CN103282024A - 用于纳米聚合物基核酸递送的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在一个方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含小于500nm的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺乳酸盐衍生物纳米颗粒和核酸。另外，本文提供了用于向受试者给予核酸的方法，所述方法包括向所述受试者给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，将所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物皮下给予至受试者。

Description

用于纳米聚合物基核酸递送的组合物和方法
1.简介
本文提供了p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在一个方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含小于500nm的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺乳酸盐衍生物纳米颗粒和核酸。另外，本文提供了用于向受试者给予核酸的方法，所述方法包括向所述受试者给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，向受试者皮下给予所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。
2.背景技术
DNA疫苗代表了精确并且有效地将抗原递呈至免疫系统的灵活策略。然而，尽管DNA疫苗具有全部的理论优势，但DNA疫苗的临床经验却相当令人失望。日益明显的是，DNA疫苗临床转化中的主要问题之一在于对质粒DNA递送来说DNA疫苗并不是最理想的平台。此外，对于多种体内和离体基因治疗应用来说需要改善的核酸递送平台。
已经开发出了用于DNA递送的病毒平台，其基于反转录病毒和腺病毒。然而，病毒载体具有显著的缺陷。施用重组病毒引起对病毒蛋白的免疫应答，这种应答可能比通过转基因引起的应答高约20倍（参见Harrington等人,2002,Hum.Gene Ther.13(11):1263-1280；和Harrington等人,2002,J.Virol.76(7):3329-3337）。这种免疫应答将免疫应答限制在转基因本身。预先存在T细胞和抗体介导的对病毒颗粒的免疫性还限制了连续施用重组病毒的能力（参见Barouch等人,2003,J.Virol.77(13):7367-7375；Premenko-Lanier等人,2003,Virology307(1):67-75；Ramirez等人,2000,J.Virol.74(16):7651-7655；和Ramirez等人,2000,J.Virol.74(2):923-933），并因此使得不能重复进行治疗方案。这种载体的反复施用导致产生了抗所述载体的中和抗体（参见Tewary等人,2005,J.Infect.Dis.191(12):2130-2137）。尽管可以通过使用不同的病毒载体完成重复递送，但这种方法是费力的并需要制备大量不同的病毒载体，从而引起生物安全问题。另外，病毒递送平台产生了病毒遗传序列与宿主基因组序列相互作用的风险。还已知大多数病毒载体会被血清核酸酶降解，从而几乎90%的注射病毒载体在24小时内被降解（参见Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:97-129；和Varmus,1988,Science240(4858):1427-1435）。病毒载体的快速降解会导致它们不能到达靶细胞。总的来说，用于核酸递送的病毒平台具有明显局限性。
用于DNA递送的非病毒平台包括脂质体（脂质体-DNA复合物（lipoplex））、合成聚合物（多聚物-核酸复合物（polyplex））（参见Wasungu等人,2006,J.Control.Release116(2):255-264；和Wasungu,2006,Biochim.Biophys.Acta1758(10):1677-1684）和壳聚糖（参见Mansouri等人,2004,Eur.J.Pharm.Biopharm.57(1):1-8），它们也被证明并不是最理想的。脂质体-DNA复合物（lipoplex）的制备非常费力并且需要将DNA配制到赋形剂中（参见Wasungu等人,2006,J.Control.Release116(2):255-264；和Wasungu,2006,Biochim.Biophys.Acta1758(10):1677-1684）。另外，Wasungu等人的发表论文显示如pH和电荷以及脂质体的结构特性的几种物理因素会影响脂质体与DNA的相互作用，并且由于会从循环系统中被迅速清除，脂质体-DNA复合物的转导效率较低。脂质体-DNA复合物和多聚物-核酸复合物组装的过程会损害质粒DNA的结构完整性，从而所得的质粒向脂质体-DNA复合物壳中的无效包裹会影响多聚物-核酸复合物（lypoplex）与细胞表面的相互作用。这可以导致lipoplex-或polyplex-递送的基因极差的转录（参见Hama,2006,Mol.Ther.13(4):786-794）。此外，由于不能将胞内DNA释放到细胞质中，因此大部分多聚物-核酸复合物需要与内涵体溶解剂共转染（参见Forrest和Pack,2002,Mol.Ther.6(1):57-66）。
几丁质和壳聚糖基产品在DNA递送应用中的使用受到聚合物产物的化学和物理异质性以及几丁质和壳聚糖制剂被蛋白或其他组分污染的阻碍（参见Vournakis等人,2004,J.Trauma57(1Suppl.):S2-6）。
因此，需要能够获得高转染效率而不引起毒性的用于核酸递送的非病毒平台。还需要允许核酸持续释放的递送载体，从而使得能够重复施用但降低其频率。
3.发明内容
本文提供了聚-N-乙酰葡糖胺（“p-Glc NAc”）纳米颗粒/核酸组合物。在一个方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含聚-N-乙酰葡糖胺和核酸，其中至少40%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一些实施方式中，所述核酸是DNA。在某些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的纳米颗粒的尺寸为约5nm至500nm之间。在一些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少50%的纳米颗粒的尺寸为约5nm至500nm之间。在某些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的纳米颗粒的尺寸为约10nm至500nm之间，20nm至200nm之间，20nm至150nm之间，20nm至100nm之间，25nm至250nm之间，25nm至150nm之间，25nm至100nm之间，50nm至200nm之间或50nm至150nm之间。在具体的实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少50%的纳米颗粒的尺寸为约10nm至500nm之间，20nm至200nm之间，20nm至150nm之间，20nm至100nm之间，25nm至250nm之间，25nm至150nm之间，25nm至100nm之间，50nm至200nm之间或50nm至150nm之间。在特定的实施方式中，至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的所述纳米颗粒的尺寸为5nm至500nm之间，10nm至500nm之间，20nm至200nm之间，20nm至150nm之间，20nm至100nm之间，25nm至250nm之间，25nm至150nm之间，25nm至100nm之间，50nm至200nm之间或50nm至150nm之间。在某些实施方式中，通过透射电子显微术或扫描电子显微术确定所述纳米颗粒的尺寸。在一些实施方式中，所述组合物还包含佐剂。在一种具体的实施方式中，所述佐剂是聚肌苷酸聚胞苷酸（polyI:C）。在另一种实施方式中，所述佐剂是细胞因子。
在一些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物。在一种具体的实施方式中，所述组合物中的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺乳酸盐衍生物。在一些实施方式中，所述组合物中的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺已用有机酸或无机酸溶解。在一种具体的实施方式中，所述组合物中的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺已用乳酸溶解。
在某些实施方式中，本文描述了p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物，其中至少65%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少70%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在其他实施方式中，所述组合物中约40%至约90%（例如，40%至90%）的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一种实施方式中，所述组合物中约60%至约80%（例如，60%至80%）的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在其他实施方式中，所述组合物中约40%至约95%，约40%至约85%，约40%至约80%，约50%至约95%，约50%至约90%，约50%至约85%，约50%至约80%，约55%至约95%，约55%至约90%，约55%至约85%，约55%至约80%，约60%至约95%，约60%至约90%，约60%至约85%，约65%至约95%，约65%至约90%，约65%至约85%，约65%至约80%或约65%至约75%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。
在一些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的聚-N-乙酰葡糖胺是长度为约50μm至约200μm的纤维。在一种具体的实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的聚-N-乙酰葡糖胺是长度为50μm至100μm的纤维。在一些实施方式中，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的聚-N-乙酰葡糖胺的分子量为至少2×106Da或至少2.5×106Da，或者所述分子量为约2×106Da至约3.5×106Da或约2.5×106Da至约3×106Da之间。
在另一个方面，所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含小于500nm的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺乳酸盐衍生物纳米颗粒和核酸。在某些实施方式中，至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的纳米颗粒的尺寸为100nm至200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所确定的。在一些实施方式中，所述组合物还包含佐剂。在一种具体的实施方式中，所述佐剂是聚肌苷酸聚胞苷酸（PolyI:C）。在另一种实施方式中，所述佐剂是细胞因子。
在另一个方面，本文提供了用于向受试者给予核酸的方法，所述方法包括向所述受试者给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在一些实施方式中，所述受试者是人。在其他实施方式中，所述受试者是非人动物。在某些实施方式中，向受试者皮下给予所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在一种具体的实施方式中，向受试者的上皮细胞皮下给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在其他实施方式中，向受试者肌内或静脉内给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。本文所述的方法，至少部分地基于以下意外发现：向受试者给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物导致核酸在施用位点处的持续表达。另外，所表达的核酸能够被专职性抗原提呈细胞有效吸收并且被输送至导致特异性CD8+T细胞活性的引流淋巴结。在一些实施方式中，给予所述组合物的导致所述组合物中的核酸持续表达至少1周、至少2周、至少4周、至少6周或至少2个月。在某些实施方式中，向受试者重复给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物（例如，两次、三次、四次、或者三次或四次以上；或每周1次，每2周1次，每3周1次，每4周1次，每6周1次，每8周1次）。在一些实施方式中，在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、3年、4年或5年（或者1年或5年以上）的一段时间内重复给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。
在特定的实施方式中，本文提供了用于向受试者给予核酸和佐剂的方法，所述方法包括向所述受试者给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物和佐剂。所述佐剂可以在所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中给药，或随所述p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物给药（例如，在包含p-Glc NAc和佐剂的单独的组合物中）。在一些实施方式中，给予包含核酸和佐剂的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物导致所述核酸和所述佐剂的持续同时释放。
在另一个方面，本文提供了制备聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物的方法。具体地，本文描述了制备所述组合物的方法，包括：（a）向聚-N-乙酰葡糖胺加入碱以使得至少40%的聚-N-乙酰葡糖胺脱乙酰化；（b）加入无机酸或有机酸以形成脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物；（c）加入缓冲液以有助于稀释；和（d）加入核酸；由此制备聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物。在这些实施方式的一些中，所述无机酸或有机酸是乳酸。在其他实施方式中，所述无机酸或有机酸是乙醇酸、琥珀酸、柠檬酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸、丙醇二酸或富马酸。在具体的实施方式中，步骤（c）中的缓冲液是乙酸钠-乙酸缓冲液或乙酸铵-乙酸缓冲液。在一些实施方式中，在步骤（d）（其中将核酸加入到在缓冲液中稀释的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物中）之前，所述核酸已与盐（例如，硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁）混合。在某些实施方式中，在制备所述聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物中使用的聚-N-乙酰葡糖胺是40%至90%脱乙酰化的，60%至80%脱乙酰化的或超过65%脱乙酰化的。在一些具体的实施方式中，在制备所述组合物中使用的聚-N-乙酰葡糖胺是约40%至约95%、约40%至约85%、约40%至约80%、约50%至约95%、约50%至约90%、约50%至约85%、约50%至约80%、约55%至约95%、约55%至约90%、约55%至约85%、约55%至约80%、约60%至约95%、约60%至约90%、约60%至约85%、约65%至约95%、约65%至约90%、约65%至约85%、约65%至约80%或约65%至约75%脱乙酰化的。
在某些实施方式中，本文描述了制备聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物的方法，还包括在上述步骤（d）中加入佐剂。在其他实施方式中，本文描述了制备聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物的方法，所述方法还包括将所述聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物与佐剂混合。所述佐剂可以是本文所述的任何佐剂（例如，PolyI:C或细胞因子）。
3.1术语
术语“烷基”是指直链或支链的饱和一价烃基，其中如本文所述亚烷基可以可选地被取代。除非另作说明，否则术语“烷基”还涵盖了直链和支链烷基两者。在某些实施方式中，所述烷基是具有1至20（C1-20）、1至15（C1-15）、1至10（C1-10）或1至6（C1-6）个碳原子的直链饱和一价烃基，或者是具有3至20（C3-20）、3至15（C3-15）、3至10（C3-10）或3至6（C3-6）个碳原子的支链饱和一价烃基。如本文所使用的，直链C1-6烷基和支链C3-6烷基也被称为“低级烷基”。烷基的实例包括，但不限于甲基、乙基、丙基（包括所有异构形式）、正丙基、异丙基、丁基（包括所有异构形式）、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基（包括所有异构形式）和己基（包括所有异构形式）。例如，C1-6烷基是指1至6个碳原子的直链饱和一价烃基或3至6个碳原子的支链饱和一价烃基。
术语“烯基”是指含有一个或多个（在一种实施方式中，1至5个）碳碳双键的直链或支链一价烃基。如本文所述，所述烯基可以可选地被取代。术语“烯基”还包括具有“顺式”和“反式”构象的基团，或者可替代地，具有“Z”和“E”构象的基团，如本领域技术人员所理解的。如本文所使用的，除非另作说明，否则术语“烯基”包括直链和支链烯基两者。例如，C2-6烯基是指2至6个碳原子的直链不饱和一价烃基或3至6个碳原子的支链不饱和一价烃基。在某些实施方式中，所述烯基是2至20（C2-20）、2至15（C2-15）、2至10（C2-10）或2至6（C2-6）个碳原子的直链一价烃基，或3至20（C3-20）、3至15（C3-15）、3至10（C3-10）或3至6（C3-6）个碳原子的支链一价烃基。烯基的实例包括，但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、烯丙基、丁烯基和4-甲基丁烯基。
术语“炔基”是指含有一个或多个（在一种实施方式中，1至5个）碳碳三键的直链或支链一价烃基。如本文所述，所述炔基可以可选地被取代。除非另作说明，否则术语“炔基”还涵盖了直链和支链炔基两者。在某些实施方式中，所述炔基是2至20（C2-20）、2至15（C2-15）、2至10（C2-10）或2至6（C2-6）个碳原子的直链一价烃基，或3至20（C3-20）、3至15（C3-15）、3至10（C3-10）或3至6（C3-6）个碳原子的支链一价烃基。炔基的实例包括，但不限于乙炔基（-C≡CH）和炔丙基（-CH2C≡CH）。例如，C2-6炔基是指2至6个碳原子的直链不饱和一价烃基或3至6个碳原子的支链不饱和一价烃基。
术语“卤素”、“卤化物”或“卤代”是指氟、氯、溴和/或碘。
术语“可选取代的”旨在表示可以被一个或多个取代基取代的基团，如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基或烷氧基，所述取代基独立地选自，例如，（a）烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，其中每一个可选地被一个或多个（在一种实施方式中，1个、2个、3个或4个）取代基Q取代；和（b）卤代、氰基（–CN）、硝基（–NO2）、–C(O)Ra、–C(O)ORa、–C(O)NRbRc、–C(NRa)NRbRc、–ORa、–OC(O)Ra、–OC(O)ORa、–OC(O)NRbRc、–OC(=NRa)NRbRc、–OS(O)Ra、–OS(O)2Ra、–OS(O)NRbRc、–OS(O)2NRbRc、–NRbRc、–NRaC(O)Rd、–NRaC(O)ORd、–NRaC(O)NRbRc、–NRaC(=NRd)NRbRc、–NRaS(O)Rd、–NRaS(O)2Rd、–NRaS(O)NRbRc、–NRaS(O)2NRbRc、–SRa、–S(O)Ra、–S(O)2Ra、–S(O)NRbRc和–S(O)2NRbRc，其中每一个Ra、Rb、Rc和Rd独立地为（i）氢；（ii）C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、杂芳基或杂环基，其中每一个可选地被一个或多个（在一种实施方式中，1个、2个、3个或4个）取代基Q取代；或（iii）Rb和Rc连同它们所连接的N原子一起形成杂环，其可选地被一个或多个（在一种实施方式中，1个、2个、3个或4个）取代基Q取代。如本文所使用的，除非另作说明，否则所有能够被取代的基团都是“可选地取代的”。
在一种实施方式中，每个Q独立地选自（a）氰基、卤代和硝基；和（b）C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、杂芳基和杂环基；和–C(O)Re、–C(O)ORe、–C(O)NRfRg、–C(NRe)NRfRg、–ORe、–OC(O)Re、–OC(O)ORe、–OC(O)NRfRg、–OC(=NRe)NRfRg、–OS(O)Re、–OS(O)2Re、–OS(O)NRfRg、–OS(O)2NRfRg、–NRfRg、–NReC(O)Rh、–NReC(O)ORh、–NReC(O)NRfRg、–NReC(=NRh)NRfRg、–NReS(O)Rh、–NReS(O)2Rh、–NReS(O)NRfRg、–NReS(O)2NRfRg、–SRe、–S(O)Re、–S(O)2Re、–S(O)NRfRg和–S(O)2NRfRg；其中每一个Re、Rf、Rg和Rh独立地为（i）氢；（ii）C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、杂芳基或杂环基；或者（iii）Rf和Rg连同它们所连接的N原子一起形成杂环。
4.附图说明
图1(A)-(F).p-Glc NAc纳米颗粒的扫描电子显微照片。
图2.用具有或不具有p-Glc NAc纳米颗粒的编码荧光素酶的质粒DNA接种后荧光素酶活性的生物发光检测。如图所示，递送编码荧光素酶基因的质粒DNA（即，皮下注射裸pDNA；皮下注射p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA或肌内注射裸pDNA）。在指定时间间隔腹膜内（i.p）注射萤光素后检测荧光素酶活性。使用IVIS系统使生物发光成像。在皮下注射后的第1天、第7天和第14天，p-Glc NAc纳米颗粒有效地释放DNA。
图3.使用p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物递送DNA导致专职性抗原提呈细胞将所编码的抗原吸收并输送至引流淋巴结。用单独的p-Glc NAc纳米颗粒（n=3）或用与100μg编码GFP的质粒DNA混合的p-Glc NAc纳米颗粒（n=3）注射六只小鼠的足垫。注射后1天，除去淋巴结并用与PE结合的抗MHC II类的单克隆抗体对细胞悬液染色。通过流式细胞术分析细胞。柱状图显示了具有GFP信号的MHC II类阳性细胞的百分比。每个柱状图代表单只小鼠。
图4.对hgp100DNA接种起反应的供体Pmel细胞的增殖。p-Glc NAc纳米颗粒/phgp100接种引起CD8+特异性反应。如图所示，在106个Pmel脾细胞（Thy1.1+）继承性转移后24小时对小鼠进行皮下接种。通过流式细胞术确定循环Pmel细胞的水平。将供体细胞的频率表示为总CD8+T细胞（n=3）的百分比的平均值±SDEV。
图5.DNA和Poly I:C与p-Glc NAc纳米颗粒的共递送提高了编码自身肿瘤抗原的DNA疫苗的抗癌免疫性和治疗效果。（A）以3×104个B16黑素瘤细胞对小鼠（n=5）实施静脉内（i.v.）注射。从B16肿瘤细胞注射后的第三天开始，三天分别进行三次皮下接种（即，用盐水对照、p-Glc NAc纳米颗粒/pTRP2，或者p-Glc NAc纳米颗粒/pTRP2/Poly I:C）。随后，将动物处死，切除它们的肺并称重。（B）用105个B16黑素瘤细胞对小鼠（n=5）实施皮下（s.c.）注射。从B16肿瘤细胞注射后的第5天开始，三天分别进行三次皮下接种（即，用盐水对照、p-Glc NAc纳米颗粒/pTRP2，或者p-Glc NAc纳米颗粒/pTRP2/Poly I:C）。处理后，一周三次监测肿瘤发展。
5.具体实施方式
5.1p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物
本文描述了p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物包含聚-N-乙酰葡糖胺或其衍生物。在一些实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺具有β-1→4构型。在其他实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺具有α-1→4构型。在某些实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺为约100%、99.9%、99.8%、99.5%、99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%纯的。在一种具体的实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺为90%至100%纯的。在一些实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺为大于90%、大于95%、大于98%、大于99%纯的，或者大于99.5%纯的。在某些实施方式中，25%至50%、40%至95%、40%至90%、40%至80%、40%至65%、50%至65%、50%至95%、50%至90%、50%至80%、60%至95%、60%至90%、60%至80%、65%至75%、65%至95%、65%至90%、65%至80%、70%至95%、70%至90%、75%至80%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一些实施方式中，25%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一些实施方式中，至少或超过25%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在具体的实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺或脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺用有机酸或无机酸衍生化以形成铵盐，从而有便于其溶解。在某些实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺或脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺是用乳酸衍生化的。在某些实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺或脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺用乳酸衍生化，以有便于其溶解。美国专利No.5,622,834；No.5,623,064；No.5,624,679；No.5,686,115；No.5,858,350；No.6,599,720；No.6,686,342和No.7,115,588（每篇专利以其全部内容作为参考并入本文）描述了聚-N-乙酰葡糖胺及其衍生物，以及产生它们的方法。
例如，可以通过微藻（优选地，硅藻）产生聚-N-乙酰葡糖胺，并且可以从微藻（优选地，硅藻）纯化聚-N-乙酰葡糖胺。可以用作产生聚-N-乙酰葡糖胺的起始来源的硅藻包括，但不限于圆筛藻属（Coscinodiscus genus）、小环藻属（Cyclotella genus）和海链藻属（Thalassiosira genus）的成员。可以通过多种不同的方法从硅藻培养物获得聚-N-乙酰葡糖胺，所述方法包括本领域中已知的机械力法和化学/生物法（参见，例如，美国专利No.5,622,834；No.5,623,064；No.5,624,679；No.5,686,115；No.5,858,350；No.6,599,720；No.6,686,342和No.7,115,588，每篇专利以其全部内容作为参考并入本文）。在某些实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺不是来源于以下一种或多种：贝类、甲壳类、昆虫、真菌或酵母。在某些实施方式中，所述组合物不包含胶原纤维。在某些实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺的纯度为约100%、99.9%、99.8%、99.5%、99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%。在一种具体的实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺的纯度为90至100%。在某些实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺是大于15μm的纤维。在具体的实施方式中，所述聚-N-乙酰葡糖胺纤维的长度大于15μm。在一些实施方式中，超过50%、超过75%、超过90%、超过95%、超过99%的聚-N-乙酰葡糖胺纤维的长度大于15μm。在一种实施方式中，100%的聚-N-乙酰葡糖胺纤维的长度大于15μm。在一些实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺的长度为50至200μm、50至150μm、50至100μm，或80至100μm。在一些实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺是直径为1至5nm、2至4nm、2至10nm、10至25nm、10至50nm、25至50nm或50至100nm的纤维。
可以通过用碱处理聚-N-乙酰葡糖胺来使聚-N-乙酰葡糖胺脱乙酰化，以获得具有游离氨基的葡糖胺残基。可以使用浓缩氢氧化钠或氢氧化钾溶液在高温下进行该水解过程。可替代地，可利用本领域已知的技术，利用壳多糖脱乙酰基酶的酶促过程来进行聚-N-乙酰葡糖胺脱酰基作用。在一种具体的实施方式中，使用下文6.1节中所述的方法使聚-N-乙酰葡糖胺脱乙酰化。在某些实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的分子量为1×104Da至3.5×106Da、5×104Da至3.5×106Da、1×105Da至3.5×106Da、5×105Da至3.5×106Da、1×106Da至3×106Da、1.5×106Da至3.5×106Da、1.5×106Da至3×106Da、2×106Da至3×106Da、2×106Da至5×106Da、2×106Da至8×106Da。在一种具体的实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的分子量为2.8×106Da。在一些实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的分子量为至少1×104Da。在一种实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的分子量为至少2×106Da。在一些实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的分子量为小于3×106Da。
在某些实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺可以用任何有机酸或无机酸衍生化（包括反离子取代（counterion substitution）以形成盐衍生物）以形成p-Glc NAc铵盐。在一些实施方式中，所述有机酸具有RCOOH结构，其中R是可选取代的烷基、烯基或炔基。在一些实施方式中，R的可选取代的烷基。在一些实施方式中，R是用一个或多个羟基取代的烷基。在某些实施方式中，RCOOH是乙醇酸或乳酸。在其他实施方式中，RCOOH是柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸、丙醇二酸或富马酸。在特定的实施方式中，RCOOH是乳酸。在某些实施方式中，脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺与聚-N-乙酰葡糖胺之比为1:1、1:2、2:1、1:3或3:1。在一种具体的实施方式中，可利用下文6.1节中所述的方法用乳酸使脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺衍生化。在一些实施方式中，使脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺衍生化以使其可溶。在某些实施方式中，通过与（本文所述的或本领域已知的）任何有机酸或无机酸培育使脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺溶解。在具体的实施方式中，使脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺衍生化以形成可溶性p-Glc NAc铵盐。在一些实施方式中，在pH约4至pH约5，例如，在pH4、pH4.5、pH5或pH在4至5之间实现脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的溶解。在一种实施方式中，将脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺与乳酸培育以使其可溶（例如，在pH4至pH5，如pH4.5）。在这种实施方式中，H+离子被乳酸反离子取代以有助于脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的溶解。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物，如乳酸盐衍生物。在一种具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含脱乙酰聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺乳酸盐衍生物。在某些实施方式中，25%至50%、40%至95%、40%至90%、40%至80%、50%至95%、50%至90%、50%至80%、60%至95%、60%至90%、60%至80%、65%至95%、65%至90%、65%至80%、70%至95%、70%至90%、75%至80%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一些实施方式中，25%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一些实施方式中，至少或超过25%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。在一种具体的实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物是由下文6.1节中所述的方法产生的组合物。
在一种具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含核酸，如下文5.2节中所述。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含0.1μg至2mg、0.2μg至1mg、0.5μg至500μg、1μg至750μg、1μg至500μg、1μg至200μg、1μg至100μg、1μg至50μg、5μg至25μg、5μg至15μg、50μg至150μg、1μg至5μg、2μg至5μg、1μg至10μg、5μg至10μg、5μg至15μg、10μg至15μg、10μg至20μg、15μg至25μg、100μg至750μg、100μg至500μg、100μg至1mg或500μg至750μg的核酸。在一些实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物包含两种、三种或更多种不同类型的核酸。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含编码两种、三种或更多种不同的肽、多肽或蛋白质的两种、三种或更多种不同类型的核酸。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含除核酸之外的佐剂。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物不包含大量蛋白质材料。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物不包含任何蛋白质或肽佐剂。在其他实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含不超过按重量计0.1%、0.5%或1%的蛋白质材料。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含不超过按重量计0.1%、0.5%、1%或2%的蛋白质材料，如通过本领域已知的任何技术所确定的（如考马斯亮蓝染色）。在其他实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的蛋白质含量是通过考马斯亮蓝染色不能检测到的。在其他实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含蛋白质或肽佐剂。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为约5nm至约500nm、约5nm至约300nm、约5nm至约150nm、约10nm至约500nm、约10nm至约300nm、约10nm至约150nm、约20nm至约500nm、约20nm至约300nm、约20nm至约150nm、约25nm至约500nm、约25nm至约300nm、约25nm至约150nm、约50nm至约100nm、约75nm至约100nm、约100nm至约125nm、约100nm至约150nm、约100nm至约200nm、约150nm至约200nm、约50nm至约150nm或约50nm至约200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为5nm至500nm、5nm至300nm、5nm至150nm、10nm至500nm、10nm至300nm、10nm至150nm、20nm至500nm、20nm至300nm、20nm至150nm、25nm至500nm、25nm至300nm、25nm至150nm、50nm至100nm、75nm至100nm、100nm至125nm、100nm至150nm、100nm至200nm、150nm至200nm、50nm至150nm或50nm至200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的纳米颗粒的尺寸为约5nm至约500nm、约5nm至约300nm、约5nm至约150nm、约10nm至约500nm、约10nm至约300nm、约10nm至约150nm、约20nm至约500nm、约20nm至约300nm、约20nm至约150nm、约25nm至约500nm、约25nm至约300nm、约25nm至约150nm、约50nm至约100nm、约75nm至约100nm、约100nm至约125nm、约100nm至约150nm、约100nm至约200nm、约150nm至约200nm、约50nm至约150nm或约50nm至约200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的纳米颗粒的尺寸为5nm至500nm、5nm至300nm、5nm至150nm、10nm至500nm、10nm至300nm、10nm至150nm、20nm至500nm、20nm至300nm、20nm至150nm、25nm至500nm、25nm至300nm、25nm至150nm、50nm至100nm、75nm至100nm、100nm至125nm、100nm至150nm、100nm至200nm、150nm至200nm、50nm至150nm或50nm至200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少或超过25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的纳米颗粒的尺寸为约5nm至约500nm、约5nm至约300nm、约5nm至约150nm、约10nm至约500nm、约10nm至约300nm、约10nm至约150nm、约20nm至约500nm、约20nm至约300nm、约20nm至约150nm、约25nm至约500nm、约25nm至约300nm、约25nm至约150nm、约50nm至约100nm、约75nm至约100nm、约100nm至约125nm、约100nm至约150nm、约100nm至约200nm、约150nm至约200nm、约50nm至约150nm或约50nm至约200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少或超过25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的纳米颗粒的尺寸为5nm至500nm、5nm至300nm、5nm至150nm、10nm至500nm、10nm至300nm、10nm至150nm、20nm至500nm、20nm至300nm、20nm至150nm、25nm至500nm、25nm至300nm、25nm至150nm、50nm至100nm、75nm至100nm、100nm至125nm、100nm至150nm、100nm至200nm、150nm至200nm、50nm至150nm或50nm至200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少或超过25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的纳米颗粒的尺寸为约10nm至约800nm、约10nm至约600nm、50nm至约800nm、约50nm至约600nm、约50nm至约500nm、约50nm至约400nm、约50nm至约300nm、约50nm至约200nm、约75nm至约500nm、约75nm至约300nm、约100nm至约500nm、约100nm至约400nm、约100nm至约300nm、约150nm至约500nm、约150nm至约400nm或约150nm至约300nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少或超过25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的纳米颗粒的尺寸为10nm至800nm、10nm至600nm、50nm至800nm、50nm至600nm、50nm至500nm、50nm至400nm、50至300nm、50nm至约200nm、75nm至500nm、75nm至300nm、100nm至500nm、100nm至400nm、100nm至300nm、150nm至500nm、150nm至400nm或150nm至300nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。
当在本文中用于修饰数值或数值范围时，术语“约”和“大约”表示与所述数值或范围的合理偏差（通常比所述数值或范围高10%和低10%）仍保持在所列举的数值或范围的预定含义内。
在一些实施方式中，所述的纳米颗粒的尺寸表示球形纳米颗粒的直径。在某些实施方式中，所述尺寸表示纳米颗粒的横截面尺寸之一的长度（例如，两个横截面尺寸中最长的一个）。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的纳米颗粒小于500nm。在一些实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的纳米颗粒小于300nm。在某些实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的纳米颗粒小于250nm。在一些实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的纳米颗粒小于200nm。在这些实施方式的一些中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、至少10nm、至少25nm或至少50nm。
在某些实施方式中，至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的纳米颗粒的尺寸为至少或超过5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。在某些实施方式中，超过25%、超过35%、超过45%、超过50%、超过55%、超过60%、超过65%、超过70%、超过75%、超过80%、超过85%、超过90%、超过95%、超过98%或超过99%的纳米颗粒的尺寸为至少或超过5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。在具体的实施方式中，100%的纳米颗粒的尺寸为至少或超过5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。在这些实施方式的一些中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为小于100nm、500nm或750nm。在某些实施方式中，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过800nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过800nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在这些实施方式的一些中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过600nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过600nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在这些实施方式的一些中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过500nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过500nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在这些实施方式的一些中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过400nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过400nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在这些实施方式的一些中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过300nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过300nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在这些实施方式的一些中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中25%至50%、40%至65%、50%至65%、65%至75%、75%至85%、85%至95%、90%至99%或95%至100%的纳米颗粒的尺寸为不超过200nm，如通过（例如）透射电子显微术或扫描电子显微术所测定的。在这些实施方式的一些中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中至少25%、至少35%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的纳米颗粒的尺寸为至少5nm、10nm、20nm、25nm或50nm。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的纳米颗粒具有不规则的几何形状。在其他实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的纳米颗粒具有规则的几何形状（例如，圆形或球形）。
在一种具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物是生物相容性的和/或可生物降解的。可以通过多种技术确定生物相容性，包括但不限于例如洗脱测试、肌内植入法或者皮内或全身注射至动物受试者的程序。在美国专利No.6,686,342中描述了这些测试，该专利以其全部内容作为参考并入本文。在一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的洗脱测试得分为“0”，肌内植入法的测试得分为“0”，皮内注射测试得分为“0”和/或体重增加，这与响应于全身注射的体重减轻相反。在一种实施方式中，聚合物或纤维的洗脱测试得分为“0”。
在一种具体的实施方式中，可生物降解的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物在给予患者或植入患者中后约1天、2天、5天、8天、12天、17天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天或100天内降解。在一个方面，p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物可缓慢生物降解的性质使得核酸能够持续释放。这种性质提高了核酸转染的效率并且保护核酸不被血清核酸酶降解。
在某些方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物是免疫中性的，因为它不引起免疫应答。在具体的方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物是免疫中性的，因为当给予至动物（例如，皮下注射或肌内注射至动物，如小鼠或兔）时，它不引起免疫应答。p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的非免疫原性质使其能够向受试者重复给药。
在一些实施方式中，如通过一种或多种生物相容性测试所示，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物不具有生物反应性。在一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物不具有生物反应性，如通过洗脱测试、皮下注射测试、肌内植入测试和/或全身注射测试所示。
在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在使用前在20℃至30℃或20℃至25℃储存一定时间段。在一种具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在使用前在室温下储存一定时间段。在一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在20℃至30℃或20℃至25℃储存约30分钟、45分钟、1小时、1.5小时或2小时。在另一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在20℃至30℃或20℃至25℃储存30至45分钟、45分钟至1小时、1小时至1.5小时、1至2小时或1.5小时至2小时。在一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在室温下储存约30分钟、45分钟、1小时、1.5小时或2小时。在另一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在室温下储存30至45分钟、45分钟至1小时、1小时至1.5小时、1至2小时或1.5小时至2小时。在具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在4℃、20℃至30℃、20℃至25℃或在室温下储存长达约30分钟、45分钟、1小时、1.5小时或2小时。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在4℃、20℃至30℃、20℃至25℃或在室温下储存超过2小时（例如，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时或24小时）或超过1天。在一种实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物在4℃储存。在一种具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以冷冻或冷冻保存（并且在向患者给药前融化）。例如，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以在-20℃或-70℃冷冻。在其他实施方式中，在向患者给药前，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物未冷冻，或未冷冻保存并融化。
5.2核酸
p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以包含本领域技术人员已知的任何核酸。这样的核酸包括，但不限于，DNA和RNA，包括cDNA、基因组DNA、质粒DNA、质粒RNA、mRNA、siRNA、微小RNA、单链RNA、双链RNA、寡核苷酸、单链或双链寡核苷酸、三链寡核苷酸和其他核酸。本文所涵盖的核酸包括正义或反义取向的核酸、修饰的、未修饰的和合成的核酸。在具体的实施方式中，所述核酸是基因的编码区。
在一个方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含编码治疗性肽、多肽或蛋白质的核酸。这种治疗性肽、多肽或蛋白质可以用于所述治疗性肽、多肽或蛋白质的产生对受试者有利的病症的治疗和/或预防中，如癌、传染性疾病、某些必需蛋白质的遗传性缺乏和/或获得性代谢或调控失调。例如，编码细胞因子，如干扰素、IL-2、IL-12或IL-15的核酸可以用于传染性疾病和/或癌的治疗和/或预防。编码胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP-7）和其他因子的核酸可以用于降低某些癌细胞（例如，乳腺癌细胞）的增殖和/或某些类型肿瘤（例如，乳腺肿瘤）的生长。编码胰岛素的核酸可以用于治疗和/或预防糖尿病。编码例如酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase）的核酸可以用于治疗尼-皮二氏病。
在另一个方面，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含编码抗原的核酸。所述核酸可以编码任何所关心的疾病目标。例如，所述核酸可以编码病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和/或肿瘤相关抗原。在一种具体的实施方式中，所述核酸编码自体抗原。病毒抗原的非限制性实例包含来自腺病毒科（例如，乳腺腺病毒和禽腺病毒）、疹病毒科（例如，单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6、埃-巴二氏病毒、HHV6-HHV8和巨细胞病毒）、光滑病毒科（例如，轻小病毒、肠内细菌相MS2（enterobacteria phase MS2）、allole病毒）、痘病毒科（例如，脊椎动物痘病毒、副痘病毒、麻雀痘病毒、软疣痘病毒（molluscipoxvirus）和昆虫痘病毒）、乳多空病毒科（例如，多瘤病毒和乳头状瘤病毒）、副粘病毒科（例如，副粘病毒、副流感病毒1、麻疹病毒（mobillivirus）（例如，麻疹病毒（measles virus））、腮腺炎病毒（rubulavirus）（例如，腮腺炎病毒（mumps virus）），肺病毒（例如，肺炎病毒、人呼吸道合胞病毒）、人呼吸道合胞病毒和偏肺病毒（例如，禽肺病毒和人偏肺病毒））、小核粮核酸病毒（例如，肠道病毒、鼻病毒、肝病毒（例如，人甲肝病毒）、心病毒和口疮病毒）、呼肠孤病毒科（例如，正呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒、质型多角体病毒、斐济病毒、植物呼肠病毒和水稻病毒）、反转录病毒科（例如，哺乳动物B型反转录病毒、哺乳动物C型反转录病毒，禽C型反转录病毒，D型反转录病毒组、BLV-HTLV反转录病毒、慢病毒（例如，人类免疫缺陷性病毒1和人类免疫缺陷性病毒2）、泡沫病毒）、黃病毒科（例如，丙型肝炎病毒）、肝病毒科（例如，乙型肝炎病毒）、披衣病毒科（例如，辛德毕斯病毒（alphavirus）（例如，辛德毕斯病毒（sindbisvirus））和风疹病毒（rubivirus）（例如，风疹病毒（rubella virus）））、弹状病毒科（例如，水泡性病毒属、狂犬病毒、短暂热病毒、质型弹状病毒和核型弹状病毒）、沙粒病毒科（例如，嵌沙样病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒和拉沙病毒）和冠状病毒科（例如，冠状病毒和环曲病毒）的抗原。
细菌抗原的非限制性实例包含来自水螺菌科（Aquaspirillum family）、固氮螺菌科（Azotobacteraceae family）、固氮菌科（Azotobacteraceae family）、拟杆菌科（Bacteroidaceae family）、巴尔通氏体种（Bartonella species）、蛭弧菌科（Bdellovibrio family）、弯曲菌种（Campylobacter species）、衣原体种（Chlamydia species）（例如，肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae））、梭状芽胞杆菌（clostridium）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae family）（例如，柠檬酸细菌种（Citrobacter species）、爱德华氏菌（Edwardsiella）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、欧文氏菌种（Erwinia species）、大肠杆菌（Escherichia coli）、哈夫尼菌种（Hafnia species）、克雷白氏菌种（Klebsiella species）、摩根氏菌种（Morganella species）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、天命菌属（Providencia）、沙门氏菌种（Salmonellaspecies）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）和弗氏志贺氏菌（Shigellaflexneri））、加德纳菌科（Gardinella family）、流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）、盐杆菌科（Halobacteriaceae family）、螺杆菌科（Helicobacterfamily）、军团菌科（Legionallaceae family）、利斯特氏菌种（Listeria species）、甲基球菌科（Methylococcaceae family）、分枝杆菌属（Mycobacteria）（例如，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis））、奈瑟氏球菌科（Neisseriaceae family）、海洋螺菌科（Oceanospirillum family）、巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae family）、肺炎球菌种（Pneumococcus species）、假单胞菌种（Pseudomonas species）、根瘤菌科（Rhizobiaceae family）、螺菌科（Spirillum family）、螺状菌科（Spirosomaceae family）、葡萄球菌属（Staphylococcus）（例如，抗二甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus）和酿脓葡萄球菌（Staphylococcuspyrogenes））、链球菌属（Streptococcus）（例如，肠炎链球菌（Streptococcusenteritidis）、筋膜链球菌（Streptococcus fasciae）和肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae））、Vampirovibr Helicobacter科和吸血弧菌科（Vampirovibriofamily）的细菌的抗原。
真菌抗原的非限制性实例包括来自犁头霉种（Absidia species）（例如，伞枝犁头霉（Absidia corymbifera）和分枝犁头霉（Absidia ramosa））、曲霉种（Aspergillus species）（例如，黄曲霉（Aspergillus flavus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）和土曲霉（Aspergillus terreus））、蛙粪霉（Basidiobolusranarum）、皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）、假丝酵母种（Candidaspecies）（例如，白色念珠菌（Candida albicans）、光滑假丝酵母（Candidaglabrata）、Candida kerr、克柔念珠菌（Candida krusei）、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、伪热带念珠菌（Candida pseudotropicalis）、Candida quillermondii、皱褶假丝酵母（Candida rugosa）、类星状念珠菌（Candida stellatoidea）和热带假丝酵母（Candida tropicalis））、粗球孢子菌（Coccidioides immitis）、耳霉种（Conidiobolus species）、新型隐球菌（Cryptococcus neoforms）、小坎宁安霉种（Cunninghamella species）、皮癣霉菌（dermatophytes）、荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）、石膏样子小孢子菌（Microsporum gypseum）、渺小毛霉菌（Mucor pusillus）、巴西芽生菌（Paracoccidioides brasiliensis）、波氏假阿利什菌（Pseudallescheria boydii）、西伯氏鼻孢子虫（Rhinosporidium seeberi）、肺炎肺囊虫（Pneumocystis carinii）、根霉种（Rhizopus species）（例如，少根根霉（Rhizopus arrhizus）、米根霉（Rhizopus oryzae）和小孢根霉（Rhizopus microsporus））、酵母菌种（Saccharomyces species）、申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）、接合菌（Zygomycetes）和如接合菌（Zygomycetes）、子囊菌（Ascomycetes）的种类、担子菌（Basidiomycetes）、半知菌（Deuteromycetes）和卵菌（Oomycetes）的真菌的抗原。
非限制性肿瘤相关抗原包括黑素细胞系蛋白（如gp100、MART-1/MelanA、TRP-1（gp75）和酪氨酸酶）和肿瘤特异性抗原（如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、-2、N-乙酰葡糖氨基转移酶-V、p15、β-联蛋白、MUM-1、CDK4、非黑素瘤抗原、HER-2/neu（乳腺癌和卵巢癌）、人乳头状瘤病毒-E6、E7（宫颈癌）和MUC-1（乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌））。
可以通过克隆技术确定或者在如Gen Bank和Uniprot的序列数据库中查寻到编码治疗性肽、多肽或蛋白质或者抗原的核酸序列。
在某些实施方式中，上述核酸可以是提供转录调控元件和可选地翻译调控元件的载体或质粒的一部分，或包含在所述载体或质粒中。所选择的载体或质粒将取决于多种因素，包括但不限于转录调控元件的强度。
除非另外说明，用于实施本发明的方面的技术将使用本领域技术人员常规实施的分子生物学和重组DNA操作和产生的常规技术。
5.3佐剂
在某些实施方式中，本文所述的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含佐剂或与佐剂联合给药。用于与本文所述的组合物联合给药的佐剂可以在给予所述组合物之前给予，随所述组合物一起给予或在给予所述组合物后给予。在具体的实施方式中，所述佐剂在p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中给予。在其他实施方式中，所述佐剂随核酸一起给予，但是不在与核酸相同的组合物中。
在一些实施方式中，术语“佐剂”是指当与本文所述的组合物一起或作为本文所述的组合物的一部分给予时，增强、提高和/或促进免疫应答的化合物。例如，佐剂可以提高和/或促进对流感病毒血球凝集素的免疫应答，而当单独给予所述化合物时不产生免疫应答。在一些实施方式中，所述佐剂产生免疫应答但不产生过敏性反应或另外的不良反应。佐剂可以通过几种机制提高免疫应答，包括（例如）淋巴细胞募集、B细胞和/或T细胞刺激和巨噬细胞刺激。
在某些实施方式中，佐剂增强了对p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中核酸所编码的抗原的固有免疫应答。在某些实施方式中，佐剂增强了对p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中核酸所编码的抗原的固有免疫应答，而不会在所述核酸所编码的产物中导致构象变化。在某些实施方式中，佐剂增强了对p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中核酸所编码的抗原的固有免疫应答，但不会在影响所述应答的定性形式的核酸所编码的产物中导致构象变化。
在具体的实施方式中，所述佐剂是蛋白质或肽。在其他实施方式中，所述佐剂不是蛋白质或肽。在一些实施方式中，所述佐剂是化学品。在其他实施方式中，所述佐剂不是化学品。
在一些实施方式中，佐剂是核酸。可以将这种佐剂置于与在p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中待递送的“第一”核酸相同或不同的构建体（construct）中。可以将这种佐剂加入到相同的“第一”p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中，或在单独的佐剂/聚合物赋形剂中与“第一”p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物一起或顺序给予。可以在两种或更多种单独的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中给予两种或更多种佐剂（例如，核酸佐剂）。在某些实施方式中，所述佐剂不是核酸。
佐剂的具体实例包括，但不限于，铝盐（白矾）（如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝）、3-脱-O-酰单磷酰酯A（MPL）（参见GB2220211）、MF59（Novartis）、AS03（Glaxo Smith Kline）、AS04（Glaxo Smith Kline）、聚山梨酯80（吐温80；ICL Americas,Inc.）、咪唑并吡啶化合物（参见国际申请No.PCT/US2007/064857，其国际公开第号为WO2007/109812）、咪唑并喹喔啉化合物（参见国际申请No.PCT/US2007/064858，其国际公开号为WO2007/109813）和皂苷，如QS21（参见Kensil等人，疫苗设计：亚单位和佐剂方法（Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach，Powell&Newman主编，Plenum Press,NY,1995）；美国专利No.5,057,540）。在一些实施方式中，所述佐剂是弗氏佐剂（完全或不完全）。其他佐剂是水包油乳液（如角鲨烯或花生油），其可选地与免疫刺激剂组合，如单磷酰酯A（参见Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997)）。其他佐剂是CpG（Bioworld Today,1998年11月15日）。这些佐剂可与或不与其他具体的免疫刺激剂一起使用，如MPL或3-DMP、QS21、聚合或单体氨基酸，如聚谷氨酸或聚赖氨酸，或本领域中已知的其他免疫增强剂。
在一个方面，佐剂是细胞因子，例如，GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、TNF-α和IFN-α。在另一个方面，所述佐剂是聚肌苷酸：聚胞苷酸（“Poly I:C”）或CPG。在一种实施方式中，所述佐剂是Poly I:C。在一些实施方式中，所述佐剂以每个给药剂量约1μg至100μg的浓度使用。在一些实施方式中，所述佐剂以每个给药剂量约0.5μg至200μg、1μg至150μg、1μg至20μg、1μg至50μg、10μg至25μg、10μg至50μg、10μg至75μg、10μg至100μg、10μg至150μg、20μg至50μg、20μg至80μg、20μg至100μg、25μg至75μg、50μg至75μg、50μg至100μg或50μg至150μg的浓度使用。在具体的实施方式中，Poly I:C或CpG以每个给药剂量约1μg至500μg、10μg至250μg、20μg至200μg、25μg至150μg、25μg至100μg、25μg至75μg、30μg至70μg或40μg至60μg的浓度使用。在其他具体的实施方式中，GM-CSF或IL-12以每个给药剂量约0.1μg至250μg、0.5μg至100μg、0.5μg至75μg、0.5μg至50μg、1μg至100μg、1μg至50μg、1μg至25μg、1μg至15μg、1μg至10μg、2μg至15μg、2μg至10μg或2.5μg至7.5μg的浓度使用。在具体的实施方式中，将佐剂加入到p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物中或与所述组合物联合使用。
5.4制备p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物的方法
在某些实施方式中，将包含用无机酸或有机酸（如乳酸、柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸、丙醇二酸或富马酸）衍生化以使其能够溶解（如以上5.1节中所述）的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的p-Glc NAc组合物在缓冲液（例如，乙酸缓冲液，如乙酸钠-乙酸缓冲液或乙酸铵-乙酸缓冲液）中稀释，并可选地在特定温度下（例如，45℃至55℃、50℃至55℃、50℃至60℃、55℃至60℃、55℃至65℃、60℃至75℃或45℃至75°）培育特定时间段（例如，5至10分钟、5至15分钟、10至15分钟、10至20分钟、15至30分钟、30至45分钟、30分钟至1小时、45分钟至1小时、5分钟至1小时、10分钟至1小时或至少5或10分钟）。在某些实施方式中，所述有机酸具有RCOOH结构，其中R是可选取代的烷基、烯基或炔基。在一些实施方式中，R是可选取代的烷基。在一些实施方式中，R是用一个或多个羟基取代的烷基。在某些实施方式中，RCOOH是乙醇酸或乳酸。在其他实施方式中，RCOOH是柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸、丙醇二酸或富马酸。在具体的实施方式中，在本文所述方法中使用的缓冲液可以是对p-Glc NAc组合物的稀释是有效的任何缓冲液。
在一些实施方式中，将包含用无机酸或有机酸（如乳酸、柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸、丙醇二酸或富马酸）衍生化/溶解以形成铵盐衍生物（如以上5.1节中所述）的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的p-Glc NAc组合物在缓冲液，如pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液（或乙酸铵-乙酸缓冲液）中溶解/稀释，并在特定温度下（例如，45℃至55℃、50℃至55℃、50℃至60℃、55℃至60℃、55℃至65℃或60℃至75℃）培育特定时间段（例如，5至10分钟、5至15分钟、10至15分钟、10至20分钟、15至30分钟、30至45分钟、30分钟至1小时或45分钟至1小时）。在一种实施方式中，将包含用乳酸衍生化/溶解的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的p-Glc NAc组合物在缓冲液，如pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液（或乙酸铵-乙酸缓冲液）中溶解/稀释以获得最终浓度为约0.001%至约0.01%、约0.01%至约0.1%、约0.1%至约0.2%、约0.1%至约0.25%、约0.1%至约0.3%、约0.1%至约0.4%、约0.1%至约0.5%、约0.1%至约1%、约0.2%至约0.3%、约0.2至约0.4%约0.2%至约0.5%的衍生化的聚-N-乙酰葡糖胺。在另一种实施方式中，将包含用乳酸衍生化/溶解的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的p-GlcNAc组合物在缓冲液，如pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液（或乙酸铵-乙酸缓冲液）中溶解/稀释以获得最终浓度为0.001%至0.01%、0.01%至0.1%、0.1%至0.2%、0.1%至0.25%、0.1%至0.3%、0.1%至0.4%、0.1%至0.5%、0.1%至1%、0.2%至0.3%、0.2至0.4%或0.2%至0.5%的衍生化的聚-N-乙酰葡糖胺。在一种具体的实施方式中，将包含用乳酸衍生化/溶解的脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺的p-Glc NAc组合物在缓冲液，如pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液（或乙酸铵-乙酸缓冲液）中溶解/稀释以获得最终浓度为0.2%的衍生化的聚-N-乙酰葡糖胺。在一种实施方式中，所选择的缓冲液使p-Glc NAc组合物沉淀。
然后，可以将一定量溶解/稀释的p-Glc NAc组合物与特定浓度的核酸混合，并且可以（通过，例如，混合、涡流或振荡）将所述混合物搅拌特定时间段（例如，5至10秒、5至15秒、5至20秒、10至20秒、20至30秒、20至40秒、30至40秒、40至50秒、50至60秒、1至2分钟、2至4分钟或2至5分钟）以形成本文所述的p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，将50至100微升、75至150微升、75至100微升或100至200微升溶解/稀释的p-Glc NAc组合物与特定浓度的核酸混合。在一种具体的实施方式中，将100微升溶解/稀释的p-Glc NAc组合物与特定浓度的核酸混合。在某些实施方式中，所述核酸已与盐（如硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁）混合，并在特定温度下（例如，45℃至55℃、50℃至55℃、50℃至60℃、55℃至60℃、55℃至65℃或60℃至75℃）培育特定时间段（例如，5至10分钟、5至15分钟、10至15分钟、10至20分钟、15至30分钟、30至45分钟、30分钟至1小时或45分钟至1小时）。在一种具体的实施方式中，将0.1μg至2mg、0.2μg至1mg、0.5μg至500μg、1μg至200μg、1μg至100μg、1μg至50μg、5μg至25μg、5μg至15μg、50μg至150μg、1μg至5μg、2μg至5μg、1μg至10μg、5μg至10μg、5μg至15μg、10μg至15μg、10μg至20μg或15μg至25μg的核酸与盐（如，硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁）混合。在一种具体的实施方式中，将所述核酸与100微升50mM的硫酸钠混合。在某些实施方式中，通过涡流将溶解/稀释的p-Glc NAc组合物和核酸的混合物搅拌特定时间段（例如，5至10秒、5至15秒、5至20秒、10至20秒、20至30秒、20至40秒、30至40秒、40至50秒、50至60秒、1至2分钟、2至4分钟或2至5分钟）。在一种具体的实施方式中，通过涡流将溶解/稀释的p-Glc NAc组合物和核酸的混合物搅拌20秒。在某些实施方式中，将佐剂和所述核酸与溶解/稀释p-Glc NAc组合物混合。有关可以加入至p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物中的佐剂的实例参见上文5.3节。
可以通过以下方法制备在制备p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的方法中使用的核酸：将其与盐（如硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁）合并或混合，并可选地将所得组合或混合物在特定温度下（例如，45℃至55℃、50℃至55℃、50℃至60℃、55℃至60℃、55℃至65℃、60℃至75℃或45℃至75℃）培育特定时间段（例如，5至10分钟、5至15分钟、10至15分钟、10至20分钟、15至30分钟、30至45分钟、30分钟至1小时、45分钟至1小时、5分钟至1小时、10分钟至1小时或至少5或10分钟）。在具体的实施方式中，将0.1μg至2mg、0.2μg至1mg、0.5μg至500μg、1μg至200μg、1μg至100μg、1μg至50μg、5μg至25μg、5μg至15μg、50μg至150μg、1μg至5μg、2μg至5μg、1μg至10μg、5μg至10μg、5μg至15μg、10μg至15μg、10μg至20μg或15μg至25μg核酸与盐（如硫酸钠）混合。在一种具体的实施方式中，将所述核酸与100微升50mM的硫酸钠混合。在具体的实施方式中，将0.5mg/ml至100mg/ml、1mg/ml至50mg/ml、1mg/ml至30mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至50mg/ml、2mg/ml至30mg/ml、2mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至30mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、4mg/ml至15mg/ml、5mg/ml至15mg/ml、5mg/ml至10mg/ml或6mg/ml至8mg/ml的硫酸钠与核酸混合。
在一种具体的实施方式中，将下文6.1节中所述的方法用于产生p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。
5.5p-GlcNAc纳米颗粒/核酸组合物的应用
本文描述了用于将核酸体内或离体递送至受试者的方法。在一种具体的实施方式中，提出了出于基因治疗或接种疫苗目的将核酸体内递送至受试者的方法。所述方法通常包括向受试者给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物包含除核酸之外的佐剂。在其他实施方式中，在给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物之前、期间或之后单独给予佐剂。
在一种实施方式中，给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物导致核酸在所述组合物中持续表达。在某些实施方式中，给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物导致核酸在所述组合物中表达1周、2周、3周、4周、1个月、1.5个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月、1年或更长时间。在某些实施方式中，给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物导致在施用后核酸表达2小时至3个月、2小时至2个月、2小时至1个月、2小时至2周、6小时至3个月、6小时至2个月、6小时至1个月、6小时至2周、12小时至3个月、12小时至2个月、12小时至1个月、12小时至2周、1天至3个月、1天至2个月、1天至1个月、1天至2周、2天至3个月、2天至2个月、2天至1个月或2天至2周的一段时间。
在另一种实施方式中，给予包含佐剂的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物能够将核酸和佐剂共递送至受试者。在一种具体的实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物能够有效释放佐剂（如GM-CSF和IL-12）以用于核酸和佐剂两者的持续同时释放。不受任何理论束缚，通过p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的核酸和佐剂的共递送提高了抗原递呈细胞在适当刺激性条件下摄取核酸的可能性。例如，当给予编码抗原的核酸时，该刺激性条件将是有用的。
可以将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物作为基因治疗方案或疫苗接种方案的一部分向受试者给药。基因治疗或疫苗接种可以用于治疗和/或预防其多种病症或症状。例如，基因治疗可以用于治疗和/或预防癌症、传染性疾病、某些必需蛋白的遗传缺乏和/或获得性代谢或调控失调。
可以将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物通过允许核酸表达的任何途径给予至受试者，其包括肠胃外途径、局部途径、皮内途径、鼻内途径、粘膜途径、腹膜内途径、硬膜外途径、舌下途径、脑内途径、叶鞘内途径、透皮途径、直肠途径、通过吸入剂、肿瘤内途径和局部途径。在某些实施方式中，将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物皮下、肌内或静脉内递送至受试者。在一种具体的实施方式中，通过皮下注射施用p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物不是静脉内施用的。
在一种具体的实施方式中，将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物给予至上皮细胞，例如，皮肤、表皮或真皮细胞。在一种实施方式中，将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物（例如）通过注射皮下给药以靶向皮肤细胞。皮下给药的优势是这种给药能够靶向在稳健抗原特异性免疫应答的起始和建立中起重要作用的抗原递呈细胞，如树突状细胞。本文所述的组合物向受试者皮肤的递送允许将所述核酸所编码的抗原靶向树突状细胞。在某些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物与佐剂（例如，细胞因子）联合给药。由于其辉引起树突状细胞的激活和/或成熟，因此核酸编码抗原和免疫应答激活因子（如细胞因子）的皮下给药是有利的。给予这样的组合物能够有助于树突状细胞的激活，并且对树突状细胞交叉激活T细胞抗原（cross-prime antigen to T cell）并产生有效免疫性是必不可少的。
在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物用于重复给药。在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物一天给予三次、一天给予两次、一天给予一次、每两天给予一次、每周给予一次、每两周给予一次或每个月给予一次，给予一个月、两个月、三个月、六个月、一年或一年以上的一段时间。在其他实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物用于一次性、非重复给药。
在一些实施方式中，向受试者给予包含0.1μg、0.5μg、1μg、1.5μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、60μg、75μg、80μg、90μg、100μg、125μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg或500μg核酸的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，向受试者给予包含0.1μg至2mg、0.2μg至1mg、0.5μg至500μg、1μg至200μg、1μg至100μg、1μg至50μg、5μg至25μg、5μg至15μg、50μg至150μg、1μg至5μg、2μg至5μg、1μg至10μg、5μg至10μg、5μg至15μg、10μg至15μg、10μg至20μg或15μg至25μg核酸的p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。
在一些实施方式中，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物是有利的，这是因为它通过允许其组分持续释放和/或表达并同时将这些组分的治疗浓度维持在所需水平来降低这些组分的给药频率。
术语“受试者”和“患者”可互换使用来表示动物，包括非人动物和人。在某些实施方式中，向0至6个月、6至12个月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁的哺乳动物给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，所述哺乳动物是非人哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是用于特定病症的动物模型。在某些实施方式中，所述哺乳动物具有患特定病症的风险或倾向。在其他实施方式中，所述哺乳动物已被诊断为患有特定病症。在一些实施方式中，所述哺乳动物表现出特定病症的症状。
在具体的实施方式中，向人给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，向0至6个月、6至12个月、1至5岁、5至10岁、5至12岁、10至15岁、15至20岁、13至19岁、20至25岁、25至30岁、20至65岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁的人给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在一些实施方式中，所述人具有患特定病症的风险或倾向。在其他实施方式中，所述人已被诊断为患有特定病症。在一些实施方式中，所述人表现出特定病症的症状。
在某些实施方式中，向宠物（例如，狗或猫）给予p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物。在某些实施方式中，将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物施用于农畜或家畜，例如，猪、牛、马、鸡等。在一些实施方式中，所述宠物、农畜或家畜具有患特定病症的风险或倾向。在其他实施方式中，所述宠物、农畜或家畜已被诊断为患有特定病症。在一些实施方式中，所述宠物、农畜或家畜表现出特定病症的症状。
在一些实施方式中，将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物施用于用标准疗法难治疗的受试者。在一些实施方式中，将p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物施用于对常规疗法的不良反应敏感的受试者。
另外，p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物可以用于转染（例如，稳定转染）细胞以产生适合于体外和/或体内使用的大量核酸基因产物。在一种实施方式中，用于核酸递送的细胞是细胞系。在另一种实施方式中，用于核酸递送的细胞是来自受试者（优选地，人类受试者）的原代细胞。在一种具体的实施方式中，用于核酸递送的细胞是癌细胞。还可以将用核酸递送组合物转染的细胞作为基因治疗规程的一部分施用于受试者（优选地，人受试者）。
5.6试剂盒
本文提供了包含装有一种或多种成分以产生p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的一个或多个容器的药物包或试剂盒。在一种具体的实施方式中，药物包或试剂盒在容器中包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物（例如，乳酸盐衍生物）。在某些实施方式中，该药物包或试剂盒还包含以下一种或多种：（i）在容器中的pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液（例如，25mM pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液）；（ii）在容器中的硫酸钠（例如，50mM硫酸钠）；（iii）在容器中的核酸；和（iv）在容器中的佐剂。
在某些实施方式中，药物包或试剂盒包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物（例如乳酸盐衍生物）、核酸和可选地佐剂。在一些实施方式中，药物包或试剂盒包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物（例如，乳酸盐衍生物）、核酸和可选地佐剂，其中所述聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物与核酸和可选地佐剂置于不同的容器中。在一些实施方式中，药物包或试剂盒包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物（例如，乳酸盐衍生物）、核酸和可选地佐剂，其中聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物、核酸和佐剂分别放置在单独的容器中。在其他实施方式中，核酸和佐剂在药物包或试剂盒的相同容器中。在某些实施方式中，药物包或试剂盒还包含以下一种或多种：（i）在容器中的乙酸缓冲液，如乙酸铵-乙酸缓冲液或乙酸钠-乙酸缓冲液（例如，pH5.7，如25mM pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液）；和/或（ii）在容器中的硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁（例如，50mM硫酸钠）。在一些实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物与乙酸缓冲液（如乙酸钠-乙酸缓冲液或乙酸铵-乙酸缓冲液）置于相同的容器中。在其他实施方式中，聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物与乙酸缓冲液（如乙酸钠-乙酸缓冲液或乙酸铵-乙酸缓冲液）置于不同的的容器中。在一些实施方式中，核酸与硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁置于相同的容器中。在其他实施方式中，核酸与硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁置于不同的容器中。
以管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府部门所规定的形式的报告书可以可选地与该容器相关，该报告书反映了用于人施用的生产、使用或销售部门的批准。
本文所涵盖的试剂盒可以在上述方法中使用。
6.实施例
6.1实施例1：p-Glc NAc纳米颗粒/核酸组合物的制备
步骤一：p-Glc NAc浆液浓度的确定
1.1用去离子（DI）水将p-Glc NAc浆液储液稀释至20L并在振荡器上混合过夜或24小时。
1.2使用Supro800滤膜将10mL稀释的浆液过滤三次（总体积30mL）。在85℃烘箱中培育三个膜直至它们干燥。
1.3称量三个膜并计算平均重量。
1.4通过将平均重量除以10来计算浓度。
例如，所得p-Glc NAc浆液可以具有平均重量=6.3mg，浓度=6.3mg/10mL=0.63mg/mL。
步骤二：计算制备垫所需的体积
垫箱的尺寸为22cm×22cm，因此所述箱的面积为484cm2。
2.1可以使用的或所需的聚合物的量为0.5mg/cm2；因此，一个垫所需的聚合物的量为0.5mg/cm2×484cm2，即242mg。
2.2可以用于一个垫的或一个垫所需的体积为242mg/0.63mg/mL，即384mL。
2.3将384mL稀释的浆液倒入具有金属滤网的金属盒中，过滤并除去垫。将所述垫在50℃烘箱中培育直至干燥，或使其在室温下在纸巾上干燥。
步骤三：膜（Mat）脱乙酰化
3.1由于溶液需要24小时来冷却，因此在脱乙酰化反应的前一天配制40%Sigma氢氧化钠（NaOH薄片）溶液。其是重量比体积制剂（weight to volume formulation）；因此，每60mL DI水中有40克NaOH薄片（重量比体积）。溶液冷却后，将其倒入1升瓶中。
3.2打开水浴，并设置为80℃。将膜浸入40%NaOH溶液中以使其与滤网松开并将其转移到1L玻璃瓶中。将金属滤网放置在4L烧杯中。将所有的膜转移到玻璃瓶中后，用剩余的40%NaOH溶液填充所述瓶至1000mL标记以上并将所述瓶放置在水浴中。
3.3将瓶与膜培育3小时。每30分钟移除并振荡所述瓶以使其混合。培育3小时将测量获得约75%的脱乙酰化。
3.4移除所述瓶并关闭水浴。将膜冷却，将40%NaOH溶液倒入4L三角瓶中并用DI水清洗膜直至pH中性（7）。将膜在DI水中浸泡过夜并完全除去40%NaOH溶液。
3.5将脱乙酰膜放置在金属滤网上并将它们在50℃烘箱中干燥并测量脱乙酰化。
步骤四：测量脱乙酰化百分比
4.1制备乙酸标准品（0.01、0.02和0.03M）和葡糖胺标准品（0.005mg/mL、0.015mg/mL和0.035mg/mL）并将它们在程序化分光光度计上运行以获得标准曲线。
4.2在0.5mg至1.0mg之间对每个样品称量出两个重量。用100μL乙酸溶解样品20分钟，使体积达到1mL w/900μL DI水。将50μL、100μL、150μL样品等分至含有950μL、900μL、850μL0.01M乙酸的三个eppendorf管中，良好混合并在分光光度计中对样品读数。
4.3获得标准品和样品读数后，使用Excel电子数据表计算脱乙酰化百分比。
步骤五：脱乙酰化测量后，计算制备凝胶所需乳酸的量。
69%脱乙酰化膜的实例：
乙酰葡糖胺221.2×.31=6857.2
葡糖胺215.6×.69=14876.4
Figure BDA00003441179100322
30%乳酸=3.33M
为实现1:1的摩尔比p-Glc NAc:LA
步骤六：将13.81mL30%的乳酸倒入装有986mL DI水和DEAC膜的烧杯中。将膜搅拌过夜以获得均一溶液。通过玻璃滤器过滤凝胶材料。在塑料覆盖的托盘中在-20℃冰箱中冷冻并冷冻干燥。
步骤七：将2g冷冻干燥的材料在100mL DI水中溶解以获得100ml2%p-Glc NAc凝胶。用高压灭菌器在120℃对凝胶灭菌20分钟。
步骤八：针对1次动物注射测量该方案：
（1）在25mM pH5.7的乙酸钠-乙酸缓冲液中将p-Glc NAc凝胶稀释100倍，并在55℃水浴中放置15分钟（稀释后的最终p-Glc NAc浓度为0.02%凝胶）。（2）将10微克DNA质粒加入到100微升50mM硫酸钠中并在55℃水浴中放置10分钟。（3）将100微升稀释的p-Glc NAc凝胶加入到DNA-硫酸钠溶液中，同时样品以高速涡旋。（4）将混合物继续涡旋20秒。（5）在向受试者注射之前，将混合物在室温下保持小于2小时。将所得p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物用于向受试者注射。
图1示出了p-Glc NAc纳米颗粒的扫描电子显微照片。
6.2实施例2：利用荧光素酶基因通过或不通过p-Glc NAc纳米颗粒组合物的体内DNA疫苗接种
将6.1节中所提及的方案用于产生包含编码荧光素酶的质粒DNA的p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物。将包含编码荧光素酶的DNA的质粒制剂（pcDNALuc）作为裸DNA制剂肌内（“i.m”）注射（100μg/只小鼠）或作为裸DNA或p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物皮下（“s.c”）注射。在给予DNA组合物后的第1天、第7天和第14天腹膜内注射萤光素底物后，使用IVS系统通过生物发光成像检测荧光素酶活性。图2示出了用pcDNA Luc组合物注射的所有小鼠中的荧光素酶活性。在用p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物皮下注射的小鼠中检测到了最高的整体荧光素酶活性。显著地，在注射后长达4天，在接受p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物单次皮下注射的相同动物中检测到与接受肌内注射的小鼠相似水平的DNA表达。此外，图2显示在用p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物接种疫苗后长达14天，转基因表达是可检测的，这表明了在给药位点处局部抗原的持续可用性。该数据表明p-Glc NAc聚合物纳米颗粒能够以导致所编码的抗原持续表达的方式释放质粒DNA。
6.3实施例3：使用p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物通过专职性抗原提呈细胞的DNA所编码的抗原向引流淋巴结的有效摄取和运输
为了确定专职性抗原提呈细胞是否有摄取收DNA并将其运输至引流淋巴结，用单独的p-Glc NAc纳米颗粒或包含100μg编码GFP的质粒DNA的p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物向6只小鼠的足垫中注射。利用6.1节中的方案来产生p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物。注射后1天，切除引流淋巴结并用与PE结合的抗MHC II类的单克隆抗体对细胞悬液进行染色。通过流式细胞术对细胞悬液分析MHC II类和绿色荧光蛋白（GFP）的双重表达。图3示出了来自用p-Glc NAc纳米颗粒/pGFP组合物免疫的小鼠和单独用p-Glc NAc纳米颗粒免疫的小鼠的引流淋巴结的细胞悬液的流式细胞术分析，其中用p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物接种的小鼠在约等于30%来自切除淋巴结的MCH II类阳性细胞中显示出GFP信号。这表明p-Glc NAc纳米颗粒能够将DNA递送至局部注射位点，从而导致所编码产物的成功表达，然后通过专职性抗原提呈细胞（APC）将摄取所表达的产物并将其运输至引流淋巴结。
6.4实施例4：响应于hgp100DNA接种的供体Pmel细胞的增殖。
将6.1节中的方案用于产生包含hgp100DNA的p-Glc NAc纳米颗粒。用裸hgp100DNA（肌内和皮下）、p-Glc NAc纳米颗粒/hgp100（皮下）接种小鼠，或在106个Pmel脾细胞（纯真Pmel细胞：对人gp100（即hgp100）内的表位CD8+T细胞TCR转基因）继承性转移后将小鼠保持24小时未接种。通过血液样品的流式细胞术确定循环Pmel细胞的水平。图4示出了响应于在脾、周围血液（“血液”）和淋巴结（“LN”）中用裸hgp100DNA或p-Glc NAc纳米颗粒/hgp100DNA接种的Pmel细胞的增殖。在淋巴结中发现了较高频率的增殖供体Pmel细胞。p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物有效激活了抗原特异性CD8+T细胞反应，如通过对用p-Glc NAc纳米颗粒/phgp100组合物免疫起反应的纯真Pmel细胞的增殖所证明的。
6.5实施例5：Poly I:C的共递送提高了编码自身肿瘤抗原的DNA疫苗的治疗效果
使用了先前所建立的利用编码TRP2（在小鼠和人中高度表达的黑素细胞分化抗原）的DNA的接种模型。上述研究已表明用编码TRP2的裸DNA接种的治疗效果最小。使用两种实验方法（皮下治疗模型和转移治疗模型）来测试p-Glc NAc纳米颗粒/DNA和p-Glc NAc纳米颗粒/DNA/佐剂组合物的效力。
对于转移治疗模型，分别对PBS盐水对照、p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA和p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA/Poly I:C用3×104个B16黑素瘤细胞静脉内注射5只小鼠。从用PBS盐水、p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA或p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA/Poly I:C的肿瘤注射的第3天开始，分别在3天对小鼠进行皮下接种（接种3次）。肿瘤注射后将所有小鼠处死，并切除它们的肺并称重。图5A示出了用p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA注射的小鼠的平均肺重量低于用PBS盐水注射的小鼠的肺重量。明显地，图5A显示用p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA/佐剂注射的小鼠的平均肺重量显著低于用p-Glc NAc纳米颗粒/DNA或PBS盐水注射的小鼠的肺重量。
对于皮下治疗模型，分别对PBS盐水对照、p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA和p-Glc NAc纳米颗粒/pDNA/Poly I:C用105个B16黑素瘤细胞皮下注射5只小鼠。从用盐水、p-Glc NAc纳米颗粒/pTRP2或p-Glc NAc纳米颗粒/pTRP2/佐剂（其中佐剂为Poly I:C）对肿瘤细胞注射后的第5天开始，三天进行三次皮下接种。处理后，一周监测三次肿瘤发展。图5B示出了p-Glc NAc纳米颗粒组合物对肿瘤尺寸的影响。图5B表明相对于盐水对照，p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物抑制肿瘤生长；它还表明p-Glc NAc纳米颗粒/DNA/佐剂组合物显示出比没有佐剂的p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物更大的肿瘤生长抑制。
总之，图5表明，在治疗性疫苗接种的情况下，向p-Glc NAc纳米颗粒/DNA组合物中加入佐剂提高了转移和皮下模型中的抗癌免疫性并延缓了肿瘤发展。
在本说明书中引用的所有专利公开、专利和专利申请如具体并且单独指明每个专利公开或专利申请作为参考并入的一样作为参考并入本文。尽管出于使理解清楚的目的已经通过例证说明和实施例详细说明了上述发明，对本领域那些技术人员显而易见的是根据本发明的教导在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下可以进行某些改变和修改。

Claims (42)

1.一种聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物，其包含聚-N-乙酰葡糖胺和核酸，其中，所述纳米颗粒的尺寸为约5nm至500nm之间，并且其中至少40%的聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺包含脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺乳酸盐衍生物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺已用有机酸或无机酸溶解。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺已用乳酸溶解。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，至少65%的所述聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，至少70%的所述聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，40%至90%的所述聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，60%至80%的所述聚-N-乙酰葡糖胺是脱乙酰化的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，所述聚-N-乙酰葡糖胺是长度为50μm至200μm的纤维。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，所述聚-N-乙酰葡糖胺是长度为50μm至100μm的纤维。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，至少50%的所述纳米颗粒的尺寸为约5nm至500nm之间。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，至少50%的所述纳米颗粒的尺寸为约10nm至500nm之间。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，至少50%的所述纳米颗粒的尺寸为20nm至200nm之间。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，至少50%的所述纳米颗粒的尺寸为25nm至150nm之间。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，所述尺寸是通过透射电子显微术或扫描电子显微术确定的。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中，所述核酸是DNA。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其还包含佐剂。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述佐剂是细胞因子。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述佐剂是聚肌苷酸:聚胞苷酸（“poly I:C”）。
21.一种用于向受试者给予核酸的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据权利要求1-20中任一项所述的组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述受试者是人。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述受试者是非人动物。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中，皮下、肌内或静脉内给予所述组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，皮下给予所述组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，向上皮细胞给予所述组合物。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中，所述组合物的给药导致所述组合物中核酸持续表达至少1周。
28.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中，所述组合物的给药导致所述组合物中核酸持续表达至少2周。
29.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中，所述组合物的给药导致所述组合物中核酸持续表达至少4周。
30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中，重复进行给药。
31.一种用于向受试者给予核酸施的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据权利要求18-20中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的给药导致所述核酸和所述佐剂的持续同时释放。
32.一种制备聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物的方法，包括：
（a）将碱加入至聚-N-乙酰葡糖胺以使得至少40%的聚-N-乙酰葡糖胺脱乙酰化；
（b）加入无机酸或有机酸以形成脱乙酰聚-N-乙酰葡糖胺铵盐衍生物；
（c）加入缓冲液以有助于稀释；和
（d）加入核酸，由此制备聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述无机酸或有机酸是乳酸。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，步骤（c）中所述的缓冲液是乙酸钠-乙酸缓冲液。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述核酸已与盐混合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述盐是硫酸钠。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中，所述聚-N-乙酰葡糖胺是40%至90%脱乙酰化的。
38.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中，所述聚-N-乙酰葡糖胺是超过65%脱乙酰化的。
39.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中，所述聚-N-乙酰葡糖胺是60%至80%脱乙酰化的。
40.根据权利要求32-39中任一项所述的方法，还包括在步骤（d）中加入佐剂。
41.根据权利要求32-39中任一项所述的方法，还包括将所述聚-N-乙酰葡糖胺纳米颗粒/核酸组合物与佐剂混合。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中，所述佐剂是poly I:C。
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