J＝8.1）.

［参考例2］

N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）边搅拌（S）-3-羟基四氢呋喃（1.0g、11mmol）的乙腈（50mL）溶液，边在室温加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（4.3g、17mmol）和三乙胺（4.4g、17mmol、4.8mL）。室温搅拌该溶液18小时后，减压浓缩。在残渣中加入饱和碳酸氢钠水溶液（100mL），以乙酸乙酯（200mL）提取。以饱和食盐水清洗有机层，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩，作为褐色油状物定量地得到N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯（2.6g）。

（2）在L-亮氨酸乙酯盐酸盐（2.7g、14mmol）和三乙胺（2.9g、28mmol）的二氯甲烷溶液（50mL）中加入N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯（2.6g、11mmol）的二氯甲烷溶液（20mL）。在室温搅拌该溶液18小时，减压浓缩。以乙酸乙酯（200mL）溶解残渣，以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗该溶液，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩。以己烷清洗残渣，作为白色固体得到N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯（3.1g、98％）。

（3）在N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯（2.9g、11mmol）的乙醇（100mL）溶液中加入1M氢氧化钠水溶液（33mL）。冰冷下搅拌该溶液3小时后，加入盐酸调整到pH3。减压蒸馏除去乙醇，以乙酸乙酯提取。以1M盐酸和饱和食盐水清洗有机层，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩。以乙酸乙酯/己烷混合液将残渣结晶化，作为无色结晶得到N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸（2.6g、85％）。

熔点：94.9～96.0℃

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.0），0.92（d，3H，J＝6.3），1.55－1.82（m，3H），1.88（m，1H），2.12（m，1H），2.81（s，4H），3.64－3.84（m，4H），4.39（m，1H），5.15（m，1H），8.04（d，1H，J＝7.8）.

［参考例3］

N-（（四氢-4H-吡喃-4-基氧基）羰基）-L-亮氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用4-羟基四氢-4H-吡喃，进行与参考例2（1）同样的反应，作为褐色油状物得到N-琥珀酰亚胺基四氢-4H-吡喃-4-基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用N-琥珀酰亚胺基四氢-4H-吡喃-4-基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色固体得到N-（（四氢-4H-吡喃-4-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（四氢-4H-吡喃-4-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色固体得到N-（（四氢-4H-吡喃-4-基氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（四氢-4H-吡喃-4-基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色固体得到标题化合物。

₁H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.0），0.92（d，3H，J＝6.3），1.43－1.93（m，7H），2.80（s，4H），3.42（m，2H），3.78－3.82（m，2H），4.39（m，1H），4.72（m，1H），7.94（d，1H，J＝7.8）.

［参考例4］

N-（（5-甲氧基-3-氧杂戊氧基）羰基）-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用二甘醇一甲醚，进行与参考例2（1）同样的反应，作为无色油状物得到5-甲氧基-3-氧杂戊基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用5-甲氧基-3-氧杂戊基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（5-甲氧基-3-氧杂戊氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（5-甲氧基-3-氧杂戊氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（5-甲氧基-3-氧杂戊氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（5-甲氧基-3-氧杂戊氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.90（dd，6H，J＝9.5，6.5），1.56－1.80（m，3H），2.80（s，4H），3.24（s，3H），3.41－3.46（m，2H），3.50－3.54（m，2H），3.56－3.60（m，2H），4.08－4.11（m，2H），4.39（m，1H），8.05（d，1H，J＝7.8）.

［参考例5］

N-（（8-甲氧基-3,6-二氧杂辛氧基）羰基）-L-亮氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用三甘醇一甲醚，进行与参考例2（1）同样的反应，作为无色油状物得到8-甲氧基-3,6-二氧杂辛基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用8-甲氧基-3,6-二氧杂辛基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（8-甲氧基-3,6-二氧杂辛氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（8-甲氧基-3,6-二氧杂辛氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（8-甲氧基-3,6-二氧杂辛氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（8-甲氧基-3,6-二氧杂辛氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.3），0.92（d，3H，J＝6.3），1.56－1.82（m，3H），2.81（s，4H），3.24（s，3H），3.43（m，2H），3.52（m，6H），3.59（m，2H），4.10（m，2H），4.40（m，1H），8.06（d，1H，J＝7.8）.

［参考例6］

N-（（11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用四甘醇一甲醚，进行与参考例2（1）同样的反应，作为无色油状物得到11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.91（dd，6H，J＝9.3，6.3），1.56－1.77（m，3H），2.81（s，4H），3.24（s，3H），3.41－3.44（m，2H），3.49－3.52（m，10H），3.59（t，2H，J＝4.7），4.08－4.11（m，2H），4.38（m，1H），8.06（d，1H，J＝7.8）.

［参考例7］

N-（（14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用五甘醇一甲醚，进行与参考例2（1）同样的反应，作为无色油状物得到14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.6），0.92（d，3H，J＝6.3），1.57－1.82（m，3H），2.81（s，4H），3.24（s，3H），3.43（m，2H），3.51（m，14H），3.59（m，2H），4.10（m，2H），4.40（m，1H），8.05（d，1H，J＝7.8）.

［参考例8］

（3S）-3-氨基-N-乙基-2-羟基-4-苯基丁酰胺盐酸盐

（1）在冰冷条件下，在L-苯基氨基丙醇（50g、66mmol）的四氢呋喃（1.3L）和水（630mL）的溶液中同时缓慢地加入二叔丁基二碳酸酯（140g、0.67mol）的四氢呋喃（500mL）溶液和1M氢氧化钠水溶液（660mL）。在室温搅拌该溶液18小时，减压蒸馏除去有机溶剂后，加入乙酸乙酯（1L）。以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗该溶液，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩。从乙酸乙酯/己烷（1∶10）的混合液将得到的白色固体再结晶，作为无色结晶得到N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基氨基丙醇（70g、84％）。

（2）在DMSO（280mL）和二氯甲烷（140mL）中溶解N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基氨基丙醇（69g、0.28mol），以冰浴冷却该溶液。在其中，加入N,N-二异丙基乙胺（110g、0.82mmol）和纯化三氧化硫吡啶配位化合物（130g、0.82mol）的DMSO（100mL）悬浊液。冰冷下搅拌该溶液1小时。以乙酸乙酯（1.5L）稀释反应液，以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩。从乙酸乙酯/己烷混合液将残渣结晶化，作为无色结晶得到N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基氨基丙醇（53g、77％）。

（3）在甲醇（100mL）中溶解N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基氨基丙醇（17g、67mmol），将该溶液冷却到5℃。在水（150mL）中溶解亚硫酸氢钠（7.0g、67mmol），将该溶液冷却到5℃。在醛溶液中加入该溶液，在5℃搅拌18小时。在水（100mL）中溶解氢氰酸钠（4.0g、81mmol），与乙酸乙酯（300mL）一起加入到上述反应液中。在室温搅拌该反应液5小时。将有机层分离，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩，作为油状物得到氰醇体。在二噁烷（250mL）和浓盐酸（250mL）中溶解该氰醇体，在其中加入苯甲醚（10mL）。将该溶液缓慢回流18小时。将该反应液冷却到室温后，减压浓缩，得到褐色半固态物质。将其在水（100mL）中溶解，以乙醚（3×50mL）清洗。将水层通过Dowex50X8柱（100-200目（mesh）、H⁺型；25×1.8cm），以水清洗到成为pH5.5，以2M氨水（约1,5L）洗脱。将洗脱的氨水减压浓缩，作为白色固体得到（3S）-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸（12g、88％）。

（4）在1M氢氧化钠水溶液（70mL）中溶解（3S）-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸（11g、56.34mmol），在该溶液中加入二叔丁基二碳酸酯（12g、57mmol）的二噁烷（70mL）溶液。边通过适当加入1M氢氧化钠水溶液将该溶液保持在pH10～11，边在室温搅拌18小时。然后，加入水（600mL）稀释，以乙醚（2×200mL）清洗。边以冰浴冷却该水层，边加入1M盐酸，调整到pH2，以乙醚（3×250mL）提取。以无水硫酸镁将有机层脱水后，浓缩，作为无色固体的非对映异构物混合物得到（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-4-苯基丁酸（12g、72％）。

（5）在DMF（45mL）中溶解（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-4-苯基丁酸（6.3g、21mmol）和1-羟基苯并三唑（3.0g、22.4mmol），以冰浴冷却。然后，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（4.6g、24mmol）后，再加入乙胺水溶液（3.0mL）。搅拌该溶液18小时。以乙酸乙酯（200mL）稀释该溶液后，以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯（5.8g、84％）。

（6）在4N盐酸/二噁烷溶液（65mL）中溶解（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯（5.5g、17mmol），室温搅拌该溶液3小时。减压浓缩该溶液，作为白色固体定量地得到标题化合物（4.4g）。

熔点：162.8～163.3℃.（Major），¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ1.02（t，3H，J＝7.2），2.93（m，2H），3.05－3.20（m，2H），3.60（m，1H），3.88（m，1H），6.75（d，1H，J＝6.0），7.19－7.37（m，5H），8.08（m，1H），8.17（br s，3H）.（Minor），¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.97（t，3H，J＝7.4），2.80（d，2H，J＝6.9），3.00（m，2H），3.69（m，1H），4.26（m，1H），6.53（d，1H，J＝5.4），7.19－7.37（m，5H），8.03（t，1H，J＝5.7），8.17（br s，3H）.

［参考例9］

（3S）-3-氨基-N-环丙基-2-羟基-4-苯基丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用环丙胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到标题化合物。

熔点：162.9～163.3℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.44（m，2H），0.57（m，2H），2.50（m，0.5H），2.65（m，0.5H），2.82（d，1H，J＝6.9），2.94（m，1H），3.60（m，0.5H），3.70（m，0.5H），3.87（m，0.5H），4.26（d，0.5H，J＝2.4），6.45（br s，0.5H），6.69（br s，0.5H），7.23－7.35（m，5H），7.99（d，0.5H，J＝4.2），8.08（br s，1.5H），8.09（d，0.5H，J＝4.5），8.23（br s，1.5H）.

［参考例10］

（3S）-3-氨基-2-羟基-4-苯基-N-丙基丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用环丙胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-氧代-3-（丙基氨基）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-氧代-3-（丙基氨基）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到标题化合物。

熔点：127.8～129.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.82（m，3H），1.35－1.47（m，2H），2.82（m，0.5H），2.95（m，3H），3.09（m，0.5H），3.58（m，0.5H），3.70（m，0.5H），3.92（m，0.5H），4.31（m，0.5H），6.55（d，0.5H，J＝4.8），6.77（d，0.5H，J＝6.6），7.21－7.36（m，5H），7.98－8.15（m，2.5H），8.24（br s，1.5H）.

［参考例11］

（3S）-3-氨基-N-环丁基-2-羟基-4-苯基丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用环丁胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-3-环丁基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-3-环丁基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到标题化合物。

熔点：162.5～163.7℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ1.59（m，2H），1.88－2.18（m，4H），2.80（d，1H，J＝6.6），2.91（m，1H），3.58（m，0.5H），3.69（m，0.5H），3.87（m，0.5H），4.08（m，0.5H），4.16－4.24（m，1H），6.50（d，0.5H，J＝5.4），6.72（d，0.5H，J＝6.0），7.21－7.33（m，5H），8.05（br s，1.5H），8.19（d，0.5H，J＝7.8），8.20（br s，1.5H），8.29（d，0.5H，J＝8.1）.

［参考例12］

（3S）-3-氨基-N-丁基-2-羟基-4-苯基丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用丁胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-3-丁基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-3-丁基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸-1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到标题化合物。

熔点：141.0～141.4℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.86（m，3H），1.16－1.47（m，4H），2.80（m，0.5H），2.99（m，3H），3.13（m，0.5H），3.57（m，0.5H），3.70（m，0.5H），3.92（m，0.5H），4.30（m，0.5H），6.53（br s，0.5H），6.77（d，0.5H，J＝6.6），7.19－7.39（m，5H），7.97－8.15（m，2.5H），8.22（s，1.5H）.

［参考例13］

（3S）-3-氨基-2-羟基-4-苯基-N-（2,2,2-三氟乙基）丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用2,2,2-三氟乙胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-氧代-3-（2,2,2-三氟乙胺）丙基）氨基甲酸-1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-氧代-3-（2,2,2-三氟乙胺）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到（3S）-3-氨基-2-羟基-4-苯基-N-（2,2,2-三氟乙基）丁酰胺盐酸盐。

熔点：103.0～108.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ2.71－2.85（m，1H），2.88－2.97（m，1H），3.60－3.82（m，2.5H），3.91－4.05（m，1H），4.45（m，0.5H），6.75（d，0.5H，J＝5.7），6.98（d，0.5H，J＝6.3），7.20－7.35（m，5H），8.12（br s，1.5H），8.25（br s，1.5H），8.70（m，1H）.

［参考例14］

（3S）-3-氨基-2-羟基-N-（2-茚满基）-4-苯基丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用2-氨基茚满，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-3-（2-茚满基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-3-（2-茚满基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到（（3S）-3-氨基-2-羟基-N-（2-茚满基）-4-苯基丁酰胺盐酸盐。

熔点：183.0～184.8℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ2.76－2.96（m，4H），3.01－3.18（m，2H），3.62（m，0.5H），3.74（m，0.5H），3.92（m，0.5H），4.25－4.39（m，1H），4.49（m，0.5H），6.48（d，0.5H，J＝5.7），6.72（d，0.5H，J＝5.7），7.13－7.35（m，9H），8.15（m，3.5H），8.26（d，0.5H，J＝7.2）.

［参考例15］

（3S）-3-氨基-2-羟基-N-（2-甲氧基乙基）-4-苯基丁酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用甲氧基乙胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-（2-甲氧基乙基）-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-（2-甲氧基乙基）-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到（3S）-3-氨基-2-羟基-N-（2-甲氧基乙基）-4-苯基丁酰胺盐酸盐。

熔点：113.9～117.7℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ2.82（d，1H，J＝6.6），2.95（m，1H），3.10－3.19（m，2H），3.22（s，1.5H），3.23（s，1.5H），3.28－3.34（m，2H），3.57（m，0.5H），3.70（m，0.5H），3.92（m，0.5H），4.32（m，0.5H），6.59（d，0.5H，J＝4.5），6.87（d，0.5H，J＝6.0），7.22－7.36（m，5H），7.92（t，0.5H，J＝5.7），7.98（t，0.5H，J＝5.1），8.09（br s，1.5H），8.24（br s，1.5H）.

［参考例16］

（3S）-3-氨基-N-乙基-2-羟基-5-苯基戊酰胺盐酸盐

（1）在Boc-L-高苯丙氨酸（20g、72mmol）的二甲氧基乙烷（100mL）溶液中，在冰冷条件下加入N-甲基吗啉（7.2g、72mmol）和氯甲酸异丁酯（9.8g、72mmol）。搅拌1小时后，过滤反应液，以冰浴冷却滤液，加入硼氢化钠（4.1g、107mmol）的水溶液（10mL），再加水（300mL）。滤取产生的沉淀物，将其以水和甲醇清洗，作为无色结晶得到N-（叔丁氧基羰基）-L-高苯丙氨醇（15g、79％）。

（2）代替N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基丙氨醇，使用N-（叔丁氧基羰基）-L-高苯丙氨醇，进行与参考例8（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（叔丁氧基羰基）-L-高苯丙氨醛。

（3）代替N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基丙氨醛，使用N-（叔丁氧基羰基）-L-高苯丙氨醛，进行与参考例8（3）同样的反应，作为白色固体得到（3S）-3-氨基-2-羟基-5-苯基戊酸。

（4）代替（3S）-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸，使用（3S）-3-氨基-2-羟基-5-苯基戊酸，进行与参考例8（4）同样的反应，作为无色油状物得到（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-5-苯基戊酸。

（5）代替（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-4-苯基丁酸，使用（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-5-苯基戊酸，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

（6）代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到（3S）-3-氨基-N-乙基-2-羟基-5-苯基戊酰胺盐酸盐。

熔点：134.4～134.9℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.99－1.06（m，3H），1.65－1.96（m，2H），2.54－2.76（m，2H），3.07－3.23（m，2H），4.15（br s，0.5H），4.25（br s，0.5H），6.44（br s，0.5H），6.55（br s，0.5H），7.17－7.33（m，5H），7.99（br s，1.5H），8.15（t，1H，J＝6.2），8.23（br s，1.5H）.

［参考例17］

（3S）-3-氨基-N-环丙基-2-羟基-5-苯基戊酰胺盐酸盐

代替乙胺的水溶液，使用环丙胺，进行与参考例16（5）同样的反应，作为白色固体得到（（1S）-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例16（6）同样的反应，作为白色固体得到（3S）-3-氨基-N-环丙基-2-羟基-5-苯基戊酰胺盐酸盐。

熔点：140.2～141.3℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.46－0.64（m，4H），1.64－1.99（m，2H），2.54－2.78（m，3H），3.35（m，1H），4.13（br s，0.5H），4.26（br s，0.5H），6.37（br s，0.5H），6.51（br s，0.5H），7.17－7.33（m，5H），8.05（br s，1.5H），8.15（d，0.5H，J＝4.5），8.20（d，0.5H，J＝4.8），8.27（br s，1.5H）.

［参考例18］

（3S）-3-氨基-2-羟基-5-甲基-N-（2-苯氧基乙基）己酰胺盐酸盐

（1）代替L-苯基丙氨醇，使用L-亮氨醇，进行与参考例8（1）同样的反应，作为无色油状物得到N-（叔丁氧基羰基）-L-亮氨醇（70g、84％）。

（2）代替N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基丙氨醇，使用N-（叔丁氧基羰基）-L-亮氨醇，进行与参考例8（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（叔丁氧基羰基）-L-亮氨醛。

（3）代替N-（叔丁氧基羰基）-L-苯基丙氨醛，使用N-（叔丁氧基羰基）-L-亮氨醛，进行与参考例8（3）、（4）同样的反应，作为无色油状物得到（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-5-甲基己酸。

（4）代替（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-4-苯基丁酸，使用（3S）-3-（叔丁氧基羰基氨基）-2-羟基-5-甲基己酸，代替乙胺水溶液，使用2-苯氧基乙胺，进行与参考例8（5）同样的反应，作为无色油状物得到（（1S）-2-羟基-1-（2-甲基丙基）-3-氧代-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

（5）代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（（1S）-2-羟基-1-（2-甲基丙基）-3-氧代-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到标题化合物。

熔点：93.6～96.2℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.71－0.89（m，6H），1.35－1.47（m，2H），1.72（m，1H），3.48－3.54（m，4H），4.00－4.07（m，2H），4.12（d，0.5H，J＝3.6），4.33（d，0.5H，J＝1.8），6.91－6.96（m，3H），7.27－7.32（m，2H），7.95（br s，1.5H），8.19－8.29（m，2.5H）.

［参考例19］

3-氨基-2-羟基-5-苯基戊酰胺盐酸盐

代替乙胺水溶液，使用氨气，进行与参考例8（5）同样的反应，作为白色固体得到（1-苄基-3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯。

代替（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，使用（1-苄基-3-氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基甲酸1,1-二甲基乙酯，进行与参考例8（6）同样的反应，作为白色固体得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ2.82（m，1H），2.93（m，1H），3.61（m，1H），3.85（m，0.5H），4.26（m，0.5H），6.48（d，0.5H，J＝4.8），6.75（d，0.5H，J＝5.7），7.24－7.35（m，5H），7.52（m，2H），8.04（brs，1.5H），8.17（brs，1.5H）.

［参考例20］

N-((2-(吡啶-2-基)乙基）羰基)-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用（2-吡啶基）乙醇，进行与参考例2（1）同样的反应，作为褐色油状物得到N-琥珀酰亚胺基2-（吡啶-2-基）乙基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用N-琥珀酰亚胺基2-（吡啶-2-基）乙基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-（吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S）-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（2-（吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为白色固体得到N-（（2-（吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（2-（吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.82－0.91（m，6H），1.42－1.76（m，3H），2.76－2.81（m，4H），3.00－3.06（m，2H），4.30－4.40（m，3H），7.23（dd，1H，J＝7.1，5.3），7.30（d，1H，J＝7.8），7.71（m，1H），7.90（d，1H，J＝8.1），8.50（d，1H，J＝4.5）.

［参考例21］

N-((2-(6-甲基吡啶-2-基)乙基氧基）羰基)-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用2-（6-甲基-2-吡啶基）乙醇，进行与参考例2（1）同样的反应，作为褐色油状物得到N-琥珀酰亚胺基2-（6-甲基吡啶-2-基）乙基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用N-琥珀酰亚胺基2-（6-甲基吡啶-2-基）乙基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-（6-甲基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S）-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（2-（6-甲基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-（6-甲基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（2-（6-甲基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.83－0.92（m，6H），1.49－1.77（m，3H），2.43（s，3H），2.81（s，4H），2.99（t，2H，J＝6.5），4.29－4.42（m，3H），7.07－7.09（m，2H），7.58（t，1H，J＝7.7），7.91（d，1H，J＝8.4）.

［参考例22］

N-((2-(5-乙基吡啶-2-基)乙基氧基）羰基)-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用（5-乙基吡啶-2-基）乙醇，进行与参考例2（1）同样的反应，作为褐色油状物得到N-琥珀酰亚胺基-2-（5-乙基吡啶-2-基）乙基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用N-琥珀酰亚胺基-2-（5-乙基吡啶-2-基）乙基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-（5-乙基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S）-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（2-（5-乙基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-（5-乙基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（2-（5-乙基吡啶-2-基）乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.75－0.92（m，6H），1.12－1.25（m，3H），1.36－1.72（m，3H），2.54－2.63（m，2H），2.81－2.83（m，4H），2.96－3.02（m，2H），4.04（m，1H），4.29－4.37（m，2H），7.21（d，1H，J＝7.8），7.53（m，1H），7.90（d，1H，J＝7.8），8.34（m，1H）.

［参考例23］

N-((2-叔丁氧基乙基氧基)羰基）-L-亮氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用乙二醇叔丁基醚，进行与参考例2（1）同样的反应，作为无色油状物得到N-琥珀酰亚胺基2-叔丁基乙基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用N-琥珀酰亚胺基2-叔丁基乙基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-叔丁基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S）-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（2-叔丁氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-叔丁氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（2-叔丁氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.3），0.92（d，3H，J＝6.3），1.13（s，9H），1.61（m，1H），1.74（m，2H），2.81（s，4H），3.48（t，2H，J＝4.7），4.04（m，2H），4.40（m，1H），8.00（d，1H，J＝7.8）.

［参考例24］

N-((2-异丙氧基乙基氧基)羰基）-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

（1）代替（S）-3-羟基四氢呋喃，使用乙二醇异丙基醚，进行与参考例2（1）同样的反应，作为无色油状物得到N-琥珀酰亚胺基2-异丙氧基乙基碳酸酯。

（2）代替N-琥珀酰亚胺基（3S）-3-四氢呋喃基碳酸酯，使用N-琥珀酰亚胺基2-异丙氧基乙基碳酸酯，进行与参考例2（2）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-异丙氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯。

（3）代替N-（（（3S）-四氢呋喃-3-基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，使用N-（（2-异丙氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸乙酯，进行与参考例2（3）同样的反应，作为无色油状物得到N-（（2-异丙氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸。

（4）代替N-（（2-甲氧基乙氧基）羰基）-L-亮氨酸，使用N-（（2-异丙氧基乙基氧基）羰基）-L-亮氨酸，进行与参考例1（2）同样的反应，作为无色油状物得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（d，3H，J＝6.6），0.92（d，3H，J＝6.3），1.08（d，6H，J＝6.3），1.61（m，1H），1.74（m，2H），2.81（s，4H），3.53（m，2H），3.57（m，1H），4.07（m2H），4.40（m，1H），8.02（d，1H，J＝7.8）.

［制造例1］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物1）

在参考例1的化合物（1.2g、3.6mmol）和参考例8的化合物（1.0g、4.0mmol）的DMF溶液中加入三乙胺（1.1g、11mmol）。在室温搅拌该溶液18小时，减压浓缩。以乙酸乙酯溶解残渣，以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗该溶液，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩。以乙酸乙酯/己烷（1∶9）混合液清洗所得到的固体，作为白色固体得到（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（0.75g、47％）。

在（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（0.7g、1.6mmol）的二氯甲烷（70mL）溶液中加入戴斯-马丁试剂（1.0g、2.4mmol）。在室温搅拌该溶液18小时。向其中加入10％硫代硫酸钠水溶液（35mL）和饱和碳酸氢钠水溶液（35mL），在室温搅拌该溶液30分钟。分离有机层，将其以1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，以无水硫酸镁脱水后，减压浓缩。以乙酸乙酯/己烷混合液将残渣结晶化，作为无色结晶得到标题化合物（0.62g、88％）。

熔点：138.0～138.3℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.83（d，3H，J＝7.5），0.85（d，3H，J＝7.2），1.04（t，3H，J＝7.1），1.35（m，2H），1.56（m，1H），2.82（m，1H），3.14（m，3H），3.25（s，3H），3.47（t，2H，J＝4.5），4.04（m，3H），5.19（m，1H），7.16－7.33（m，6H），8.24（d，1H，J＝7.2），8.70（m，1H）.MALDI－TOF－MS：C₂₂H₃₃N₃O₆（M＋Na）^＋，458.2267，实测值，458.2361.

［制造例2］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物2）

代替参考例1的化合物，使用参考例2的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：158.9～160.7℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.83（d，3H，J＝6.6），0.85（d，3H，J＝6.9），1.04（t，3H，J＝7.1），1.35（m，2H），1.55（m，1H），1.83（m，1H），2.08（m，1H），2.82（m，1H），3.14（m，3H），3.61－3.78（m，4H），4.01（m，1H），5.07（m，1H），5.19（m，1H），7.17－7.33（m，6H），8.22（d，1H，J＝7.2），8.69（t，1H，J＝5.7）.MALDI－TOF－MS：C₂₃H₃₃N₃O₆（M＋H）^＋，448.2447，实测值，448.2509.

［制造例3］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸四氢-4H-吡喃-4-基酯（化合物3）

代替参考例1的化合物，使用参考例3的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸四氢-4H-吡喃-4-基酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：140.0～141.8℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.84（m，6H），1.04（t，3H，J＝7.2），1.35（m，2H），1.49（m，3H），1.79（m，2H），2.82（m，1H），3.14（m，3H），3.41（m，2H），3.78（m，2H），4.02（m，1H），4.66（m，1H），5.19（m，1H），7.15－7.33（m，6H），8.22（d，1H，J＝7.2），8.69（t，1H，J＝5.7）.MALDI－TOF－MS：C₂₄H₃₅N₃O₆（M＋Na）^＋，484.2424，实测值，484.2486.

［制造例4］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物4）

代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：112.4～113.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.83（d，3H，J＝6.6），0.85（d，3H，J＝6.6），1.35（m，2H），1.56（m，1H），2.68－2.88（m，2H），3.11（m，1H），3.25（s，3H），3.47（t，2H，J＝4.5），4.04（m，3H），5.17（m，1H），7.17－7.34（m，6H），8.25（d，1H，J＝7.2），8.73（d，1H，J＝4.8）.MALDI－TOF－MS：C₂₃H₃₃N₃O₆（M＋Na）^＋，470.2267，实测值，470.2441.［α］_D ²⁵＋6.3°（c0.20，DMSO）

［制造例5］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物5）

代替参考例1的化合物，使用参考例2的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：169.2～170.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.83（d，3H，J＝8.1），0.85（d，3H，J＝6.9），1.34（m，2H），1.55（m，1H），1.83（m，1H），2.08（m，1H），2.79（m，2H），3.12（m，1H），3.61－3.80（m，4H），4.02（m，1H），5.08（m，1H），5.17（m，1H），7.22－7.35（m，6H），8.24（d，1H，J＝6.6），8.74（d，1H，J＝5.1）.MALDI－TOF－MS：C₂₄H₃₃N₃O₆（M＋Na）^＋，482.2267，实测值，482.2586.

［制造例6］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸四氢-4H-吡喃-4-基酯（化合物6）

代替参考例1的化合物，使用参考例3的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸四氢-4H-呋喃-4-基酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：137.0～138.2℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.84（m，6H），1.35（m，2H），1.48（m，3H），1.80（m，2H），2.79（m，2H），3.11（m，1H），3.41（m，2H），3.79（m，2H），4.03（m，1H），4.65（m，1H），5.18（m，1H），7.15－7.30（m，6H），8.23（d，1H，J＝6.9），8.73（d，1H，J＝5.4）.MALDI－TOF－MS：C₂₅H₃₅N₃O₆（M＋H）^＋，474.2604，实测值，474.2643.

［制造例7］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物7）

代替参考例8的化合物，使用参考例10的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-氧代-3-（丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：108.8～109.9℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.83（m，9H），1.35（m，2H），1.46（m，2H），1.55（m，1H），2.83（dd，1H，J＝14.0，9.2），3.08（m，3H），3.25（s，3H），3.48（t，2H，J＝4.4），4.04（m，3H），5.19（m，1H），7.22－7.28（m，6H），8.24（d，1H，J＝6.9），8.68（t，1H，J＝5.6）.MALDI－TOF－MS：C₂₃H₃₅N₃O₆（M＋H）^＋，450.2604，实测值，450.2832.

［制造例8］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物8）

代替参考例8的化合物，使用参考例11的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丁基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：114.2～115.3℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.84（m，6H），1.34（m，2H），1.49－1.72（m，3H），2.10（m，4H），2.81（dd，1H，J＝13.8，9.3），3.10（m，1H），3.25（s，3H），3.47（m，2H），4.03（m，3H），4.22（m，1H），5.15（m，1H），7.24（m，6H），8.24（d，1H，J＝7.2），8.91（d，1H，J＝7.8）.MALDI－TOF－MS：C₂₄H₃₅N₃O₆（M＋Na）^＋，484.2424，实测值，484.2400.

［制造例9］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-丁基氨基-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物9）

代替参考例8的化合物，使用参考例12的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-丁基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：94.0～95.2℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.85（m，9H），1.25（m，2H），1.35（m，2H），1.42（m，2H），1.56（m，1H），2.83（dd，1H，J＝13.8，9.0），3.10（m，3H），3.25（s，3H），3.47（t，2H，J＝4.5），4.04（m，3H），5.18（m，1H），7.21－7.29（m，6H），8.23（d，1H，J＝6.6），8.67（t，1H，J＝6.0）.MALDI－TOF－MS：C₂₄H₃₇N₃O₆（M＋H）^＋，464.2760，实测值，464.2870.

［制造例10］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（2,2,2-三氟乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物10）

代替参考例8的化合物，使用参考例13的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-氧代-3-（2,2,2-三氟乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：152.5～153.9℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.84（m，6H），1.34（m，2H），1.55（m，1H），2.86（dd，1H，J＝14.0，8.6），3.10（dd，1H，J＝14.1，4.8），3.25（s，3H），3.48（t，2H，J＝4.7），3.90（m，2H），4.04（m，3H），5.14（m，1H），7.21－7.31（m，6H），8.34（d，1H，J＝6.9），9.29（m，1H）.MALDI－TOF－MS：C₂₂H₃₀F₃N₃O₆（M＋H）^＋，490.2165，实测值，490.2434.

［制造例11］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（2-茚满基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物11）

代替参考例8的化合物，使用参考例14的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-（2-茚满基氨基）-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：141.9～143.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.83（d，3H，J＝6.9），0.86（d，3H，J＝6.9），1.36（m，2H），1.57（m，1H），2.80－2.96（m，3H），3.10－3.18（m，3H），3.24（s，3H），3.47（t，2H，J＝4.7），4.04（m，3H），4.50（m，1H），5.19（m，1H），7.13－7.30（m，10H），8.29（d，1H，J＝6.9），8.97（d，1H，J＝7.2）.MALDI－TOF－MS：C₂₉H₃₇N₃O₆（M＋H）^＋，524.2760，实测值，524.2810.

［制造例12］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（2-甲氧基乙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物12）

代替参考例8的化合物，使用参考例15的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2-羟基-3-（2-甲氧基乙基氨基）-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：127.0～127.9℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.83（d，3H，J＝6.9），0.86（d，3，J＝6.9），1.35（m，2H），1.56（m，1H），2.83（dd，1H，J＝13.8，9.0），3.11（dd，1H，J＝14.0，4.4），3.24（s，3H），3.25（s，3H），3.16－3.34（m，2H），3.39（m，2H），3.48（t，2H，J＝4.5），4.04（m，3H），5.20（m，1H），7.18－7.30（m，6H），8.21（d，1H，J＝6.9），8.66（t，1H，J＝5.4）.MALDI－TOF－MS：C₂₃H₃₅N₃O₇（M＋Na）^＋，488.2373，实测值，488.2680.

［制造例13］

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-乙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物13）

代替参考例8的化合物，使用参考例16的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：119.1～120.4℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（t，6H，J＝6.3），1.03（t，3H，J＝7.2），1.43（t，2H，J＝7.2），1.61－1.85（m，2H），2.07（m，1H），2.56－2.74（m，2H），3.07－3.17（m，2H），3.25（s，3H），3.49（t，2H，J＝4.7），4.05－4.14（m，3H），4.89（m，1H），7.16－7.36（m，5H），7.34（d，1H，J＝8.4），8.33（d，1H，J＝6.9），8.65（t，1H，J＝5.9）.MALDI－TOF－MS：C₂₃H₃₅N₃O₆（M＋H）^＋，450.2604，实测值，450.2701.

［制造例14］

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-乙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物14）

代替参考例1的化合物，使用参考例2的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例16的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-3-乙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：111.9～114.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.89（t，6H，J＝6.3），1.03（t，3H，J＝7.2），1.43（t，2H，J＝7.4），1.60－1.91（m，3H），2.09（m，2H），2.56－2.76（m，2H），3.07－3.17（m，2H），3.63－3.82（m，4H），4.02－4.13（m，1H），4.88（m，1H），5.09－5.13（m，1H），7.16－7.31（m，5H），7.34（d，1H，J＝8.4），8.34（d，1H，J＝6.9），8.66（t，1H，J＝5.7）.MALDI－TOF－MS：C₂₄H₃₅N₃O₆（M＋H）^＋，462.2604，实测值，462.2870.

［制造例15］

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-环丙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物15）

代替参考例8的化合物，使用参考例17的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：109.7～111.1℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.53－0.68（m，4H），0.87－0.91（m，6H），1.43（t，3H，J＝7.2），1.59－1.85（m，2H），2.01－2.13（m，1H），2.56－2.74（m，3H），3.25（s，3H），3.48－3.51（m，2H），4.05－4.14（m，3H），4.87（m，1H），7.17－7.36（m，6H），8.34（d，1H，J＝6.6），8.69（d，1H，J＝5.1）.MALDI－TOF－MS：C₂₄H₃₅N₃O₆（M＋H）^＋，462.2604，实测值，462.2742.

［制造例16］

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-3-环丙基氨基-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯（化合物16）

代替参考例1的化合物，使用参考例2的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例17的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代-1-（苯基乙基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸（3S）-四氢呋喃-3-基酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：115.8～116.2℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.56－0.59（m，4H），0.88（t，6H，J＝6.3），1.42（t，2H，J＝7.4），1.60－1.91（m，3H），2.09（m，2H），2.56－2.76（m，3H），3.63－3.81（m，4H），4.05－4.13（m，1H），4.87（m，1H），5.09－5.13（m，1H），7.20－7.35（m，6H），8.34（d，1H，J＝6.9），8.69（d，1H，J＝5.1）.MALDI－TOF－MS：C₂₅H₃₅N₃O₆（M＋H）^＋，474.2604，实测值，474.2598.

［制造例17］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯（化合物17）

代替参考例1的化合物，使用参考例4的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：127.9～128.7℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.54－0.66（m，4H），0.81－0.86（m，6H），1.30－1.42（m，2H），1.57（m，1H），2.73（m，1H），2.82（dd，1H，J＝14.3，9.2），3.11（dd，1H，J＝13.8，4.2），3.24（s，3H），3.42－3.44（m，2H），3.50－3.57（m，4H），3.99－4.04（m，3H），5.17（m，1H），7.22－7.30（m，6H），8.22（d，1H，J＝6.9），8.71（d，1H，J＝4.8）.MALDI－TOF－MS：C₂₅H₃₇N₃O₇（M＋Na）^＋，514.2530，实测值，514.2944.［α］_D ²⁵＋13.9°（c0.20，DMSO）

［制造例18］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸8-甲氧基-3,6-二氧杂辛酯（化合物18）

代替参考例1的化合物，使用参考例5的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸8-甲氧基-3,6-二氧杂辛酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：116.0～117.2℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.83（d，3H，J＝7.8），0.85（d，3H，J＝6.9），1.35（m，2H），1.57（m，1H），2.73－2.86（m，2H），3.11（m，1H），3.24（s，3H），3.44（m，2H），3.51（m，6H），3.56（t，2H，J＝4.7），4.04（m，3H），5.17（m，1H），7.22－7.31（m，6H），8.25（d，1H，J＝6.9），8.73（d，1H，J＝5.1）.MALDI－TOF－MS：C₂₇H₄₁N₃O₈（M＋Na）^＋，558.2792，实测值，558.2717.［α］_D ²⁵＋2.5°（c0.20，DMSO）

［制造例19］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷酯（化合物19）

代替参考例1的化合物，使用参考例6的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一碳烷酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：97.5～98.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.54－0.66（m，4H），0.81－0.86（m，6H），1.32－1.37（m，2H），1.56（m，1H），2.73（m，1H），2.82（dd，1H，J＝14.0，9.2），3.11（dd，1H，J＝14.1，4.2），3.24（s，3H），3.41－3.44（m，2H），3.50－3.51（m，10H），3.54－3.57（m，2H），3.99－4.08（m，3H），5.16（m，1H），7.22－7.31（m，6H），8.25（d，1H，J＝7.2），8.73（d，1H，J＝5.1）.MALDI－TOF－MS：C₂₉H₄₅N₃O₉（M＋Na）^＋，602.3054，实测值，602.3427.［α］_D ²⁵＋6.9°（c0.20，DMSO）

［制造例20］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-2,3-二氧代-3-（环丙基氨基）丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷酯（化合物20）

代替参考例1的化合物，使用参考例7的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-环丙基氨基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸14-甲氧基-3,6,9,12-四氧杂十四碳烷酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：98.5～99.9℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.83（d，3H，J＝6.9），0.85（d，3H，J＝7.8），1.35（m，2H），1.57（m，1H），2.73－2.86（m，2H），3.11（m，1H），3.24（s，3H），3.42（m，2H），3.51（m，14H），3.56（t，2H，J＝3.3），4.04（m，3H），5.17（m，1H），7.22－7.30（m，6H），8.24（d，1H，J＝6.9），8.72（d，1H，J＝4.5）.MALDI－TOF－MS：C₃₁H₄₉N₃O₁₀（M＋Na）^＋，646.3316，实测值，646.3404.

［制造例21］

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-1-（2-甲基丙基）-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯（化合物21）

代替参考例8的化合物，使用参考例18的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-2-羟基-1-（2-甲基丙基）-3-氧代-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-甲氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：99.7～100.5℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.88（dd，12H，J＝12.0，6.3），1.35－1.54（m，4H），1.58－1.75（m，2H），3.25（s，3H），3.46－3.53（m，4H），4.03－4.07（m，5H），5.06（m，1H），6.91－6.95（m，3H），7.26－7.31（m，3H），8.15（d，1H，J＝7.2），8.81（t，1H，J＝5.9）.MALDI－TOF－MS：C₂₅H₃₉N₃O₇（M＋H）^＋，494.2866，实测值，494.2967.

［制造例22］

（（1S）-1-（（（（1S）-2,3-二氧代-1-（2-甲基丙基）-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯（化合物22）

代替参考例1的化合物，使用参考例4的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例18的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1S）-2-羟基-1-（2-甲基丙基）-3-氧代-3-（2-苯氧基乙基）氨基丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：53.3～54.1℃.¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.87（dd，12H，J＝12.2，6.5），1.35－1.54（m，4H），1.58－1.75（m，2H），3.24（s，3H），3.41－3.45（m，2H），3.47－3.57（m，6H），4.03－4.07（m，5H），5.06（m，1H），6.91－6.96（m，3H），7.26－7.31（m，3H），8.17（d，1H，J＝6.9），8.83（t，1H，J＝5.7）.MALDI－TOF－MS：C₂₇H₄₃N₃O₈（M＋H）^＋，538.3128，实测值，538.3140.

［制造例23］

（（1S）-1-（（（（1RS）-3-氨基-1-苄基-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯（化合物23）

代替参考例1的化合物，使用参考例4的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例19的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（1S）-1-（（（（1RS）-3-氨基-1-苄基-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯，作为无色结晶得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.77（d，3H，J＝6.3），0.83（d，1.5H，J＝6.6），0.86（d，1.5H，J＝6.9），1.05－1.63（m，3H），2.68－2.85（m，1H），3.12（m，1H），3.23（s，3H），3.42（m，2H），3.51－3.56（m，4H），4.03（m，3H），5.22（m，1H），7.21－7.31（m，6H），7.81（d，1H，J＝14），8.06（d，1H，J＝18），8.19（d，0.5H，J＝6.9），8.26（d，0.5H，J＝7.5）.

［制造例24］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（吡啶-2-基）乙酯（化合物24）

代替参考例1的化合物，使用参考例20的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（吡啶-2-基）乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58－0.66（m，4H），0.83（t，6H，J＝7.1），1.31－1.35（m，2H），1.53（m，1H），2.74（m，1H），2.81（dd，1H，J＝14.1，9.3），3.02（t，2H，J＝6.3），3.11（dd，1H，J＝14.0，4.1），4.01（m，1H），4.28－4.32（m，2H），5.17（m，1H），7.14－7.34（m，8H），7.75（t，1H，J＝6.8），8.23（d，1H，J＝7.2），8.51（d，1H，J＝4.2），8.71（d，1H，J＝4.5）.

［制造例25］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（6-甲基吡啶-2-基）乙酯（化合物25）

代替参考例1的化合物，使用参考例21的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（6-甲基吡啶-2-基）乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：162.0～163.6℃.

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.54－0.66（m，4H），0.76－0.86（m，6H），1.54（m，1H），2.43（s，3H），2.73－2.86（m，2H），2.96（t，2H，J＝6.5），3.11（m，1H），4.03（m，1H），4.21－4.34（m，2H），5.17（m，1H），7.07－7.30（m，8H），7.58（t，1H，J＝7.7），8.23（d，1H，J＝6.9），8.72（d，1H，J＝4.8）.

［制造例26］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（5-乙基吡啶-2-基）乙酯（化合物26）

代替参考例1的化合物，使用参考例22的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-（5-乙基吡啶-2-基）乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

熔点：119.9～121.0℃.

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58－0.66（m，4H），0.75－0.85（m，6H），1.17（t，3H，J＝7.7），1.33－1.36（m，2H），1.53（m，1H），2.58（dd，2H，J＝15.5，8.3），2.74－2.85（m，2H），2.94－2.98（m，2H），3.12（m，1H），4.04（m，1H），4.28－4.29（m，2H），5.17（m，1H），7.13－7.26（m，7H），7.55（d，1H，J＝8.1），8.22－8.35（m，2H），8.75（m，1H）.

［制造例27］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-叔丁氧基乙酯（化合物27）

代替参考例1的化合物，使用参考例23的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-叔丁氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.83（d，3H，J＝7.5），0.85（d，3H，J＝6.9），1.12（s，9H），1.35（m，2H），1.57（m，1H），2.74（m，1H），2.82（m，1H），3.11（m，1H），3.45（m，2H），3.98（m，3H），5.17（m，1H），7.24（m，6H），8.23（d，1H，J＝6.6），8.71（d，1H，J＝4.8）.

［制造例28］

（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2,3-二氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-异丙氧基乙酯（化合物28）

代替参考例1的化合物，使用参考例24的化合物，代替参考例8的化合物，使用参考例9的化合物，进行与制造例1同样的反应，经过（（（1S）-1-（（（（1S）-1-苄基-3-（环丙基氨基）-2-羟基-3-氧代丙基）氨基）羰基）-3-甲基丁基）氨基甲酸2-异丙氧基乙酯，作为无色结晶得到标题化合物。

¹H－NMR（300MHz，DMSO－d₆）δ0.58（m，2H），0.65（m，2H），0.83（d，3H，J＝7.2），0.85（d，3H，J＝6.9），1.07（d，6H，J＝5.7），1.35（m，2H），1.57（m，1H），2.74（m，1H），2.82（m，1H），3.12（m，1H），3.50（m，2H），3.55（m，1H），4.01（m，3H），5.17（m，1H），7.24（m，6H），8.22（d，1H，J＝6.9），8.71（d，1H，J＝3.6）.

μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶抑制活性的测定

按照在文献（Anal.Biochem.,1993年、第208卷，p.387-392）中记载的方法测定μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶的抑制活性。即，在96孔板上，加入在包含各种浓度的被检验化合物的DMSO溶液（2.5μL）中包含0.5mg/mL的酪蛋白、50mM的Tris盐酸缓冲液（pH7.4）、20mM的二硫苏糖醇和1.0nmol的μ-钙蛋白酶（来自人红血球、Cosmo Bio株式会社生产）或m-钙蛋白酶（来自猪肾脏、Cosmo Bio株式会社生产）的反应液（200μL）。向其中加入20mM的氯化钙水溶液（50μL），以30℃使之反应60分钟。将该反应液（100μL）移到其他96孔板，加入纯化水（50μL）和50％的蛋白质染色试剂（Protein Assay Dye Reagent）（Bio-Rad Laboratories公司生产；目录No.500-0006）水溶液（100μL），室温放置15分钟后，以595nM测定吸光度。将不包含被检验化合物、同样处理的样品作为对照值，将代替20mM氯化钙水溶液而加入1mMEDTA水溶液（50μL）进行同样处理的样品作为空白值，计算由下式算出的抑制率，求出50％抑制需要的浓度（IC₅₀）。

抑制率（％）=﹛1-（测定值-空白值）/（对照值-空白值）﹜×100

将该浓度（IC₅₀）作为酶（钙蛋白酶）抑制活性（μM）表示在表1中。各化合物抑制μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶的活性。

［表1］

这些化合物中，在以下的研究中使用化合物17。化合物17为SNJ-1945。以下，将化合物17也记为SNJ-1945。

另外，在以下的研究中使用的实验动物和实验细胞，基本上与上述非专利文献1（Masami Yamada et.al.,Nature Medicine15,1202-1207（2009））同样操作地配制。另外，在使实验动物死亡时，首先使用致死量的醚施加麻醉，使之安乐死。另外，在以下的实验中有使用DAPI染色法的情况，众所周知DAPI是将核染色的荧光色素。

LIS1基因杂合缺陷型小鼠（LIS1杂合突变小鼠）的制作

LIS1杂合突变小鼠按照以下的方法制作。作为LIS1的条件性基因敲除小鼠，使用129S-Pafah1b1^tm2Awb/J（杰克逊实验室，The JacksonLaboratory）。该小鼠是具有在内含子Ⅱ和内含子V中插入loxP序列、在Cre-loxP系统中使外显子Ⅲ-外显子Ⅵ缺失使LIS1失活的系统的小鼠。使该129S-Pafah1b1^tm2Awb/J的雌鼠和同型的EⅡ-Cre转化小鼠（FVB/N-Tg（EⅡa-cre）C5379Lmgd/J、杰克逊实验室）的雄鼠交配，通过使Cre蛋白部分地反应，除去用于筛选129S-Pafah1b1^tm2Awb/J（杰克逊实验室）具有的ES细胞的neo基因。使不具有该neo基因的129S-Pafah1b1^tm2Awb/J彼此相互交配，制作129S-Pafah1b1^tm2Awb/J的同型小鼠。使该neo（-）129S-Pafah1b1^tm2Awb/J同型小鼠的雄鼠和FVB/N-Tg（EⅡa-cre）C5379Lmgd/J（杰克逊实验室）的雌鼠交配，制作LIS1杂合突变小鼠。

野生型小鼠使用从日本CLEA株式会社购入的FVB/NJcl小鼠。

由SNJ-1945造成的细胞内LIS1蛋白量变化的研究

从LIS1基因杂合缺陷或野生型小鼠（第12.5-14.5天的胚胎）各5只中分别建立成纤维细胞（MEF；小鼠胚胎成纤维细胞）。

成纤维细胞由下述的方法建立。将妊娠小鼠由颈椎脱臼致死，将小鼠胚胎立即无菌地分离，以小镊子取出头部和内脏组织后，用剪刀将小鼠胚胎剪碎，在剪碎的组织片中加入10ml胰蛋白酶-EDTA（GIBCO，25200），加入到在50ml的塑料管（NUNC，373687）中，以37℃孵育30分钟。30分钟孵育后，加入10ml的胎牛血清（EQUITECH-BIO，Inc.、SFBM30-1798），以10ml移液管（NUNC，159633）吹打（pipetting），分离细胞。在室温静置5分钟后回收上清，转移到50ml的塑料管（NUNC，373687）后，以1000RPM离心分离5分钟，弃掉上清。然后，用加入了D-MEM（WAKO，041-29775）、相当于10％的胎牛血清（EQUITECH-BIO，Inc.、SFBM30-1798）和相当于1％的L-谷氨酰胺（GIBOCO，25030）、青霉素-链霉素（Pen-Strep）（GIBOCO，15140）的细胞培养液，在10cm细胞培养皿（Greinerbio-one，664160）中培养细胞团。细胞每3天以PBS清洗10cm细胞培养皿（Greiner bio-one，664160）。接着，在该细胞培养皿中加入1ml的胰蛋白酶-EDTA（GIBOCO，25200），以37℃孵育5分钟，将细胞分离，加入添加有D-MEM（WAKO，041-29775）、相当于10％的胎牛血清（EQUITECH-BIO，Inc.,SFBM30-1798）和相当于1％的L-谷氨酰胺（GIBOCO，25030）、青霉素-链霉素（GIBOCO，15140）的细胞培养液（9ml），以10ml移液管（NUNC，159633）吹打，在5个10cm细胞培养皿（Greiner bio-one，664160）中分别各加入2ml。再在该细胞培养皿中加入添加有D-MEM（WAKO，041-29775）、相当于10％的胎牛血清（EQUITECH-BIO，Inc.，SFBM30-1798）和相当于1％的L-谷氨酰胺（GIBOCO，25030）、青霉素-链霉素（GIBOCO，15140）的细胞培养液（8ml），得到合计10ml的细胞培养液，以37℃、5％CO₂的条件，使用细胞培养器培养。

使用该细胞，按照以下程序研究在各细胞中，SNJ-1945如何影响细胞内的LIS蛋白量。具体地，如下操作通过进行免疫印迹进行研究。即，用蛋白质提取缓冲液提取（20mM Tris-HCl pH7.5、100mM NaCl、5mM EDTA、0.1％Triton-X100）配制的成纤维细胞，将蛋白质定量，在每1道加样10μg蛋白质，在用10％丙烯酸凝胶分离（SDS-PAGE）后，转印于Immobilon膜（Millipore、IPVH00010），检测LIS和DIC（动力蛋白中间链（dynein intermediate chain）：反映动力蛋白的量）。另外，β肌动蛋白为了作为蛋白量的参考利用而检测。另外在该免疫印迹中使用的抗体如下。抗LIS1抗体（N-19、SC-7577、山羊多克隆抗体、Santa Cruz Biotechnology；1∶100稀释）、抗细胞质动力蛋白中间链抗体（74.1，鼠单克隆抗体、Millipore；1∶100稀释）、抗βCOP抗体（小鼠单克隆抗体、Sigma；1∶100稀释）、抗β肌动蛋白抗体（SC-7210，兔多克隆抗体、Santa Cruz Biotechnology；1∶100稀释）

在图1中表示结果。在a中表示被检出的条带，在b中表示将条带的强度图表化的图。相对在Lis1+/-的细胞中，LIS蛋白量显著下降，在以SNJ-1945处理过的Lis1+/-的细胞中，可以看到LIS蛋白量的恢复。由此，表示由SNJ-1945能够治疗无脑回畸形。

由SNJ-1945产生的细胞内的蛋白质定位的变化的研究

将LIS1基因杂合缺陷或野生型小鼠（第12.5-14.5天的胚胎）各5只编成1组，使用与上述同样的方法，从各组建立成纤维细胞（MEF；小鼠胚胎成纤维细胞）（即，汇集相同基因型的小鼠，建立成纤维细胞。）。使用该细胞，按照以下的程序进行免疫细胞染色，研究在各细胞中，SNJ-1945对细胞内的蛋白质定位如何的影响。

首先，在6孔板（Nunc）铺设预先以0.1N盐酸清洗的载玻片（24×24mm；松浪硝子制），以1.0×105细胞/孔的方式在D-MEM培养液（包含10％胎牛血清，和光纯药制）中接种MEF细胞。接着，在37℃、5％CO2存在下将该6孔板培养过夜后，以最终浓度成为200μM的方式添加SNJ-1945。再在相同条件下孵育2小时。

作为对照实验，添加1％二甲基亚砜（DMSO）进行同样的实验。MEF细胞以磷酸缓冲液（PBS）清洗后，以4％多聚甲醛（WAKO：162-16065）固定（室温、15分钟）。以0.2％Triton X-100处理该MEF细胞后（室温、10分钟），以5％牛血清白蛋白（和光纯药）／Block Ace（雪印乳业），在室温封闭1小时。作为一次抗体，分别以封闭溶液稀释抗LIS1抗体（N-19、SC-7577、山羊多克隆抗体、Santa CruzBiotechnology；1∶100稀释）、抗细胞质动力蛋白中间链抗体（74.1，小鼠单克隆抗体、Millipore；1∶100稀释）、抗βCOP抗体（小鼠单克隆抗体、Sigma；1∶100稀释），室温使之反应1小时。反应后，以磷酸缓冲液（PBS）清洗该MEF细胞，使其在室温与以磷酸缓冲液（PBS）1∶2000稀释的作为二次抗体的Alexa546抗小鼠IgG（Invitrogen）或Alexa546抗山羊IgG（Invitrogen）反应1小时。为了进行核染色，以最终浓度为0.2μM的方式添加DAPI（4’,6-二氨基-2-苯基吲哚，Invitrogen：D1306），再在室温孵育15分钟。孵育后，以PBS充分清洗该细胞，使用荧光显微镜观察用甘油（Merck）包埋。

另外，为了得到微管负端聚集部位的位置信息，对作为中心体的标记物的γ微管蛋白也同样地进行免疫染色。作为抗γ微管蛋白抗体使用Santa Cruz mouse monoclonal antibody小鼠单克隆抗体（1∶100稀释），作为二次抗体，使用被荧光标记的Invitrogen Alexa488抗小鼠IgG（1∶1000稀释）。

用共聚焦激光显微镜（TCS-SP5，Leica）仔细地进行观察后，将各种因子在各自条件下在MEF细胞中的细胞内定位大致分为“在核周边聚集的细胞”和“在细胞质整体中分布的细胞”2大类，对各细胞群各取10个标本，每1个标本任意抽取10个细胞，对于合计100个细胞进行评价，算出平均值±标准偏差，由student t-检验（未配对）进行显著性差别检验。在图2～图4中表示结果。图4中的记号表示如下的意思：N.S.：无显著差别，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

另外，图2b、图3b、图4b是将细胞从核边缘部到细胞的边缘部以放射状充分分割，测定在各区域中的荧光强度（即，从核边缘部到细胞的边缘部，等间隔直线状地测定10点的荧光强度），将其定量化的结果图表化的图。荧光强度反映规定的蛋白质的量，表示在各区域中存在多少蛋白质。LIS1在中心体周边应该存在较多的部位，从LIS1杂合突变小鼠建立的成纤维细胞即使在中心体周边，LIS1量也下降。但是，可知由SNJ-1945，LIS1量恢复到正常（图2）。

另外，相对于细胞质动力蛋白在中心体周边达到峰值并形成平缓的斜率，从LIS1杂合突变小鼠建立的成纤维细胞在中心体周边达到峰值并急剧下降，在细胞周边相比于正常较为缺乏。但是，可知由SNJ-1945，细胞质动力蛋白量也恢复到正常（图3）。

另外，β-COP是高尔基体（在成纤维细胞中，定位在中心体周边）的标记物之一，一般可以作为观察细胞质动力蛋白功能的指标使用，正常时，在中心体具有高密度，并且在细胞周边显示一定的分散。在从LIS1杂合突变小鼠建立的成纤维细胞中，与细胞质动力蛋白同样显示在细胞中心局部存在的分布（图4）。该分布异常反映细胞质动力蛋白的局部存在，可知伴随由SNJ-1945的给药细胞质动力蛋白定位正常化，分布正常化（图4）。

由SNJ-1945产生的小脑颗粒神经细胞的迁移能力变化的研究

通过吹打将LIS1基因杂合缺陷或野生型小鼠（出生后3-7天后）的小脑（分别10只的量）组织片破碎后，以0.025％胰蛋白酶（GIBCO：25200／0.0013％DNaseⅠ（Sigma：DN-25）37℃处理20分钟。离心后，加入包含10％马血清的BME培养液（Gibco：21010）清洗，停止反应。然后，加入包含0.0052％DNaseⅠ/10％马血清的BME培养液进行吹打，通过细胞用筛（Cell strainer，直径70μm；Becton Dickinson）后，在未处理的24孔板接种细胞，以37℃、5％CO₂预先孵育30分钟。再在不含DNaseⅠ但包含10％马血清的BME培养液中，同样孵育8-12小时，使小脑颗粒细胞的凝集块形成。然后，在6孔板（Nunc）中，铺设用多聚赖氨酸（Sigma：P4707）和层粘连蛋白（Sigma：L4544）处理过的盖玻片（24×24mm；松浪硝子），在包含营养补充剂（N-2supplement；Gibco:17502048）的BME培养液中移入小脑颗粒神经细胞的凝集块，以最终浓度为200μM的方式添加SNJ-1945。将该凝集块以37℃、5％CO₂孵育18-24小时。

作为对照实验，添加1％二甲基亚砜（DMSO，Sigma：D8779），进行同样的实验。

孵育后，以磷酸缓冲液（PBS）清洗凝集块后，以4％多聚甲醛（WAKO：162-16065）固定（室温、15分钟）。接着，以0.2％Triton X-100处理后（室温、10分钟），为了进行核染色，以最终浓度为0.2μM的方式添加DAPI（4’,6-二氨基-2-苯基吲哚，Invitrogen:D1306），再在室温孵育15分钟。然后，以PBS反复充分清洗，以凝集块不被破坏的方式小心使用荧光显微镜观察用甘油（Merck）包埋。

用共聚焦激光显微镜（TCS-SP5，Leica）仔细地进行观察后，对于各细胞群，测定神经细胞从小脑颗粒细胞凝集块的边缘移动的距离（μm），以20（μm）划分10-210（μm），以在各移动距离范围内分布的细胞数相对于全部细胞数的百分数表示。另外，算出平均移动距离（μm），以平均移动距离（μm）±标准偏差表示。显著偏差检验由Studentt-检验（未配对）进行。在图5中表示结果。

如图5所示，相对于Lis1+/-的神经细胞几乎不迁移，在以SNJ-1945处理过的Lis1+/-的神经细胞中，可以看到迁移能力恢复。

由此可知，能够由SNJ-1945治疗无脑回畸形。

由SNJ-1945腹腔内给药产生的小鼠胚胎脑中的LIS1蛋白变化的研究

对5只同型的EⅡ-Cre转化小鼠（FVB/N-Tg（E Ⅱ a-cre）C5379Lmgd/J、杰克逊实验室）的雌鼠，通过将1只不具有neo基因的neo（-）129S-Pafah1b1^tm2Awb/J同型小鼠的雄鼠在同一鼠笼中饲养进行交配，准备合计6件该鼠笼，开始交配实验。另外，neo（-）129S-Pafah1b1^tm2Awb/J同型小鼠与上述方法同样地构建。在每天早晨7-10点期间进行插入确认（交尾的确认），决定妊娠周期。将SNJ-1945以100mg/ml的浓度在二甲基亚砜（DMSO，Sigma：D8779）中溶解，在妊娠12天（E12）时，在妊娠母体的腹腔内，以给药量为100μg/体重g的方式注入（腹腔内给药）。

为了判断由SNJ-1945给药产生的效果，测定正常小鼠胚胎和LIS1杂合突变小鼠胚胎（SNJ-1945给药）的LIS1蛋白。

在SNJ-1945给药组中，为了判断伴随时间经过的SNJ-1945效果，在给药后0小时（刚给药后）、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、48小时和72小时的各时间后取出脑组织，测定LIS1的蛋白质。另外，在LIS1蛋白的各测定中，分别使用6只小鼠（n=6）。

由颈椎脱臼使母体死亡后，立即将胚胎分离，将脑组织单独分离。LIS1的蛋白量测定在取出小鼠脑后，立即测定重量，相对小鼠脑的重量，加入2倍量的蛋白质溶解液（30mM Tris-HCl pH.6.8，1.5％十二烷基硫酸钠（SDS），0.3％溴酚蓝（BPB，Sigma：B5525-10G）），0.3％2-巯基乙醇（2-ME，WAKO：135-07522），15％甘油），再由超声波处理使之完全可溶化。95℃加热处理5分钟后，由12.5％的SDS-丙烯酰胺电泳分离1μl来自脑组织的蛋白质溶解液，通过使用抗LIS1抗体（N-19、SC-7577、山羊多克隆抗体、Santa Cruz Biotechnology；1∶100稀释）的免疫印迹检测。

在图6中表示结果。LIS1杂合突变小鼠胚胎的LIS1蛋白量是正常小鼠胚胎的一半左右，但由SNJ-1945给药，恢复到正常程度。另外，由一次给药，其效果至少持续3天。

由此表示，能够由SNJ-1945治疗无脑回畸形。

由SNJ-1945口服给药产生的新生小鼠脑中的LIS1蛋白变化的研究

对5只同型的EⅡ-Cre转化小鼠（FVB/N-Tg（EⅡa-cre）C5379Lmgd/J、杰克逊实验室）的雌鼠，通过将1只不具有neo基因的neo（-）129S-Pafah1b1^tm2Awb/J同型小鼠的雄鼠在同一鼠笼中饲养进行交配，准备合计6件该鼠笼，开始交配实验。每天早晨确认分娩，将确认分娩时定义为新生鼠。将SNJ-1945以100mg/ml的浓度在二甲基亚砜（DMSO）中溶解，以给药量为200μg/体重g的方式，使用移液管口服给药。

为了判断由SNJ-1945给药产生的效果，测定正常新生小鼠和LIS1杂合突变新生小鼠（SNJ-1945给药）的LIS1的蛋白质。

在SNJ-1945给药组中，为了判断伴随时间经过的SNJ-1945的效果，在给药后0小时（刚给药后）、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、48小时和72小时的各时间后取出脑组织，测定LIS1的蛋白质。另外，在LIS1蛋白的各测定中，分别使用6只小鼠（n=6）。

将新生小鼠断头使之死亡后，立即将脑组织单独分离。LIS1的蛋白量测定在取出小鼠脑后，立即测定重量，相对小鼠脑的重量，加入2倍量的蛋白质溶解液（30mM Tris-HCl pH6.8，1.5％十二烷基硫酸钠（SDS），0.3％溴酚蓝（BPB），0.3％2-巯基乙醇（2-ME），15％甘油），再由超声波处理使之完全可溶化。95℃加热处理5分钟后，由12.5％的SDS-丙烯酰胺电泳分离1μl来自脑组织的蛋白质溶解液，通过使用抗LIS1抗体（N-19、SC-7577、山羊多克隆抗体、Santa CruzBiotechnology；1∶100稀释）的免疫印迹检测。

在图7中表示结果。LIS1杂合突变新生小鼠的LIS1蛋白量是正常新生小鼠的一半左右，但由SNJ-1945给药，恢复到正常程度。另外，由一次给药，其效果至少持续3天。

由此表示，即使在出生后，也能够由SNJ-1945的口服给药治疗无脑回畸形。

由SNJ-1945腹腔内给药产生的成体小鼠脑中的LIS1蛋白变化的研究

对LIS1杂合突变小鼠，将SNJ-1945以100mg/ml的浓度在二甲基亚砜（DMSO）中溶解，在出生后3周时，以给药量为100μg/体重g的方式在腹腔内注入。

为了判断由SNJ-1945给药产生的效果，测定正常成体小鼠和LIS1杂合突变成体小鼠（SNJ-1945给药）的LIS1的蛋白质。在SNJ-1945给药组中，为了判断伴随时间经过的SNJ-1945的效果，在给药后0小时（刚给药后）、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、48小时和72小时的各时间后取出脑组织，测定LIS1的蛋白质。另外，在LIS1蛋白的各测定中，分别使用6只小鼠（n=6）。

由颈椎脱臼使成体小鼠死亡后，立即将脑组织单独分离。LIS1的蛋白量测定在取出小鼠脑后，立即测定重量，相对小鼠脑的重量，加入2倍量的蛋白质溶解液（30mM Tris-HCl pH.6.8，1.5％十二烷基磺酸钠（SDS），0.3％溴酚蓝（BPB），0.3％2-巯基乙醇（2-ME），15％甘油），再由超声波处理使之完全可溶化。95℃加热处理5分钟后，由12.5％的SDS-丙烯酰胺电泳分离1μl来自脑组织的蛋白质溶解液，通过使用抗LIS1抗体（N-19、SC-7577、山羊多克隆抗体、Santa CruzBiotechnology；1∶100稀释）的免疫印迹检测。

在图8中表示结果。LIS1杂合突变成体小鼠的LIS1蛋白量是正常成体小鼠的一半左右，但由SNJ-1945给药，恢复到正常程度。另外，由一次给药，其效果至少持续3天。

由此表示，即使是出生后，也能够由SNJ-1945治疗无脑回畸形。

由SNJ-1945腹腔内给药产生的对于胎鼠脑的细胞凋亡影响的研究

对5只同型的EⅡ-Cre转化鼠（FVB/N-Tg（EⅡa-cre）C5379Lmgd/J、杰克逊实验室）的雌鼠，通过将1只不具有neo基因的neo（-）129S-Pafah1b1^tm2Awb/J同型小鼠的雄鼠在同一鼠笼中饲养进行交配，准备合计6件该鼠笼，开始交配实验。每天早晨7-10点期间进行插入确认（交尾的确认），决定妊娠周期。将SNJ-1945以100mg/ml的浓度在二甲基亚砜（DMSO）中溶解，从E9.5天（妊娠9.5天）隔日以100μg/体重g在LIS1杂合突变小鼠（Lis1+/-）和对照小鼠（正常胎鼠）的妊娠小鼠母体腹腔内给药。在E15.5（妊娠15.5天），由颈椎脱臼使小鼠母体死亡后，取出小鼠胚胎，以4％多聚甲醛（WAKO：162-16065）固定24小时，置换为PBS后，按照常规方法进行石蜡包埋。将组织块制成5μm厚的切片，使之附着在APS涂布的载玻片上。

脱蜡操作后，在室温进行15分钟20μg/ml的蛋白酶K/PBS处理，在室温进行10分钟3％的H2O2/PBS处理。使用ApopTag细胞凋亡检测试剂盒（ApopTag Apoptosis Detection Kit）（Millipore：S7100）进行TUNNEL（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧核苷酸缺口末端标记法）染色，检测细胞凋亡。另外，已知TUNNEL染色是通过检测片段化DNA而能够检测出细胞凋亡的方法。

在图9中表示结果。在正常小鼠中几乎不能看到细胞凋亡，但在LIS1变异小鼠中可以高频率地看到细胞凋亡。另外可知由SNJ-1945给药，在LIS1变异小鼠中观察到的细胞凋亡显著减轻。由此，可以认为由SNJ-1945的给药，能够减轻无脑回畸形的症状。

无脑回畸形模型小鼠（LIS1基因杂合缺陷小鼠）的行动解析

无脑回畸形患者的运动功能显著下降。因此，为了确认无脑回畸形的治疗效果，将无脑回畸形模型小鼠的运动功能作为指标进行研究。

＜行为分析实验用小鼠的准备＞

在行为分析实验时，将野生型小鼠和Lis1（+/-）的杂合突变体小鼠分为5组（C组、M1组、M2组、M3组和M4组）。属于各组的小鼠的详细情况如下。另外，作为饵料，使用（CE-2、日本CLEA）。使用的野生型小鼠和杂合小鼠的制作方法，与上述的“LIS1基因杂合缺陷小鼠（LIS1杂合突变小鼠）的制作”相同。

C组：对照组的野生型小鼠。

M1组：SNJ-1945的非给药的Lis1杂合小鼠。

M2组：在二甲基亚砜（Sigma、D-5879）中，以100mg/ml的浓度溶解SNJ-1945，在妊娠9.5天（E9.5）的时刻，以给药量为200μg/母体体重g/天的方式在妊娠母体的饵料中加入SNJ-1945进行给药，再在出生后与下述M3组同样地进行给药的Lis1杂合小鼠。

M3组：从出生后当天起，将在0.5％CMC（羧甲基纤维素钠盐：和光039-01335）中以50mg/ml的浓度溶解有SNJ-1945的溶液，以200μg/体重g/天的方式进行强制口服给药，再从出生后第21天起以给药量为200μg/体重g/天的方式将加入SNJ-1945的饵料进行给药的Lis1杂合小鼠。

M4组：从出生后第10天起，将在0.5％CMC（羧甲基纤维素钠盐）中以50mg/ml的浓度溶解有SNJ-1945的溶液以200μg/体重g/天的方式进行强制口服给药，再从出生后第21天起以给药量为200μg/体重g/天的方式将加入SNJ-1945的饵料进行给药的Lis1杂合小鼠。

在食饵（CE-2、日本CLEA）中混入SNJ-1945，以SNJ-1945给药量为200μg/体重g/天的方式连续向各小鼠口服给药。行为分析实验，准备各组12～16只小鼠，在行动实验设施中预饲养1～2周后，从约9周龄到约12周龄的期间进行。行为分析实验结束后，进行基因型的判断，对于全部小鼠确认基因型。

另外，为了保证行动解析的结果起因于各组的差异，在行动解析开始前，在以下的（ⅰ）～（ⅳ）方面，确认没有表现异常的小鼠。

（ⅰ）健康状态

进行直肠温度测定、体重测定，确认在直肠温度和体重中，各组中没有异常、显著差别。另外，进行触须状态（触须是否变短或是否没有）、体毛状态（体毛是否脱落或毛是否整齐）确认。没有存在问题的个体。

（ⅱ）是否有神经学的异常，对于以下的项目进行确认。

翻正反射（Righting Reflex）（翻倒后是否翻转过来）

触须颤动（Whisker-Twitch）（接触触须时，有回头看等反应）

耳朵颤动（Ear-Twitch）（接触耳朵时，有回头看等反应）

接触目标（Reaching）（悬在空中时，爪是否伸向前面的桌子，确认视觉）

钥匙相碰声（Key Jangling）（是否对晃动钥匙串的声音有反应，确认听觉、痉挛敏感性）

对于这些项目，没有在反应中有异常的小鼠。

（ⅲ）握力和肌肉力量

进行握力测定和肌肉力量测定，在握力和肌肉力量是否有问题，对于以下的项目进行确认。

金属线悬挂试验（Wire hang test）（使小鼠抓住金属网以后，将金属网翻过来的试验）

握力试验（Grip Strength test）（使小鼠抓住金属网进行拉扯，测定小鼠肌肉力量的试验）

这些试验的结果，在各组中没有显著差别，可知在握力和肌肉力量上没有问题。

（ⅳ）焦虑样行为

作为焦虑样行为的试验，进行明暗选择试验。准备明箱和暗箱有一处被连接的装置，在暗箱中放置小鼠。小鼠一般喜好黑暗场所，但为了进行试探行为，也侵入明箱。测定在10分钟内，在明箱和暗箱中分别滞留的时间、来回明箱和暗箱的次数、在最开始进入明箱之前的潜伏时间、移动距离。在明箱的滞留时间短、来回次数少、在最开始进入明箱之前的潜伏时间长等的情况，可以认为焦虑样行为亢进。实验的结果，各组中没有显著差别，另外，明箱和暗箱各自的滞留时间无差别。可以认为焦虑样行为没有亢进，确认了被实验环境、实验者等驯化。

＜统计处理＞

小鼠的行为分析实验数据的统计处理，使用统计软件Stat View（SAS institute）进行。关于上述5组全体进行ANOVA解析（多组的分散分析），对于危险率（p值）为5％以下（p＜0.05）的判断为有显著差别。在ANOVA解析中，在比较对象决定后的多重比较（事后比较）中，使用Fisher’s PLSD法。

＜行为分析实验1：转棒试验＞

作为协调运动-运动学习的试验，进行转棒试验。该试验的概要如下。准备圆柱状棒（rod）以一定速度旋转的装置，当将小鼠放置在旋转的棒上，小鼠就会不掉落而在棒上行走。将棒的旋转速度在5分钟从5rpm加速到40rpm。1次试行是进行到小鼠从棒上掉落或进行到经过5分钟。实验1天试行3次进行2天（合计试行6次）。随着反复试行，小鼠变得不容易从棒上掉落，因此在棒上的滞留时间变长。运动学习能力降低（差）的小鼠，从棒上不掉落的运动的进步差，在棒上的滞留时间不变长。实验的结果，C组的运动进步最快，滞留时间长（图10、图11）。相比于C组，M1组的运动进步慢，滞留时间显著减少，因此，可知运动学习能力减少（图10、图11）。进行了SNJ-1945给药的M2、M3组，运动的进步曲线在M1组和C组的中间（图10），综合滞留时间延长到与C组没有显著差别的水平，可以确认由SNJ-1945的口服给药产生的运动学习能力的改善（图11）。

＜行为分析实验2：步态分析＞

为了调查运动功能异常和小脑失调等，进行解析行走（足迹）的试验（步态分析）。具体地，在以24cm/秒旋转的透明跑步机上载放小鼠，使其行走，从下方以高速照相机（150flame/秒）拍摄，以专用软件（DigiGait，MOUSE SPECIFICS，Inc.）解析足迹。在该试验中，在步幅和足的角度以外，还评价足的落地方式和离地方式等多种指标。

［步态分析的主要解析项目］

·摆动时间（Swing Duration）：足在空中悬着的时间

·％摆动（%Swing）：在踏出一步的动作中，足在空中悬着的时间的比例

·停步时间（Braking Duration）：从足踏在带上开始到足完全附着在带上为止的时间

·％停步（%Braking）：在踏出一步的动作中，从足踏在带上开始到到足完全附着在带上为止的时间的比例

·％停步的支撑（%Brake of Stance）：在足接触带的动作中，从足踏在带上开始到足完全附着在带上为止的时间的比例

·推进时间（Propulsion Duration）：从足完全附着在带上开始到足刚从带离开为止的时间

·％推进（%Propulsion）：在踏出一步的动作中，从足完全附着在带上开始到足刚从带离开为止的时间的比例

·％推进的支撑（%Propel of Stance）：在足接触带的动作中，从足完全附着在带上开始到足刚从带离开为止的时间的比例

·支撑时间（Stance Duration）：足接触带的时间

·％支撑（%Stance）：在踏出一步的动作中，足接触带的时间的比例

·跨步时间（Stride Duration）：在踏出一步耗费的时间

·摆动对支撑的比例（Swing-to-stance ration）：足在空中悬着的时间和足接触带的时间之比

有显著差别的是％摆动（在踏出一步的动作中，足在空中悬着的时间的比例）和摆动对支撑的比例（足在空中悬着的时间和足接触带的时间之比）。因此，进行以这些为指标的研究。另外，已知％摆动在有关节炎等的动物时，值上升。可以认为是由于在空中踏出足时，关节不能顺利运动的缘故。

相比于C组，M1组的％摆动显著上升，可以认为踏出足的运动功能有异常（图12）。进行了SNJ-1945给药的M2、M3、M4组，与C组没有显著差别，可以确认运动功能的改善。摆动对支撑的比例是行走方式变化时产生变化的值，越接近跑步状态越接近1。相比于C组，M1组的摆动对支撑的比例显著减少，接近于1，但进行了SNJ1945给药的M2组，恢复至与C组没有显著差别的水平，相比于M1组，M3和M4组都接近1（图13）。从这些结果确认到了胚胎期和出生后的由SNJ-1945的口服给药产生的运动功能的改善。

来自人无脑回畸形患者的细胞的解析

＜人无脑回畸形患者的基因诊断＞

从无脑回畸形患者和双亲采取1ml血液，使用1.5ml用的样品杯（Bio-BIK：SC-015），以4℃、3000转/分钟进行离心分离。采取50μl包含白血球的沉淀表层，溶解在250μl的DNA提取缓冲液（10mMTris-HCl pH7.5、0.5％十二烷基磺酸钠（SDS），10mM乙二胺四乙酸、10μg/ml蛋白酶K（Roche03-115-852-001））中，以37℃使之反应1小时。然后，加入100μl苯酚、100μl氯仿，剧烈混合后，以4℃、15000转/分钟进行5分钟离心分离。将上清移入新的1.5ml用的样品杯（Bio-BIK：SC-015），加入30μl的3M乙酸钠、700μl乙醇，混合后，以4℃、15000转/分钟进行5分钟离心分离。弃去上清，在100μl（10mMTris-HCl pH7.5、1mM乙二胺四乙酸）中溶解沉淀的DNA，在基因诊断中使用。

基因诊断将tctaaaatag ttatcctttg ttac和aggtgaataaaggaacactgtaca作为引物，以PCR将基因进行扩增。在合计50μl的反应液中加入1μl患者的DNA、1μl的10mM dNTP、1μl的100μM引物、0.5μl BIOTAG（BiolineBio21040），以94℃:20秒、55℃:30秒、72℃:60秒重复35个循环的PCR（Applied Biosystems Gene Amp9700）扩增，进行DNA的碱基序列的确定。碱基序列的确定以tctaaaatag ttatcctttg ttac和aggtgaataaaggaacactgtaca为引物，使用Big Dye Terminator v3.1（AppliedBiosystems#4336917）进行。循环程序以94℃:20秒、55℃:30秒、60℃:4分钟进行35个循环（Applied Biosystems Gene Amp9700），以ABI3500xL（Applied Biosystems）解析读出产物序列。其结果，可知蛋白质翻译区域的第460位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，由此，产生终止密码子，通过蛋白质的翻译在此结束，生成功能上无活性的LIS1（图14）。

＜来自人无脑回畸形患者的成纤维细胞的建立＞

成纤维细胞的建立如下进行。即，无菌地从上述无脑回畸形患者获取一部分表皮（5mm见方），在培养液（E-MEM（和光051-07615）、10％胎牛血清（Equitech-Bio Inc、SFBM30-1798、1xL-谷氨酰胺（Gibco25030），1xPen Strep（Gibco15140）；以下，作为培养液使用该组成的混合液）中保存，在室温4小时输送。输送后，将组织片切为1mm见方，使之在培养烧瓶（Becton Dickinson353009）中固定，在6ml培养液中培养3周。培养3周后，确认来自组织片的成纤维细胞增殖后，以磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate buffered saline、PBS（-）、137mMNaCl、2.7mM KCl、10mM NaH₂PO₄、1.8mM KH₂PO₄、pH7.4）清洗，加入0.5ml Trypsin-EDTA（Gibco25200），以37℃使之反应5分钟，将细胞分离后，加入10ml培养液，移入10cm培养皿（Greiner664-160）培养。

＜细胞荧光免疫染色＞

为了以显微镜观察细胞，在盖玻片上培养细胞。将盖玻片（24×24No.1、松浪哨子工业株式会社）在0.1M盐酸中浸20分钟，水洗后，放入70％乙醇中，在超净台内保存。在超净台内，在6孔板（FALCON353046）的各孔底各放置1片该盖玻片，使乙醇干燥后，每1孔添加0.5×10⁵个成纤维细胞，培养16小时，使细胞附着在盖玻片上。

准备含有SNJ-1945的培养液。具体地，在培养液中以最终浓度为200μM的方式混合在二甲基亚砜（SIGMA D-5879）中溶解的SNJ-1945，37℃静置1小时，使SNJ-1945在培养基中溶解，制成含有SNJ-1945的培养液。对在上述6孔板培养的细胞，弃去孔中培养基后以2ml/孔加入含有SNJ-1945的培养液，进行2小时培养。另外，作为对照，使用添加了等量二甲基亚砜的培养液，同样地进行培养。

培养2小时后，以磷酸缓冲生理食盐水（Phosphate buffered saline、PBS（-）、137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM NaH₂PO₄、1.8mM KH₂PO₄、pH7.4）清洗，在PBS（-）（和光163-20145）中加入4％多聚甲醛（PFA），在室温将细胞固定15分钟。以PBS（-）清洗，加入0.2％triton X-100（聚氧乙烯（10）辛基苯基醚，和光168-11805）的PBS（-）溶液，在室温进行细胞的浸透化10分钟。再以PBS（-）清洗细胞，添加封闭液（3％BSA（Sigma A3156-5G）、4％Block Ace粉末（雪印乳业株式会社），添加PBS（-），使得能够在室温1小时将非特异性结合封闭（封闭处理）。一次抗体将以15000rpm、4℃离心5分钟得到的上清以封闭液稀释100倍使用。

在湿盒（Wet chamber）中垫上石蜡膜，载放300μl抗体溶液，以盖玻片的细胞面向下的方式，在该抗体溶液上，室温静置1小时使之反应。将细胞附着的盖玻片返回加入了PBS（-）的6孔板上，振荡5分钟，反复清洗4次。二次抗体和用于将核染色的色素10mM DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，同仁28718-90-3），以PBS（-）将以15000rpm、4℃离心5分钟得到的上清稀释1000倍（DAPI为500倍），每1孔加入1.5ml，避光、室温边缓慢振荡1小时边使之反应。加入PBS（-），反复4次5分钟的振荡清洗。在盖玻片（荧光染色用S0318、松浪硝子工业株式会社）上一滴一滴地滴加封入液（Fluor Save Reagent、CALBIOCHEM），细胞面向下地盖上盖玻片封入。为了防止空气侵入，以漆（lacquer）密封盖玻片的周围，固定30分钟～1小时左右，将盖玻片表面以含水的棉棒清洗后，以包含乙醇的棉棒清洗，作为观察试样。

另外，在以下的表2中表示在荧光染色用中使用的抗体一览表。

［表2］

＜共焦点显微镜观察＞

以共焦点显微镜（TCS FP5S，Leica）进行进行了荧光免疫染色的细胞的观察。使用3种激光（二极管(Diode)405nm，氩(Argon)488nm输出30％，HeNe543nm），激发荧光色素，使用油浸物镜（HCX PL Apolambda blue63x1.4油）观察。在图像拍摄中使用专用软件（LAS AFLeica），以变焦(Zoom)x2，512x512像素(pixel)，扫描速度(scan speed)400Hz，帧平均(frame average)4的条件拍摄。细胞的边界通过同时拍摄微分干涉图像得到。拍摄图像从LIF（Leica Image Format）文件转换为TIFF格式的文件进行图像解析。荧光显微镜图像的解析使用ImageJ（NIH）进行。

［LIS1的分布：图15和图16］

使用抗Lis1抗体，使用荧光免疫染色过的培养细胞，观察LIS1在细胞内的分布。其结果，在正常的Lis1（+/+）细胞中，LIS1在核和中心体周边定位，在细胞边缘部几乎不能看到。在Lis1（+/-）细胞中，丧失在Lis1（+/+）细胞中可以看到的LIS1向核周边的聚集，从核周边到细胞边缘部均匀地分布。特别是显著地观察到在Lis1（+/+）细胞中几乎看不到的沿着细胞边缘的分布。当以SNJ-1945处理该Lis1（+/-）细胞，就与Lis1（+/+）同样地可以确认LIS1再次向核和中心体周边聚集。由此可知，由SNJ-1945处理，能够使来自人无脑回畸形患者细胞的LIS1的细胞内分布向与正常细胞同样的分布恢复。

［细胞质动力蛋白的分布：图17和图18］

使用抗DIC（细胞质动力蛋白）抗体，使用荧光免疫染色过的培养细胞，观察细胞质动力蛋白的细胞内分布。其结果，在Lis1（+/+）细胞中，细胞质动力蛋白从核和中心体周边到细胞边缘部具有平缓的斜率并且在整体中分布。另一方面，在Lis1（+/-）细胞中，细胞质动力蛋白向周边部的扩散丧失，在核和中心体周边可见细胞质动力蛋白的集中定位。当以SNJ-1945处理该Lis1（+/-）细胞，就与Lis1（+/+）细胞同样地细胞质动力蛋白从核周边到细胞边缘部在整体中分布。由此可知，由SNJ-1945处理，可以使来自人无脑回畸形患者细胞的细胞质动力蛋白的细胞内分布向与正常细胞同样的分布恢复。

［β-COP小泡的分布：图19和图20］

使用抗β-COP抗体，观察β-COP小泡的细胞内分布。其结果，在Lis1（+/+）细胞中，β-COP小泡从核和中心体周边到细胞边缘部具有平缓的斜率，并且在整体中大致均匀地分布。在Lis1（+/-）细胞中，β-COP小泡向核周边以外的扩散丧失，β-COP小泡大量在核和中心体周边定位。当以SNJ-1945处理该Lis1（+/-）细胞，就变得与Lis1（+/+）细胞同样地，β-COP小泡再次从核周边到细胞边缘部大致均匀地分布。由此可知，由SNJ-1945处理，可以使来自人无脑回畸形患者细胞的β-COP小泡的细胞内分布向与正常细胞同样的分布恢复。

另外，图16、18、20是表示与图2b、图3b、图4b同样解析结果的曲线图。即，具体地如下操作作成的图像。将LIS1、细胞质动力蛋白、β-COP小泡各自的细胞内定位，从核边缘部到细胞边缘部，以相等间隔直线状地测定10点的荧光强度。在各条件下，分别测定20个细胞，各点的荧光强度，将以细胞整体的荧光强度设为1标准化后的值作图。误差线表示标准误差。

LIS1的分布，在正常细胞中是在核周边部聚集，在Lis1（+/+）细胞中是扩散到细胞整体，但通过SNJ-1945处理，向核周边部的聚集恢复到与正常细胞相同的水平（图16）。细胞质动力蛋白和β-COP小泡，在正常细胞中在细胞整体中分布，但在Lis1（+/-）细胞中，发生向细胞核周边部的聚集。通过SNJ-1945处理，可以恢复为与正常细胞同样的细胞内分布（图18、图20）。

＜蛋白质定量＞

［细胞提取液的配制］

在超净台内，在6孔板中每1孔添加3×105个细胞、培养16小时，使细胞附着在板的各孔中。弃去孔中的培养基，以2ml/孔的比例加入上述含有SNJ-1945的培养液（以SNJ-1945最终浓度为200μM的方式加入了溶解有SNJ-1945的二甲基亚砜的培养液），进行2小时培养。另外，作为对照，使用添加了等量的二甲基亚砜（SIGMA D-5879）的培养基同样地进行培养。

添加SNJ-1945，培养2小时后，以PBS（-）清洗2次，加入500μl的PBS（-），以细胞刮刀刮取细胞。回收在1.5ml管中，以15000rpm、5分钟、4℃离心，弃去上清，得到细胞的沉淀。在刮取细胞后的孔中加入500μl PBS（-），再次以细胞刮刀刮取残留的细胞，加入在沉淀中。以15000rpm、5分钟、4℃离心，弃去上清，得到细胞的沉淀。再在刮取细胞后的孔中加入500μl PBS（-），回收残留的细胞，加入在沉淀中。以15000rpm、4℃离心5分钟，弃去上清，回收细胞的沉淀。

在回收了细胞的管中分别加入70μl裂解缓冲液，吹打溶解细胞、得到细胞悬浊液。另外，裂解缓冲液在用时配制，组成如下。

20mM tris-HCl（2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇，pH7.5，100mM NaCl，5mM EDTA，0.1％triton X-100，10μg/ml抑肽素A，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素，1mM PMSF（苯甲基磺酰氟，SIGMA P7626-5G）

接着，以液氮使该细胞悬浊液冷冻。然后，将冷冻的细胞悬浊液再一次融化。将该细胞悬浊液进一步吹打，进行超声波处理，使细胞溶解。将该液氮冷冻、吹打、超声波的一系列处理反复3次。此后，以15000rpm、4℃离心5分钟，回收上清，加入新的管中。将其作为细胞提取液在实验中使用。

［免疫印迹］

测定细胞提取液的吸光度，进行整个溶液的蛋白质定量。将在裂解缓冲液中溶解的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，SigmaA3156-5G）作为标准试样使用。在96孔板中加入200μl布拉德福德试剂（Bradford reagent），加入2μl细胞提取液，以96孔板检测仪ARVOSx（PerkinElmer）测定595nm的吸光度，将全体的蛋白量定量。

接着，进行SDS-PAGE。准备10％聚丙烯酰胺微板凝胶，将细胞提取液和样品缓冲液（250mM Tris-HCl pH6.8、40％甘油、8％十二烷基磺酸钠（SDS）、5％2-巯基乙醇、5％溴酚蓝）以3∶1混合。根据用布拉德福德试剂定量的蛋白质量，以10μg/孔的方式在凝胶的各孔中上样。同时，上样5μl的电泳用蛋白质标记物（marker）（Precision PlusProtein Standards dual Color161-0373，BIO-RAD）。使用泳动缓冲液（25mM tris、192mM甘氨酸、0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)），每一块微板凝胶以20mA、85分钟的条件进行电泳。

从电泳结束后的凝胶将蛋白质转印于PVDF薄膜（Immobilon-PIPVH00010，MILLIPORE）。以150mA、90分钟的条件进行转印。另外，用于转印的转印缓冲液的组成如下。

A液：0.3M tris-HCl pH9.6，0.02％SDS,

B液：25mM tris-HCl pH10.2，0.02％SDS,

C液：25mM tris-HCl pH10.2，0.02％SDS，2mM6-氨基己酸

对每1张蛋白质转印后的薄膜，对薄膜加入30ml的封闭液（5％BSA，4％Block Ace、25mM tris-HCl pH7.6、137.7mM NaCl、0.1％tween-20），室温振荡1小时，将非特异性结合封闭（封闭处理）。一次抗体以15000rpm、4℃离心5分钟得到的上清以封闭溶液稀释100～300倍使用。一次抗体在湿盒内、在室温与薄膜反应1小时。一次抗体反应后，在TTBS缓冲液（25mM tris-HCl pH7.6、137.7mM NaCl、0.1％tween-20）中振荡10分钟，进行3次薄膜清洗。二次抗体以15000rpm、4℃离心5分钟得到的上清以TTB稀释1000倍使用。二次抗体在湿盒内、室温与薄膜反应1小时。在TTBS缓冲液中振荡10分钟，清洗3次。以MilliQ水振荡3分钟，清洗3次。将在AP缓冲液（100mM trispH9.5、100mM NaCl、5mM MgCl2）中加入1%的NBT/BCIP液（NBT/BCIP Stock Solution，Roche）的溶液作为发色液，在发色液中浸入薄膜，使之发色10分钟到30分钟。以MilliQ水振荡3分钟，清洗3次。以Kimtowels（工业擦拭纸）夹住两面，使薄膜干燥。

另外，在以下的表3中表示在该免疫印迹中使用的一次抗体和二次抗体的一览表。

［表3］

使用lumino图像分析器LAS-3000（富士胶卷），解析干燥的薄膜，进行图像的读取。使用专用软件LAS3000IR（富士胶卷），以曝光类型-精密、曝光时间-自动、感光度-标准、亮度-5的条件，以方法-数字化EPI模式拍摄。拍摄的图像以TIFF形式保存，使用专用的图像解析软件MultiGauge V3.1（富士胶卷），测定目的蛋白质条带的吸光度。由免疫印迹的条带确认人成纤维细胞内的LIS1、细胞质动力蛋白、β-肌动蛋白各蛋白质的总量（图21）。另外，将进行4次实验的结果的平均图表化（图22：误差线表示标准误差，显著差别以危险率5％进行t检验判断）。其结果，Lis1（+/-）细胞的LIS1量，相比于正常细胞的Lis1（+/+）减少到一半以下，但进行了药剂处理后的LIS1的量恢复到接近Lis1（+/+）的LIS1水平。也可以看到细胞质动力蛋白中间链的量增加。作为对照蛋白质观察的β-肌动蛋白的量看不到变化。由此，确认了通过由SNJ-1945，抑制作为蛋白质分解酶的钙蛋白酶的功能，LIS1的分解被抑制，细胞内的LIS1的量增加到接近正常细胞的水平。

使用SNJ-1945以外的钙蛋白酶抑制剂的研究（参考研究例）

以通常食饵（CE-2、日本CLEA）饲养正常小鼠和Lis1（+/-）的杂合突变体小鼠（每组8只），在出生后3周龄，以10mg/ml将作为钙蛋白酶抑制剂的ALLN（Merck208719）溶解在二甲基亚砜中，在小鼠腹腔内注入40μg/g体重相当量的ALLN。另外，以10mg/ml将作为其它钙蛋白酶抑制剂的E64d（Roche1585681）溶解在二甲基亚砜，在小鼠（8只）的腹腔内注入20μg/g体重相当量的E64d。注入后，在6小时和24小时后，由麻醉处置后颈椎脱臼使给药小鼠死亡，将脑组织立即分离。LIS1的蛋白量的测定，将小鼠脑取出后，立即测定重量，相对于小鼠脑的重量，加入2倍量的蛋白质溶液（30mM Tris-HCl pH.6.8、1.5％十二烷基磺酸钠（SDS），0.3％溴酚蓝、0.3％巯基乙醇，15％甘油），再由超声波处理，使之完全可溶化。在95℃热处理5分钟后，由12.5％的SDS-丙烯酰胺电泳分离1μl来自脑组织的蛋白质溶解液，通过使用抗LIS1抗体的免疫印迹检测LIS1。此外，抗体使用在上述表3中记载的抗体。

另外，在以下表示ALLN和E64d的结构式。

在图23中表示结果。向Lis1杂合突变小鼠胚胎的LIS1蛋白量是正常小鼠胚胎的一半左右，即使将ALLN、E64d给药，也确认不到LIS1蛋白量的改善，可知ALLN、E64d不能期待作为无脑回畸形治疗药。

各钙蛋白酶抑制剂的毒性的研究

从出生后第4～5天的FVB鼠（15只）切出小脑，在无Ca²⁺Hank’s平衡盐溶液（CF-HBSS；Ca²⁺、Mg²⁺-free Hank’s balanced salt solution（CMF-HBSS，SIGMA）中包含5mM氯化镁（MgCl₂，Wako）和4mg/mL葡萄糖（Wako）的溶液）内，取出脑脊膜，切碎。以CF-HBSS清洗小脑片后，在包含0.025％胰蛋白酶（invitrogen）和6.25μg/mL脱氧核糖核酸酶（DNase，SIGMA）的CF-HBSS内，37℃放置20分钟，离心。将得到的组织用10％HS/BME（DNase培养基）（在包含10％马血清（HS，invitrogen）的Eagle基本培养基（BME，invitrogen）（10％HS/BME）中添加了5mM MgCl₂和25μg/mL DNase的溶液）清洗、离心，在细胞中加入DNase培养基，移入24孔板（nunc），在包含5％CO₂的大气下以37℃静置30分钟，使细胞悬浮。将细胞悬浮液回收后，以10％HS/BME清洗，再移入24孔板，在包含5％CO₂的大气下以37℃培养16小时。在包含1％牛血清白蛋白（BSA、SIGMA）和0.5％N2supplement（invitrogen）的BME内回收细胞，将细胞悬浮液预先在多聚赖氨酸（SIGMA）和层粘连蛋白（SIGMA）涂布的35mm Glass BaseDish（IWAKI）中，以5×10⁵cells/mL接种，在包含5％CO₂的大气下以37℃培养8小时。将所培养的神经细胞作为被检测神经细胞。

如下操作配制包含SNJ-1945、E64d或ALLN的培养液（10％HS/BME）。在培养液中以最终浓度为200μM的方式混合在二甲基亚砜（SIGMA D-5879）中溶解的SNJ-1945，37℃静置1小时，使SNJ-1945在培养基中完全溶解。使ALLN和E64d也同样溶解在培养基中。其中，以最终浓度分别为50μM和100μM的方式在培养基中添加ALLN和E64d。

在准备的被检测神经细胞中，以2ml/孔加入溶有各化合物的培养基，进行16小时培养。另外，作为对照，使用添加了同量二甲基亚砜（SIGMA D-5879）的培养基同样地进行培养。培养后，以倒置型显微镜（TCS FP5S、Leica）观察细胞。使用20倍的物镜。在图像的拍摄中使用专用软件（LAS AF、Leica）、以512×512像素的条件拍摄。在图24中表示结果。

如图24所示，在只添加了二甲基亚砜（DMSO）的对照细胞中，神经突起正常伸长，发生细胞迁移，细胞扩散到周围。添加了SNJ1945的细胞，神经突起伸展，细胞迁移，与对照没有差别。另一方面，在添加了ALLN的细胞中，细胞凝集成圆形，几乎没有将神经突起伸展的细胞。细胞仍旧聚集在中央，也几乎观察不到迁移。添加了E64d的细胞也同样地在中央凝集，不能将突起伸长的细胞多。相比于对照，也几乎不发生迁移，细胞向周边部的移动极少。由此，相比于其它的钙蛋白酶抑制剂，SNJ-1945即使是高浓度，也完全观察不到细胞毒性，确认了对细胞的安全性高。

Claims

1.通式(Ⅰ)所示的化合物在用于无脑回畸形的治疗或预防的医药品的制造中的用途，所述医药品以出生后的无脑回畸形患者作为对象，

式中，R¹表示具有低级烷氧基作为取代基的低级烷基、具有杂环基作为取代基的低级烷基、杂环基或式(Ⅱa)所示的基团，

R²表示可以具有苯基作为取代基的低级烷基，

R³表示可以具有卤素、低级烷氧基或苯基作为取代基的低级烷基、缩合多环式烃基或氢原子，

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

R¹为式(Ⅱa)所示的基团，

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

R¹为式(Ⅱb)所示的基团，

式中，n表示1～6的整数。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

在R¹所示的低级烷基上的作为取代基的杂环基为可以具有低级烷基作为取代基的吡啶基。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

R¹所示的杂环基的杂原子为氧原子。

6.如权利要求1～5中任一项所述的用途，其特征在于：R³所示的低级烷基为环丙基。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

通式(Ⅰ)所示的化合物为

((1S)-1-((((1S)-1-苄基-2,3-二氧代-3-(环丙基氨基)丙基)氨基)羰基)-3-甲基丁基)氨基甲酸2-甲氧基乙酯、

((1S)-1-((((1S)-1-苄基-2,3-二氧代-3-(环丙基氨基)丙基)氨基)羰基)-3-甲基丁基)氨基甲酸5-甲氧基-3-氧杂戊酯、

((1S)-1-((((1S)-1-苄基-2,3-二氧代-3-(环丙基氨基)丙基)氨基)羰基)-3-甲基丁基)氨基甲酸8-甲氧基-3,6-二氧杂辛酯、

((1S)-1-((((1S)-1-苄基-2,3-二氧代-3-(环丙基氨基)丙基)氨基)羰基)-3-甲基丁基)氨基甲酸11-甲氧基-3,6,9-三氧杂十一烷酯、或

((1S)-1-((((1S)-1-苄基-3-(环丙基氨基)-2,3-二氧代丙基)氨基)羰基)-3-甲基丁基)氨基甲酸2-(吡啶-2-基)乙酯。

8.如权利要求1～5或7中任一项所述的用途，其特征在于：其为口服剂、注射剂或点滴剂。

9.如权利要求1～5或7中任一项所述的用途，其特征在于：通式(Ⅰ)所示的化合物的用量为每2～5天1次50～1200mg。

10.如权利要求6所述的用途，其特征在于：其为口服剂、注射剂或点滴剂。

11.如权利要求6所述的用途，其特征在于：通式(Ⅰ)所示的化合物的用量为每2～5天1次50～1200mg。