CN103267853B - 鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可快速检测水产动物鮰爱德华菌的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法，有底板，在底板上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述金标垫上喷涂有胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体，硝酸纤维素膜上有包被鮰爱德华菌多克隆抗体的检测线a及由羊抗鼠IgG构成的质控线b，所述鮰爱德华菌单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化制备而成。
Description
技术领域
本发明属于水产动物致病菌的免疫学快速检测技术领域，尤其是一种可快速检测水产动物鮰爱德华菌的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法。
背景技术
鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri) 隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，爱德华氏菌属（Edwardsiella）是引起多种鱼类产生爱德华菌病的病原菌，现已知其感染的宿主包括斑点叉尾鮰、黄颡鱼、胡子鲶、欧鲶、虹鳟、黑鲈等，具有发病急、发病率高和死亡率高等特点。目前，针对鮰爱德华菌的检测方法主要有传统的微生物学检测技术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附法、细菌凝集法以及PCR技术等。上述检测方法均因操作复杂、耗时久、需要特殊的仪器设备和专业人员，而达不到快速、现场检测的目的，不适合在基层推广使用。胶体金免疫层析试纸条以其快速简便、不需特殊仪器、结果可肉眼判读、灵敏度高、特异性强等优点，已成为当今快速敏感的免疫检测技术之一，并开始逐渐应用于水产养殖业的多个领域。
胶体金免疫层析试纸条是宽度为0.3cm的试纸条，有底板，在底板上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，各部分之间重叠相接。通常在金标垫上喷涂有胶体金标记的抗体，硝酸纤维素膜上有包被抗体的检测线a和有羊抗鼠IgG构成的质控线b。其检测原理是利用吸水垫形成的毛细作用，置于样品垫上的被检测抗原首先与金标垫上的胶体金标记的抗体结合，并沿着硝酸纤维素膜（NC膜）继续向前移动，当到达固着有抗体的检测线a时，抗体将其捕获，随着反应进行，不断富集达到肉眼可见水平；过量的胶体金标记的抗体继续向前移动，到达固着有羊抗鼠IgG的质控线b时，被捕获并不断富集。因此若样品为阳性，则在检测线和质控线上均出现色条带，若样品为阴性，则仅在质控线上出现同样色彩的色条带。但是，由于迄今为止并没有适用于胶体金免疫层析试纸条的鮰爱德华菌单克隆抗体，以至于目前对于鮰爱德华菌还是采用微生物学检测技术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附法、细菌凝集法以及PCR技术等进行检测，胶体金免疫层析试纸条并没有在检测鮰爱德华菌中得以应用。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可快速检测水产动物鮰爱德华菌的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条，有底板，在底板上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述金标垫上喷涂有胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体，硝酸纤维素膜上有包被鮰爱德华菌多克隆抗体的检测线a及由羊抗鼠IgG构成的质控线b，所述鮰爱德华菌单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化制备而成。
一种上述的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
a. 制备鮰爱德华菌单克隆抗体：取保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，取小鼠腹水，置离心管离心后收集上清并纯化，即得鮰爱德华菌单克隆抗体；；
b. 制备胶体金：采用柠檬酸三钠作为还原剂制备18~20nm胶体金溶液，并调整胶体金溶液的pH至8.2，备用；
c. 制备胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体：在电磁搅拌器下将鮰爱德华菌单克隆抗体缓慢加入备用的胶体金溶液中，鮰爱德华菌单克隆抗体的质量和胶体金溶液的体积比为0.025：1，经纯化和浓缩后形成胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体；
d. 对金标垫和硝酸纤维素膜处理：将胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体以9ul/cm2均匀喷涂在金标垫上；将鮰爱德华菌多克隆抗体稀释成1.2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线a；将羊抗鼠IgG稀释成2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线b，37℃干燥4h；
e. 组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次由上至下呈阶梯状固定于不干胶底板上，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有重叠部分，切成规格宽度的试纸条。
所述a步骤是取保藏号为CGMCC No. 7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11制成细胞悬液，1000r/min离心5 min，去上清，用1640细胞培养液重悬细胞，使最终细胞密度为5×106个/ml，得到杂交瘤细胞液；用杂交瘤细胞液免疫小鼠，7~10天后取小鼠腹水，置离心管离心，2000r/min，l0min，离心后收集上清并采用Protein-A亲和层析法纯化收集的腹水，即得鮰爱德华菌单克隆抗体。
所述保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11是按如下方法制备的：
f. 培养鮰爱德华菌（ATCC 33202）；
g. 制备鮰爱德华菌液并免疫Balb/C小鼠；
h. 取小鼠脾脏进行细胞融合，产生融合的杂交瘤细胞， 用间接酶联免疫技术筛选阳性细胞，通过有限稀释法进行克隆。
所述h步骤是按照如下方法进行：在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，筛选阳性细胞，通过有限稀释法进行克隆，即获得阳性杂交瘤细胞。
本发明可应用于检测鮰爱德华菌，与现有检测方法相比，具有以下优点：
（1）检测快速：检测时间仅5~10min，现场即可出结果；
（2）特异性强、灵敏度高：本试纸条与其他水产动物常见的致病菌无交叉反应，最低检测限为5×105cells/ml；
（3）操作简便，无需专业人员和辅助的特殊仪器；
（4）有效期长：2-8℃密封保存，有效期为1年。
附图说明
图1是本发明实施例的结构示意图。
Ei-5D11杂交瘤细胞保藏日期：2013年2月21日；
分类命名：抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏号：CGMCC No.7305。
具体实施方式
本发明的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条结构与现有技术相同，有底板5，在底板5上从一端依次由上至下呈阶梯状粘有样品垫4、金标垫3、硝酸纤维素膜2及吸水垫1，各部分之间重叠相接。与现有技术所不同的是金标垫3上喷涂有胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体，硝酸纤维素膜2上有包被鮰爱德华菌多克隆抗体的检测线a和有羊抗鼠IgG构成的质控线b，所述鮰爱德华菌单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7305的杂交瘤细胞免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化制备而成。
所述分泌抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞是按如下方法制备：
1．制备菌液
鮰爱德华菌（ATCC 33202）在营养琼脂培养基上25℃培养18～24小时后，用无菌的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）制成菌悬液，经0.5﹪福尔马林灭活24小时，14000r/min离心20min，0.01mol/L PBS冲洗2次，血球板计数，调节细菌浓度为4×108 cells/ml。
2．免疫小鼠
用灭活的鮰爱德华菌作为抗原免疫Balb/C小鼠，共免疫4次，每次免疫剂量为0.1ml，具体免疫程序如下：
2.1 基础免疫，鮰爱德华菌与福氏完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
2.2 两周后第一次加强免疫，鮰爱德华菌与福氏不完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
2.3 三周后第二次加强免疫，采用尾静脉注射方式，无佐剂；
2.4 四周后第三次加强免疫，采用尾静脉注射方式，无佐剂；
2.5 第三次加强免疫后的第3天，将小鼠脱颈椎处死，取脾脏用于细胞融合。
3．细胞融合
在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养，倒置相差显微镜观察杂交瘤细胞生长情况。大约两周后，取杂交瘤细胞上清液，进行检测。
4．间接酶联免疫技术筛选鮰爱德华菌杂交瘤株
4.1包被抗原：将鮰爱德华菌用碳酸盐包被液（pH=9.6）稀释至5×106cells/ml，加入96孔酶标板中（100ul/孔），4℃包被过夜；
4.2 PBS-T（PBS含0.05% Tween 20）洗3次，每次5min；
4.3每孔加入200ul 3%的牛血清白蛋白（PBS配）37℃封闭1h；
4.4 PBS-T洗3次，每次5min；
4.5加入3步骤所得杂交瘤细胞上清夜，100 ul/孔，阴性对照用骨髓瘤细胞培养上清液代替；37℃，孵育1h；
4.6 PBS-T洗3次，每次5min；
4.7每孔加入100μl碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠IgG（1：4000），37℃，孵育1h；
4.8 PBS-T洗3次，每次5min；
4.9每孔加入100μl PNPP发色液，暗处反应5～20min，每孔加入50μl 2M的NaOH，稳定3～5min，即可用405nm工作波长测定OD值，计算各实验孔与阴性对照OD值之比（P/N），当P/N≥2.1时该孔为阳性。
5．克隆
采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。将阳性杂交瘤细胞用1640培养液重悬，10倍梯度稀释至102cells/ml，取1 ml细胞液加入9 ml培养液，混合均匀，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1 ml。选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液按照步骤4进行检测，所得阳性孔按照上述方法再克隆2次，即得分泌抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞（保藏号CGMCC No.7305）。
本发明的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条制备方法，按以下步骤进行：
1. 制备鮰爱德华菌单克隆抗体：取生长旺盛，形态良好的鮰爱德华菌杂交瘤细胞（CGMCC No.7305），制成细胞悬液，1000r/min离心5 min，去上清，用1640细胞培养液重悬细胞，，使最终细胞密度为5×106个/ml，备用；取6~8周龄Balb/C小白鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只，1周后，腹腔内注射杂交瘤细胞株（CGMCC No.7305）0.5ml/只，7~10天后，见小鼠腹部明显膨大，拉颈处死小鼠，用酒精棉球消毒下腹部皮肤后，用注射器抽取腹水，将收集的腹水混合，置离心管离心（2000r/min，l0min），离心后收集上清，采用Protein-A亲和层析法纯化收集的腹水，即鮰爱德华菌单克隆抗体。
2. 制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原法制备18~20nm胶体金，是将100ml 0.01％氯化金，加热至沸腾；取2ml的1％柠檬酸钠加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾10min，直至溶液颜色呈透亮的红色，自然冷却后蒸馏水恢复至l00ml体积；胶体金溶液棕色瓶4℃保存，备用，透射电镜下观察胶体金颗粒的均匀度及粒径。
3.制备胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体：取已制备好的胶体金溶液10ml，用0.1mol/L K2CO3溶液调整溶液pH至8.2，在电磁搅拌下，边搅拌边加入250μl 1mg/ml单克隆抗体，继续搅拌30min，再逐滴加入5％BSA至终浓度为1％，逐滴加入5％PEG20000至终浓度为1％（以稳定胶体金颗粒的残留表位），搅拌30min。1500r/min，4℃离心20min，取上清；将上清以10000r/min，4℃离心60min，弃上清；将沉淀以10ml金标复溶液溶解，重复离心2～3次；最后将沉淀溶于原体积1/10金标稀释液中，4℃保存备用。
4. 对金标垫和硝酸纤维素膜处理：将胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体以9ul/cm2均匀喷涂在金标垫上；将鮰爱德华菌多克隆抗体稀释成1.2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线a；将羊抗鼠IgG稀释成2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线b，37℃干燥4h。
5. 组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次由上至下呈阶梯状固定于不干胶底板上，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有重叠部分，切成规格宽度的试纸条。
本发明的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条结果判定：
将试纸条插入样品悬液中10s后取出，室温放置3~10min，观察质控线及检测线显色情况，阳性反应检测线及质控线处各出现 1 条红色条带；阴性反应只质控线出现一条红色条带；若质控线不出现红色条带，则表示测试条失效。
本发明的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的特性分析：
1．试纸条的特异性分析
用本发明的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条检测鮰爱德华菌（ATCC33202）、迟钝爱德华菌（SU 100）、大肠杆菌（ATCC 29532）、嗜水气单胞菌（BSK-70）、杀鲑气单胞菌（MT 004）、副溶血弧菌（KCTC 2471），同时以PBS为阴性对照，评价特异性及交叉反应情况，所用细菌浓度为108cells/mL。结果显示，用组装后的试纸条检测迟钝爱德华菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌均呈阴性，而鮰爱德华菌的检测结果成阳性，说明本试纸条与测试菌株无交叉反应，特异性强。
2．试纸条的灵敏度检测
取不同浓度（5×109cells/ml至 5×104cells/ml）的鮰爱德华菌菌悬液，用胶体金试纸条检测，评价其最低检测量。结果显示试纸条的最低检测限为5×105cells/ml。
3. 试纸条的稳定性测试
将试纸条于2-8℃密封保存1年，每隔1个月检测一次，各项指标均符合以上要求。
Claims (5)
1.一种鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条，有底板（5），在底板（5）上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫（4）、金标垫（3）、硝酸纤维素膜（2）及吸水垫（1），其特征在于：所述金标垫（3）上喷涂有胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体，硝酸纤维素膜（2）上有包被鮰爱德华菌多克隆抗体的检测线a及由羊抗鼠IgG构成的质控线b，所述鮰爱德华菌单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化制备而成。
2.一种如权利要求1所述的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
a. 制备鮰爱德华菌单克隆抗体：取保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，取小鼠腹水，置离心管离心后收集上清并纯化，即得鮰爱德华菌单克隆抗体；
b. 制备胶体金：采用柠檬酸三钠作为还原剂制备18~20nm胶体金溶液，并调整胶体金溶液的pH至8.2，备用；
c. 制备胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体：在电磁搅拌器下将鮰爱德华菌单克隆抗体缓慢加入备用的胶体金溶液中，鮰爱德华菌单克隆抗体的质量和胶体金溶液的体积比为0.025：1，经纯化和浓缩后形成胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体；
d. 对金标垫和硝酸纤维素膜处理：将胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体以9ul/cm2均匀喷涂在金标垫上；将鮰爱德华菌多克隆抗体稀释成1.2mg/mL，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线a；将羊抗鼠IgG稀释成2mg/mL，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线b，37℃干燥4h；
e. 组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次由上至下呈阶梯状固定于不干胶底板上，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有重叠部分，切成规格宽度的试纸条。
3.根据权利要求2所述鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述a步骤是取保藏号为CGMCC No. 7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11制成细胞悬液，1000r/min离心5 min，去上清，用1640细胞培养液重悬细胞，使最终细胞密度为5×106个/mL，得到杂交瘤细胞液；用杂交瘤细胞液免疫小鼠，7~10天后取小鼠腹水，置离心管离心，2000r/min，l0min，离心后收集上清并采用Protein-A亲和层析法纯化收集的腹水，即得鮰爱德华菌单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11是按如下方法制备的：
f. 培养鮰爱德华菌ATCC 33202；
g. 制备鮰爱德华菌液并免疫Balb/C小鼠；
h. 取小鼠脾脏进行细胞融合，产生融合的杂交瘤细胞， 用间接酶联免疫技术筛选阳性细胞，通过有限稀释法进行克隆。
5.根据权利要求4所述鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述h步骤是按照如下方法进行：在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2mL，置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，筛选阳性细胞，通过有限稀释法进行克隆，即获得阳性杂交瘤细胞。
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