CN103275186A

CN103275186A - 具有肾脏保护作用的多肽及其应用

Info

Publication number: CN103275186A
Application number: CN2013102272843A
Authority: CN
Inventors: 朱同玉; 龙亚秋; 戎瑞明; 杨橙; 许忠良; 李龙
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-07
Also published as: CN103275186B

Abstract

本发明提供了一种具有肾脏保护作用的多肽，其特征在于，其序列的结构通式为：X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-R₂，其中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀和X₁₁独立地为L-或D-型的天然碱性、酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，所述的氨基酸选自Cys、Ser、Asn、Leu、Ala、Arg、Glu和Gln，R₂为氢或氨基。本发明可用于治疗肾缺血再灌注损伤。

Description

具有肾脏保护作用的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及五类具有肾脏保护作用的化学修饰肽，其主要功能序列来源于促红细胞生成素(EPO)B螺旋的表面，通过化学结构修饰提高其体内代谢稳定性。

背景技术

肾脏缺血缺氧导致能量代谢不足、腺苷三磷酸(ATP)过度耗竭，再灌注过程又产生大量氧自由基，两者均可导致肾小管上皮细胞调亡，使肾功能严重受损。同时，在缺血过程中，大量炎症细胞募集至肾小管间质内，释放各种炎性介质，不仅造成肾组织直接损伤，也可引起肾血管内皮细胞损伤和免疫原性增强，并进一步导致免疫性血管损伤。临床上引起肾脏缺血再灌注(Ischemia reperfusion，IR)损伤的原因主要有心血管疾病、脓毒症、创伤、外科手术等。而近来随着肾移植手术逐渐增加，移植肾的缺血再灌注损伤可导致其功能延迟恢复甚至慢性移植物肾病，严重影响手术效果和病人预后。虽然近年来肾脏缺血再灌注损伤的实验及临床研究不断深入，许多具有肾脏保护作用的药物被开发出来，但总体上疗效均不确切。

EPO在临床上广泛应用于纠正尿毒症患者的肾性贫血。近年来研究显示，EPO在肾脏组织局部与受体结合后，可通过多条信号途径抑制半胱天冬酶(Caspase)活化、维持线粒体膜电位、维持糖酵解及腺苷三磷酸(ATP)合成，减少肾小管上皮细胞凋亡。此外，研究证实EPO亦能下调缺血再灌注损伤后肾组织局部的白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及Toll样受体-4(TLR-4)等炎症因子的表达，明显抑制缺血后肾小管间质炎细胞浸润，并通过NF-κB途径下调肾组织局部炎症反应。虽然EPO显示出良好的肾组织保护作用，但其在临床上促红细胞的治疗应用中亦具有增加血粘度、促进血栓形成及导致高血压等不良反应。而研究发现，EPO的组织保护作用呈剂量依赖性，且明显高于其发挥促红作用的所需剂量，这使其不良反应发生的概率大大增加。因此，如何既保留EPO的组织保护效应又避免促红作用带来的不良反应已成为其能否应用于临床的关键。

最近，Brines等基于EPO及其受体相互作用的结构分析，在EPO的B螺旋亚基亲水表面挑选出11个氨基酸残基合成线型多肽(Helix B surface peptide，HBSP，序列见图1)。HBSP在动物模型中显示出良好的组织保护作用，且无促红细胞生成的副作用。进一步机理研究表明，HBSP可通过抑制细胞凋亡和炎症反应发挥肾脏缺血再灌注损伤的保护功能。然而，线性肽HBSP在血浆内易被肽酶降解，其半衰期仅有约2min，极大地限制其临床应用。

构像约束的结构修饰是提高多肽对酶解抵抗性的有效手段，而且环化既能稳定活性肽的优势构像，又能提高选择性。本发明选取硫醚环合策略来构建HBSP环肽，且硫醚键可进一步氧化为相对刚性的亚砜键。这两种环合策略既能稳定肽的二级结构，又具有一定的柔韧性，在提高酶解抵抗性的同时，可以保持或提高肽配体与受体的亲和力。另一方面，相对简单的全D-氨基酸取代以及N-端加帽(N-Capping)也可有效增加肽链的代谢稳定性。因此在本发明中采用以上3种策略对线性HBSP进行结构修饰(图1)，并在大/小鼠肾缺血再灌注损伤模型中评估其活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供具有肾脏保护作用的化学修饰肽及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种具有肾脏保护作用的多肽，其特征在于，其序列的结构通式为：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-R₂ (I)，

其中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀和X₁₁独立地为L-或D-型的天然碱性、酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，所述的氨基酸选自Cys、Ser、Asn、Leu、Ala、Arg、Glu和Gln，R₂为氢或氨基。

优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

q-e-q-l-e-r-a-l-n-s-s-R₂，

其中，R₂为氢或氨基。

更优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

q-e-q-l-e-r-a-l-n-s-s-NH₂。

(All D-HBSP)

本发明还提供了一种具有肾脏保护作用的多肽，其特征在于，其序列的结构通式为：

R₁-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-R₂ (II)，

其中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁和X₁₂独立地为L-或D-型的天然碱性、酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，所述的氨基酸选自Cys、Ser、Asn、Leu、Ala、Arg、Glu和Gln，R₁为胺或者季铵盐，R₂为氢或氨基。

优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

R₁-Q-E-Q-L-E-R-A-L-N-S-S-C-R₂，

其中，R₁为胺或者季铵盐，R₂为氢或氨基。

更优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

环(X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂)-R₂ (III)

其中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁和X₁₂独立地为L-或D-型的天然碱性、酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，所述的氨基酸选自Cys、Ser、Asn、Leu、Ala、Arg、Glu和Gln，R₂为氢或氨基。

优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

环(Q-E-Q-L-E-R-A-L-N-S-S-C)-R₂，

其中，R₂为氢或氨基。

更优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

更优选地，所述的具有肾脏保护作用的多肽的序列为：

本发明所涉及的多肽可以通过下列方法获得，其包括用已知的液相合成法和固相合成法。同时本发明在原有的通用合成方法上进行了改进，使合成更加稳定可靠，易于操作，制备效率高。

本发明还提供了上述各种具有肾脏保护作用的多肽在制备治疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、提供了一种防治肾缺血再灌注损伤的新型临床候选药物，为肾移植病人带来福音；

2、为短肽类药物，生物活性高，安全性好；

3、转化为药物容易，应用前景光明；

4、适应症具有很强的可拓展性。

附图说明

图1为来源于EPO的B螺旋功能域的亲水表面同侧的11个氨基酸肽链(HBSP)，

以及本发明基于HBSP序列设计的三种类型结构修饰肽结构图；

图2为多肽的合成路线图；

图3为亚砜环肽SO-CHBP的圆二色谱CD图，其中，虚线D为硫醚环肽TE-CHBP，C为亚砜环肽(R)-SO-CHBP，E为亚砜环肽(S)-SO-CHBP，A线为亚砜((R)-SO-CHBP)对硫醚(TE-CHBP)做的差谱；B线为亚砜((S)-SO-CHBP)对硫醚(TE-CHBP)做的差谱；

图4为3个环肽在大鼠肾缺血再灌注损伤后对肾功能的影响(**：p＜0.01)。

图5为HBSP衍生肽在小鼠肾缺血再灌注损伤后对肾功能的影响(*：p＜0.05；**：p＜0.01)

图6为HBSP及硫醚环肽在人血浆中的稳定性图；

图7为HBSP及硫醚环肽在人肝细胞中的稳定性图；

图8为CHBP在再灌注6小时至48小时对肾功能的影响图；

图9为H&E染色及组织损伤评分图；

图10为TUNEL染色及细胞计数图；

图11为MPO染色及细胞计数图；

图12为肾脏内IL-6和RORγt mRNA表达图。

具体实施方式

本发明所涉及的Rink Amide-MBHA resin、HBTU、HOBt、DIC、EDT、Fmoc保护的氨基酸均购于上海吉尔化工，TFA、DIEA、TEA等试剂均通过购买获得。

本发明所使用的缩写具有以下含义：

EPO 促红细胞生成素 ATP 腺苷三磷酸

IR 缺血再灌注 IL-1 白介素1

IL-6 白介素6 TNF-α 肿瘤坏死因子α

MCP-1 巨噬细胞趋化蛋白-1 TLR-4 Toll样受体-4

N-Cap N-端加帽 Cys(C) 半胱氨酸

Ser(S) 丝氨酸 Asn(N) 天冬酰胺

Leu(L) 亮氨酸 Ala(A) 丙氨酸

Arg(R) 精氨酸 Glu(E) 谷氨酸

Gln(Q) 谷氨酰胺 DMF N，N-二甲基甲酰胺

HBTU 苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐

DIEA N，N-二乙基丙胺 HOBt 1-羟基苯并三唑

DIC 二异丙基碳二亚胺 TFA 三氟乙醇

EDT 1，2-乙二硫 TEA 三乙胺

Fmoc- 芴甲氧羰酰基 RP-HPLC 反相高效液相色谱

PBS 磷酸缓冲溶液 Trt 三苯甲基

t-Bu 叔丁基 MeCN 乙腈

pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

Scr 血清肌酐 BUN 血尿氮素

MPO 过氧化物酶 PCR 多聚酶链式反应

ESI-MS 电喷雾质谱

本发明中，所有氨基酸构型除注明为D-型外，均为L-型。

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1：目标多肽及其制备：

1、试剂与仪器

化合物的合成采用CEM Liberty1微波多肽合成仪和人工合成两种方式，多肽产物通过反相高效液相色谱分离纯化(RP-HPLC Waters 1525\2489\2707)，结构通过质谱ESI-MS鉴定，采用Finnigan LCQ Deca mass spectrometer测定。目标化合物的纯度都大于95％，采用双溶剂系统高效液相色谱进行多肽纯度分析(系统1，溶剂组成A：0.05％TFA水溶液，B：0.05％TFA乙腈溶液；系统2，溶剂组成A：0.05％TFA水溶液，C：0.05％TFA甲醇溶液)。制备柱型号为：Vydac C18，120A(10×250mm)；XBridgeTM C18，5μM，19×150mm，225nm或210nm处紫外检测；分析柱型号为：SunfireTM，C18，3.5μM，4.6×150mm，225nm或210nm处紫外检测。圆二色光谱用Jacso J-810测得，使用光径为1mm石英池，PBS(pH7.4)缓冲溶液作溶剂。

所用树脂为Rink Amide-MBHA resin，天然和非天然氨基酸均采用N-Fmoc保护，边链采用对酸敏感保护基：Gln(Trt)，Glu(tBu)，Arg(pbf)，Ser(tBu)，Cys(Trt)。HBTU/DIEA作为偶联反应活化剂，DMF作为偶联反应溶剂；20％哌啶/DMF(v/v)和0.1N HOBt作为脱N-Fmoc试剂；TFA：EDT：H₂O(95％：2.5％：2.5％)作为切除树脂和脱边链保护基的裂解混合液(Cleavage cocktail)。

2、HBSP衍生肽的合成：

(1)All D-HBSP的合成：

L-和D-构型氨基酸开链肽由CEM Liberty 1 Peptide Synthesizer合成得到，从Rink Amide-MBHA resin树脂(0.1mmol)出发，采用微波反应(37W，75℃)去N-端保护基，偶联反应的微波功率设定为27W，温度为50℃，时间为300s。

合成反应管中依次加入1ml 0.2mmol/ml的Fmoc-Cys(Mmt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH。

试剂瓶中加入2.5当量的HBTU/DIEA作为偶联反应活化剂，3ml DMF作为偶联反应溶剂；5ml 20％哌啶/DMF(v/v)和0.1N HOBt作为脱N-Fmoc试剂，整个合成过程由CEM Liberty 1 Peptide Synthesizer合成得到。

后处理及其纯化：

裂解前的准备：将CEM Liberty 1 Peptide Synthesizer合成得到的树脂依次用DMF(共清洗6次，每次2ml)，DCM(共清洗6次，每次2ml)，MeOH(共清洗6次，每次2ml)，DCM(共清洗6次，每次2ml)清洗，清洗后的树脂真空干燥。

裂解：将裂解试剂5ml(由体积比为7.6∶0.2∶0.2的TFA、TES和H₂O组成)加入到干燥的树脂中，室温下振摇2小时。过滤，收集滤液，用5ml的TFA清洗树脂，合并滤液。滤液在氮气下浓缩到1-2ml，即为多肽浓缩液。将25ml O℃的冷乙醚加入到多肽浓缩液中，有大量固体析出。离心8分钟(3000r/s)。将上清液小心倒出，再加入0℃的冷乙醚，反复此步骤3次，冷冻干燥析出的固体，就得到多肽粗品。

纯化：使用反相高效液相色谱法纯化多肽。液相条件：溶剂系统：0.05％TFA水溶液；B：0.05％TFA乙腈溶液。分离多肽经冷冻干燥得纯品。

All D-HBSP：ESI-MS m/z：calcd 1273.7(M+H)⁺，found 1273.8；tR＝13.10min(10-90％ of solvent B over 30 min，purity 98.4％)；tR＝21.90min(10-90％ ofsolvent C over 30min，purity 98.8％)。

N-Cap-HBSP的合成：

由CEM Liberty 1 Peptide Synthesizer合成得到，从Rink Amide-MBHA resin树脂(0.1mmol)出发，采用微波反应(37W，75℃)去N-端保护基，偶联反应的微波功率设定为27W，温度为50℃，时间为300s。

试剂瓶中加入2.5当量的HBTU/DIEA作为偶联反应活化剂，3ml DMF作为偶联反应溶剂；5ml20％哌啶/DMF(v/v)和O.1N HOBt作为脱N-Fmoc试剂，整个合成过程由CEM Liberty 1 Peptide Synthesizer合成得到。

将合成好的脱去末端Fmoc保护的氨基酸树脂转移到相应的反应釜中，DMF洗后，加入5ml DMF，2.5eq的氯乙酸酐，2.5eq的DIC，与摇床上反应6h，得到末端乙酰化的树脂多肽。

裂解前的准备：将末端乙酰化的树脂多肽依次用DMF(共清洗6次，每次2ml)，DCM(共清洗6次，每次2ml)清洗，清洗后真空干燥。

裂解：将裂解试剂5ml(由体积比为95∶2.5∶2.5的TFA、EDT和H₂O组成)加入到真空干燥后的末端乙酰化的树脂多肽中，30℃下振摇2小时。过滤，收集滤液，用5ml的TFA清洗树脂，合并滤液。滤液在氮气下浓缩到1-2ml，得到多肽浓缩液。

离心：将25ml0℃的冷乙醚加入到多肽浓缩液中，有大量固体析出。离心8分钟(3000r/s)。将上清液小心倒出，再加入0℃的冷乙醚，反复此步骤3次，冷冻干燥析出的固体，就得到多肽粗品。

将上述粗品溶于体积比为1∶1比例的H₂O/MeCN中，使其最终浓度为10^-2M浓度，加入10当量的N-甲基吗啡啉，用Na₂CO₃将pH至调到10，油浴加热下65℃反应6小时，将溶液冷冻干燥得粗品。

纯化：使用反相高效液相色谱法纯化多肽。液相条件：溶剂系统：0.05％TFA水溶液；B：0.05％TFA乙腈溶液。分离多肽经冷冻干燥。得到N-端4-甲基-4-(2-氧乙基)吗啡啉-4-鎓加帽的衍生肽N-Cap-HBSP：ESI-MS m/z：calcd 1517.7(M)⁺，found 1517.5；tR＝11.46min(10-90％ of solvent B over 30 min，purity 97.4％)；tR＝22.40min(10-90％ of solvent C over 30 min，purity 96.8％).

TE-CHBP的合成：

如图2所示，由CEM Liberty 1 Peptide Synthesizer合成得到，从RinkAmide-MBHA resin树脂(O.1mmol)出发，采用微波反应(37W，75℃)去N-端保护基，偶联反应的微波功率设定为27W，温度为50℃，时间为300s。

合成反应管中依次加入1ml 0.2mmol/ml的Fmoc-Cys(Mmt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(pbO-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH。

裂解前的准备：将所述的末端乙酰化的树脂多肽依次用DMF(共清洗6次，每次2ml)，DCM(共清洗6次，每次2ml)清洗，清洗后真空干燥。

裂解：将裂解试剂5ml(由体积比为95∶2.5∶2.5的TFA、EDT和H₂O组成)加入到真空干燥后的树脂多肽中，30℃下振摇2小时。过滤，收集滤液，用5ml的TFA清洗树脂，合并滤液。滤液在氮气下浓缩到1-2ml，得到多肽浓缩液。

离心：将25ml0℃的冷乙醚加入到多肽浓缩液中，有大量固体析出。离心8分钟(3000r/s)。将上清液小心倒出，再加入0℃的冷乙醚，反复此步骤3次，合并析出固体，就得到多肽粗品。

环化：将上述粗品溶于体积比为1∶1比例的H₂O/MeCN中，使其最终浓度为10^-2M浓度，加入TEA将pH至调到10，微波下75℃反应(也可油浴加热下65℃反应)20min，既得到环合的硫醚，将溶液冷冻干燥得粗品。

纯化：使用反相高效液相色谱法纯化多肽。液相条件：溶剂系统：0.05％TFA水溶液；B：0.05％TFA乙腈溶液。分离多肽经冷冻干燥。得产品TE-CHBP：ESI-MS m/z：calcd 1416.7(M+H)⁺，found 1416.8；tR＝15.01min(10-90％solvent B over 30 min，purity 98.9％)；tR＝25.12min(10-90％solvent C over 30min，purity 98.4％)。(图2)

SO-CHBP的合成：

如图2所示，将上述制备的硫醚环肽TE-CHBP溶解于2ml5％的H₂O₂水溶液，室温搅拌反应6h，经RP-HPLC纯化，冷冻干燥得到亚砜环肽(R)-SO-CHBP和(S)-SO-CHBP。(R)-SO-CHBP：ESI-MS m/z：calcd 1432.6(M+H)⁺，found 1432.7；tR＝14.011min(10-90％solvent B over 30 min，purity 99.3％)；tR＝24.993min(10-90％solvent C over 30 min，purity 99.8％).(S)-SO-CHBP：ESI-MS m/z：calcd1432.6(M+H)⁺，found 1432.7；tR＝14.044min(10-90％solvent B over 30 min，purity 98.4％)；tR＝25.025min(10-90％ solvent C over 30 min，purity 99.0％)(图2)。

亚砜环肽构型的鉴定

由于亚砜具有手性，所以由硫醚环肽TE-CHBP氧化得到的亚砜环肽SO-CHBP是2个非对映异构体，经RP-HPLC分离可得到两个组分(R)-SO-CHBP(极性较大)和(S)-SO-CHBP(极性较小)。亚砜在220nm处，存现负cotton效应(-)为R构型；存现正cotton效应(+)为S构型。从CD谱图(图3)可以看出线A代表的(R)-SO-CHBP在220nm处为负cotton效应，故为R构型；线B代表的(S)-SO-CHBP在220nm处为正cotton效应，为S构型。

本发明以HBSP为对比，研究了5类多肽对肾脏的保护作用，具体实验如下：实施例2：代谢稳定性结构修饰的HBSP衍生肽对大/小鼠肾缺血再灌注损伤后肾功能的作用评估

a、清洁级雄性SD大鼠(200-250g)及SPF级雄性BALB/C小鼠(20-25g)均购自上海斯莱克实验动物有限公司。大鼠随机分为6组，分别为假手术(Sham)组、缺血再灌注(IR)对照组、HBSP治疗组、TE-CHBP治疗组、(S)-SO-CHBP治疗组和(R)-SO-CHBP治疗组，每组6只。小鼠随机分为7组，分别为缺血再灌注(IR)对照组、HBSP治疗组、All D-HBSP治疗组、N-Cap-HBSP治疗组、TE-CHBP治疗组、(S)-SO-CHBP治疗组和(R)-SO-CHBP治疗组，每组6只。

b、大/小鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立。简言之：腹腔注射1％戊巴比妥钠(生理盐水稀释)50mg/kg(购自上海中山医院实验动物实验中心)麻醉，麻醉成功后固定于平板上，沿中线切开腹壁进入腹腔，仔细分离暴露右侧肾脏及肾蒂，予无损伤血管夹夹闭肾蒂，同法处理左侧肾脏及肾蒂。肾蒂血管阻断(大鼠45min，小鼠30min)，肾脏颜色变紫黑说明血流阻断成功，松开血管夹后肾脏出现花斑样改变，颜色逐渐变红，说明血流灌注恢复。假手术组仅予分离双侧肾脏及肾蒂，不予夹闭。

c、对于大鼠肾缺血再灌注损伤模型，HBSP治疗组、TE-CHBP治疗组、(S)-SO-CHBP治疗组和(R)-SO-CHBP治疗组于肾血流灌注恢复后即刻腹腔分别给予8nmol/kg的HBSP、TE-CHBP、(S)-SO-CHBP和(R)-SO-CHBP1次，缺血再灌注(IR)对照组相应给予等量生理盐水。对于小鼠肾缺血再灌注损伤模型，HBSP治疗组、All D-HBSP治疗组、N-Cap-HBSP治疗组、TE-CHBP治疗组、(S)-SO-CHBP治疗组和(R)-SO-CHBP治疗组于肾血流灌注恢复后即刻腹腔分别给予8nmol/kg的HBSP、All D-HBSP、N-Cap-HBSP、TE-CHBP、(S)-SO-CHBP和(R)-SO-CHBP1次，缺血再灌注(IR)对照组相应给予等量生理盐水。

d、术后48h取血标本，4500rpm/min离心20min，取血清予日立全自动生化分析仪检测血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平。

实验结果：

本发明首先测定了3个环肽TE-CHBP、(R)-SO-CHBP和(S)-SO-CHBP在大鼠肾缺血再灌注损伤模型上对肾功能的影响。结果如图4所示，再灌注后48h，IR组肾功能明显受损，血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)含量IR组明显高于Sham组，而HBSP组则明显低于IR组。更为重要的是，3个环肽组的Scr及BUN均显著低于IR组，而硫醚环肽和(R)-构型亚砜环肽较HBSP肾功能保护作用更强，且(R)-构型亚砜环肽的活性优于(S)-构型。另外，硫醚环肽组Scr及BUN显著低于(S)-构型亚砜环肽组，亦轻微低于(R)-构型亚砜环肽组，但无统计学差异，因此硫醚环肽的肾脏功能保护活性可能优于亚砜环肽(图4)。这些结果表明，运用构像约束策略对线性多肽HBSP进行结构修饰以提高其代谢稳定性是有效的。一方面，环肽的酶解稳定性得到提高；另一方面，构像约束也有利于配体与受体的结合，因此，两方面因素共同使环肽对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用较之开链肽HBSP显著增强。

本发明进一步在小鼠肾缺血再灌注损伤模型上，测试了5个衍生肽对肾功能的影响(图5)。所有肽均显著降低了Scr和BUN，相对于线性肽链HBSP，5个肽都显示出增强的肾脏保护作用。在血清肌酐Scr上，硫醚环肽仍然表现出优越于亚砜环肽的肾功能保护活性，提示刚性较强的亚砜环合键可能变动了必需氨基酸边链的空间朝向，导致其活性有所降低。比较有意思的是，全D-构型的线性肽也具有很好的肾脏功能保护作用，主要源于其增强的酶解抵抗性，其构像的柔韧性可能有助于关键氨基酸残基边链朝向于适合与受体蛋白相互作用的位置。这提示本发明今后在环肽的结构优化设计上增加其柔韧性可能有利于其活性的进一步提升。

本发明以硫醚环肽为例，进一步比较了其与线性HBSP的稳定性，具体实验如下：

实施例3硫醚环肽与HBSP的血浆半衰期测定

a.选用含有0.2μM和1μM浓度的HBSP和硫醚环肽CHBP的正常人血浆(来自健康志愿者)，在37℃孵育。

b.在不同时间点提取50ul血浆样本后，加入150ul乙醇终止反应

e.利用质谱分析检测HBSP和硫醚环肽的含量。此项检测设置了3次平行实验。

实验结果：

HBSP在60分钟后基本均降解，其半衰期未超过10分钟，但是硫醚环肽5小时后仍以原性形式存在，表明其在血浆中是稳定的(图6)。

实施例4硫醚环肽与HBSP在人肝微粒体中的半衰期测定

a.选用100μl浓度为6μM的HBSP和100μl浓度为6μM的硫醚环肽分别与100μl正常人肝细胞悬液(购自In Vitro Technologies，Victoria，Australia)(2×10⁶个/ml)在37℃孵育。

b.在不同时间点提取样本后，加入200μl乙腈终止反应。

c.利用质谱分析检测HBSP和硫醚环肽的含量。此项检测设置了3次平行实验。

实验结果：

HBSP的半衰期是96.25分钟，而硫醚环肽则为247.5分钟，表明硫醚环肽经肝细胞的代谢较HBSP明显减慢(图7)。

实施例5硫醚环肽在小鼠缺血再灌注损伤中的保护作用

本发明通过小鼠缺血再灌注损伤模型，多时间点取样评估硫醚环肽(图中简称CHBP)在整个缺血再灌注的损伤-修复期的作用。

a.实验分组：小鼠随机分为两组，IR+CHBP治疗组和缺血再灌注(IR)对照组，每组6只。小鼠缺血再灌注损伤模型建立同实施例2。IR+CHBP治疗组于肾血流灌注恢复后即刻腹腔分别给予8nmol/kg的CHBP1次，缺血再灌注(IR)对照组相应给予等量生理盐水。

b.取标本时间为再灌注后6、12、24小时及5、7天。

e.肾功能测定：术后于上述时间点取血标本，4500rpm/min离心20min，取血清予日立全自动生化分析仪检测血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平。

d.石蜡包埋的组织标本处理：由小鼠体内切取的肾脏按长轴对半切开，取其中一半放入4％中性甲醛溶液中4℃固定24小时。次日对组织行脱水处理，依次浸泡50％乙醇90min，70％乙醇90min，85％乙醇90min，95％乙醇90min，100％乙醇60min，另一100％乙醇60min。然后使组织透明，依次浸泡乙醇和二甲苯混合溶液(体积比1∶1)60min，二甲苯60min，另一二甲苯60min。接着在62℃的二甲苯和石蜡的混悬液(体积比1∶1)中浸泡90min，再依次在2瓶不同的62C的石蜡液中各浸泡120min。将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却，冷却完毕后，切4μm的薄片，放入漂片机中展开，再将切片捞于多聚赖氨酸附膜载玻片上，记号笔做好编号，70℃干烤1小时，组织片与载玻片贴紧后再于60℃烘箱烘烤5小时，完成后拿出备用。

e.H&E染色评价肾脏组织结构损伤：对上述石蜡包埋的组织标本切片行苏木素-伊红(H&E)染色。组织损伤评分由2位单盲的病理科医师进行，随机挑选20个视野。评分标准为根据肾小管损伤程度，分别记为O(＜1％)；1(1-10％)；2(11-20％)；3(21-40％)；4(41-60％)；5(61-75％)；6(＞75％)。20个视野分数计算均数后即为该切片最终得分。

f.TUNEL染色评价细胞凋亡：对上述石蜡切片，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxy nucleotidyl transferase mediateddUTP nickend labeling，TUNEL)检测细胞凋亡。切片脱蜡后采用40μg/ml蛋白酶K(EMD Chemicals，NJ，USA)在37℃修复抗原15min，之后按照试剂盒(购自Millipore，MA，USA)说明书进行反应，最后用苏木素复染5min，水溶性封片剂封片后显微镜观察。在400倍视野下随机选取20个视野，计数凋亡细胞数目。

g.MPO染色评价中性粒细胞浸润：使用上述石蜡切片，脱蜡后采用40μg/ml蛋白酶K(EMD Chemicals，NJ，USA)在37℃修复抗原15min，一抗采用anti-MPO抗体(稀释度1∶600，购自DAKO，Carpinteria，USA)，4℃过夜孵育。显色后用苏木素复染5min，水溶性封片剂封片后显微镜观察。在400倍视野下随机选取20个视野，计数阳性细胞数目。

h.PCR法检测肾脏中炎症因子和转录因子水平：Trizol法(Invitrogen，Carlsbad，USA)提取肾脏组织RNA，使用3μgRNA进行逆转录反应，逆转为cDNA。引物IL-6，RORγt，GAPDH序列均来自于PubMed数据库。实时定量PCR反应采用SYBR Green法(Takara Bio Inc.，Tokyo，Japan)，使用MasterCyclerRealPlex4系统(Eppendorf，Hamburg，Germany)。PCR反应条件为：30s，95℃，然后进行45个循环的扩增，5s95℃，30s55℃，60s72℃。使用GAPDH作为内参基因，计算方法采用2^-ΔΔCt法。

实验结果显示：CHBP在再灌注6小时至48小时显著改善了肾功能(图8)。显著改善了组织损伤(图9)。显著抑制了再灌注损伤后多时点的细胞凋亡(图10)。显著抑制了再灌注损伤后多时点的中性粒细胞进入(图11)。CHBP在mRNA水平抑制了肾脏中炎症因子IL-6和转录因子RORγt表达(图12)。