CN114269374A

CN114269374A - 基于酵母的口服疫苗接种

Info

Publication number: CN114269374A
Application number: CN202080053024.7A
Authority: CN
Inventors: D·J·奥哈根; S·S·尼卡姆; R·S·纽顿
Original assignee: Esperovax Inc
Current assignee: Esperovax Inc
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2022-04-01
Also published as: US20220145309A1; AU2020279381A1; CA3138174A1; EP3972641A4; IL288177A; WO2020237100A1; EP3972641A1; JP2022532922A; BR112021023348A2

Abstract

描述了各种适用于口服疫苗接种的重组酵母、疫苗组合物、食品组合物、给动物接种疫苗的方法以及相关方法、试剂盒和核酸分子。

Description

基于酵母的口服疫苗接种

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年5月21日提交的美国临时申请号62/850,681和2020年3月18日提交的美国临时申请号62/991,536的优先权益，所述临时申请的内容特此以全文并入并且用于达成所有目的。

技术领域

本公开涉及疫苗接种领域。更具体地，本公开涉及基于酵母的口服疫苗接种领域。特定实例涉及重组酵母细胞、疫苗组合物、食品组合物、生产疫苗的方法以及给动物接种疫苗的方法。本公开还涉及各种其它方法、试剂盒和核酸分子。

背景技术

疫苗接种是一种用于减少和预防人类疾病的廉价且有效的方法。然而不幸的是，全球疫苗接种率仍使世界上约15％的人口易感染可预防的疾病。许多传统疫苗依赖于医疗保健专业人员所施用的注射，这固有地限制了可以治疗的患者数目。此外，基于注射的疫苗常常有大量的储存和处理要求，这可能会阻碍生产、交付和施用工作的规模化。

已经描述了基于酵母的疫苗平台用于大批量疫苗生产和/或用作口服疫苗接种。参见U.S.10,117,915。然而迄今为止，此类平台并不有效地释放复杂的免疫原，如病毒样颗粒或包膜病毒样颗粒。

因此，需要改善的疫苗、疫苗组分、疫苗组合物和相关方法、试剂盒以及其它疫苗相关技术。

发明内容

本发明人已经意外地发现，表达免疫原，如病毒样颗粒或包膜病毒样颗粒的重组酵母细胞中细胞壁的调控性透化可以显著改善重组酵母的免疫原释放。不希望受理论束缚，本发明人假设，通过使用本文所描述的一种或多种方法诱导调控性透化，与未透化的重组酵母细胞相比，可以改善所释放的免疫原(例如，呈包含免疫原和/或含有编码免疫原的包装核酸序列的VLP形式)的量；与先前所描述的透化方法相比，在更高水平上维持重组酵母细胞活力的程度；可以增加所得疫苗组合物的功效；和/或与先前所描述的方法相比，免疫原释放可以更具选择性。这些改善中的一者或多者继而可以显著提高体外免疫原生产方法中回收的免疫原的量或纯度；酵母提供给抗原呈递细胞的免疫原的量；和/或在已经施用重组酵母细胞的受试者胃肠道中由重组酵母细胞释放的免疫原的量。

通过诱导细胞壁透化剂，如细胞壁降解酶(例如，甘露聚糖酶、葡聚糖酶、几丁质酶或它们的组合)的表达，诱导细胞壁生物合成抑制剂的表达，或通过以调控的方式减少或消除细胞壁生物合成途径的组分的表达，可以诱导调控性透化。不希望受理论束缚，本发明人进一步假设，除了上文所描述的意外益处之外，细胞壁降解酶的调控性诱导还意外地通过增加细胞壁降解产物，如酵母糖蛋白、β葡聚糖或甘露聚糖的脱落和/或呈递来增加疫苗组合物中酵母细胞壁组分提供的固有佐剂活性。

在优选的实施方案中，免疫原所递送给的抗原呈递细胞在体内，如在已经例如口服施用重组酵母的受试者的胃肠道中。在一些情况下，酵母作为口服疫苗口服施用。本文描述了各种适用于口服疫苗接种的示例性重组酵母细胞。

在一个方面，适用于口服疫苗接种的重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞。一般来说，重组酵母细胞是包含至少一种异源核酸序列的宿主细胞。举例来说，异源元件可以包含异源启动子。异源启动子可以是来自与宿主细胞相比不同物种或品系的细胞的启动子。在一些实施方案中，异源启动子是与第二核酸序列可操作连接的内源启动子的拷贝，其中内源启动子和第二核酸序列在野生型酵母细胞中不是可操作连接的。

在一些实施方案中，与内源启动子的野生型位置相比，异源启动子是存在于基因组或细胞内位置中的不同位置的内源启动子。举例来说，与野生型酵母细胞中启动子的染色体位置相比，异源启动子可以处于不同的染色体位置。作为另一个实例，异源启动子可以存在于质粒或附加型片段上，其中启动子位于野生型酵母细胞中的宿主细胞染色体中。在一些实施方案中，与重组酵母细胞中异源启动子的细胞内位置相比，异源启动子可以是天然地在不同细胞器中发现的启动子。举例来说，异源启动子可以是来自内源酵母细胞线粒体基因组的启动子，并且与重组酵母细胞的细胞核中的第二核酸序列可操作连接。

在一个实施方案中，重组酵母细胞包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。

在一些实施方案中，免疫原是或包含病毒样颗粒(VLP)的组分，如衣壳蛋白或其功能片段。在一些实施方案中，免疫原是或包含含有第一部分和第二部分的融合蛋白，其中第一部分包含衣壳蛋白或其功能片段并且第二部分包含抗原。在一些实施方案中，免疫原是或包含包膜VLP(eVLP)，如基质蛋白或其功能片段的组分。在一些实施方案中，免疫原是或包含含有第一部分和第二部分的融合蛋白，其中第一部分包含基质蛋白或其功能片段并且第二部分包含抗原。在一些实施方案中，VLP包含含有第一部分和第二部分的融合蛋白，其中第一部分包含VLP形成单位(例如，HIV-GAG或衣壳蛋白或其功能片段)并且第二部分包含免疫原或报告多肽。在一些情况下，报告多肽是酶。在一些情况下，报告多肽是荧光蛋白。在含有报告蛋白的实施方案中，此类VLP可用于跟踪向受试者施用VLP和/或受试者细胞对VLP的摄取。

示例性GAG-GFP融合体以SEQ ID NO.14列出。在一些情况下，GAG-GFP融合体包含SEQ ID NO.14的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，GAG-GFP融合蛋白与SEQ ID NO.14的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同。在一些情况下，GAG-GFP融合蛋白包含SEQ ID NO.14的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。在一些情况下，GAG-GFP融合蛋白包含SEQ ID NO.14的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。

在一些实施方案中，细胞壁降解酶是葡聚糖酶，如β-葡聚糖酶。

在一个实施方案中，适用于口服疫苗接种的重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞，并且包含编码调控性启动子的第一核酸序列；编码一种或多种来自流感病毒(或冠状病毒)的蛋白质的第二核酸序列；以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，细胞壁降解酶是葡聚糖酶，如β-葡聚糖酶或β-1,3-葡聚糖酶。

在一些情况下，来自流感病毒的蛋白质选自由M1基质蛋白(例如，人流感M1基质蛋白)或其功能片段、血凝素或其免疫原性片段以及神经氨酸酶或其免疫原性片段组成的组。在一些情况下，第二核酸编码至少两种来自流感病毒的蛋白质，所述蛋白质选自由M1基质蛋白(例如，人流感M1基质蛋白)或其功能片段、血凝素或其免疫原性片段以及神经氨酸酶或其免疫原性片段组成的组。在一些情况下，第二核酸编码人流感M1基质蛋白、血凝素和神经氨酸酶。

在一些情况下，来自冠状病毒的蛋白质选自由冠状病毒刺突蛋白(例如，COVID-19刺突蛋白)或其免疫原性或功能片段以及冠状病毒M1基质蛋白(例如，COVID-19M1基质蛋白)或其免疫原性或功能片段组成的组。在一些情况下，第二核酸编码至少两种来自冠状病毒的蛋白质，所述蛋白质选自由M1基质蛋白或其免疫原性或功能片段以及冠状病毒刺突蛋白或其免疫原性或功能片段组成的组。

适合的COVID-19刺突蛋白可以是但不限于包含以SEQ ID NO.22列出的序列的免疫原性片段。在一些情况下，COVID-19刺突蛋白包含SEQ ID NO.22的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，COVID-19刺突蛋白包含与SEQ ID NO.22的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，COVID-19刺突蛋白包含含有SEQ ID NO.22的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，COVID-19刺突蛋白包含SEQ ID NO.22的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。

重组酵母细胞可以是重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。

在示例性实施方案中，适用于口服疫苗接种的重组酵母细胞来源于野生型酿酒酵母酵母细胞，并且包含编码Tet-off调控性启动子的第一核酸序列；编码一种或多种选自由来自流感病毒的人流感M1基质、血凝素和神经氨酸酶蛋白组成的组的免疫原的第二核酸序列；以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。

在示例性实施方案中，适用于口服疫苗接种的重组酵母细胞来源于野生型酿酒酵母酵母细胞，并且包含编码Tet-off调控性启动子的第一核酸序列；编码一种或多种本文所描述的冠状病毒免疫原的第二核酸序列；以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。

在另一个实施方案中，适用于口服疫苗接种的重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞，并且包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁抑制毒素的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。

在一个方面，本发明提供了多个前述重组酵母细胞中的任一者，或本文所描述的重组酵母细胞中的任一者，或它们的组合。多个可以在至少1x10⁶至约1x10¹⁵个细胞，或至少1x10⁷至约1x10¹⁴个细胞，或至少1x10⁸至约1x10¹³个细胞的范围内。

多个重组酵母细胞可以在包含约1x10⁵个细胞/毫升至约2x10⁹个细胞/毫升，优选地约1x10⁸个细胞/毫升至约2x10⁹个细胞/毫升的密度的培养基中。多个重组酵母细胞可以在包含约1x10⁹个细胞/毫升至约1x10¹⁰个细胞/毫升的密度的浓缩液体中。举例来说，液体可以是浓缩的培养基，或者可以通过从培养基中分离细胞并将细胞再悬浮于缓冲液中来浓缩多个重组酵母细胞。多个细胞可以是冷冻干燥或喷雾干燥的组合物。在一些情况下，冷冻干燥的组合物包含至少1x10⁶个细胞/克至1x10⁹个细胞/克。在一些情况下，喷雾干燥的组合物包含至少1x10⁶个细胞/克至1x10⁹个细胞/克。

本文还描述了各种示例性疫苗组合物。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含界定腔体的可摄入容器，如胶囊，以及安置于腔体中的重组酵母细胞。安置于腔体中的重组酵母细胞可以是例如前述重组酵母细胞中的任一者，或本文所描述的重组酵母细胞中的任一者，或它们的组合，例如，在液体、浓缩液体或固体(例如，冷冻干燥或喷雾干燥)制剂中。在一些实施方案中，可摄入容器包含至少1x10⁶个重组酵母细胞至约1x10¹²个重组酵母细胞。在一些实施方案中，重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞，并且包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达可以在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。

在另一个实施方案中，疫苗组合物包含界定腔体的可摄入容器以及安置于腔体中的重组酵母细胞。重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞，并且包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁抑制毒素的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达可以在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。

另一种示例性疫苗组合物包含界定腔体的可摄入胶囊以及安置于腔体中的来源于野生型酵母细胞的冷冻干燥或喷雾干燥的重组酵母细胞。重组酵母细胞可以包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码VLP免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达可以在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。

本文还描述了各种食品组合物。

在一个实施方案中，食品组合物包含至少一种食料和至少一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含界定腔体的可摄入容器以及本文所描述的重组酵母细胞或包含安置于腔体中的多个本文所描述的重组酵母细胞的组合物。在另一个实施方案中，食品组合物包含至少一种食料；和多个疫苗组合物，所述疫苗组合物中的每一者包含界定腔体的聚合外壳以及安置于腔体中的多个本文所描述的重组酵母细胞。在另一个实施方案中，食品组合物包含至少一种食料和疫苗组合物，所述疫苗组合物包含安置于由聚合外壳界定的腔体中的多个本文所描述的重组酵母细胞。在另一个实例中，食品组合物包含含有至少一种食料的基质和包含多个本文所描述的重组酵母细胞的疫苗组合物。在一些情况下，疫苗组合物与食料基质混合。

另一种示例性疫苗组合物包含与海藻酸盐或几丁聚糖或它们的组合以及一种或多种赋形剂组合的如本文所描述的多个喷雾干燥的重组酵母细胞。适合的赋形剂包括但不限于MgCl₂、CaCl₂以及它们的组合。参见Szekalska等,Materials(Basel).2018年9月11日(9):1522；和美国专利号9,700,519。重组酵母细胞可以包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码VLP免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶或细胞壁抑制剂毒素的第三核酸序列。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达可以在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。

还描述了生产疫苗的各种示例性方法。

在一个实施方案中，生产疫苗的方法包括通过以下方式创造本文所描述的重组酵母细胞：向野生型酵母细胞中引入编码调控性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶或细胞壁抑制剂的第三核酸序列，并且将重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中。在一些实施方案中，所述方法包括或还包括培养重组酵母细胞以产生多个重组酵母细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括收获多个重组酵母细胞的至少一部分并且将收获的重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中。

在另一个实施方案中，生产疫苗的方法包括通过以下方式创造本文所描述的重组酵母细胞：向野生型酵母细胞中引入编码在阻抑物存在下受阻抑的正阻抑性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括或还包括使包含在阻抑物存在下受阻抑的正阻抑性启动子的多个重组酵母细胞在包含阻抑物的培养物中生长。在一些实施方案中，所述方法包括或还包括将多个重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中或者用聚合介质，如海藻酸盐或几丁聚糖对多个重组酵母细胞进行喷雾干燥。

在一些实施方案中，所述方法还包括去除足够量的阻抑物以促进由第二和/或第三核酸序列编码的蛋白质的产生。可以通过更换、稀释或去除包含阻抑物的培养基来去除阻抑物。可以通过例如在受试者的消化道中稀释或允许稀释阻抑物来去除阻抑物。

在另一个实施方案中，生产疫苗的方法包括通过以下方式创造重组酵母细胞：向野生型酵母细胞中引入编码在阻抑物存在下受阻抑的正阻抑性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括或还包括使包含正阻抑性启动子的多个重组酵母细胞在包含阻抑物的培养物中生长。在一些实施方案中，所述方法包括或还包括冷冻干燥或喷雾干燥多个重组酵母细胞；以及将多个重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中。第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者包含野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。第二和第三核酸序列的表达可以在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些实施方案中，第二和/或第三核酸序列的表达在调控性启动子的控制下。

在一些实施方案中，所述方法还包括去除足够量的阻抑物以促进由第二和/或第三核酸序列编码的蛋白质的产生。可以去除阻抑物，然后可以将多个重组酵母细胞孵育预定的时间段，从而激活正阻抑性启动子并且发生第二和/或第三核酸序列的表达。可以在冷冻干燥之前实现启动子激活。另外或替代地，可以在冷冻干燥和/或重构多个冷冻干燥的重组酵母细胞之后或通过所述冷冻干燥和/或重构进行启动子激活。另外或替代地，可以在施用多个例如冷冻干燥和任选重构的重组酵母细胞之后或通过所述施用进行启动子激活。

本文还描述了给动物接种疫苗的各种示例性方法。

在一个实施方案中，给动物接种疫苗的方法包括向所述动物口服递送根据一个实施方案的疫苗组合物。在另一个实施方案中，给动物接种疫苗的方法包括向所述动物口服递送根据一个实施方案的食品组合物。在一些实施方案中，动物是人，并且所述方法包括指导所述人口服摄入根据一个实施方案的疫苗组合物。

在另一个实施方案中，所述方法包括指导所述人口服摄入根据一个实施方案的食品组合物。

本文还描述了供应疫苗的各种方法。

在一个实施方案中，供应疫苗的方法包括生产多个疫苗组合物，所述多个疫苗组合物中的每个疫苗组合物包含根据一个实施方案的疫苗组合物；并且将多个疫苗组合物递送至个体，所述个体被指定用于将多个疫苗组合物中的个别疫苗组合物递送至所述多个动物中的个别动物，以达成给所述多个动物中的个别动物接种疫苗的目的。

在另一个实施方案中，供应疫苗的方法包括生产多个食品组合物，所述多个食品组合物中的每个食品组合物包含根据一个实施方案的食品组合物；并且将多个食品组合物递送至个体，所述个体被指定用于将多个食品组合物中的个别食品组合物递送至所述多个动物中的个别动物，以达成给所述多个动物中的个别动物接种疫苗的目的。

本文还描述了各种示例性试剂盒。

在一个实施方案中，试剂盒包括包装基材、根据一个实施方案的疫苗组合物以及使用疫苗组合物的说明书。

在另一个实施方案中，试剂盒包括包装基材、根据一个实施方案的食品组合物以及使用食品组合物的说明书。

本文还提供了各种示例性分离的核酸分子。

在一个实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO.1，其编码可用于本发明的方法、组合物和试剂盒中的示例性分泌型β-葡聚糖酶细胞壁降解酶。在另一个实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO.2，其编码可用于本发明的方法、组合物和试剂盒中的示例性分泌型H1N1甲型流感血凝素。在另一个实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO.3，其编码示例性H1N1甲型流感基质蛋白1。在另一个实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ IDNO.4，其编码可用于本发明的方法、组合物和试剂盒中的示例性分泌型几丁质酶细胞壁降解酶。

在另一个实施方案中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO.15或其功能或免疫原性片段。在一些情况下，分离的核酸分子编码SEQ ID NO.15的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO.15的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，分离的核酸编码包含SEQ ID NO.15的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO.15的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。

在另一个实施方案中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO.16或其功能或免疫原性片段。在一些情况下，分离的核酸分子编码SEQ ID NO.16的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO.16的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，分离的核酸编码包含SEQ ID NO.16的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO.16的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。

在另一个实施方案中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO.17或其功能或免疫原性片段。在一些情况下，分离的核酸分子编码SEQ ID NO.17的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO.17的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，分离的核酸编码包含SEQ ID NO.17的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，分离的核酸编码包含SEQ ID NO.17的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。

在另一个实施方案中，分离的核酸分子编码细胞壁抑制毒素。在一些情况下，细胞壁抑制毒素包含SEQ ID NO.23的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，相对于由SEQ ID NO.5编码的蛋白质或以SEQ ID NO.23列出的多肽序列，毒素包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。在一些情况下，毒素与由SEQ ID NO.5编码的分泌蛋白序列至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，β-1-3-葡聚糖酶与SEQ ID NO.23的至少25、50、100或125个连续胺基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，核酸编码由SEQ ID NO.5编码的细胞壁抑制毒素。在一些情况下，示例性细胞壁抑制毒素包含SEQ ID NO.23。

对本发明的额外理解，包括适用于口服疫苗接种的示例性重组酵母细胞、疫苗组合物、食品组合物、生产疫苗的方法、给动物接种疫苗的方法以及相关方法、试剂盒和核酸分子，可以通过查看以下所选实施例的详细描述和附图而获得。

附图说明

图1是示例性重组酵母细胞的示意图。

图2是示例性疫苗组合物的示意图。

图3是示例性食品组合物的示意图。

图4是生产疫苗的示例性方法的示意图。

图5是生产疫苗的另一种示例性方法的示意图。

图6是给动物接种疫苗的示例性方法的示意图。

图7是给动物接种疫苗的另一种示例性方法的示意图。

图8是给动物接种疫苗的另一种示例性方法的示意图。

图9是给动物接种疫苗的另一种示例性方法的示意图。

图10是供应疫苗的示例性方法的示意图。

图11是供应疫苗的示例性方法的示意图。

图12是示例性试剂盒的示意图。

图13是另一种示例性试剂盒的示意图。

图14说明了获自从酵母细胞培养基收获的eVLP的人流感H1、M1和N1蛋白的免疫印迹染色。

图15说明了携带mRNA有效载荷的eVLP的示意图，所述有效载荷用于在所施用的宿主的摄取(例如，吞噬)eVLP的靶细胞中表达重组免疫原。

图16说明了使用EGFP特异性引物的eVLP的RT-PCR结果，所述结果证明eVLP中包装的EGFP mRNA的存在。

图17说明了分泌携带EGFP mRNA有效载荷的eVLP的重组酵母细胞的荧光显微镜图像。

图18说明了表达来自吞噬的eVLP(右)的mRNA编码的EGFP的树突细胞(左)。

图19说明了从培养基获得的eVLP的透射电子显微照片。

图20说明了生产用于口服施用的海藻酸盐包封的酵母细胞微球的方法。

图21说明了海藻酸盐包封的酵母细胞微球的荧光显微镜图像。左：说明了微球包封后的散装材料。右：说明了包封多个产生VLP的重组酵母细胞的单个微球。

图22说明了海藻酸盐包封的酵母细胞微球的口服施用的结果。条形从左至右指示：施用高剂量的口服海藻酸盐包封的酵母细胞微球的小鼠中的抗GAG-GFP血清抗体水平；施用标准H1/N1可注射疫苗的小鼠中的抗流感血清抗体水平；施用盐水对照的小鼠中的抗GAG-GFP血清抗体水平；施用中等(M)剂量的口服海藻酸盐包封的酵母细胞微球的小鼠中的抗GAG-GFP血清抗体水平；以及施用低(L)剂量的口服海藻酸盐包封的酵母细胞微球的小鼠中的抗GAG-GFP血清抗体水平。

图23说明了编码在ADH2启动子控制下的HIV GAG-GFP融合体和在ADH2启动子控制下的β-葡聚糖酶(Egress 1)的示例性构建体。

图24说明了编码HIV GAG-MS2融合蛋白、β-葡聚糖酶和编码mRNA的核酸序列的示例性构建体，所述mRNA编码EGFP并且包括多个MS2-蛋白结合位点。

图25说明了编码流感神经氨酸酶蛋白的核酸序列的示例性序列。

图26说明了编码HIV GAG-GFP融合蛋白的核酸序列的示例性序列。

图27说明了用于在酵母中在ADH2启动子控制下表达埃博拉糖蛋白(GP)的载体。埃博拉VP40也可以在不同或共同启动子的控制下表达。

图28说明了用酵母分泌信号和消解酶表达埃博拉GP的结果。诱导GP在重组酵母细胞中的表达并且在指定的时间点获取样品。

图29说明了酵母细胞在有和没有葡聚糖酶处理下的DAPI染色。DAPI染色指示酵母细胞壁的透化。

图30说明了在通过葡萄糖饥饿诱导VP40和葡聚糖酶6或24小时后上清液和酵母细胞裂解物中的埃博拉VP40表达。

图31说明了在酵母中通过葡萄糖饥饿诱导表达后的VP40表达结果。XXXXX代表葡聚糖酶。

图32说明了用流感或埃博拉抗原产生VLP的异源蛋白的某些组合。

图33说明了用于酵母细胞表达的流感VLP三盒表达载体。

图34说明了用于酵母细胞表达的埃博拉VLP三盒表达载体。

图35说明了在共表达细胞壁透化剂的条件下含有GP和VP40的埃博拉VLP的酵母细胞内表达水平。

图36说明了在共表达细胞壁透化剂的条件下含有GP和VP40的埃博拉VLP的酵母分泌(上清液)表达水平。

图37说明了在共表达细胞壁透化剂的条件下含有M1和H1的流感VLP的酵母分泌(上清液)表达水平。

图38说明了在共表达细胞壁透化剂的条件下含有GP和VP40的流感VLP的酵母细胞内表达水平。

图39说明了在共表达细胞壁透化剂的条件下流感VLP的酵母分泌(上清液)表达水平。

图40说明了用于通过包括MS2结合位点阵列将所关注的基因(例如，yGFP)并入VLP中的表达盒的示意图。可以将含有所关注的基因和MS2结合位点阵列的RNA转录物包装至至少部分由含有MS2结合蛋白序列的融合蛋白形成的VLP中。

具体实施方式

以下详细描述和附图描述和说明了各种适用于生产疫苗免疫原的示例性重组酵母。此类重组酵母细胞可以用于例如口服疫苗接种、用于制造疫苗组合物、用于给动物接种疫苗的方法中以及相关方法、试剂盒和核酸分子中。提供描述和图式以使本领域技术人员能够制造和使用一种或多种适用于口服疫苗接种的重组酵母、疫苗组合物、试剂盒和核酸分子并执行示例性方法。所述描述和图式并不意图以任何方式限制权利要求书的范围。

如本文所用，术语“动物”是指脊椎动物。这个术语包括哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和两栖动物。因此，这个术语包括人类、家养宠物(如狗和猫)、野猫、马、牛和其它脊椎动物。这个术语还包括农业上重要的动物，如家养的猪、鸡、牛、绵羊、山羊、马、驴、骡、鸭、鹅和火鸡。

如本文所用，术语“腔体”是指由物体界定的开放空间。就其本身来说，这个术语不需要任何特定的结构或物理特性，并且包括例如具有暴露开口的空间和封闭的空间。

如本文所用，术语“共同遗传控制”是多个核酸序列受同一启动子调控的特性。这个术语包括其中多个核酸序列位于调控两个核酸序列表达的单个启动子下游的核酸排列。这个术语还包括其中多个核酸序列中的一者位于启动子的第一个拷贝下游并且多个核酸序列中的另一者位于启动子的第二个拷贝下游的核酸排列。应了解，在启动子的多个拷贝用于在共同遗传控制下表达蛋白质的方案中的情况下，拷贝不需要在序列上相同并且只要维持功能等效性，启动子序列的微小变化是可容忍的。

如本文所用，术语“可摄入”是指所涉及的要素由动物摄入的能力。

如本文所用，术语“调控性启动子”是指在特定条件下起始特定基因转录的DNA区域。这个术语包括诱导性启动子和阻抑性启动子。诱导性启动子的实例包括正诱导性启动子，即，在诱导物存在下激活的诱导性启动子，例如，通过诱导物与激活物分子之间的相互作用使组合实体与诱导性启动子结合以实现由诱导性启动子控制的下游基因转录；和负诱导性启动子，即，在诱导物存在下激活的诱导性启动子，例如，通过诱导物与阻抑物之间的相互作用以阻断或禁止阻抑物与诱导性启动子结合，从而消除对由诱导性启动子控制的下游基因转录的遏制。阻抑性启动子的实例包括正阻抑性启动子，即，在阻抑物存在下受阻抑的启动子，例如，通过阻抑物与激活物分子之间的相互作用以阻断或禁止激活物分子与阻抑性启动子结合，从而消除对由阻抑性启动子控制的下游基因转录的激活；和负阻抑性启动子，即，在阻抑物存在下受阻抑的启动子，例如，通过阻抑物与共阻抑物分子之间的相互作用使组合实体与阻抑性启动子结合以实现由阻抑性启动子控制的下游基因转录。这个术语还包括可以经过调控以作为正诱导性启动子和负诱导性启动子两者的启动子；和响应环境队列的启动子，如光的存在或不存在、特定分子的不存在；以及可以通过提供或去除特定分子或环境队列来具体调控的任何其它启动子。

如本文所用，术语“容器”是指能够部分或完全含有物质，如一种或多种重组酵母细胞的结构。就其本身来说，这个术语不需要任何特定的结构或物理特性，并且包括例如开放结构、封闭结构、单组分结构、多组分结构、刚性结构和柔性结构。

如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指由病毒结构蛋白组成且缺乏病毒核酸的非感染性纳米结构。病毒样颗粒在形态上类似于病毒，但除此之外，缺乏感染宿主细胞的能力。VLP通常由至少一种结构组分组成，例如，形成颗粒外壳的衣壳或基质蛋白。

如本文所用，术语“包膜病毒样颗粒”或“eVLP”是指包括宿主细胞衍生膜的病毒样颗粒，通常是在病毒从宿主细胞出现时在出芽过程中获得的基于脂质的膜。eVLP通常包含至少一种基质蛋白。在一些情况下，eVLP可以包含2或3种或更多种不同的基质蛋白。在一些情况下，一种或多种基质蛋白经过工程改造以在eVLP的蛋白外壳的外表面上展示抗原肽序列。举例来说，抗原肽序列可以插入一个或多个基质蛋白环序列中，使得抗原肽序列暴露于组装的eVLP的蛋白外表面上。在一些情况下，eVLP经过工程改造以在eVLP的表面上包括一种或多种免疫原性肽。在一些情况下，一种或多种eVLP组分在宿主细胞中表达，所述宿主细胞进一步表达一种或多种可以嵌入eVLP的脂质双层包膜中的抗原(例如，糖肽)。

如本文所用，术语“无包膜病毒样颗粒”是指不包括宿主细胞衍生膜的VLP。首字母缩略词neVLP是指术语“无包膜病毒样颗粒”。neVLP可以包含至少一种衣壳蛋白。在一些情况下，neVLP可以包含2或3种或更多种不同的衣壳蛋白。在一些情况下，一种或多种衣壳蛋白经过工程改造以在neVLP的外表面上展示抗原肽序列。举例来说，抗原肽序列可以插入一个或多个衣壳蛋白环序列中，使得抗原肽序列暴露于组装的neVLP的蛋白外表面上。

VLP，包括neVLP和/或eVLP，可以经过工程改造以包括核酸结合肽，所述核酸结合肽继而可以结合特定的核酸结合位点序列。如下文进一步描述，在MS2外被蛋白中发现一种示例性核酸结合肽，所述核酸结合肽结合例如折叠成发夹环结构的MS2复制酶mRNA的19个核苷酸的核糖体结合位点。通常包括一个或多个核酸结合位点作为核酸结合位点的重复阵列以增加定位至核酸的同源蛋白的量。在一些情况下，重复序列可能损害重组编码序列的遗传稳定性。在一个实施方案中，重复阵列中的核酸结合位点是序列不同但仍保留同源蛋白结合功能的同义结合位点。同义核酸结合位点的此类阵列描述于例如Wu等,GenesDev.2015年4月15日(29(8)；876-886中。

经过工程改造以包括核酸结合肽的此类VLP可以用于将编码抗原的核酸递送至抗原呈递细胞以通过在抗原呈递细胞中表达抗原来增加疫苗反应。在一个实施方案中，VLP包含至少一种与核酸结合元件融合的衣壳或基质蛋白。在示例性实施方案中，VLP包含HIV-Gag-MS2融合体，例如，以SEQ ID NO.13列出的GAG-MS2融合体。在一些情况下，GAG-MS2融合蛋白包含SEQ ID NO.13的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，GAG-MS2融合蛋白与SEQ ID NO.13的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同。在一些情况下，GAG-MS2融合蛋白包含SEQ ID NO.13的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。在一些情况下，GAG-MS2融合蛋白包含SEQ ID NO.13的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。

用于结合核酸的替代性融合包括但不限于流感或冠状病毒基质蛋白M1或M2与核酸结合肽的融合、冠状病毒刺突蛋白与核酸结合肽的融合以及HBV核衣壳蛋白与核酸结合肽的融合。

另外或替代地，此类VLP可以用于递送编码报告体的核酸，以通过在摄取VLP的细胞中表达报告体来增加报告体信号。

替代性核酸结合肽和相应核酸结合位点序列包括但不限于U.S.2017/0233762中所描述的那些，所述文献的内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，包括但不限于RNA配体序列和RNA结合肽序列及其用途。技术人员将了解，可以并入多个RNA结合肽序列(例如，在VLP融合蛋白中)和它们的配体(例如，在待包装的靶核酸中)以包装相同核酸的多个拷贝或包装多个不同的核酸。

在本文公开多肽序列的情况下，例如由序列表公开，应了解，此类多肽可以包括适合于支持成熟形式(例如，其中信号序列被切割)多肽从宿主生物体(如酵母细胞)分泌的N端分泌信号。在信号肽已经存在于所公开的序列中的情况下，技术人员将了解，此种序列还公开了信号肽切割后多肽的成熟形式。此外，技术人员将了解，信号序列可以用针对本文描述的宿主生物体而优化的信号序列置换。

本文描述了通过产生重组免疫原的重组酵母细胞的调控性透化来提供改善的所述重组免疫原释放的方法和组合物。如本文在各种实施方案中所描述，这种改善的免疫原释放可以通过细胞壁降解酶表达的调控性诱导、细胞壁生物合成途径的组分表达的调控性阻抑或者细胞壁生物合成抑制剂表达的调控性诱导来提供。

图1是示例性重组酵母细胞100的示意图。重组酵母细胞100包含编码调控性启动子150的第一核酸序列110；编码免疫原160，优选VLP免疫原的第二核酸序列112；以及编码细胞壁降解酶180的第三核酸序列114。在一些实施方案中，第一核酸序列110、第二核酸序列112和第三核酸序列114中的至少一者或每一者包含野生型酵母细胞中不天然出现并且已经人工引入野生型酵母细胞中以产生重组酵母细胞100的核酸序列。在一些情况下，第二核酸序列112和/或第三核酸序列114的表达在调控性启动子150的共同遗传控制下。因此，重组酵母细胞100已经进行遗传修饰以包括至少一种免疫原基因112、至少一种细胞壁降解酶基因114和至少一种调控性启动子110。第一、第二和/或第三核酸序列可以存在于一个或多个质粒上。在一些情况下，将第一、第二和第三核酸序列中的至少一者或全部插入酵母细胞的基因组中相同或不同的基因座处。在优选的实施方案中，免疫原是VLP，如eVLP，或者是VLP的组分。

重组酵母细胞100可以由任何适合的野生型酵母细胞产生，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择用于生产根据特定实施方案的重组酵母细胞的野生型酵母细胞，这些考虑因素包括有待用于特定实施方案中的细胞壁、免疫原和细胞壁降解酶的性质；野生型酵母细胞的可用性；野生型酵母细胞可以用一种或多种包含第一、第二和第三核酸序列的载体转化的相对容易程度；野生型酵母细胞可以按生产水平量生长的相对容易程度；以及野生型酵母细胞在冷冻干燥或使用其它技术处理以实现生长和其它活动暂停后保持稳定的时间长度。适合的野生型酵母细胞的实例包括酿酒酵母(S.cerevisiae，也称为“面包酵母”)、毕赤酵母(Pichia pastoris)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。

发明人已经确定，至少因为它的即时可用性、明确表征的转化效率和明确表征的处理技术，所以酿酒酵母可用作生产根据本发明的实施方案的重组酵母细胞中的野生型酵母细胞。发明人已经将酿酒酵母菌株Sc1602 MATα、ura3-、leu-、pep4-、och1-鉴定为在生产根据本发明的实施方案的重组酵母细胞中可用的野生型酵母细胞。

第一核酸序列110编码调控性启动子150。调控性启动子150可以包含任何适合的调控性启动子，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择用于根据特定实施方案的重组酵母细胞的调控性启动子，这些考虑因素包括生产重组酵母细胞中所用的野生型酵母细胞的性质；对免疫原和/或细胞壁降解酶的生产进行的任何所需类型的控制；以及使用特定诱导性启动子控制VLP免疫原和细胞壁降解酶表达所需的任何设备和/或供应品。适合的调控性启动子的实例包括诱导性启动子，包括正诱导性启动子、负诱导性启动子以及可以经过调控以作为正诱导性启动子和负诱导性启动子两者的诱导性启动子；和阻抑性启动子，包括正阻抑性启动子、负阻抑性启动子以及可以经过调控以作为正阻抑性启动子和负阻抑性启动子两者的阻抑性启动子。适合的调控性启动子的实例包括在半乳糖存在下激活由启动子控制的基因转录的Gal1诱导性启动子，以及在不存在葡萄糖的情况下激活转录的ADH2启动子。视为适合的调控性启动子的其它实例包括但不限于PTet、pTP1、pTEF1、pPYK1、pADH1、FMD1、pHXT7、pGAL1、pGAL7、pGAL10、pPHO5、pCUP1和pDAN1。

发明人已经确定，Tet-off调控性启动子，一种正阻抑性启动子，对于作为调控性启动子包含于根据本发明的重组酵母细胞中是特别有利的。在Tet-off系统中，当四环素或其衍生物之一存在时，由调控性启动子控制的基因转录被关闭。发明人认为包含这种调控性启动子特别有利，至少是因为它能够实现生产方法。举例来说，如下文详细描述，在重组酵母细胞中包含这种调控性启动子能够实现在实验室环境中在四环素或四环素衍生物存在下使重组酵母细胞的培养物生长的方法。在所述方法的这个阶段中，不会转录培养物中的重组酵母细胞中由Tet-off系统控制的基因，例如编码免疫原的核酸序列和/或诱导细胞壁透化的核酸序列，如细胞壁降解酶。在稍后时间可以去除四环素或四环素衍生物。举例来说，在细胞培养物在培养物中已经达到足够的密度或生长期后，可以在预定时间段内去除足够量的阻抑物，从而在预定时间段的时长内激活编码免疫原的核酸序列和/或编码细胞壁降解酶的核酸序列的转录。这使得在培养物中收获重组酵母细胞之前能够产生所需量的免疫原和/或细胞壁降解酶。继而，这确保了当待接种疫苗的患者摄入重组酵母细胞时，例如在患者摄入冷冻干燥的重组酵母的口服疫苗接种期间，一定量的免疫原和/或细胞壁降解酶是立即可用的，这可以对疫苗的功效产生积极影响。

作为另一个实例，正阻抑性启动子可以用于通过细胞壁生物合成途径的调控性阻抑来调控细胞壁透化性。举例来说，重组酵母细胞可以经过工程改造以包括与细胞壁生物合成途径的组分可操作连接的正阻抑性启动子并且例如以受调控的方式表达免疫原。重组酵母细胞可以在允许细胞壁生物合成的条件下培养，随后可以通过去除阻抑物来阻抑细胞壁生物合成。在一些实施方案中，通过与细胞壁生物合成途径的内源组分可操作连接的正阻抑性启动子的启动子置换或插入来提供细胞壁生物合成途径的调控性阻抑。或者，可以敲除内源细胞壁生物合成途径组分并且将替代物(例如，拷贝)引入重组酵母细胞中，所述替代物与正阻抑性启动子可操作连接。

如本文所描述，在一些实施方案中，免疫原和细胞壁透化剂(例如，细胞壁降解酶、细胞壁生物合成毒素等)在可调控性启动子的共同遗传控制下。或者，在一些实施方案中，以不同方式调控免疫原和细胞壁透化剂。在一些实施方案中，调控性启动子与编码细胞壁透化剂的核酸序列可操作连接。在一些实施方案中，不同的(例如，调控性)启动子与编码免疫原或其组分的核酸序列可操作连接。

在一些情况下，选择与细胞壁透化剂可操作连接的启动子以在重组酵母已经培养至足够的密度(例如，1x10⁸个细胞/毫升，OD₆₀₀≥10，或OD₆₀₀≥20)或生长期(例如，对数期、对数中期或对数后期生长)之后诱导或去阻抑细胞壁透化剂的表达。在一些情况下，选择与细胞壁透化剂可操作连接的启动子以在已经收获重组酵母之后或在已经向受试者施用重组酵母之后诱导或去阻抑细胞壁透化剂的表达。

在一些情况下，选择与免疫原或其组分可操作连接的启动子以在向受试者施用重组酵母之前诱导或去阻抑免疫原的表达。举例来说，可以在培养重组酵母细胞期间去阻抑或诱导免疫原的产生。在本发明的一些方法中，诱导或去阻抑免疫原的表达，然后诱导或去阻抑透化剂的表达。在一些情况下，可以通过在诱导免疫原表达后诱导细胞壁透化剂的表达来提高表达的免疫原的产量。在其它情况下，例如，在免疫原的低效释放压倒宿主细胞的分泌能力的情况下，可以优选地在诱导免疫原表达之前或同时诱导细胞壁透化剂的表达。如本文所描述，一种用于同时诱导免疫原和细胞壁透化剂两者的示例性方法是将编码免疫原和透化剂两者的核酸序列与可调控性共同遗传控制元件可操作连接。

在一些实施方案中，编码细胞壁透化剂的核酸序列在调控性启动子的控制，并且组成性地表达编码免疫原的核酸序列。

在一些情况下，用于在透化的酵母中产生重组VLP的方法还包括在诱导期中抑制细胞复制。在一些实施方案中，复制的抑制可以通过减少复制的代谢负担来提高VLP的产生。通过抑制细胞壁产生(例如，使用杀伤毒素)、抑制细胞壁维持(例如，使用细胞壁降解酶)或抑制基因组复制、诱导检查点激活物(如TEL1或Mps1)的表达来固有地抑制细胞复制。

在一些情况下，通过抑制内源性DNA聚合酶的表达或活性来抑制基因组复制。在一些情况下，通过去除编码内源酵母DNA聚合酶的基因组区域的全部或一部分来抑制DNA聚合酶。在一些情况下，产生本文所描述的VLP的方法包括诱导重组性重组酶(如CRE重组酶)的表达，从而诱导基因组中编码内源DNA聚合酶的基因组区域处一个或多个，优选两个loxP位点的重组。通常，loxP位点定位于内源DNA聚合酶的重要区域的侧翼。在一些实施方案中，CRE重组酶在以下所共用的可调控性启动子的遗传控制下：编码细胞壁透化剂的核酸序列，和/或编码免疫原或其组分(例如，流感血凝素或神经氨酸酶，或冠状病毒刺突蛋白)的核酸序列，和/或编码VLP形成蛋白序列，如GAG蛋白(例如，HIV Gag)、基质蛋白(例如，流感M)、核衣壳蛋白(例如，冠状病毒N或流感NP)、包膜蛋白(例如，冠状病毒E)或它们的组合的核酸序列。因此，在一些实施方案中，本文所描述的酵母宿主细胞含有一个或多个重组位点，例如在编码基因组区域的DNA聚合酶处或侧翼的loxP位点，以及编码异源重组酶，如CRE重组酶的核酸。

用于抑制细胞复制的基于重组的方法在形成适合于向哺乳动物受试者施用的疫苗方面可能特别有利，其中疫苗含有或可能含有完整酵母细胞的至少一部分，这是因为此类细胞不会复制。举例来说，在一些实施方案中，本文所描述的VLP通过同时或顺序重组被诱导以抑制复制，例如通过同时或顺序透化，收集含有VLP的细胞培养物上清液并且用于形成疫苗。在一些情况下，用于形成疫苗的细胞培养物上清液还含有可以例如提供佐剂作用的酵母细胞组分。另外或替代地，在本文所描述的一些实施方案中，VLP来自细胞培养物上清液，并且还收获不可复制的酵母细胞并与配制剂混合以产生疫苗。

第二核酸序列112编码免疫原160，优选VLP免疫原。免疫原可以包括例如任何适合的VLP免疫原，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择用于重组酵母细胞的VLP免疫原，这些考虑因素包括针对其产生重组酵母细胞以包括于疫苗(例如本文所描述的各种疫苗组合物)中的任何特定致病剂的身份和抗原，VLP免疫原的总体大小，以及其它考虑因素。此外，虽然所说明的实施方案显示了编码单一免疫原的单一核酸序列112，但应注意，在根据一个实施方案的重组酵母细胞中可以包括各自编码免疫原或其组分的多个核酸序列。各自编码免疫原的适合数目的核酸序列的实例包括但不限于一个、至少一个、多于一个、两个、多个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个和超过十个。此外，第二核酸序列112可以编码裸VLP免疫原或包膜VLP免疫原。

适合的VLP免疫原的实例包括但不限于来自以下的一种或多种免疫原：霍乱、登革热、白喉、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、乙型流感嗜血杆菌(Hib)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感、日本脑炎、疟疾、麻疹、脑膜炎球菌性脑膜炎、腮腺炎、百日咳、肺炎球菌病、脊髓灰质炎、狂犬病、轮状病毒、风疹、破伤风、蜱传脑炎、肺结核、伤寒、水痘、黄热病、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、恰加斯病(Chagas Disease)、基孔肯亚病(Chikungunya)、登革热、产肠毒素大肠杆菌、肠道病毒71(EV71)、B族链球菌(GBS)、单纯疱疹病毒、HIV-1、人类钩虫病、利什曼病(Leishmaniasis Disease)、疟疾、尼帕病毒(Nipah Virus)、伤寒沙门氏菌病、诺如病毒(Norovirus)、副伤寒、呼吸道合胞病毒(RSV)、血吸虫病、志贺氏菌(Shigella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、结核病和通用流感疫苗。

包括编码来自流感病毒的eVLP免疫原人流感M1基质、血凝素和神经氨酸酶蛋白的核酸序列被认为对于意图用于针对流感病毒的口服疫苗中的根据本发明的重组酵母细胞是有利的。

第三核酸序列114可以编码细胞壁透化剂，如细胞壁降解酶180。细胞壁降解酶可以包括任何适合的细胞壁降解酶，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择用于根据特定实施方案的重组酵母细胞的细胞壁降解酶，这些考虑因素包括由第二核酸序列112编码的免疫原的性质和大小、编码包含于重组酵母细胞中的免疫原的不同核酸的数目、重组酵母细胞的细胞壁的性质以及其它考虑因素。适合的细胞壁降解酶的实例包括但不限于葡聚糖酶(如β-1,3-葡聚糖酶)、甘露聚糖酶、几丁质酶和能够降解酵母细胞壁的其它酶。

在一些情况下，β-1,3-葡聚糖酶包含SEQ ID NO.10的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，相对于由SEQ ID NO.1编码的蛋白质或以SEQ ID NO.10列出的多肽序列，β-1,3-葡聚糖酶包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。在一些情况下，β-1-3-葡聚糖酶与由SEQ ID NO.1编码的分泌蛋白序列至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，β-1-3-葡聚糖酶与SEQ ID NO.10的至少25、50、100、125或150个连续胺基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，葡聚糖酶包含SEQ ID NO.10的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。

在一些情况下，甘露聚糖酶包含SEQ ID NO.11的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，相对于以SEQ ID NO.11列出的多肽序列，甘露聚糖酶包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。在一些情况下，甘露聚糖酶与由SEQ IDNO.11编码的分泌蛋白序列至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，β-1-3-葡聚糖酶与SEQ ID NO.11的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，甘露聚糖酶包含SEQ ID NO.11的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。

在一些情况下，几丁质酶包含SEQ ID NO.12的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部。在一些情况下，相对于由SEQ ID NO.4编码的蛋白质或以SEQ ID NO.12列出的多肽序列，几丁质酶包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。在一些情况下，几丁质酶与由SEQ ID NO.4编码的分泌蛋白序列至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，几丁质酶与SEQ ID NO.12的至少25、50、100、125或150个连续胺基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或至少99％相同。在一些情况下，几丁质酶包含SEQ IDNO.12的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失。

在一些实施方案中，重组酵母细胞壁的主要组分是β-1,3-葡聚糖，并且细胞壁降解酶是或包含β-1,3-葡聚糖酶。在一些实施方案中，重组酵母细胞壁的主要组分是甘露聚糖，并且细胞壁降解酶是或包含甘露聚糖酶。在一些实施方案中，重组酵母细胞壁的主要组分是几丁质，并且细胞壁降解酶是或包含几丁质酶。在一些实施方案中，诱导一种或两种或更多种葡聚糖酶细胞壁降解酶，如β-1-3-葡聚糖酶和β-1-6-葡聚糖酶的组合的表达来以受调控的方式透化细胞壁。在一些实施方案中，诱导一种或两种或更多种几丁质酶细胞壁降解酶的组合的表达来以受调控的方式透化细胞壁。在一些实施方案中，诱导一种或两种或更多种甘露聚糖酶细胞壁降解酶的组合的表达来以受调控的方式透化细胞壁。在一些实施方案中，诱导葡聚糖酶、几丁质酶和甘露聚糖酶中的两者或更多者的组合或每一者的表达来以受调控的方式透化细胞壁。

在一些实施方案中，细胞壁透化剂是来自作为宿主细胞的天然捕食者的酵母的细胞壁降解酶。举例来说，毕赤酵母属(Pichia)和拟威尔酵母属(Williopsis)的某些孢子形成子囊菌酵母表达对完整的酿酒酵母细胞壁展现出高糖苷活性的细胞壁降解酶。因此，在某些实施方案中，细胞壁透化剂可以是毕赤酵母属或拟威尔酵母属细胞壁降解酶。作为另一个实例，某些细菌，如节杆菌(Arthrobacter)或纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)，表达表达对完整的酿酒酵母细胞壁展现出高糖苷活性的细胞壁降解酶。因此，在一些实施方案中，细胞壁透化剂是来自节杆菌或纤维化纤维微细菌的细胞壁降解酶。

包括编码β-葡聚糖酶(如β-1,3-葡聚糖酶)的核酸序列被认为在包含基于流感的VLP免疫原，如来自上文所描述的流感病毒的eVLP免疫原人流感M1基质、血凝素和神经氨酸酶蛋白的重组酵母细胞中特别有利，至少是因为预期这种特定的细胞壁降解酶能够有效地将酵母细胞壁降解至足以允许组装的eVLP从重组酵母细胞中逃逸的程度。

除了包括编码细胞壁降解酶的核酸序列之外或作为其替代，可以包括编码细胞壁抑制毒素的核酸。在这些实施方案中，编码的毒素抑制或防止新形成的重组酵母细胞中细胞壁的形成。因此，新形成的重组酵母细胞完全没有细胞壁或只有部分形成的细胞壁。在任一种情况下，重组酵母细胞中包含的一种或多种免疫原能够在没有细胞壁降解酶帮助下离开新形成的重组酵母细胞。

如果包括于根据一个实施方案的重组酵母细胞中，那么可以包括编码任何适合的细胞壁抑制毒素的核酸序列。适合的细胞壁抑制毒素的实例包括但不限于木拉克拟威尔酵母(Williopsis Mrakii)杀伤毒素。

因此，第一核酸序列110可以包括编码选择用于根据特定实施方案的重组酵母细胞的调控性启动子的任何核酸序列。类似地，第二核酸序列112可以包括编码选择用于根据特定实施方案的重组酵母细胞的一种或多种免疫原的任何核酸序列。最后，第三核酸序列114可以包括编码选择用于根据特定实施方案的重组酵母细胞的细胞壁透化剂，如细胞壁降解酶的任何核酸序列。

第二核酸序列112和第三核酸序列114的表达可以在调控性启动子150的共同遗传控制下。在一些实施方案中，制造遗传构建体，所述遗传构筑体包括位于第一核酸序列下游的第二核酸序列112和第三核酸序列中的每一者。在其它实施方案中，第二核酸序列112位于第一核酸序列110的第一拷贝下游并在第一拷贝的遗传控制下，并且第三核酸序列114位于第一核酸序列110的第二拷贝下游并在第二拷贝的遗传控制下。在后面的实施方案中，第一核酸序列110和第二核酸序列112的第一拷贝可以与第一核酸序列110和第三核酸序列114的第二拷贝位于相同或不同的核酸分子(例如，载体、质粒或染色体)上。举例来说，为了产生根据这些实施方案之一的重组酵母细胞，可以用两种不同的遗传载体转化野生型酵母细胞-编码第一核酸序列110和第二核酸核酸序列112的第一拷贝的第一遗传载体以及编码第一核酸序列110和第三核酸序列114的第二拷贝的第二遗传载体。

在某些实施方案中，第二核酸序列112编码包含病毒结构元件和核酸结合蛋白的融合蛋白。在这些实施方案中，重组酵母细胞100包括编码核酸结合蛋白和所关注的抗原或免疫原的结合标靶的第四核酸序列116。类似于第一核酸序列110、第二核酸序列112和第三核酸序列114，这些实施方案中的第四核酸序列116可以包括野生型酵母细胞中不天然出现并且已经人工引入野生型酵母细胞中以产生重组酵母细胞100的核酸序列。

在根据这些实施方案的一个特定实例中，第二核酸序列编码Gag-MS2融合蛋白。融合蛋白的Gag部分是组装形成病毒颗粒的HIV gag蛋白，而融合蛋白的MS2部分是天然地与RNA中明确定义的非翻译茎环结构相互作用的MS2噬菌体外被蛋白。这些实施方案中第二核酸序列的适合核酸序列的实例包括SEQ ID NO.6。这些实施方案中第四核酸序列的适合核酸序列的示例性前体包括SEQ ID NO.7，在图40中呈现的最后一张图中示意性地说明。SEQID NO.7编码MS2锚，其包括MS2蛋白可以结合的一系列茎环结构；以及ygfp，其包括可以用于插入一个或多个所选抗原和/或免疫原的一系列明确表征的限制酶位点。因此，编码yGFP报告体的序列可以替代本文所描述的抗原和/或免疫原中的任一者，包括但不限于编码病毒免疫原的蛋白质，如流感血凝素和/或神经氨酸酶，或冠状病毒刺突蛋白。

在一些情况下，MS2结合序列可以是MS2序列的重复阵列的一部分。在一些情况下，重复MS2序列可能损害重组编码序列的遗传稳定性。在一个实施方案中，重复阵列中的核酸结合位点是序列不同但仍保留同源蛋白结合功能的同义结合位点。同义核酸结合位点的此类阵列描述于例如Wu等,Genes Dev.2015年4月15日(29(8)；876-886中。在一些实施方案中，MS2序列包含以下发夹环形成序列SEQ ID NO.8(NRNDSASSANCASSSNNYN)，其中S代表C或G；D代表A、G或U；R代表A或G；并且Y代表C或U。在一些实施方案中，核酸结合位点在重复阵列中，所述重复阵列包含MS2序列，如SEQ ID NO.8的MS2序列的8至48次重复。在一些实施方案中，重复阵列包含MS2序列，如SEQ ID NO.8的MS序列的8至24次，优选24次重复。在一些情况下，核酸结合位点的重复阵列由SEQ ID NO.9编码。

这些实施方案被认为是特别有利的，至少是因为(例如，Gag)-MS2融合蛋白起作用以结合并包装对应于由第四核酸序列编码的抗原或免疫原的RNA。在使用中，根据这些实施方案之一的重组酵母细胞将释放包含编码所关注的抗原和/或免疫原的RNA的VLP。举例来说，如果包含于根据一个实施方案的疫苗组合物或食品组合物中，那么重组酵母细胞将在摄入疫苗组合物或食品组合物的动物体内释放由树突细胞或其它抗原呈递细胞摄取的VLP。然后，这些细胞可以翻译RNA并且在动物免疫系统的正常功能运作中呈递一种或多种抗原和/或免疫原，这可能触发对一种或多种所选抗原和/或免疫原的所需免疫反应。

将了解，GAG蛋白编码序列可以用多种VLP形成蛋白序列取代，包括但不限于编码流感基质蛋白或冠状病毒衣壳蛋白的序列等。

在这些实施方案中，第四核酸序列可以但不必与第一核酸序列110、第二核酸序列112和/或第三核酸序列114一起在调控性启动子150的共同遗传控制下。另外，在这些实施方案中的一些实施方案中，第四核酸序列114可以编码适合的一种或多种所关注的抗原或免疫原。适合的实例包括一种或多种病毒抗原和/或免疫原、一种或多种细菌抗原和/或免疫原，以及被认为适合于引发免疫反应的任何其它抗原或免疫原。来源于流感病毒、RSV、HIV和其它病毒的抗原被认为特别适合包含于这些实施方案中。

在一些实施方案中，第二核酸序列112编码一种或多种足以形成VLP的病毒基因而缺乏一种或多种产生病毒子代所必需的病毒基因。在这些实施方案中的一些实施方案中，重组酵母细胞100包括编码所关注的抗原或免疫原的第四核酸序列116。类似于第一核酸序列110、第二核酸序列112和第三核酸序列114，这些实施方案中的第四核酸序列116可以包括野生型酵母细胞中不天然出现并且已经人工引入野生型酵母细胞中以产生重组酵母细胞100的核酸序列。

VLP，包括neVLP和/或eVLP，可以经过工程改造以包括可扩增复制子或编码这种VLP的构建体。如本文所用，“可扩增复制子”包含一个或多个能够支持宿主细胞中自复制的最小核酸序列。举例来说，VLP可以包装编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的RNA核酸，所述聚合酶能够将包装的RNA核酸或其部分复制至少1次，优选至少2次。在一些情况下，包装的核酸包括5'和/或3'非翻译区(UTR)，优选包装的核酸包括5'和3'UTR。通常，可扩增复制子含有所关注的基因，如编码免疫原的核酸序列。

在一些实施方案中，此类可扩增复制子可以由副流感病毒(PIV)基因组，如PIV 5型(例如，PIV5)基因组的部分构建。在一些实施方案中，可扩增复制子是包含副流感病毒(例如，PIV5)NP、V/P和L基因的全部、功能部分或至少一部分的核酸，以及任选的所关注的基因，如编码免疫原、MS2蛋白、MS2结合位点和/或报告体的核酸序列。在一些实施方案中，可扩增复制子缺乏一种或多种选自由M、F、SH和HN组成的组的PIV基因(例如，PIV5基因)，或者不能表达选自由M、F、SH和HN组成的组的PIV5蛋白中的一者或多者。在一些情况下，可扩增复制子包含PIV5 NP、V/P和L基因。在一些情况下，可扩增复制子包含插入PIV(例如，PIV5)V/P与L基因之间的所关注的基因。

适合的基于PIV的复制子包括但不限于Wei等,npj Vaccines 2,32(2017)中描述的那些复制子，优选地其中所述复制子包括编码在5'与3'UTR之间的免疫原(例如，血凝素、神经氨酸酶或刺突蛋白，或报告体，和/或如本文所描述的其它所关注的基因，如本文所描述的MS2或其它锚定序列，如本文所描述的MS2蛋白，或如本文所描述的VLP形成多肽(例如，基质、GAG或衣壳蛋白或其功能片段))的核酸。此类复制子可以包括其它遗传元件或与其它遗传元件结合使用，所述遗传元件如对于支持自复制必不可少的启动子或顺式或反式作用辅助多肽或基因，如Wei等的美国专利号9,034,343和/或WO 2002/077211中所描述；或其直向同源物，如WO 2002/077211中所公开的U.S.9,034,343的元件或多肽的直向同源物。

在示例性实施方案中，通过用所关注的基因置换PIV5融合糖蛋白(例如，SEQ IDNO.18)、M、SH和/或HN来产生复制子，任选地其中复制子还包括选择性标志物(例如，潮霉素抗性标志物)，优选地其中选择性标志物插入V/P与L之间。

在示例性实施方案中，PIV5 L基因编码包含SEQ ID NO.19的蛋白质。在一些情况下，PIV5 L基因编码包含SEQ ID NO.19的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部的蛋白质。在一些情况下，PIV5 L基因编码与SEQ ID NO.19的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，PIV5 L基因编码包含SEQ ID NO.19的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，PIV5 L基因编码包含SEQ ID NO.19的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。

在示例性实施方案中，PIV5 NP基因编码包含SEQ ID NO.20的蛋白质。在一些情况下，PIV5 NP基因编码包含SEQ ID NO.20的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部的蛋白质。在一些情况下，PIV5 NP基因编码与SEQ ID NO.20的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，PIV5NP基因编码包含SEQ ID NO.20的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，PIV5 NP基因编码包含SEQ ID NO.20的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。

在示例性实施方案中，PIV5 V/P基因编码包含SEQ ID NO.21的蛋白质。在一些情况下，PIV5 V/P基因编码包含SEQ ID NO.21的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部的蛋白质。在一些情况下，PIV5 V/P基因编码与SEQ ID NO.21的至少25、50、100、125或150个连续氨基酸或全部至少80％、85％、90％、95％或99％相同的蛋白质。在一些情况下，PIV5 V/P基因编码包含SEQ ID NO.21的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。在一些情况下，PIV5 V/P基因编码包含SEQ ID NO.21的长度至少为25、50、100、125或150个氨基酸的连续氨基酸区域的不超过1、2、4或5个单氨基酸插入、取代和/或缺失的蛋白质。

在一些情况下，用所关注的基因置换M、F、SH和HN PIV(例如，PIV5)基因中的一者或全部。在一些情况下，用流感或冠状病毒基质或衣壳蛋白基因或其功能和/或免疫原性片段置换NP或V/P中的一者或多者。在一些情况下，可扩增复制子包含编码流感或冠状病毒基质或衣壳蛋白的免疫原性和/或功能片段的核酸序列。在一些实施方案中，可扩增复制子包含PIV(例如，PIV5)5'和/或3'UTR。在一些实施方案中，所关注的基因和RdRp基因在5'与3'UTR之间。在一些实施方案中，RdRp基因和所关注的基因被编码为单个多肽，所述多肽在RdRp蛋白与由所关注的基因编码的蛋白质之间包括自切割肽序列。在一些情况下，自切割肽是2A自切割肽，如明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒的T2A肽。可扩增PIV5复制子的额外实施方案描述于例如WO 2016/176510中。

在一些实施方案中，可扩增复制子包含来自野田村病毒(Nodamura virus，NoV)的RdRp基因的功能片段或全部。参见例如Biddlecome等,PLoS One.2019；14(6):e0215031。在一些情况下，可扩增复制子包含NoV RdRp基因或其功能片段以及在NoV RNA1的5'与3'UTR之间的所关注的基因。在一些实施方案中，RdRp基因和所关注的基因被编码为单个多肽，所述多肽在RdRp蛋白与由所关注的基因编码的蛋白质之间包括自切割肽序列。在一些情况下，自切割肽是2A自切割肽，如明脉扁刺蛾病毒的T2A肽。

在一些实施方案中，可扩增复制子包含所关注的基因和α病毒复制酶的功能片段或全部。α病毒编码四种非结构蛋白(nsP1-4)，最初作为多蛋白P1234产生。nsP4是核心RNA依赖性RNA聚合酶，但所有四种nsP或至少其功能片段是RNA合成所需要的。在一些实施方案中，包含α病毒复制酶的功能片段或全部的可扩增复制子还包含α病毒5'顺式作用元件和/或3'UTR，优选5'顺式作用元件和3'UTR。适合的α病毒复制子的实施方案包括但不限于Pushko的U.S.2006/0198854中描述的那些复制子，优选地其中所述复制子包括编码在5'顺式作用元件(例如，5'UTR)与复制子3'端(例如，3'UTR)之间的免疫原(例如，血凝素、神经氨酸酶或刺突蛋白，或报告体，和/或如本文所描述的其它所关注的基因，如本文所描述的MS2或其它锚定序列，如本文所描述的MS2蛋白，或如本文所描述的VLP形成多肽(例如，基质、GAG或衣壳蛋白或其功能片段))的核酸。此类复制子可以包括其它遗传元件或与其它遗传元件结合使用，所述遗传元件如对于支持自复制必不可少的启动子或顺式或反式作用辅助多肽或遗传元件，如U.S.2006/0198854中所描述。

本文所描述的可扩增复制子的实施方案，包括包含一种或多种PIV基因和/或一种或多种复制酶或RdRp基因(例如，PIV5或NoV RdRp或α病毒复制酶)的那些复制子，可以包装至本文所描述的VLP中的任一者中。类似地，可以产生可扩增复制子并包装于本文所描述的酵母宿主细胞系统中的任一者中，并且作为VLP从透化的酵母宿主细胞释放。

在根据这些实施方案的一个特定实例中，第二核酸序列112包含副流感5(PIV5)NP、V/P和L基因中每一者的至少一部分。在这个实例中，第二核酸序列112缺乏选自由M、F、SH和HN组成的组的PIV5基因中的一者或多者。

在这些实施方案中，第四核酸序列可以但不必与第一核酸序列110、第二核酸序列112和第三核酸序列114一起在调控性启动子150的共同遗传控制下。此外，在这些实施方案中，第四核酸序列114可以编码适合的一种或多种所关注的抗原或免疫原。适合的实例包括一种或多种病毒抗原和/或免疫原、一种或多种细菌抗原和/或免疫原，以及被认为适合于引发免疫反应的任何其它抗原或免疫原。来源于流感病毒、RSV、HIV和其它病毒的抗原被认为特别适合包含于这些实施方案中。

在转化之后，根据一个实施方案的重组酵母细胞可以基于期望的结果、特征或特性使用任何需要的和/或适合的技术、过程和/或方法进一步处理。举例来说，如下文详细描述，重组酵母细胞可以用于疫苗组合物中。对于这些实施方案，发明人已经确定脱水的重组酵母细胞是特别有利的。因此，可以使用用于使酵母脱水的常规方法，如冷冻干燥来处理根据特定实施方案的重组酵母细胞。冷冻干燥重组酵母细胞被认为是特别有利的，因为所得冷冻干燥的重组酵母细胞具有所需要的残留水分水平和长期稳定性。因此，在一些实施方案中，重组酵母细胞包括冷冻干燥的重组酵母细胞。此外，在一些实施方案中，重组酵母细胞被微囊化并且在食物中烘烤或置于液体中。

图2是示例性疫苗组合物200的示意图。疫苗组合物200包含界定腔体212的可摄入容器210以及安置于腔体212中的根据本发明的一个实施方案的至少一个重组酵母细胞214。举例来说，在一个实施方案中，疫苗组合物200包括至少一个重组酵母细胞，所述重组酵母细胞经过遗传修饰以产生免疫原和细胞壁透化剂，例如，在调控性启动子的共同遗传控制下。在一些情况下，细胞透化剂是细胞壁降解酶。作为另一个实例，在一个实施方案中，疫苗组合物200包括至少一个重组酵母细胞，所述重组酵母细胞经过遗传修饰以产生免疫原和细胞壁抑制毒素，例如，在调控性启动子的共同遗传控制下。应注意，在图2中，免疫原、细胞壁透化剂、调控性启动子或编码这些元件的核酸序列都没有说明。

可摄入容器210可以包括任何适合的可摄入容器，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择包括于根据特定实施方案的疫苗组合物中的适当可摄入容器，这些考虑因素包括疫苗组合物中所包含的重组酵母细胞的性质和量、任何储存和处理要求以及其它考虑因素。适合的可摄入容器的实例包括但不限于胶囊、耐酸胶囊和界定孔的胶囊。

至少一个重组酵母细胞214可以包括根据本发明的一个实施方案的任何重组酵母细胞，包括本文所描述的示例性重组酵母细胞。此外，至少一个重组酵母细胞214可以包括任何适合数目的重组酵母细胞，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择包含于根据特定实施方案的疫苗组合物中的重组酵母细胞的适当数目，这些考虑因素包括重组酵母细胞中所包含的免疫原的性质、重组酵母细胞中所包含的免疫原的拷贝数以及其它考虑因素。包含于根据本发明的一个实施方案的疫苗组合物中的重组酵母细胞的适合数目的实例包括但不限于一个、至少一个、多于一个、两个、多个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、多于十个、一百个、至少一百个、多于一百个、一千个、至少一千个、多于一千个、一百万个、至少一百万个和多于一百万个。包含于根据本发明的一个实施方案的疫苗组合物中的重组酵母细胞数目的适合范围的实例包括但不限于约1与约10⁷之间、约1与约10⁶之间、约1与约10⁵之间、约1与约10⁴之间、约1与约10³之间、约1与约10²之间以及约1与约10之间。

图3说明了包含根据本发明的一个实施方案的疫苗组合物302和至少一种食料304的食品组合物300。疫苗组合物302可以包括根据一个实施方案的任何疫苗组合物。因此，疫苗组合物包含界定腔体312的可摄入容器310以及安置于腔体312中的根据一个实施方案的至少一个重组酵母细胞314。在图3中所说明的食品组合物300中，可摄入容器310包括聚合外壳，所述聚合外壳已经喷施至多个重组酵母细胞314上以将重组酵母细胞314微囊封于由聚合外壳形成的可摄入容器310界定的腔体312中。

食品组合物300包括至少一种疫苗组合物302，并且如图3中所说明，可以包括多于一个疫苗组合物。实际上，任何适合数目的疫苗组合物可以包含于根据特定实施方案的食品组合物中，并且技术人员将能够基于各种考虑因素来选择包含于根据特定实施方案的食品组合物中的疫苗组合物的适合数目，这些考虑因素包括食品组合物的大小、形状和构造，疫苗组合物的性质，包括食品组合物中所包含的每种疫苗组合物中包含的重组酵母细胞的数目，以及其它考虑因素。可以包含于根据本发明的一个实施方案的食品组合物中的疫苗组合物的适合数目的实例包括但不限于一个、至少一个、多于一个、两个、多个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、多于十个、约1与约10⁷之间、约1与约10⁶之间、约1与约10⁵之间、约1与约10⁴之间、约1与约10³之间、约1与约10²之间以及约1与约10之间。

至少一种食料304可以包括被认为适合作为食物由动物食用的任何物质。实例包括面粉、小麦、糖、黄油、面包、面团、肉、酸奶、水果或其一部分、蔬菜或其一部分、水或另一种液体，以及这些实例的组合。

食品组合物可以采用任何适合的形式，包括但不限于曲奇饼、糖果、小吃棒、饼干、薄饼、糕、饮料、酸奶以及任何其它被认为需要的形式。

图4是生产疫苗的示例性方法的示意图400。初始步骤410包括通过以下方式创造重组酵母细胞：向野生型酵母细胞中引入编码调控性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁透化剂(例如，细胞壁降解酶)的第三核酸序列。重组酵母细胞可以包括根据一个实施方案的任何重组酵母细胞。因此，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含重组酵母细胞所来源的野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。引入步骤410可以根据任何适合的技术或方法进行，包括常规的转化技术和方法。

另一个步骤412包括将重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中以产生根据一个实施方案的疫苗组合物。

图5是生产疫苗的另一种示例性方法的示意图500。初始步骤510包括通过以下方式创造重组酵母细胞：向野生型酵母细胞中引入编码在阻抑物存在下受阻抑的正阻抑性启动子的第一核酸序列、编码免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁透化剂(例如，细胞壁降解酶)的第三核酸序列。重组酵母细胞可以包括根据一个实施方案的任何重组酵母细胞。因此，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的至少一者或每一者可以包含重组酵母细胞所来源的野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列。此外，在一些情况下，第二和第三核酸序列的表达在调控性启动子的共同遗传控制下。引入步骤510可以根据任何适合的技术或方法进行，包括常规的转化技术和方法。

正阻抑性启动子可以包括任何适合的正阻抑性启动子。如上文所描述，发明人已经确定Tet-off启动子被认为是有利的。在这些实施方案中，阻抑物包括四环素或四环素衍生物。

另一个步骤512包括在包含阻抑物的培养物中培养来源于重组酵母细胞的多个重组酵母细胞。

另一个步骤514包括从培养物中去除阻抑物。

另一个步骤516包括将多个重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中。

任选的步骤518包括允许在从培养物中去除阻抑物的步骤514与将多个重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中的步骤516之间经过预定的时间段。包括这个任选的步骤518被认为是有利的，至少是因为它能够激活启动子并且因此在将多个重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中之前第二和第三核酸序列能够表达一段时间。

另一个任选的步骤520包括冷冻干燥多个重组酵母细胞。如果包括在内，那么这个步骤520可以在将多个重组酵母细胞安置于由可摄入容器界定的腔体中的步骤516之前、同时或之后进行。

图6是给动物接种疫苗的示例性方法的示意图600。步骤610包括向待接种疫苗的动物口服递送根据一个实施方案的疫苗组合物。

图7是给动物接种疫苗的另一种示例性方法的示意图700。步骤710包括向待接种疫苗的动物口服递送根据一个实施方案的食品组合物。

图8是给动物接种疫苗的另一种示例性方法的示意图800。步骤810包括指导待接种疫苗的动物口服摄入根据一个实施方案的疫苗组合物。

图9是给动物接种疫苗的另一种示例性方法的示意图900。步骤910包括指导待接种疫苗的动物口服摄入根据一个实施方案的食品组合物。

图10是供应疫苗的示例性方法的示意图1000。初始步骤1010包括生产多个疫苗组合物，所述多个疫苗组合物中的每个疫苗组合物包括根据一个实施方案的疫苗组合物。稍后的步骤1012包括将多个疫苗组合物递送至个体，所述个体指定用于将多个疫苗组合物中的个别疫苗组合物递送至所述多个动物中的个别动物以达成给所述多个动物中的个别动物接种疫苗的目的。

图11是供应疫苗的示例性方法的示意图1100。初始步骤1110包括生产多个食品组合物，所述多个食品组合物中的每个食品组合物包括根据一个实施方案的食品组合物。稍后的步骤1112包括将多个食品组合物递送至个体，所述个体指定用于将多个食品组合物中的个别食品组合物递送至所述多个动物中的个别动物以达成给所述多个动物中的个别动物接种疫苗的目的。

图12是示例性试剂盒的示意图1200。试剂盒1200包括包装基材1210，如容器或材料片；安置于包装基材1210之上或之中的根据一个实施方案的疫苗组合物1212；视情况而定，以及说明书1214。说明书1314可以包括关于将疫苗组合物口服递送至动物的说明书、关于口服摄入疫苗组合物的说明书或两者。

图13是示例性试剂盒的示意图1300。试剂盒1300包括包装基材1310，如容器或材料片；安置于包装基材1310之上或之中的根据一个实施方案的食品组合物1312；视情况而定，以及说明书1314。说明书1314可以包括关于将食品组合物口服递送至动物的说明书、关于口服摄入食品组合物的说明书或两者。

实施例

图27-40中说明了各种实施例。

实施例1：H1/N1 eVLP生产

用编码人流感H1、N1和M1蛋白重组β-葡聚糖酶的核酸各自在诱导性启动子的控制下转化多形汉逊酵母细胞。将重组细胞在摇瓶中培养至约OD₆₀₀＝10并进行诱导。在诱导条件下培养重组细胞，并且在足够的时间后，通过离心分离培养基和细胞。收获细胞耗尽的培养基样品，在SDS-PAGE样品缓冲液中加热以使蛋白质变性，并且通过SDS-PAGE分级。将分级的蛋白质转移至印迹膜，并且探测H1、N1和M1蛋白的存在。结果显示培养基中有高水平的H1、N1和M1蛋白，从而指示培养基中eVLP的分泌很强。图14。

实施例2：HIV GAG-MS2 eVLP生产

图15说明了由本实施例中产生的构建体编码的eVLP的示意图。用编码HIV-GAG融合蛋白和EGFP-MS2 mRNA的核酸转化酵母细胞，在摇瓶中培养至约OD₆₀₀＝10并进行诱导。在诱导条件下培养重组细胞，并且诱导后从培养基中收获酵母细胞。还收获培养基以获得eVLP。RT-PCR分析确认了eVLP中EGFP mRNA的存在(图16)。回收的酵母细胞的显微镜检查展示了eVLP的分泌(图17)。纯化eVLP并且与树突细胞(DC)一起孵育。与DC一起孵育24小时后，荧光显微镜检查确认了DC中EGFP的产生(图18)。这些结果指示了DC吞噬eVLP并翻译EGFPmRNA以表达功能性EGFP。

还通过透射电子显微镜检查来分析作为粗培养物上清液(图19，左)和超速离心获得纯化的eVLP之后(图19，右)的eVLP。纯化的eVLP直径约为80至120nm，包膜厚度约为4.2nm。

实施例3：HIV GAG-GFP eVLP配制和口服施用

用如图23中所说明的构建体转化重组酵母细胞。将重组细胞在摇瓶中培养至约OD₆₀₀＝10，进行诱导，并且在诱导条件下培养。然后收获培养基用于配制。

图20说明了配制策略的示意图。简单地说，将收获的细胞悬浮于1.6％海藻酸盐溶液中，并且与CaCl₂溶液混合以形成微囊化的产生eVLP的酵母细胞。然后将微囊化材料转移至硅酸钠溶液，然后是1.5％海藻酸盐溶液，最后是CaCl₂溶液。所得材料产生直径约100μm的肠溶衣微球(图21)。

向四组(高剂量、中剂量、低剂量和盐水对照)中的BABL/c小鼠口服施用微球囊封的酵母细胞。结果展示了在施用高、中和低剂量的小鼠中可检测到GFP表达，但在施用盐水的小鼠中未检测到。检测到抗GFP血清抗体。诱导的抗GFP抗体浓度类似于施用标准H1可注射疫苗后20天获得的抗H1血清水平(图22)。

前述详细描述涉及各种适用于口服疫苗接种的示例性重组酵母、疫苗组合物、给动物接种疫苗的方法以及相关方法、试剂盒和核酸分子。说明这些各种实例的描述和附图仅意图提供发明人认为在其发明范围内的主题的实例，并且不意图以任何方式限制任何权利要求的范围。本文公开的所有公布、专利、专利申请和专利公布特此以全文引用的方式并入且用于达成所有目的，并且程度如同每个所公开的公布、专利、专利申请或专利公布特定地以引用的方式并入一样。

本文所描述的实施方案包括：

1.一种来源于野生型酵母细胞的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

编码调控性启动子的第一核酸序列；

编码VLP免疫原的第二核酸序列；以及

编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；

优选地其中所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的每一者包含所述野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列；并且

优选地其中所述第二和第三核酸序列的表达在所述调控性启动子的共同遗传控制下。

3.实施方案1的重组酵母细胞，其中所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的第一拷贝下游并在所述第一拷贝的遗传控制下，并且所述第三核酸序列位于所述第一核酸序列的第二拷贝下游并在所述第二拷贝的遗传控制下。

4.实施方案3的重组酵母细胞，其中所述第一核酸序列的所述第一拷贝和所述第二核酸序列与所述第一核酸序列的所述第二拷贝和所述第三核酸序列位于相同的核酸分子上。

5.实施方案3的重组酵母细胞，其中所述第一核酸序列的所述第一拷贝和所述第二核酸序列位于第一核酸分子上，并且所述第一核酸序列的所述第二拷贝和所述第三核酸序列位于第二核酸分子上；或者

前述实施方案中任一项的重组酵母细胞，其中所述酵母细胞包含细胞壁降解酶(例如，葡聚糖酶)、VLP基质蛋白和免疫原，任选地其中所述细胞壁降解酶和/或所述VLP基质蛋白，和/或所述细胞壁降解酶、VLP基质蛋白和免疫原中的每一者在可调控性启动子的控制下，并且任选地其中所述可调控性启动子中的一者或多者或每一者是相同的启动子、相同启动子的不同拷贝或不同的启动子。

6.实施方案1的重组酵母细胞，其中所述调控性启动子包括诱导性启动子，优选地其中所述调控性启动子包括阻抑性启动子；更优选地其中所述调控性启动子包括正阻抑性启动子。

7.实施方案2的重组酵母细胞，其中所述调控性启动子包括Tet-off调控性启动子。

8.实施方案1的重组酵母细胞，其中所述VLP免疫原包含一种或多种来自流感病毒的蛋白质，优选地其中所述VLP免疫原包含来自流感病毒的M1基质蛋白、血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白。

9.实施方案8的重组酵母细胞，其中所述VLP免疫原包含来自流感病毒的人流感M1基质、血凝素和神经氨酸酶蛋白。

10.实施方案1的重组酵母细胞，其中所述细胞壁降解酶包括葡聚糖酶，优选地其中所述细胞壁降解酶包括β-葡聚糖酶。

11.实施方案10的重组酵母细胞，其中所述细胞壁降解酶包括β-1,3-葡聚糖酶。

12.实施方案1的重组酵母细胞，其中所述细胞壁降解酶包括甘露聚糖酶。

13.实施方案1的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞还包含编码细胞壁抑制毒素的第四核酸序列；

其中所述第四核酸序列在所述野生型酵母细胞中不天然出现；优选地其中所述第二、第三和第四核酸序列的表达在所述调控性启动子的共同遗传控制下。

14.任何前述实施方案的重组酵母细胞，其中所述野生型酵母细胞包含酿酒酵母。

15.任何前述实施方案的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞是冷冻干燥的。

16.一种来源于野生型酵母细胞的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

编码调控性启动子的第一核酸序列；

编码一种或多种来自流感病毒的蛋白质的第二核酸序列；以及

编码葡聚糖酶的第三核酸序列；

优选地其中所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的每一者包含所述野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列；

17.一种来源于野生型酿酒酵母酵母细胞的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

编码Tet-off调控性启动子的第一核酸序列；

编码来自流感病毒的人流感M1基质、血凝素和神经氨酸酶蛋白的第二核酸序列；以及

编码葡聚糖酶的第三核酸序列；

18.一种来源于野生型酵母细胞的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

编码调控性启动子的第一核酸序列；

编码VLP免疫原的第二核酸序列；以及

编码细胞壁抑制毒素的第三核酸序列；

19.一种冷冻干燥的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞并且经过转化以包括编码VLP免疫原的核酸序列和编码细胞壁降解酶的核酸序列，所述核酸序列在调控性启动子的共同遗传控制下并且在所述野生型酵母细胞中不天然出现。

20.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：

界定腔体的可摄入容器；以及

来源于野生型酵母细胞并且安置于所述腔体中的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码VLP免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；

其中所述第二和第三核酸序列的表达在所述调控性启动子的共同遗传控制下。

21.实施方案20的疫苗组合物，其中所述可摄入容器包括胶囊。

22.实施方案21的疫苗组合物，其中所述胶囊是耐酸的，并且在口服施用后将基本上功能性的酵母和/或VLP递送至受试者的肠。

23.实施方案21的疫苗组合物，其中所述胶囊界定一个或多个孔，例如，固体胶囊中可以经过诱导以释放细胞和/或VLP的孔，如机械可诱导的孔。

24.实施方案20的疫苗组合物，其中所述重组酵母细胞包括实施方案1至19中任一项的重组酵母细胞。

25.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：

界定腔体的可摄入胶囊；以及

来源于野生型酵母细胞并且安置于所述腔体中的冷冻干燥的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码VLP免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；

26.一种食品组合物，所述食品组合物包含：

至少一种食料；以及

至少一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含

界定腔体的可摄入容器；以及

安置于所述腔体中的重组酵母细胞，或多个重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码VLP免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；

所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的每一者包含所述野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列；并且

所述第二和第三核酸序列的表达在所述调控性启动子的共同遗传控制下。

27.实施方案26的食品组合物，其中所述可摄入容器包括已经喷施至所述重组酵母细胞上或所述多个酵母细胞上的聚合外壳。

28.实施方案27的食品组合物，其中所述至少一种疫苗组合物包含多于一种疫苗组合物。

29.实施方案26的食品组合物，其中所述多于一种疫苗组合物中的每种疫苗组合物的所述可摄入容器包括已经喷施至所述重组酵母细胞上的聚合外壳。

30.实施方案26的食品组合物，其中所述食料包含面粉、小麦、糖、黄油、面包、面团、肉、水果或其部分和蔬菜或其部分中的一者或多者。

31.实施方案26的食品组合物，其中所述食品组合物呈曲奇饼、糖果、小吃棒、饼干、薄饼、糕或饮料的形式。

32.一种食品组合物，所述食品组合物包含：

至少一种食料；以及

多种疫苗组合物，所述多种疫苗组合物中的每种疫苗组合物包含界定腔体的聚合外壳；以及

安置于所述腔体中的多个重组酵母细胞，所述多个重组酵母细胞中的每个重组酵母细胞包含编码调控性启动子的第一核酸序列、编码VLP免疫原的第二核酸序列以及编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；

33.一种食品组合物，所述食品组合物包含至少一种食料和包含多个重组酵母细胞的疫苗组合物，所述重组酵母细胞安置于由聚合外壳界定的腔体中，所述多个重组酵母细胞中的每个重组酵母细胞来源于野生型酵母细胞并且经过转化以包括编码VLP免疫原的核酸序列和编码细胞壁降解酶的核酸序列，所述核酸序列在调控性启动子的共同遗传控制下并且在所述野生型酵母细胞中不天然出现。

34.实施方案33的食品组合物，其中所述多个重组酵母细胞中的每个重组酵母细胞是冷冻干燥的。

35.一种给动物接种疫苗的方法，所述方法包括向所述动物口服递送根据一个实施方案的疫苗组合物。

36.一种给动物接种疫苗的方法，所述方法包括向所述动物口服递送根据一个实施方案的食品组合物。

37.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

包装基材；

根据实施方案20的疫苗组合物；

以及关于使用所述疫苗组合物的说明书。

38.实施方案37的试剂盒，其中所述包装基材包括材料片。

39.实施方案38的试剂盒，其中所述疫苗组合物安置于所述包装基材上。

40.实施方案39的试剂盒，其中所述疫苗组合物紧固至所述包装基材。

41.实施方案40的试剂盒，所述试剂盒还包括将所述疫苗组合物紧固至所述包装基材的收缩包裹材料。

42.实施方案37的试剂盒，其中所述包装基材包括容器。

43.实施方案37的试剂盒，其中所述关于使用所述疫苗组合物的说明书包括关于向动物口服施用所述疫苗组合物的说明书。

44.实施方案37的试剂盒，其中所述关于使用所述疫苗组合物的说明书包括关于口服摄入所述疫苗组合物的说明书。

45.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

包装基材；

根据实施方案26的食品组合物；

以及关于使用所述食品组合物的说明书。

46.实施方案45的试剂盒，其中所述包装基材包括材料片。

47.实施方案46的试剂盒，其中所述食品组合物安置于所述包装基材上。

48.实施方案47的试剂盒，其中所述食品组合物紧固至所述包装基材。

49.实施方案48的试剂盒，所述试剂盒还包括将所述食品组合物紧固至所述包装基材的收缩包裹材料。

50.实施方案45的试剂盒，其中所述包装基材包括容器。

51.实施方案45的试剂盒，其中所述关于使用所述食品组合物的说明书包括关于向动物口服施用所述食品组合物的说明书。

52.实施方案45的试剂盒，其中所述关于使用所述食品组合物的说明书包括关于口服摄入所述食品组合物的说明书。

53.一种来源于野生型酵母细胞的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

编码调控性启动子的第一核酸序列；

编码Gag-MS2融合蛋白的第二核酸序列；

编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；以及

编码非翻译的MS2结合序列和抗原的第四核酸序列；

优选地其中所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和所述第四核酸序列中的每一者包含所述野生型酵母细胞中不天然出现的核酸序列；并且

54.实施方案53的重组酵母细胞，其中所述第二、第三和第四核酸序列的表达在所述调控性启动子的共同遗传控制下。

55.实施方案53的重组酵母细胞，其中所述第四核酸序列来源于流感病毒、RSV和HIV之一。

56.一种来源于野生型酵母细胞的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

编码调控性启动子的第一核酸序列；

包含副流感5NP、V/P和L基因中的每一者的至少一部分并且缺乏选自由M、F、SH和HN组成的组的副流感5基因中的一者或多者的第二核酸序列；

编码细胞壁降解酶的第三核酸序列；以及

编码抗原的第四核酸序列；

57.实施方案56的重组酵母细胞，其中所述第二、第三和第四核酸序列的表达在所述调控性启动子的共同遗传控制下。

58.实施方案56的重组酵母细胞，其中所述第四核酸序列来源于除副流感5以外的病毒。

59.实施方案58的重组酵母细胞，其中所述第四核酸序列来源于流感病毒、RSV和HIV之一。

Claims

1.一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：

-与编码细胞壁透化剂的核酸序列可操作连接的异源可调控性启动子；以及

-与编码免疫原或其组分的核酸序列可操作连接的异源启动子，并且任选地还包含

-与编码病毒基质蛋白或其功能片段、病毒衣壳蛋白或其功能片段、或病毒结构蛋白或其功能片段的核酸序列可操作连接的异源启动子。

2.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原包含VLP的组分。

3.如权利要求2所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原包含VLP的结构组分。

4.如权利要求3所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原包含衣壳蛋白或其功能片段。

5.如权利要求3所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原包含基质蛋白或其功能片段。

6.如权利要求2所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原包含与核酸结合肽融合的VLP组分，优选地其中所述结合肽包含MS2肽序列。

7.如权利要求6所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞还包含含有包含核酸结合肽配体序列的区域和编码抗原的区域的核酸序列，优选地其中所述核酸结合肽配体序列包含MS2配体序列。

8.如权利要求2所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原包含嵌入eVLP的脂质双层中的抗原。

9.如权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞包含编码VLP的结构组分的核酸序列和编码嵌入由所述结构VLP组分形成的eVLP的脂双层中的抗原的核酸序列。

10.如权利要求1至9中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述免疫原和细胞壁透化剂在共同遗传控制下。

11.如权利要求1至10中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述细胞壁透化剂是β-葡聚糖酶。

12.如权利要求11所述的重组酵母细胞，其中所述β-葡聚糖酶是β-1-3-葡聚糖酶。

13.如权利要求12所述的重组酵母细胞，其中所述β-1-3-葡聚糖酶包含由SEQ ID NO.1编码的分泌蛋白序列，或其中所述β-1-3-葡聚糖酶包含SEQ ID NO.10的至少100个连续氨基酸或全部。

14.如权利要求12所述的重组酵母细胞，其中所述β-1-3-葡聚糖酶与由SEQ ID NO.1编码的分泌蛋白序列至少95％或至少99％相同，或其中所述β-1-3-葡聚糖酶与SEQ ID NO.10的至少100个连续氨基酸或全部至少95％相同。

15.如权利要求12所述的重组酵母细胞，其中相对于由SEQ ID NO.1编码的蛋白质或以SEQ ID NO.10列出的多肽序列，所述β-1-3-葡聚糖酶包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。

16.如权利要求1至10中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述细胞壁透化剂是几丁质酶。

17.如权利要求16所述的重组酵母细胞，其中所述几丁质酶包含由SEQ ID NO.4编码的分泌蛋白序列，或其中所述几丁质酶包含SEQ ID NO.12的至少100个连续氨基酸或全部。

18.如权利要求16所述的重组酵母细胞，其中所述几丁质酶与由SEQ ID NO.4编码的分泌蛋白序列至少95％或至少99％相同，或其中所述几丁质酶与SEQ ID NO.12的至少100个连续氨基酸或全部至少95％相同。

19.如权利要求16所述的重组酵母细胞，其中相对于由SEQ ID NO.4编码的蛋白质序列或以SEQ ID NO.12列出的多肽序列，所述几丁质酶包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。

20.如权利要求1至10中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述细胞壁透化剂是细胞壁抑制毒素，例如由SEQ ID NO.5编码，包含由SEQ ID NO.5编码或以SEQ ID NO.23列出的蛋白质序列，与由SEQ ID NO.5编码或以SEQ ID NO.23列出的分泌蛋白序列至少95％或至少99％相同，或相对于由SEQ ID NO.5编码或以SEQ ID NO.23列出的蛋白质序列包含不超过1、2、3、4或5个单氨基酸取代、缺失和/或添加。

21.一种用于生产疫苗组合物的方法，所述方法包括：

-在调控性启动子阻抑可操作连接的核酸序列表达的条件下在培养基中培养根据权利要求1至20中任一项所述的重组酵母细胞；以及

-诱导与异源可调控性启动子可操作连接的核酸的表达，从而透化所述重组酵母细胞。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述方法包括在所述培养的至少一部分中诱导与所述异源可调控性启动子可操作连接的所述核酸的表达，以及：

从所述培养基中收获所述透化的重组酵母细胞；或者

从所述培养基中收获免疫原。

23.如权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述方法包括收获所述重组酵母细胞、透化的重组酵母细胞或免疫原并且由此形成疫苗组合物。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述方法包括冷冻干燥收获的重组酵母细胞或透化的重组酵母细胞并且由此形成所述疫苗组合物。

25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括将食料与所述疫苗组合物混合。

26.一种用于制造包含重组酵母细胞的疫苗组合物的方法，所述方法包括：

-提供根据权利要求1至20中任一项所述的重组酵母细胞；以及

-将所述重组酵母细胞与药学上可接受的赋形剂或食料混合。

27.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含根据权利要求1至20中任一项所述的重组酵母细胞和药学上可接受的赋形剂或食料。

28.一种向受试者施用疫苗的方法，所述方法包括：

-提供根据权利要求27所述的疫苗组合物；以及

-口服施用所述疫苗组合物。