湿度指示剂
本发明涉及含至少一种湿度指示化合物的冻干物。本发明还涉及选自聚(丙烯酸-共-马来酸)、聚丙烯酸和/或其盐的至少一种化合物用于指示湿度的用途以及用于监测冻干物的湿含量的方法。
冷冻干燥也称为冻干法或升华干燥,是用于保护性制备高价值产品的方法。在冷冻干燥时,冰晶不经转变成液态而直接蒸发。冷冻干燥的最终产物被称为冻干物。
在生物技术和制药工业中,该冷冻干燥用于液态试剂制剂如药物或酶溶液的稳定化处理和防腐处理。用此方法例如可在室温下长期保持敏感性酶的活性。为使用干燥试样的内容物(作为药物或用于生物反应例如PCR(PolymerChainReaction(PCR,聚合酶链反应)),将合适的溶剂加入冻干物中,该溶剂通常是水。这导致干燥的内容物物质即刻再溶解,于是该物质在溶液中重新发挥具原有的作用。
由于湿度指示剂的存在使得冻干物的使用变得容易,该湿度指示剂显示出冻干物中的湿含量。市场上可得到的湿度指示剂基本上基于在冻干物再湿润时干燥盐的颜色反应。在这种情况下,该指示剂体系可直接施加于干燥剂上或施加于载体材料例如纸上。通常在施加后接着干燥所得的指示剂体系,以使其以色调的起始状态“干燥”存在。如果该指示剂色层随后与湿汽相接触,则该层系改变其颜色。通过选用合适的层系可由此确定准确的空气湿度或该载体材料的材料湿度。
通常使用的干燥剂是硅胶、矾土或分子筛。
美国专利US6655315公开了一个可制备具有变色的湿度指示剂的实例。在该美国专利中描述了一种湿度指示剂,其由氯化铜或由一种或多种可释放出Cu2+-离子的盐着色。该湿度指示剂此外包含一种或多种金属氯化物。这种指示剂体系的缺点主要在于其是由多种成分组成的混合物,这些成分必须在湿度指示剂使用前才以特定的比例混合。此外,在一些生物试样中不希望使用着色的湿度指示剂,因为由于指示剂的颜色或出现的变色会对试样产生光学上的不利影响。再则,在US6655315中所述的湿度指示剂之所以未添加入生物反应,是因为其主要由载体材料和大多为二价的盐(Co2+,Mg2+,Cr2+等)组成。这些二价盐常强烈抑制酶反应如PCR。此外,在该美国专利US6655315中完全未提及在冻干物中使用湿度指示剂。
WO92/02804A公开了一种湿度指示剂,其包含作为指示剂材料的硫氰酸钴和吸湿性盐。该吸湿性盐选自氯化铜、氯化钠和氯化钾。该指示剂体系由于使用的成分不适合用于生物敏感性冻干物中。此外,在WO92/02804A中未提及该湿度指示剂完全适用于冻干物中。
基于此,本发明的目的是制备适于冻干物中湿度的指示剂体系,该指示剂体系尤其不具有前述的那些缺点。
本发明的目的特别是提供可与生物试样的冻干物组合使用的湿度指示剂。但是在此不应将此观点理解为将所述生物试样直接与湿度指示剂相一起保存,而特别是将该湿度指示剂与该生物试样在空间上分开保存,但其存在于与生物试样同一的气氛中。如果在这样一种空间上彼此分开但在同一气氛中的包含至少一种生物试样和至少一种湿度指示剂的组件中发生吸湿,则可由分开存在的湿度指示剂显示吸湿。在此,该湿度指示剂应优选可易于制备。
在本发明范围内,对各种用于冻干物的指示剂体系进行了研究,并发现,通常这类化合物适合用作冻干物中的指示剂体系,即该化合物在给定的至少70%,优选50%,更优选30%,尤其优选10%的周围空气的相对空气湿度存在下,与基本不存在水的情况相比,其显示出至少30%,更优选60%,特别优选90%的体积减小。
在本发明范围内,将基本不存在水理解为相对空气湿度为0%。
因此,本发明的基本目的首先通过与冻干物组合使用湿度指示剂得以实现,与基本不存在水的情况相比,在所给定的至少70%,优选50%,更优选30%,尤其优选10%的周围空气的相对空气湿度的存在下,该湿度指示剂显示出至少30%,更优选60%,特别优选90%的体积减小。
如果该湿度指示剂本身是一种冻干物,则是特别优选的。由此可大大简化包含至少一种生物试样和至少一种湿度指示剂的组件的制备,因为例如可同时冻干所述至少一种生物试样和所述湿度指示剂。
此外,本发明的基本问题的解决不需要使用在其上施加湿度指示体系(化合物、配合物、复合材料等)的载体材料,因为其本身作为独立的冻干物存在。
因此,根据本发明的湿度指示剂本身是一种冻干物,并由此固有适用于监控例如存在于相邻孔中的冻干试样的湿度状态。
在本发明的一个特别有利的实施方式中,该湿度指示剂在吸收至少60重量%的给定量的水后会完全溶解,基于干燥的湿度指示剂的起始重量计。
本发明的基本目的还通过在冻干物中使用选自聚(丙烯酸-共-马来酸)、聚丙烯酸和/或其盐的湿度指示剂得以实现。
因此,本发明首先涉及包含至少一种湿度指示剂的冻干物,与基本不存在水的情况相比,在给定的至少70%,优选50%,更优选30%,尤其优选10%的周围空气的相对空气湿度存在下,该湿度指示剂显示出至少30%,更优选60%,特别优选90%的体积减小。
在本发明范围内,将湿度指示剂理解为一种单独的化合物,但也意指多种单独化合物的组合物。
本发明特别涉及包含至少一种湿度指示剂的冻干物,所述湿度指示剂选自聚(丙烯酸-共-马来酸)、聚丙烯酸和/或其盐。
在根据本发明制备的化合物中,聚(丙烯酸-共-马来酸)(CAS-号52255-49-9)优选是具有平均分子量约为50000的共聚物;此外,丙烯酸-单体与马来酸-单体的摩尔比优选为约1∶1。
在本发明范围内,使用聚(丙烯酸-共-马来酸)的钠盐是特别适宜的。
因为本发明的湿度指示剂本身优选是一种冻干物,所以基于该冻干物计,湿度指示化合物的含量优选为30-100重量%,优选为40-100重量%,特别优选为50-100重量%。
根据本发明制备的湿度指示剂优选作为冻干物与另外至少一种另外的生物活性成分组合使用,其中该湿度指示剂和所述至少一种生物活性成分在空间上彼此分开存在,但同时存在于同一气氛中。
该另一种生物活性成分例如可选自血液,其组分;蛋白质,特别是酶;病毒;细菌;激素;抗生素;脂肪酸;脂质;具有任意链长的碳水化合物;疫苗;低分子量化学化合物,其盐和有机物(Organika)。
该湿度指示化合物和/或所述至少一种生物活性成分可引入到PCR-条上的孔中或可存在于微滴定板、标准化(任选非标准化)的反应容器的孔中,可存在于反应腔中,可存在于微流态的周围介质或耗材中。
该湿度指示化合物的冻干物通常可由该湿度指示化合物的至少一种水溶液出发制得。在此,该水溶液可具有0.01-20重量%,优选0.1-5重量%,特别优选0.25-2.5重量%的湿度指示化合物的浓度,在每种情况中基于该水溶液计。此外,该水溶液可包含至少另一种上述定义的生物活性成分。
根据本发明的冻干物例如可按下列方法制备:
(i)制备包含至少一种根据本发明的湿度指示化合物的水溶液;
(ii)将所制备的混合物引入或施加到孔中或其它的表面上;
(iii)冷冻和孵育由方法步骤(ii)所得到的混合物;和
(iv)在适合的真空中干燥由方法步骤(iii)所得到的混合物,其中该干燥阶段可包括在合适负压下的主干燥和后干燥。
在主干燥期间,使该待干燥的产物溶于其中的水升华。主干燥在真空下进行,该真空相当于在要进行干燥的温度下的水的蒸汽压(例如:该产物必须冷却到至少-40℃,以此不会在干燥时改变其结构,因此在主干燥期间用0.12mbar冻干。这是在-40℃下水的蒸汽压。由此只要还有水存在,待干燥产物的温度就处于-40℃)。所述后干燥用于去除直接结合在待干燥产物上的水分子。为此必须施加例如0.001mbar的高真空。
在本发明范围内,将孵育理解为该待干燥混合物冷冻的时间,对此,在给定的冷冻温度下的孵育时间的长度对冻干物的特性(特别是对冷冻干燥饼的外观和结构)具有影响,并可由本专业人员进行适当调整。
在方法步骤(ii)中制备的冷冻可在-10至-200℃,优选-20至-80℃,特别优选-30至-50℃下进行。冷冻的持续时间可为0.5-24小时,优选0.5-8小时,特别优选1-3小时。
在该干燥步骤期间,温度可至多升高到室温。后干燥优选在至少20℃和0.1-0.00001mbar,更优选0.01-0.0001mbar,特别优选0.01-0.001mbar的真空下进行,后干燥时间优选为0-72小时,更优选1-24小时,特别优选3-10小时。
本发明的冻干物优选在PCR-容器,特别是PCR-小管中制备。
在本发明的另一方式中,将吸湿性物质加入到该待冻干的指示剂溶液中。与不加吸湿性物质的情况相比,这导致该冻干物在较低的空气湿度下已改变其体积。
对吸水和由此产生的重量增加而言,主要是在该冻干物中的湿度指示剂化合物的绝对量起了决定性作用。但对体积减小而言,特别是原始溶液(即在冻干之前)中的湿度指示化合物的百分数具有决定意义:这就是说,在干燥前的溶液中的起始浓度越高,则为使该冻干物改变外形的空气湿度就必须越高。
此外,本发明涉及湿度指示化合物在湿度指示中的用途,与基本不存在水的情况相比,在给定的至少70%,优选50%,更优选30%,尤其优选10%的周围空气的相对空气湿度存在下,该湿度指示化合物显示出至少30%,更优选60%,特别优选90%的体积减小。
本发明的另一主题是选自下述的湿度指示化合物在冻干物中用于湿度指示的用途:聚(丙烯酸-共-马来酸)、聚丙烯酸和/或其盐。
按上面的阐述实现在冻干物中的湿度指示。
本发明的另一主题是用于监测冻干物的湿含量的方法,其特征在于,
(i)提供一种含至少一种根据本发明的湿度指示化合物的冻干物;并
(ii)观察该湿度指示化合物的体积。
在本发明范围内,该湿度指示化合物的体积可用目视法监测,此外,该湿度指示化合物的体积的观测还可通过与等效的空白试样的对比观测来实现。
借助于下面的实施例详述本发明。
下面使用的术语和缩写:
LoC=Lab-on-a-Chip(芯片上的实验室)
PAMA=聚(丙烯酸-共-马来酸),Na盐
PEG=聚乙二醇
Lyophilisation=冷冻干燥的同意词
MTP=微滴定板
rel.LF=相对空气湿度。
实验1:湿汽作用引起的冷冻干燥的PAMA的外形变化
PAMA-溶液在冷冻干燥时形成固态的密实网络。由此得知,PAMA-冻干物是一种白色物体,本领域技术人员称之为“饼”。其本来无所特别。而意外的是该饼在潮湿空气作用下会消失,这如下列实验所示。
将50μl的0.5%-或5%-PAMA-溶液填注到PCR-条中,并冷冻干燥(在-80℃下冷冻,在-50℃下孵育2小时,在升高的温度(-40℃至20℃)下于真空(0.2mbar)中干燥,在20℃和0.002mbar下进行后干燥)。将10μl的水吸移到配置冻干物的PCR-管的盖中,并同该合适的盖将管密封。在0.5%-PAMA-冻干物情况下,该饼经2-4分钟后开始“熔合”。其体积减小,且表面越来越呈玻璃状(图1)。相反,5%-PAMA-冻干物在15分钟孵育后也未显示出其形态的变化(图2)。
实验1的结果示于图1a和1b中。在此,右面的4个管包含相应的冻干物,两个是由0.5%-PAMA-溶液开始(左起第1和第2管),两个是由5%-PAMA-溶液开始(左起第3和第4管)。在图1a和1b中,两图中的带标记“0.5”的管2(左起)含由0.5%-PAMA-溶液得到的冻干物(左方(图1a):湿孵育前,右方(图1b):湿孵育15分钟)。可看出在管2(左起)中的冻干物经湿-孵育后发生溶解,而由5%-PAMA-溶液得到的冻干物经同样的湿孵育后仍不发生溶解(在右图(图1b)上该冻干物存在于管3和4的盖中)。
如已提及的,图2a和2b(与图1a和b中呈相同的管排列)的对比示出,5%-PAMA-冻干物在15分钟孵育后也未显示出其形态的变化。
实验2:
在下文中示出一个实验,其中将0.5%/1%/5%/10%-PAMA溶液冷冻干燥,并随后曝露于43-59%的相对空气湿度下。如上述在PCR-管中制备不同的PAMA-饼。然后在干燥器中于有CaCl2-溶液存在下对这些PCR-管进行孵育(开口,无盖),并每隔一定时间拍取照片文件。由此,在该干燥器中的相对空气湿度为43%(开始)至59%(在实验终点)。图3示出,该0.5%-PAMA-饼经不到2小时后已大大收缩。产生该同样的效应,1%-试料需约3小时,5%-试料需大于5小时。10%-试料在10天后的最终照片文件中才显示出完全收缩的冻干物。该变湿的PAMA-饼的最终尺寸通常正比于所存在的PAMA-量。
结果示于图3中,其示出PAMA-冻干物变湿的时间顺序(0小时至10天)。
实验3:
下面两个实验用最简单的方法表明,可如何利用PAMA的“熔合”效应用于湿度指示剂。
在石蜡膜的下面写上英文字“humid”。之后在该石蜡膜的上面施加0.5%-PAMA-溶液,并如实验1中一般进行冷冻干燥。
将如此准备好的在石蜡膜上的PAMA-饼置入半开口的其中有4ml水的塑料盒中。在接下来的1.5小时中对该PAMA-饼的变化拍取照片文件(图4)。可明显看出,该PAMA-h怎样变得几乎不可见,而可辨别其下面的笔迹“humid”即“潮湿”。
图4a左方示出变湿前的经冷冻干燥的PAMA-饼,图4b示出在湿空气中45分钟后的PAMA-饼,而图4c示出在湿空气中1小时45分钟后的PAMA-饼。
实验4:
在该MTP-凹穴的外面绘上红色的永久标记,以产生红色的面。每两个MTP-凹穴填注有包括每2μl的孔雀绿溶液在内的每200μl的0.1%/0.5%/2%/5%的PAMA。之后将该经填注的MTP如实验1中所述般进行冷冻干燥。
将如此制得的MTP依次在实验台(20℃,35%相对空气湿度)上放置14天、在干燥器(22℃,45%相对空气湿度)中放置10天以及在干燥器(22℃,75%相对空气湿度)中放置2天。在35%相对空气湿度下于实验台上2天后,未能看出PAMA-饼的继续变化(图5a)。在45%相对空气湿度下10天后,0.1%-和0.5%-PAMA-饼发生收缩(图5b)。最后,在75%相对空气湿度下2天后,所有的PAMA-饼均减少(图5c)。
实验5:
该实验表明,在变湿时并非每种聚合物物质均显示出体积减小。曾对比了聚丙烯酸(PAA,分子量250000)、PEG3000、PEG8000以及PEG35000(PEG=聚乙二醇)。如已多次所述,在PCR-管中填注每100μl这些物质,并进行冷冻干燥。之后,将冻干物曝露于升高的空气湿度。图6显示,在75%相对空气湿度下经8天的孵育后,所述各化学药品的冻干物-饼均已变化。可明显看出,聚丙烯酸的饼的体积明显减小。因此,PAA的表现与PAMA可比较。相反,三种PEG-饼均未显示出变化,并因此不适合作为本发明范围内的湿度指示剂的物质基础。
在图6中以给定的从左到右的顺序示出各由PAA、PEG8000、PEG35000、PEG3000的0.5%-溶液制成的经冷冻干燥的饼。
实验6:定量被PAMA冻干物吸收的水
为更好理解在变湿情况下PAMA-饼的体积极度减小的现象,曾测定在何种空气湿度程度下发生形态变化和那时吸收了多少水。
将不同PAMA-浓度(1-8%w/v)的溶液以及不同体积的10%-PAMA-溶液移取到PCR-条中,并如第一个实验中所述般冷冻干燥。切断该PCR-管-条,并称重合具有冻干物的各个管。然后将其在约20℃下曝露于约60%的相对空气湿度下4天。经该孵育时间后,重新称重所述PCR-管,并确定重量差。如果将吸收的水量(读取干燥状态和湿状态的重量差)相对于PAMA起始量作图,可看出吸收的水量和原始干燥的PAMA-溶液体积之间的很清晰的比例关系(图7a)或吸收的水量和经干燥的PAMA-溶液的PAMA-浓度之间的很清晰的比例关系(图7b)。两个观测表明,虽然吸收的水量与起始的PAMA-量有关,但与起始的PAMA-浓度无关。
实验7:
用该实验可明显证明,实际上仅绝对存在的PAMA-量而不是原始溶液的浓度决定了PAMA-冷冻饼吸收了多少水。
为此,将
a)20-100μl的10%的PAMA-溶液和
b)每80μl的1-8%-PAMA-溶液
填注到PCR-管带上(一式三份),并如开始所述进行冷冻干燥。干燥的PAMA-饼的重量用精密天平测定。接着将这些开口管曝露于不断增加的空气湿度(9%,33%,45%,75%),其中在每种情况中,在给定的空气湿度下孵育约1周。在每次更换至下一更高的空气湿度前,重新测定该PAMA-饼的重量。
由图8a和8b以及表1和2表明,该两试料即a)和b)具有相同的每毫克PAMA-起始重量的重量增加。
表1:在不同空气湿度下孵育时PAMA-冻干物(按试料a)制备)的重量增加
平均的重量增加[重量%]:222867。
表2:在不同空气湿度下孵育时PAMA-冻干物(按试料b)制备)的重量增加
平均的重量增加[重量%]:212970。
实验8:
在此实验中确定,与PAMA-冻干物相比,PEG-冻干物(PEG=聚乙二醇)吸收了多少水。为此,再次冷冻干燥在PCR-管中的每4x100μl的5%的PAMA-溶液或PEG8000-溶液(图9a:左方4管含PAMA和右方4管含PEG8000)。测定干燥物质的重量。接着将冻干物在75%的相对空气湿度下曝露4天,并重新称重。图9a和9b示出该试料在变湿前和变湿后的照片。可明显看出,该PEG8000-冻干物(右方4管)未显示出体积减小,而PAMA-冻干物(左方4管)有非常明显的减小(图9b)。重量测定给出,在相同的固体重量下,PAMA-试料具有3.35mg的吸水量,是PEG8000-试料吸水量(1.05mg)的约3倍多。由此PAMA吸收自身固体重量的约67%的水(多次实验的测量值证实),而在PEG8000的情况中却仅为21%。估计该高的吸水容量是PAMA情况下冻干物变化的原因。
实验9:
按一式双份移取含不同PAMA-浓度(0.01-1%w/v)的溶液到PCR-条中,并如第一个实验中所述般冷冻干燥。结果可见于图10。该实验表明,溶液中必须含至少0.25%PAMA,由此冷冻干燥产生优质的饼。
图10示出具有不断增加的PAMA-浓度(从左上至右下:(每2x)0.01%/0.025%/0.05%/0.1%/0.25%/0.5%/1%)的溶液的冷冻干燥饼。
实验10:
移取含不同PAMA-浓度(0.5或1%w/v)和氟化铯-浓度(0/20/30/40mM或50/60/70/80mMCsF)的溶液到PCR-条中,并如第一个实验中所述般冷冻干燥(图11a)。接着该开口管依次曝露于不断增加的空气湿度(7天9%,14天24%,1天34%)。在34%的相对空气湿度下经1天后,大多数试料急剧减少(图11b)。可明显看出,该减少的程度与试料中的CsF的浓度相关。
图11a和11b中从左向右示出含下列CsF-浓度和PAMA-浓度的管:0mM和0.5%,20mM和0.5%,30mM和0.5%,40mM和0.5%,50mM和1%,60mM和1%,70mM和1%,80mM和1%。
实验11:
将含各种PAMA-浓度(0.25-5%w/v)的不同体积(25-100μl)的溶液如第一个实验中所述般进行冷冻干燥。图12a示出刚冷冻干燥后的试料:自上起第一行:每2x每25μl的0.25%、0.5%、1%、2.5%PAMA;自上起第二行:2x每25μl的5%PAMA,每2x每50μl的0.25%、0.5%、1%PAMA;自上起第三行:每2x每50μl的2.5%、5%PAMA;每2x每100μl的0.25%、0.5%PAMA;最下行:每2x每100μl的1%、2.5%、5%PAMA。
随后将这些开口管曝露于45%的相对空气湿度下。3小时后,所有含0.25%PAMA的冻干物均减少,并与经干燥的起始体积无关。最后经1天后,所有含小于等于1%PAMA的试料显示出明显减少,并与起始体积无关。所有2.5%PAMA-试料仅发生非常小的减少,并与起始体积无关。仅5%PAMA-试料表明不发生减少,并也与起始体积无关。图12b示出与图12a同样的试料,但其是在45%的相对湿度下经1天的孵育。