CN103261440A - 测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用逐步连接和切割方法测定多核苷酸的序列的方法，其中对两种或多种测试探针具有特异性的两种或多种切割酶顺次地用来确定结合的测试探针，从而确定目标多核苷酸的序列。在优选方面，在反应中使用的探针和/或碱基被标记，例如，使用珠粒。

Description

测序方法

技术领域

本发明涉及用于测定多核苷酸序列的新的逐步连接和切割方法，其中在切割步骤中使用多种不同的切割酶，其中不同的酶对于结合于多核苷酸内的不同碱基的不同探针具有特异性。这使得能够基于进行切割的酶来确定序列中的碱基。

背景技术

已通过各种方法进行多核苷酸测序许多年并且已提供了关于不同物种的基因组的大量信息。即使已测定人基因组的序列，但仍存在重新测序的极大兴趣以确定遗传倾向性或遗传或基因相关疾病。因此，对于绘制突变的图谱、组织特异性mRNA生产和表达分析具有极大的兴趣。另外，来自其它物种的基因组的测序是感兴趣的，即从头测序。

通常已通过Sanger双脱氧法来进行DNA测序（Sanger,Nicklen andCoulson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74,5463-7），自20世纪80年代以来其已被使用。它是基于首先经酶处理的克隆DNA的电泳过滤的多分子方法。通过间断聚合，酶促过程产生单链DNA，其中利用荧光团标记的双脱氧NTP（其终止链延伸）和dNTP（其不终止链延伸）的混合物。因此，利用此过程获得链长的混合物，其中每个DNA链的长度表示碱基位置，并且连接的荧光团的颜色表示在3’端处碱基的鉴别。这些鉴别被称为对齐彩色点（aligned coloured dot），其中一条线的点表示一个DNA序列。然而，Sanger测序法需要使用多个链，并且对于仅约1000个碱基，测序是可能的。

Maxam等（Proc.Natl.Acad.Sci.,1977,74,560-4）的化学降解法也已用于DNA测序并且涉及在特定核苷酸处核苷酸序列的切割，从而导致产生不同长度的链，其中每个长度表示在该位置处存在特定核苷酸。因此，化学降解法还需要链的电泳分离以供序列测定。

因此，Sanger的链终止法和Maxam的化学降解法均需要产生一组或多组标记的DNA片段，其各自以特定的核苷酸碱基终止。必须通过大小来分离片段以确定序列，因此所使用的电泳凝胶必须能够区分较大片段，其区别于单核苷酸的大小。如上文所讨论的，这限制了可以一次测序的DNA链的大小。

在本领域中已提出对链终止法的改进，例如通过结合酶促和读取阶段。因此，代替通过在电泳过滤器上的位置来表示碱基位置，通过在特定的时间点获取的读数来提供碱基位置。因此可以实时读取序列。利用此原理的第一项技术，即焦磷酸测序（pyrosequencing）（Ronaghi,Uhlen andNyren,Science,1998,281,363-365），并不使用荧光团而是使用荧光素酶，当由释放自聚合步骤的焦磷酸酯间接触发时其产生光，其中一次一个地提供核苷酸。来自这种过程的光的产率远低于荧光团产生的光，因此仍然必须克隆DNA，以使得每个聚合步骤产生足以用于可靠检测的光。这种方法可以处理400个核苷酸的DNA长度，但不适合于检测序列内的均聚物，即相同核苷酸的重复。

其它实时方法包括通过合成进行的测序，其可以用于多分子或单分子测序，通过连接进行的测序（用于多分子测序），以及通过逐步连接和切割进行的测序（用于多分子测序）。通过合成进行的测序涉及使用荧光团标记的终止核苷酸碱基，其被加入固定目标DNA序列。因此，在每个循环中，通过聚合，将单终止核苷酸碱基并入目标DNA序列，然后借助于它的荧光团标记来确定碱基。在已获得读数以后可以化学中和终止碱基以使得聚合能够继续进行。另外，可以化学或光化学切割在碱基和标记之间的脂质链，使得可以除去之前并入的标记，使得能够进行随后并入标记的读取。

通过连接进行的测序涉及将荧光团标记探针连接于未知序列，其中该序列可以通过能够与其连接的探针的序列确定。另外，通过逐步连接和切割进行的测序（Brenner et al,US5,714,330，其以引用方式结合于本文）涉及一系列稍有不同的方法，其基于使用探针，该探针具有用于核酸酶（其切割部位是与识别部位分开的）的核酸酶识别部位。因此，可以借助于与其结合的探针的序列或借助于连接于并入DNA序列的核苷酸碱基的标记来确定DNA序列，然后在探针中的核酸酶识别部位能够诱导待确定的DNA序列的切割以释放探针和/或并入的核苷酸，从而缩短序列以使得能够确定接下来的核苷酸。

在现有技术的逐步连接和切割方法中，序列内的碱基的检测依靠检测连接于探针的标记，其在连接过程中进行结合（在连接标记以后或在切割步骤中它的释放以后）。可以通过以下顺序步骤实现碱基检测：使目标多核苷酸接触标记探针（对于一种或多种碱基具有特异性）并确定它是否结合。如果发生结合，则然后进行切割步骤。如果没有发生结合，则加入下一种探针，直到探针结合。以这种方式，仅可以使用单一标记。可以通过使用不同的标记来加快此过程，例如，荧光团，其可以用来区别可以一起加入的不同探针。特定标记因而与探针的结合使得能够确定它所结合的互补序列，从而能够确定目标序列的一种或多种碱基。

然而，此过程需要产生多种不同标记和用于区别它们的方式，从而导致复杂的生产和检测系统。因此需要快速测序方法，其使得能够一起加入探针而不需要使用多种标记来区别它们，因而可以仅使用用于测序方法的单一标记和检测系统来进行。

发明内容

本发明人现在提供了新的测序方法，其中在逐步连接和切割测序反应中使用多种切割酶。

在第一方面，本发明提供了用于确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，该方法包括以下步骤：

（i）使所述多核苷酸接触至少第一和第二测试探针，各自包含可以互补于在所述多核苷酸中的一个或多个碱基的部分，可选地至少一种测试互补碱基，其各自可以互补于在所述多核苷酸中的碱基，以及当所述测试互补探针的所述测试第一或第二互补部分互补于在所述多核苷酸中的所述一个或多个碱基时，通过所述第一或第二探针与所述多核苷酸的连接，将所述第一或第二测试互补探针共价结合于所述多核苷酸；

（ii）加入第一酶，其能够除去至少部分的所述第一测试探针和通过切割反应被测序的多核苷酸的至少一个碱基（如果所述第一测试探针结合于所述多核苷酸），然后顺序地加入至少第二酶，其能够除去至少部分的所述第二测试探针（如果所述第二测试探针结合于所述多核苷酸），其中每种所述酶是不同的并且对于所述第一或第二探针具有特异性；

（iii）可选地，用至少两种不同的测试互补探针和至少两种酶，重复步骤（i）和（ii），其中所述酶可以相同或不同于在步骤（ii）中使用的酶，直到测试探针已结合于所述多核苷酸，其中上述测试探针具有互补于所述一个或多个碱基和可选地测试互补碱基的部分；

（iv）通过确定在步骤（i）、（ii）或（iii）中所述测试互补碱基和/或探针是否结合于所述多核苷酸，来确定结合于多核苷酸的所述一个或多个碱基的测试探针的测试互补碱基和/或互补部分，从而确定多核苷酸的所述一个或多个碱基；

其中进行步骤（i）至（iv）的每个循环一次或多次，并在每个循环中确定所述序列的一个或多个碱基。

优选地，将多核苷酸固定在载体上。

该方法使得能够识别多核苷酸序列的一个或多个末端核苷酸并从多核苷酸的端部除去一个或多个核苷酸，以使得能够发生连接和切割的任何进一步的所期望的循环。

在所述方法中，在每个循环中，可以使用两种或多种测试互补碱基或探针。在步骤（ii）中，可以顺次地使用各自能够切割不同测试互补探针的多种酶。

在其中还采用互补碱基的方法中，这些碱基可以用来在自由3’端处结合于目标序列（其中探针从该部位的下游结合），并且可以通过聚合连接，其中使用适当的聚合酶。在下文中讨论的信号单元（信号元件，signalling means）可以与碱基或探针有关，但在切割以后必须被释放。

可以使用采用互补测试碱基的各种方法。在测试碱基仅用来完成待切割的双链部分并且并不互补于待测序的碱基的情况下，在反应中可以同时使用所有4种可能的碱基，并且基于测试探针结合的碱基来确定序列。在这种情况下，在上述方法中，聚合酶还用于步骤（i）。在切割后借助于至少部分的测试探针（优选所有的测试探针）除去并入的碱基之后，碱基或测试探针可以携带信号单元。相比之下，如果待测序的碱基之一是测试碱基结合的碱基，由于探针提供了用于确定何种探针已结合的单元，其中通过它已被连接于目标并提供用于切割，因此应连同第一测试探针一起使用第一测试碱基，使得可以通过第一测试探针的结合和切割来确定第一测试碱基的结合。在这种情况下，在步骤（i）中，在切割步骤以前，应加入和连接第一测试探针和碱基，并在加入和连接第二测试探针和碱基以前除去过量的第一测试探针和碱基，等等。在这种情况下，可以将信号单元连接于测试碱基或探针。然而，方便地，为了使过程尽可能简化，待检测的碱基互补于在测试探针中的一个或多个碱基，以及不使用测试碱基（即，探针结合在目标多核苷酸的单链部分的3’端处）或一起使用所有可能的碱基以完成产生的分子的双链部分，从而使得能够进行随后的切割。

当使用互补碱基时，它可以携带信号单元。互补碱基可以是通过聚合加入延伸链的端部的终止核苷酸。此碱基可以相邻结合于探针，该探针结合于目标多核苷酸。

可以顺次地或一起或以其组合的方式（例如，一起加入两种探针，接着加入另外两种探针）加入至少两种待加入的测试探针。当顺次地加入时，可以在每次加入以后进行连接步骤（当还使用测试碱基时，其是适当的）或优选地在已加入所有测试探针以后进行。如下文所讨论的，在该方法中，可以使用4种以上的探针，其可以顺次地和/或一起加入。

在优选特征中，在步骤（i）中，使用至少第一、第二、第三和第四测试探针，各自包含可以互补于所述多核苷酸中的一个或多个碱基的部分，以及在步骤（ii）中，使用至少第一、第二、第三和第四酶，所有上述酶是不同的并且对于所述第一、第二、第三或第四探针具有特异性。

在一种优选的实施方式中，在每个循环中确定一个碱基。

在可替换的优选的实施方式中，在步骤（i）中，使用至少第一和第二测试探针，其各自包含可以互补于所述多核苷酸的一个或多个碱基的部分，以及在步骤（ii）中，使用至少第一和第二酶。优选地，在每个循环中确定所述序列的一个以上的碱基。

在其中仅使用第一和第二测试探针的方法中，可能的是，可以不使用与目标多核苷酸具有互补性的探针，因而在步骤（i）中探针可以不结合。在这种情况下，步骤（ii）是多余的并且可选地不进行。然而，在自动化方法中，这样的步骤可以在步骤（iii）之前进行，其中将最终结合互补探针。然而，在其中不进行步骤（ii）的方法中，例如，在循环的第一部分中，当使用不同探针时必然地将在循环的下一部分中进行步骤（i）和（ii），直到探针结合于多核苷酸。

在优选的方面，重复步骤（i）至（iv）一次以上，即进行一个以上的循环，优选至少2个循环（如在下文中讨论的）。在特别优选的方面，重复所述步骤使得测试所有测试碱基或探针组。

因此，本发明的方法可以确定特定核苷酸或探针是否已被并入待测序的多核苷酸中，其中测试探针或碱基（其优选为标记的）的结合表明特定测试互补核苷酸或探针的并入，因此可以确定在多核苷酸中它所结合的序列。被确定的所述一个或多个碱基可以是测试探针所结合的一个或多个碱基和/或测试碱基所结合的一个碱基。

如在本文中所使用的，术语"确定核苷酸序列"是指部分以及全序列的确定。（此措词可与"识别"序列中的碱基互换使用。）核苷酸序列的确定涵盖任何序列长度，因此，通过该方法可以确定至少一个核苷酸碱基，虽然优选地可以确定一个以上的核苷酸，例如，可以确定至少2、3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000或10000以上核苷酸。因此，优选地，进行该方法的步骤（即每个循环）至少2、3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000或10000次或按比例较低（如果在每个反复循环中确定多个碱基）。

核苷酸序列的确定包括在特定位置处特定碱基的识别（即，A、T/U、G或C），即完全识别，或提供上述碱基的部分识别，例如，该方法可以识别小于4（即，3或2）的碱基组，其包括用于上述碱基的选择，例如，A或T而不是G或C，或A、T或G而不是C。可替换地，部分识别提供关于碱基的鉴别（identity）的信息，当结合例如在其它循环中获得的信息时，其使得能够进行碱基的完全识别。当在每个循环中一个以上的碱基将被确定（即，读取）时，即，当接触目标的探针碱基的数目，其在探针组中并不是完全简并的，是两个或多个时，在循环中的这种部分识别是特别有用的。如果"步长"，即在每个循环中进行的碱基的数目小于涉及读取的碱基数目（例如，每个循环确定两个碱基，但目标序列进程（progresses），例如，被缩短，一次仅一个碱基，例如在逐步连接和切割方法中，在下一个循环以前，切割可以从目标序列除去单个碱基），则获得的部分识别可以是特别有用的。获自重叠读取的信息的组合可以用来明确地或足够明确地获得将有用的序列，尤其是当作为测序材料来源的个体属于其基因组作图（mapping）为已知的物种时，以及主要地单核苷酸多态性（SNP）数据是测序的目的。每个碱基将涉及至少两个读取循环的事实，并借助于在探针组中探针序列的正确组合，可以用来增强信息水平以增加数据质量，例如，用来更高可靠性地识别在连接酶具有最低选择性的情况下的碱基而不需要大量的探针组。

因此，通过实例的方式，对于在每个循环中确定的两个碱基，但一个碱基步长，4个探针组可以用来代替16个探针组，并且在几乎所有的情况下当基因组图谱是已知时，仍然可以在更高SNP数据质量的情况下确定碱基序列。在这种情况下，在每个探针组中，4种不同类型的探针是存在的（虽然没有区分）。因此，在第一循环中，可以确定，目标两个碱基序列具有4种可能性，其是基于探针组，该探针组包含结合的探针。在下一个循环中，类似地，对于目标两个碱基序列可以确定4种可能性。然而，在这些两个循环中，在两个循环中均读出相同碱基，因为测序反应步骤在循环之间仅测定一个碱基。当测序继续识别序列时，可以结合和改善这种重叠信息，其中按照在随后循环中揭示的信息，通过识别结合的4种可能性中正确的一种。

类似地，当3个碱基涉及读取循环时，但仅一个碱基步长，例如，9探针组可以用来代替64探针组。因为所有碱基以这种方式已涉及3次读取，所以在大多数情况下将检测出单读取错误，尤其是如果基因组图谱是已知的。另外，借助于正确构建的探针组，通常还可以检测出双误（doublefault），尤其是在连接酶具有最小特异性的情况下，即，对于T4DNA连接酶，T/G特异性。

因此，如本文中所指的，"循环"是指为实现测试碱基或探针与目标序列的结合所需要的步骤，其中进行上述步骤（i）至（iv）以及在上述循环结束时所述碱基的识别可以是部分或完全的。

另外，"确定核苷酸序列"包括重新测序已知的核苷酸序列，以及序列比较，并研究在已知序列中的多态性和突变。另外，"确定核苷酸序列"可以包括确定在序列中4种类型的核苷酸的一种、两种或三种的位置，例如，可以期望仅确定在序列内胞嘧啶的位置，以及识别在序列中任何或所有4种核苷酸碱基的位置。

用本发明的方法确定其序列的"多核苷酸"可以是任何多核苷酸，但优选为DNA或RNA序列。通常，RNA序列经受反转录以在经受测序之前产生拷贝DNA。可替换地，如果RNA序列直接用于本发明的方法，则反转录酶/RNA聚合酶或RNA连接酶可以用来并入互补碱基或探针（如下文进一步讨论的），而不是将用于DNA序列的DNA聚合酶或DNA连接酶。多核苷酸序列可以进一步是任何长度，但包含至少两个核苷酸碱基并且通常为至少3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸碱基。例如，利用本发明可以检测至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000或10000个碱基的多核苷酸序列。

虽然在优选的实施方式中，多个多核苷酸序列（即多个分子）用来产生序列信息，并结合来自连接于每个分子的信号单元例如标记的信息，但在可替换的实施方式中，待测序的多核苷酸是单个多核苷酸。如本文中所指的，"单个"多核苷酸是指通过本文描述的方法用于测序的单个分子。在这种情况下，单个分子的数据用来推导序列。在这种实施方式中，其中利用该方法可以同时测序所期望的一种以上的分子，但在这种情况下则分别确定各单个多核苷酸的碱基。在这种实施方式中的方法依靠使用信号单元，其产生甚至当仅单一信号单元（例如标记）存在时可检测的信号，单个珠粒，如在下文中讨论的。

如本文中所指的，"固定的"是指直接或间接固定于载体，例如，通过结合于另一种分子，其结合于载体。可以通过化学偶联实现直接固定，以及可以例如借助于通过结合伴侣（partner）的偶联实现间接固定，如下文中描述的，例如，通过杂交于互补寡核苷酸，例如通过连接分子。这种形式的间接偶联是优选的。

杂交之后可以连接以避免在升高的温度或施加力下释放目标多核苷酸，尤其是如果杂交区较短时。

"固体载体"可以是任何固体载体，例如载玻片，例如玻璃片、微阵列、微颗粒等，但特别可以是适合于检测信号的仪器，例如，适合于检测珠粒（如下面进一步描述的），例如在PCT/GB2010/00324中描述的，其以引用方式结合于本文（即，用于光学检测或用于磁性检测的芯片）。在必要的情况下，可以改变载体，例如芯片，以使得目标多核苷酸能够适当结合，例如以使得能够在特定部位结合，从而使得能够进行该方法和检测信号，例如珠粒。

如上文所讨论的，将测试互补碱基或探针结合于其序列待确定的多核苷酸（目标序列）。因此，优选地，本发明的多核苷酸序列可以是至少部分单链的，以使得互补碱基或探针能够结合。特别是，多核苷酸序列可以是单链，其中互补寡核苷酸序列在5'处连接于多核苷酸部分，其序列待确定，从而提供引发的（primed）多核苷酸序列，其可以延伸，例如通过互补碱基的并入（通过聚合），以及使得探针能够结合。可替换地，多核苷酸可以主要是双链，例如，具有几个核苷酸碱基的单链伸出或部分的双链，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10以上核苷酸碱基，探针可以通过连接与其结合，例如，具有互补重叠的互补双链探针。如下文所讨论的，探针可以是单链或可以是具有单链伸出的双链，可以将其结合于在多核苷酸序列中的部分或所有单链伸出。

如本文中所指的，"接触"是指在使得能够形成互补碱基对结合的条件下（如果测试探针或碱基具有相对于多核苷酸中的一个或多个碱基的互补碱基），使多核苷酸和测试碱基或探针接触。

可以通过使得碱基或探针能够结合于在多核苷酸序列中的它的互补序列的任何方法或技术实现共价结合。尤其是，可以通过聚合并入单个碱基，例如利用DNA或RNA聚合酶、或转录酶/反转录酶，以及通过连接并入或结合探针。碱基或探针的这种并入将在5'至3'或3'至5'方向延伸多核苷酸。

如在本文中所使用的，"连接"是指在模板驱动反应中在两个或多个核酸的末端之间形成共价键或连接键，其中可以酶促或化学地发生连接。可以利用用于DNA序列的DNA连接酶和用于RNA序列的RNA连接酶实现连接。

如在本文中（可互换）使用的，术语"碱基"或"核苷酸"包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的天然核苷酸，尤其是具有2'-脱氧形式或非天然核苷酸，其以同样的方式起作用，即和天然核苷酸形成互补碱基对并且可以通过聚合或连接并入多核苷酸序列。

"互补碱基"是指这样的碱基，其特异性地与在多核苷酸中待确定的碱基碱基配对。因此，如果在多核苷酸中待确定的碱基是胸腺嘧啶，则并入的互补碱基将是腺嘌呤，或者如果在多核苷酸中待确定的碱基是胞嘧啶，则并入的互补碱基将是鸟嘌呤，反之亦然。

"可以互补于在所述多核苷酸中的一个或多个碱基"的探针的"部分"是指一个或多个核苷酸的序列，当它们互补时，其能够结合于目标多核苷酸。

"测试"互补碱基或探针是指这样的探针或碱基，其可以呈现相对于目标序列的所期望的互补性。如下文中描述的，有限数目的置换（permutation）是可能的，例如对于单碱基，仅4种置换是可能的。测试碱基或探针用来提供不同的置换以确定碱基或探针是否具有与目标序列的互补性，因此将结合于上述序列。没有所期望的互补性的测试碱基或探针将不结合于目标序列。

如本文中所指的，所述"至少第一和第二检测"探针使得能够一次包括多种不同的碱基或探针（例如，2、3、4、5、7或8种以上碱基和/或探针）。在可以互补于在研究中的一种或多种碱基的探针的碱基或部分中，上述不同的碱基或探针是不同的。通过使用不同的切割酶，其选择性地切割所使用的仅一种探针，从而释放可以检测的信号单元，来识别已结合于目标多核苷酸的碱基或探针。可替换地，可以获得关于探针的鉴别的部分信息，其可以结合在以后循环中获得的信息（如前面所讨论的）。基于切割反应所获得的碱基的识别可以结合基于信号单元所获得的碱基的识别（例如，利用相同或不同的信号单元）（如下文中描述的）。

在连接反应中使用的探针应能够连接于目标多核苷酸以及当存在互补性时在连接以前应和多核苷酸形成双链体（duplex）。优选地，探针（或其结合于多核苷酸的区）应完全配对于多核苷酸以使得多核苷酸序列能够成功识别，即探针应相对于待确定的序列具有100%互补性。

探针可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50个核苷酸。在探针是双链的情况下，每个链可以包含此数目的核苷酸。探针还可以包含信号单元（如下文进一步讨论的）。

探针可以是单链或可以是至少部分双链，其取决于其中所使用的具体方法。优选地，用于本发明的逐步连接和切割方法的探针可以是至少部分双链的。特别优选地，所述测试探针包含双链部分，其可以包含核酸酶的识别部位，以及可以进一步具有突出链（或单链部分），其可以和多核苷酸的互补突出链形成双链体。以这种方式，探针将连接于具有互补突出部分的多核苷酸。可以借助于连接于测试探针的信号单元或借助于连接于核苷酸碱基（在连接步骤以前，其并入多核苷酸）的信号单元来确定多核苷酸序列。在任何一种情况下，在探针的连接以后，进行切割，例如通过核酸酶，该核酸酶识别在探针内的序列以在一个部位（一个或多个核苷酸）自沿着多核苷酸的连接部位切割该连接复合物，从而留下端部，其可以涉及连接和/或聚合的任何进一步的循环并释放信号单元（连同相关联的核苷酸）以使其能够除去。

在这方面，探针可以是具有突出单链部分的双链，例如具有至少1、2、3、4、5或6个核苷酸碱基，其可以互补于多核苷酸序列的所有或部分的突出单链部分。为了实现连接，优选地，所述探针具有3个以上的碱基（例如，4、5、6或7个碱基）的单链部分。因此，探针的突出链是5'或3’端并不是关键的，只要它能够连接于多核苷酸的突出链。优选地，多核苷酸的突出链和探针形成完全配对的双链体。

根据本发明，可以通过对探针具有特异性的酶来切割探针。因此，方便地，探针包含用于切割酶的至少一个识别部位。

"能够除去至少部分的所述测试探针的酶"是切割酶，其识别和结合于测试探针（当结合于目标核苷酸序列时）以及切割测试探针和/或相邻于在目标多核苷酸上的所述探针的序列，但可以不必结合于或切割所述测试探针（当未结合于目标核苷酸序列时）。当所述酶切割测试探针时，上述切割有效地切割，因而从目标多核苷酸:探针复合体除去探针的切割部分。当所述酶切割相邻序列时，切割发生在所述探针的上游或下游，使得在切割以后从目标多核苷酸:探针复合物除去探针（全部）和目标多核苷酸序列的部分。切割和识别部位优选为分开的。虽然识别部位包括探针序列的至少部分，但切割部位可以不包含任何的探针序列，例如当切割部位是在识别部位的上游或下游时，例如当酶是限制酶时。

当探针携带信号单元如标记时，切割部位可以是在标记和结合于目标待测序的多核苷酸的探针的其余部分之间。在这种情况下，如果有必要，为了使得能够进行反复的测序反应，另外的切割酶可以是必要的以除去探针的剩余部分以及目标序列的至少部分，从而示出用于测序的新碱基。然而，方便地，定位切割部位，使得在切割以后，从目标多核苷酸:探针复合物全部地除去探针以及目标多核苷酸的至少一个碱基。

优选地，所述酶是核酸酶，例如限制酶，其具有与它的识别部位分开的切割部位，并且所述探针包含所述核酸酶的识别部位。在这种情况下，切割致使从目标多核苷酸除去一个或多个碱基。这使得能够重复上述方法。每种测试探针（或探针组）具有不同核酸酶的识别部位。

因此，在优选方面，探针可以进一步包含核酸酶（限制酶）的核酸酶识别部位，其使得能够在远离识别部位的位置进行核酸酶切割。优选地，为用于逐步切割和连接反应，所述核酸酶是IIb型限制酶，优选AloI、ArsI、BaeI、BarI、BpiI、Bsp24I、FalI、Hin4I、NmeDI、PpiI、PsrI或TstI，或IIs型限制酶，优选AarI、Acc36I、AceIII、BbsI、BfuAI、BtgZI、Eco31I、EcoO441、EspI、FokI或LweI。

例如，核酸酶识别部位可以使得在离核酸酶识别部位至少1、2、3、4、5、6、7、10、15或20个碱基的上游和/或下游处进行核酸酶切割。这可视为切割酶的"达到"。在本文描述的连接和切割方法中，优选地，所述核酸酶在切割以后产生用于下一个循环的长突出端（overhang）（单链区）。优选地，使用IIs型或IIb型的限制酶。在这方面，尤其是所述核酸酶是IIb型限制部位，其在切割以后产生5-bp突出端。

如在本领域中已知的，在依赖引入用于切割的限制部位的方法中，如果限制部位出现在目标序列中，则测序可以受到影响。可以通过在固定目标以前用待使用的限制酶或具有相同识别序列的限制酶来切割目标从而避免上述问题。可替换地，可以通过目标序列的甲基化来避免上述问题。

在本发明的方法中，采用至少第一和第二探针，其具有相对于相应探针具有特异性的第一和第二酶。因此，当探针结合于待测序的多核苷酸时，第一探针识别和切割第一（而不是第二）探针，即，它对于第一探针是特异性的，但并不识别或切割第二探针。方便地，这可以通过使用具有不同的识别部位的酶（以及相应探针）来实现。因此，在本发明的优选的实施方式中，每种酶是核酸酶，其具有与它的识别部位分开的切割部位并且所述测试探针包含用于所述核酸酶的识别部位，以及在所述方法中使用的每种酶具有不同的识别部位。酶的切割部位可以是相同或不同的。优选地，如上文所讨论的，所述酶是限制酶，优选IIb型限制酶以及在所述方法中使用的每种酶是不同的限制酶。

如上文所讨论的，覆盖在目标序列中的所有置换的测试探针中的一种的部分互补于在多核苷酸中的一个或多个碱基。因此，探针应能够连接于多核苷酸以使得能够并入其中。于是，在多核苷酸中一个或多个碱基的识别是可能的。在任何探针的单链部分，即可以连接于多核苷酸的部分内，发现相关的测试探针的部分，其互补于一个或多个碱基。在部分双链探针中，在单链突出部中发现互补部分。优选地，探针的单链部分将与在多核苷酸中的相应区具有100%互补性，虽然这不是必须的。例如，在其中用探针确定仅单个核苷酸的实施方式中，完美的碱基配对仅识别特定核苷酸是必要的。通常，在这种情况下，并入的（例如连接于多核苷酸）测试探针的末端核苷酸将互补于在多核苷酸中待确定的碱基，虽然互补核苷酸可以不在探针的末端。

如果在每个循环中需确定在多核苷酸中的一个以上的核苷酸，则成功连接于多核苷酸的探针的至少2、3、4、5、或6个等核苷酸将互补于在多核苷酸中的那些核苷酸。如在下文中讨论的，在这种情况下，将有必要产生足够的探针以覆盖每个置换。

可以测试每种测试探针成功连接于多核苷酸以使得能够识别其所连接的探针，因而使得能够识别在多核苷酸中的目标核苷酸的序列。

因此，虽然在优选的实施方式中，将成功地连接于多核苷酸的探针的单链部分可以100%与其互补，但探针的单链部分可以仅与其共享至少80、90或95%的互补性。

如本文所指的，"探针组"是指一组探针，其需要用来识别在目标序列中存在的一种可能的置换。在本发明的方法中，探针组可以用作测试探针（例如，当使用4种以上探针时，如当在每个循环中要确定2个碱基时则产生4个探针组，以及在每个组中的探针可以不同，如基于它们的信号单元），因而如本文所指的探针包括探针组。如果仅需确定单个碱基，也可以产生探针组，以使得测试探针能够结合于未知目标序列。为了识别在多核苷酸内的特定序列，应产生每种置换的探针组，其代表在特定长度的探针内可能的碱基的总的不同组合。产生用于每种置换的探针组，虽然，如果在与目标接触以后每个探针组是可区别的，例如，经由它的标记或释放，则可以一起使用这些探针组。如果仅需测序在目标多核苷酸中的一个碱基，那么仅4种置换是可能的，并且在这种情况下，应产生仅4组探针。如果要同时测序两个碱基，那么在这种情况下16种置换是可能的，并且应产生16组探针以具有全特异性。

例如，2个核苷酸碱基的探针可以具有核苷酸碱基的16种不同的组合，因此应构建16种不同的探针，用于加入多核苷酸序列。如果探针长于在每个循环中待检测的碱基数目，则可以为每种置换产生探针组。

然而，在本发明的方法中可以联合探针组，如果它们可以区分，例如，通过使用不同的信号单元以及不同的切割识别部位（如在下文中讨论的）。因此，可以一起或彼此顺次地加入不同的探针组，并且在切割以后（以及也可选地之前）研究信号单元的存在。在这方面，特定信号单元的检出可以表示特定探针的加入，因而在多核苷酸中的相应序列。在其中信号单元还用来提供序列信息（如在下文中讨论的）以及在所有情况下信号单元是相同的方法中，顺次地加入探针组以使得能够检测连接于探针（其已结合于目标多核苷酸）的信号单元。

优选地，在探针（或探针的单链部分）中的碱基数目多于读取的数目，例如，在其中仅识别第一碱基的循环中，可以使用5个碱基的探针。在每个循环中当探针（或其单链部分）长于待测序的碱基的数目时，为了使得能够结合于目标序列，需要改变不互补于待测序碱基的碱基。因此，在这些位置可以使用简并或摆动碱基（wobble base）。因此，例如，如果仅需确定单个碱基，而探针（或探针的单链部分）的长度是6个碱基，则在5个碱基位置应使用简并或摆动碱基。在这种情况下，存在4种可能的置换，但对于每种置换需要覆盖简并碱基的探针组。因此，在这种情况下，4组将包括ANNNN、TNNNN、CNNNN和GNNNN，其中每个这些组将包括4x4x4x4=256种不同的探针。这提供了在未被读取的位置处简并的探针组。在这种情况下，来自上述方法的读取将是在每个第五位置处存在的碱基。为了识别插入的4个碱基，可以重复反应，其中通过释放合成链和在另一个起点重新开始该过程，使得总共进行5次测序以提供全序列。当使用逐步连接和切割方法时，在每个循环中，读取将前进一个或多个碱基，其取决于切割酶的达到。

结合于多核苷酸的碱基或探针可以具有终止效应，其防止进一步延伸或其它碱基或探针并入序列。因此，在本发明的方法的优选方面，互补碱基或探针终止于另外的互补碱基或探针的结合。

因此，碱基可以是双脱氧核苷酸或探针可以具有在末端位置处的这样的碱基。这样的碱基仅适用于最终序列循环，这是因为这种核苷酸的引入导致永久终止。对于在序列反应期间和在最后循环以前的终止，可以使用可替换的已知的可逆改变。在这种情况下，在借助于它的信号单元，例如，与其连接的珠粒，已检测到并入的碱基或探针以后，可以化学中和该终止效应，从而使得碱基或探针能够进一步并入或结合于多核苷酸序列。这类终止在本领域中是已知的，例如对3'OH基团的改变，如在Jingyue et al.US2004/0185466中，图14。在循环结束时，可以切割这些终止基团，以使得能够持续聚合（参见Jingyue et al:PCT/US02/09752，其涉及用于这样做的适宜试剂）。在加入探针用于连接方法的情况下，这些探针基本上终止反应（例如，直到发生切割反应），因此，对于所述探针，不需要终止核苷酸，虽然可以使用终止碱基，例如，其中5'被去磷酸化。通过使用适当的激酶，这可以被再引入，用于下一个循环。

可以通过标记探针的切割，例如通过核酸酶（例如限制酶，如核酸酶或RNA内切核酸酶），来除去探针的终止效应。

在优选方面，如果选择较大的信号单元，例如珠粒，使得它的大小，例如半径大于目标多核苷酸的长度，则互补探针或碱基的结合可以具有终止效应。在这种情况下，携带探针或碱基的第二信号单元不能进入目标多核苷酸，从而基本上终止任何进一步的延伸或结合。以这种方式，甚至可以正确地确定均聚物，条件是如果在单个载体（其作为标记，例如珠粒）上携带多个碱基或探针，则在载体上放置碱基，使得不能将两个连续碱基并入来自相同载体的相同目标。使用上述方法的优点在于，不需要液体交换，或可以直接重复使用液体。

如果多核苷酸接触由于缺乏互补性而未能结合的测试碱基或探针，则可以使用不同的测试探针（即，具有探针的不同测试互补碱基或部分），直到测试碱基或探针结合于多核苷酸，即可以进行上述步骤（iii）。可以在上述方法期间的不同点来评估碱基或探针是否已结合于多核苷酸，如下文中描述的，通过评估信号单元的存在，尤其是，在使任何测试碱基或探针接触多核苷酸以前和/或以后和/或在释放和除去信号单元以前。

如本文中所定义的，"在步骤（i）、（ii）或（iii）期间，通过确定所述测试互补碱基和/或探针是否结合于所述多核苷酸来确定结合的测试互补碱基和/或测试探针互补部分"是指评估在该过程期间碱基或测试探针是否结合。方便地，可以在步骤（i）至（iii）期间评估来自与目标多核苷酸有关的信号单元的信号的存在或不存在，其表示测试碱基或探针结合于多核苷酸。如在本文中所使用的，被"结合"于所述多核苷酸的所述信号单元借助于测试探针或碱基的中间性（intermediacy）进行结合。

因此，为了本发明的方法的进行，使信号单元与所述测试探针或测试互补碱基相关。"信号单元"是任何部分，通过信号的产生或存在，其能够直接或间接检测。信号可以是任何可检测的物理特性如由辐射发射、散射或吸收性质、磁性性质所赋予的，或其它物理性质如电荷、大小或现有分子（例如标记）的结合性质或可以产生的分子（例如气体排放等）。可以使用使得能够信号放大的技术，例如，其自单个活性结合部位产生多个信号事件，例如通过酶的催化作用来产生多种可检测产物。

方便地，信号单元可以是标记单元（例如，标记），其本身提供可检测信号或用于产生可检测信号的单元。方便地，这可以通过使用放射性或其它标记来实现，其中上述标记可以在探针生产期间被并入或直接结合于待用于本发明的碱基或探针。

因此，在优选方面，信号由与所述测试探针或测试互补碱基有关的标记单元来提供，其中上述标记单元优选连接于所述测试探针或测试互补碱基。

适当的标记是以下标记，其直接或间接地使得能够检测或测定探针或碱基与目标多核苷酸的结合。上述标记包括例如放射性标记、化学标记，例如发色团或荧光团（例如染料如荧光素和罗丹明），或高电子密度的试剂如铁蛋白、血蓝蛋白或胶体金。在一个方面，待使用的标记不是珠粒。然而，在特别优选的方面，标记是珠粒。

可替换地，标记可以是酶，例如过氧化物酶或碱性磷酸酶，其中通过它与适当物质（entity）（例如底物）的相互作用来可视化酶的存在。标记还可以形成信号对的部分，其中上述对的其它成员存在于、或紧密靠近结合于目标多核苷酸的探针或碱基，例如，荧光化合物和淬灭荧光底物可以用于相邻的结合碱基和探针上。

信号单元可以间接地与探针或碱基有关，例如，通过结合伴侣，其中之一携带信号单元（如在下文中讨论的）。因此，在优选方面，在所述方法期间，结合对的第一结合伴侣连接于所述测试探针或测试互补碱基，所述信号单元连接于所述结合对的第二结合伴侣，以及所述第一结合伴侣连接于所述第二结合伴侣。因此，例如，标记可以提供在不同的物质，如抗体上，其识别连接于探针或碱基的肽部分，例如连接于在探针的合成期间所使用的碱基。当信号单元不直接与探针或碱基有关，但探针或碱基提供用于连接信号单元的有关方式时，信号单元可以在此过程中在任何方便的点与探针或碱基有关。

因此，在优选方面，本发明的方法提供了用于确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，该多核苷酸优选固定在固体载体上，该方法包括以下步骤：

（i）（a）使所述多核苷酸接触至少第一和第二测试探针，各自包括可以互补于在所述多核苷酸中的一个或多个碱基的部分，可选地至少一个测试互补碱基，其各自可以互补于在所述多核苷酸中的碱基，测试碱基和/或探针信号单元与其连接，或结合对的第一结合伴侣与其连接，以及当所述测试互补探针的所述测试第一或第二互补部分互补于在所述多核苷酸中的所述一个或多个碱基（通过所述第一或第二探针与所述多核苷酸的连接）时，使所述第一或第二测试互补探针共价结合于所述多核苷酸，

（b）当结合伴侣连接于所述测试互补碱基和/或探针时，将连接于所述结合对的第二结合伴侣的信号单元结合于所述测试互补碱基和/或探针，通过所述结合对，所述第一结合伴侣与其连接；

（ii）加入第一酶，通过切割反应，其能够除去至少部分的所述第一测试探针和待测序的多核苷酸的至少一个碱基（如果所述第一测试探针结合于所述多核苷酸），然后顺次地加入至少第二酶，其能够除去至少部分的所述第二测试探针（如果所述第二测试探针结合于所述多核苷酸），其中每种所述酶是不同的并对于所述第一或第二探针具有特异性；

（iii）用至少两种不同的测试互补探针和至少两种酶可选地重复步骤（i）和（ii），其中所述酶可以相同或不同于在步骤（ii）中使用的酶，直到具有互补于所述一个或多个碱基的部分的测试探针已结合于所述多核苷酸以及可选地测试互补碱基已结合于所述多核苷酸；

（iv）在步骤（i）、（ii）或（iii）期间，通过确定所述信号单元是否连接于所述测试互补碱基和/或探针是否结合于所述多核苷酸，来确定结合于多核苷酸的所述一个或多个碱基的测试互补碱基和/或测试探针的互补部分，以识别多核苷酸的所述一个或多个碱基；

其中进行步骤（i）至（iv）的每个循环一次或多次，并且在每个循环中确定所述序列的一个或多个碱基。

可以在步骤（i）至（iii）期间，在不同的时间下，评估标记单元的存在或不存在或信号水平，以使得能够确定，例如（a）可以在任何结合以前（即，在步骤（i）开始时）评估，（b）在步骤（i）或（iii）（部分（i））以后评估结合以确定信号单元是否结合于多核苷酸，和/或（c）在切割以后（即在步骤（ii）或（iii）（步骤（ii）以后）评估结合。因为上述方法依赖于不同酶的选择性切割，所以至少在切割步骤以后进行确定。在其中信号单元提供另外序列信息的方法中，还至少在步骤（i）或（iii）（部分（i））的结合以后进行确定。评估可以是定量或定性的。

因此，在优选方面，确定步骤（iv）包括确定与所述测试探针或测试互补碱基有关的信号的存在、不存在或水平，其中信号的存在指示所述测试碱基或探针的结合。在另外的优选方面，在所述切割步骤以前和以后，确定与所述测试探针或测试互补碱基有关的信号水平，以及在切割以后信号的降低指示结合所述测试碱基或探针。

在确定步骤（iv）期间，除去信号单元，例如，如下文中描述的。确定步骤包括为实现确定所必要的所有操作，例如，包括切割，除非这样的步骤被分开叙述。

如上文提到的，可以使用各种不同的方案，其使得能够进行步骤（iv）的确定。可以将进行单一置换并携带信号单元的最简单的测试探针加入目标多核苷酸并且可以评估结合于所述目标的信号单元的存在，以确定在目标多核苷酸中是否存在上述置换（即特定碱基）。然后在切割步骤期间释放信号单元并且用相对于不同置换的测试探针重复上述方法，直到确定相关置换，如通过信号单元的结合所证明的。在这种情况下，原位检测信号单元。在替换方案中，其可以在释放（通过切割）以后检测。

在本发明的方法中，信号单元，例如标记的释放表示研究中的碱基，例如在不同探针或探针组之间的区别特征，是被第一酶而不是第二酶（例如，在信号单元与探针的连接中或在探针内的特定限制部位）所切割的能力，以及在相关条件下信号单元的释放（例如，正确的限制酶用于限制部位，其在置换之一中释放信号单元）表示目标碱基。在此优选方面，所述测试探针或在信号单元和所述测试互补探针或碱基之间的连接包含限制酶的识别部位。

本发明使得能够使用单一信号单元，但另外，可以使用多个不同信号单元，其各自产生不同类型的信号以识别测试探针所结合的碱基。上述方法可以用于目标碱基的识别的另外确认，例如，经由它的切割特性和连接于它的信号单元来识别结合的探针。可替换地，上述方法可以用来显示在该方法期间的另外的测序信息。当使用单一信号单元时，这可以用来识别探针，其结合并且其在切割反应期间被除去。信号单元还可以用来提供另外的测序信息，这是因为它独立于切割识别部位。因此，可以产生，例如，16种探针以覆盖相对于两个碱基可能的每种置换。然后可以将这些探针分为组，其中第一（或第二碱基）是相同的但关注的其它碱基有所不同，即分为4个探针组，其均携带相同信号单元，但其中基于它们的切割特性，即，切割酶识别部位，可以区别该组的4种探针。在该方法中，加入第一探针组并评估来自上述该组的探针的结合（在切割以前）。如果没有探针结合，则加入第二组的探针等等，直到探针结合。在来自探针组的探针结合以后，这使得能够识别在该序列中的一个碱基，其是基于探针组的鉴别，其中第一（或第二）碱基是不变的。为了识别第二（或第一）碱基，即，识别来自探针组的4种探针内结合的特定探针，借助于每种不同的切割酶进行连续切割反应，直到发生切割并释放信号单元。以这种方式，在单循环中，可以确定第一和第二碱基。

方便地，在这样的方法中还可以使用多种不同信号单元，并且在这种情况下可以同时使用所有探针组。因此，例如，可以在每个循环中确定两个相邻碱基，其中一个碱基的确定是基于信号单元类型以及另一个碱基的确定是基于探针的切割特性。在这种情况下，可以产生16种探针以覆盖两个碱基的可能的每种置换。基于不同的信号单元，可以区分第一碱基不同的4种探针组，以及基于它们的切割特性，可以区分第二碱基不同的4种探针组。在本发明的方法中，可以一起或顺次地使用4种探针组。因此，例如，如果一起使用探针组，以及用不同切割酶顺次地进行切割，则可以检测结合的信号单元和切割所需要的切割酶，以识别16种探针中结合的探针，因而可以在每个循环中测序2个碱基。

可以理解，在单个循环中通过利用探针或探针组的不同的区别技术（如上文所讨论的）和/或顺次加入，可以确定另外的碱基。通过示例的方式，通过利用顺次加入的4个探针组可以确定3个碱基，其中在第一探针组（探针组1）中的每个探针在位置N处是不变的，但对于位置N+1和N+2处的每种置换的探针提供在探针组中。在该探针组内，通过用于不同变量的不同的信号单元，可以确定在N+1处变化的探针，以及通过用于不同变量的不同的切割特性，可以确定在位置N+2处变化的探针。在本发明的方法中，将探针组1加入目标多核苷酸中。如果在探针组1中没有探针结合，则使探针组2接触目标多核苷酸等等，直到探针结合。在已发生结合以后，检测已结合探针的信号单元，接着借助于有关酶进行顺次切割。通过包含已结合探针的探针组来识别位置N，信号单元的识别使得能够识别位置N+1，以及切割以除去至少部分的探针的酶识别位置N+2。

因此，在优选方面，本发明的方法提供了一种方法，其中所述第一和第二探针包含第一组和第二组探针，以及使信号单元连接于所述探针和/或碱基，接着顺序加入所述至少第一和第二探针组和/或碱基，并在每次加入以后检测与信号单元有关的信号，以确定结合于所述多核苷酸的测试互补碱基和/或探针，从而确定所述目标序列的一个或多个碱基的序列，其中确定的一个或多个碱基不同于在步骤（ii）期间通过确定被切割的探针所确定的一个或多个碱基。

在特别优选的方面，所使用的信号单元可以是不同的。在这种情况下，可以一起加入第一和第二探针和/或碱基，并在单个步骤中进行确定。因此，在优选方面，所述第一和第二探针包含第一组和第二组探针，并且将不同的信号单元（其可以加以区别）连接于探针和/或测试碱基的每个组的至少两个探针，以及检测与所述不同的信号单元有关的信号以确定哪一个测试互补碱基和/或探针结合于所述多核苷酸，从而确定所述目标序列的一个或多个碱基的序列，其中确定的一个或多个碱基不同于在步骤（ii）期间通过确定被切割的探针所确定的一个或多个碱基。在这种情况下，基于它们的切割特性来区分第一或第二探针组，以及基于它们的信号单元来确定该组内的探针。方便地，使用4组探针，各自包含4种不同的探针，不同的信号单元与其连接，其可以加以区别。

优选地，为了改善准确性，检测来自所述信号单元的信号水平，并且可以在循环期间的不同时间点加以比较。方便地，在假定结合以前和/或以后和/或在切割以后（当总是进行至少在切割以后的检测时）检测信号。如果信号单元还用来提供序列信息，则还必须至少在结合以后检测信号。在特别优选的方面，在所述切割步骤以前和以后，测量与探针/碱基有关的信号，以及所述水平的降低表示所述碱基或探针的结合，从而使得能够借助于连接于所述珠粒的碱基或探针来识别一个或多个目标碱基。上述方法是有用的，因为酶促反应可以是不完全的，例如，连接或切割（通过设计或默认）。

在上述方法中，与碱基或探针有关的信号的存在或不存在或水平表示研究中的碱基。因此，在优选方面，通过确定与所述碱基或探针有关的信号的存在、不存在或水平来进行步骤（iv），其中信号的存在表示所述测试碱基或探针的结合。在另外的优选方面，在切割步骤以前和以后，确定与所述碱基或探针有关的信号的水平，以及在切割以后信号的降低表示所述测试碱基或探针。

如上文提到的，在优选方面，标记单元是珠粒。如本文所指的，所述珠粒的"信号"是被检测的信号，例如，它的磁性、光学活性、荧光、颜色等等，其取决于所用珠粒的特性。

因此，在优选方面，用珠粒标记碱基或探针，其包含互补于在待确定的目标多核苷酸中的碱基或序列的一个或多个碱基。连接于碱基或探针（其已并入多核苷酸）的单个珠粒的存在可以容易地检测，如下文中描述的，从而使得能够识别在切割步骤以前和/或以后已并入的互补碱基或探针，因而使得能够识别在多核苷酸中它所结合的碱基或序列。在测序反应中珠粒用作标记，其可以提供相对于在本领域的测序方法中的常规标记（如荧光团标记）的许多优点。首先，珠粒容易检测，这是因为它们大于荧光团，当使用单一分子测序时其使得它们能够应用。此外，当使用珠粒作为标记时，不存在低信号水平的问题。另外，可以检测珠粒而不需要使用贵重仪器，例如利用在集成电路中或基于光或磁的电磁珠检测机制（electronic bead detection mechanism）。可以容易和快速地从反应除去珠粒，尤其是如果它们是顺磁性的，因此当使用珠粒标记时，相对于荧光标记，不存在噪声问题。此外，可以使用机械切割，因而避免如在一些现有技术的测序方法中所需要的化学去除。因此，在一个优选方面，通过它的磁性来除去和/或检测所述珠。

之前珠粒没有被建议用于标记互补于待确定的碱基或序列的核苷酸或探针，其中它们在反复测序反应期间结合于目标序列。尤其是，以前没有披露使用单个珠粒作为标记来确定在反复的测序反应中在多核苷酸的特定位置处的一个或多个核苷酸，尤其是当目标分子的序列是未知时。尤其是，先前未曾披露，在其中使用多种切割酶的本发明的方法中珠粒的使用。鉴于较大尺寸，珠粒使得能够进行单分子的测序。测序单分子的能力避免任何克隆步骤并且无需扩增。这使得为获得序列所需要的工作量减少并进一步防止将不必要的误差引入多核苷酸。

珠粒和其它较大标记可以用作标记和用作测试探针或碱基的载体，因此多种探针可以存在于单个珠粒上，例如，探针组（如前面所讨论的）。优选地，当使用探针组时，每组探针存在于相同载体（例如，珠粒）上。用于不同置换的每组探针可以是在分开的珠粒上或可以存在于相同的珠粒上，这是因为可以通过除珠粒的信号之外的方式来区分探针，即，通过释放珠粒所必要的条件（例如，每种置换的探针具有不同的机制，其使得能够释放珠粒，例如，特定限制部位，其将珠粒连接于探针）。

如上文所讨论的，在需要逐步连接和切割的测序方法中，可以使用具有单链突出部的部分双链探针。在这方面，探针可以包含在双链部分中的核酸酶识别部位。在该方法中，探针可以携带信号单元（例如珠粒），用于识别在多核苷酸中的互补核苷酸。当探针（如果互补）连接于目标多核苷酸（即，在切割以前）和/或可以使得切割反应能够发生，从而释放信号单元，例如，珠粒，并使得它的检测（在释放以后）或其不存在于目标多核苷酸时，可以评估信号单元（例如珠粒）的存在。

虽然在优选方面，探针包括相对于待检测的一个或多个核苷酸的一个或多个互补核苷酸，但上述方法还涵盖使用信号单元，例如，珠粒，标记核苷酸，和探针，其可以连接于上述核苷酸以提供核酸酶识别部位。在这种情况下，可以评估信号单元（例如珠粒）的结合，以在切割以前和/或在切割以后查看它是否连接于目标多核苷酸：作为释放探针的部分或在通过切割释放的一个或多个核苷酸上。

在从探针切割以后，应从多核苷酸除去信号单元，以使得能够检测在已被除去的材料中的信号和/或仍然与目标多核苷酸有关的信号。"除去所述信号单元"（例如珠粒）是指空间上分离信号单元与目标多核苷酸，以使得能够区别目标多核苷酸（在所述信号单元所连接的有关测试碱基或探针的结合以后信号单元与其相连）和多核苷酸（已从其释放和除去信号单元）。在信号单元的释放以后，进行除去，其后，信号单元是自由的以从目标多核苷酸的位置除去。通过上述方法的切割步骤来进行释放。在释放以后，可以除去信号单元，例如，通过磁体或流体流动（如在下文中讨论的），其取决于信号单元。

在本发明的优选方面，当使用的信号单元是珠粒时，可以使用拴珠（绑定珠粒，tethered bead）。可以将其连接于固体载体或目标分子的部分或它的连接分子（条件是它并不影响本文描述的测序方法）。在该方法中，代替珠粒的外部供应，以这样的方式使拴珠与每个目标有关，使得它们具有更高的自由度，直到将它们连接于结合于目标序列的探针/碱基。当经由探针/碱基结合于目标时，加入的自由度的限制可以起因于目标的较短的长度（相比于系绳（tether））或起因于系绳的定位（相比于相关目标），从而产生更短的距离和/或相对于一些参比位置的不同定位，当该方法使用在表面上的检测器时，上述参比位置可以是检测点。

在这类方法中，测试碱基或探针结合于所述目标多核苷酸并携带结合伴侣，以使得拴珠（其携带该对的其它结合伴侣）能够结合于那些碱基或探针。然而，应小心以避免碱基或探针太多地直接结合于珠粒，即直接在提供处结合于珠粒，其是相对于：首先结合于目标，同时保持珠粒离目标一定距离，然后当珠粒移向目标多核苷酸或能够自由移动时结合于目标，从而达到目标（即，每个珠粒到达其自身的目标）。在许多情况下，和在聚合或连接期间使用的酶缓冲液相比，结合伴侣快得多地结合于优化设计的流体（例如，如用于链霉亲和素Dynabeads的“结合和洗涤流体”）。

在使用拴珠的情况下，珠粒的除去是指从目标多核苷酸去除，以使得在后续步骤或下一个循环中探针或碱基能够结合。

在上述方法中，进行上述步骤一次或多次并在每个循环中确定所述序列的一个或多个碱基。如上文提到的，循环是指为识别目标序列的一个或多个碱基所需要的步骤。如果在单一步骤中互补碱基/探针的所有置换提供至目标多核苷酸，其中例如借助于不同酶进行的不同探针的切割使得不同信号单元的区别和/或使用，即一起使用所有测试探针/碱基，则可以通过进行上述步骤仅一次来完成循环。然而，如果并不是所有测试碱基/探针用来同时识别碱基或序列，则可以需要另外的步骤来识别碱基或目标序列。在这种情况下，上述方法包括如上文所述的步骤，但其中对待使用的每组测试碱基/探针进行步骤（i）、（ii）和（iv），直到已经实现识别。如上文所述，一个或多个碱基的识别可以是绝对或部分的。

在确定信号单元是否连接时，可以使用如上文描述的检测步骤。因此，可以检测与信号单元有关的信号的存在或不存在或水平。在根据本发明的特别优选方面，进行定量评估以确定连接于多核苷酸的（来自信号单元的）信号水平。

在本发明的方法中，如前面所讨论的，信号单元以及它们的连接基（相对于用于每种置换的碱基或探针）可以是不同的并且可以是可区分的，从而在实施上述方法期间使得它们能够一起加入和分开检测。在替换方案中，用于所有测试探针的信号单元可以是相同的并且在步骤（i）中可以顺次地或分开地加入每种探针组，直到采用具有相关的互补探针或碱基的探针组。

可以一起加入探针组的组，因为可以在切割步骤中区分它们。

可以基于它们的信号单元以及，例如在那些探针中的识别部位，来区分探针。因此，例如，不同组的探针可以结合于相同载体（例如珠粒）或相同类型的载体，但每个组或多组探针具有不同的限制部位。在这种情况下，可以将一组或多组探针加入反应，然后使用连续的限制酶，其被引导到特定探针限制部位。通过特定限制酶的释放将表示相关探针结合，因而表示目标序列/碱基的识别。例如，上述方法可以使用在突出端中具有相同数目的碱基的2、3、或多种限制酶，接连地，并在每次加入以前或以后检测与目标有关的信号单元。在4个不同探针组的情况下，可以通过不同的限制部位来区分每个组，并且可以一次加入所有探针组，接着是连续切割反应。可替换地，两组探针可以用于两个不同循环，其中在每个循环中可以借助于不同酶进行两轮切割。不同组合是可能的。例如，可以利用由G和T探针组成一组探针来进行连接，接着借助于A和C探针的混合物进行连接。如果A和G探针使用一种限制酶以及C和T使用另一种，则在两次连接和两次切割以后可以区分所有4种碱基。使用另一种分组，借助于三次连接和三次切割，可以区分9组。通过组与待检测的两个或多个碱基的适当组合，即，不是完全不同的，但可能部分不同的，可以增加数据质量，特别是其中连接酶是最小选择性的，例如，对于T/G检测。如上文提到的，这可以结合信号单元的使用以使得能够获得进一步的序列信息。

如上文提到的，在上述方法中，通过评估信号单元的不存在或存在来确定已结合的测试互补碱基或探针的步骤可以在不同的点进行。因此，步骤（iv）是指在上述方法中在不同时间点可以进行的确定。然而，当进行切割步骤（步骤（ii））并在切割步骤以后进行确定时，仅示出关于何种探针已结合的信息。优选地，然而还在切割以前进行确定，例如，在用于比较目的结合和/或连接以前。如果不仅可以由切割模式获得序列信息，例如如果信号单元将用来区别不同的探针（如前面所讨论的），则还可以在切割以前进行确定。

可以使用步骤的不同顺序，其取决于使用的探针和酶。因此，因为可以借助于它们的切割反应来区别两种或多种探针，所以可以在切割以前一起或顺次地加入它们。可以顺次地加入切割酶。在这种情况下，可以在加入探针以前、在它们的加入以后、在切割以前或在切割以后，进行信号单元的检测，以及可以针对每个探针结合或切割步骤或在多种探针结合或切割步骤以后进行，其取决于使用的方案。

在本发明的方法中，互补碱基或探针在结合于多核苷酸以前标记信号单元或在结合于多核苷酸以后标记信号单元（通过使用结合伴侣）。在特定实施方式中，在结合于多核苷酸以后，标记碱基或探针。如果在结合以后标记，则在确定连接于结合的碱基或探针的信号单元的存在的步骤以前，应进行除去任何未结合的信号单元的步骤。这可以容易实现，例如如果信号单元是珠粒，其是顺磁性的（通过施加磁体）。

类似地，如果在结合以前标记碱基/探针，则在确定连接于结合的碱基或探针的信号单元的存在的步骤以前，应进行除去任何未结合的碱基/探针信号单元标记的复合物的步骤。

可以原位检测（即当连接于目标序列时）或在释放以后检测标记的探针或碱基。在后者情况下，洗涤测序反应以从混合物除去未结合的信号单元，然后通过切割来释放信号单元（如上文描述的）。在释放的混合物中信号单元的存在是在目标序列中相应互补碱基存在的证据。

在可以开始下一组测试探针的评估以前，必须从目标序列（或从释放探针或碱基，供重复使用）除去信号单元。在其中原位检测信号单元的方法中，在它们的检测以后，必须释放（通过切割）和除去它们。

如上文描述的，在酶促切割步骤期间，释放信号单元。因此，可以将切割部位放置在碱基或探针和信号单元之间。尤其是，可以将限制酶部位并入信号单元和碱基或探针之间。可以使用任何限制酶并且可以利用对于上述部位而言任何适宜的限制酶来实现切割。尤其是，可以采用IIs型或IIb型限制性内切核酸酶（如上文描述的）。可以直接相邻于碱基或探针（即在最邻近信号单元的探针在部分）来定位限制或切割部位以使得能够切割信号单元以及任何接头或可以存在的其它结合部分，或可以直接相邻于信号单元来定位限制或切割部位以使得能够切割和可能的信号单元的再利用。切口限制酶可以用来释放信号单元。虽然上述方法使得能够使用酶，该酶在使得能够除去仅部分的探针和信号单元的部位进行切割。在这种情况下，需要进一步的切割步骤以除去探针的其余部分。然而，方便地，进行单切割步骤，其除去全探针和它连接的信号单元以及目标序列的一个或多个碱基以使得能够开始测序的下一个循环。

因此，在另外的优选方面，所述探针或在信号单元和所述测试互补探针或碱基之间的连接包含用于限制酶的识别部位以及所述酶是在所述方法中使用的酶。

当珠粒用作信号单元时，它们优选为磁性的，从而能够易于去除，例如利用磁体（如果珠粒是顺磁性的）。可替换地，可以通过分离和洗涤来实现除去，例如利用流体流动，例如在芯片上。可以使用这些技术的组合。在已除去切割的珠粒以后，可以进行进一步的珠粒检测或可视化步骤，以在重新开始反应以前检查已成功除去所有珠粒，例如，在中和链终止效应以前，以及这样的步骤的进行是优选的。

如在本文中所使用的，术语"珠粒"是指微颗粒，其通常但不一定是球形固体载体。虽然珠粒的大小并不是关键的，但它们可以例如具有至少0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5、3或3.5μm的直径并具有不大于50、20、10、8或6μm的最大直径。尤其是，在本发明中可以使用1或2.8或4.5或10μm的珠粒。直径是指沿着珠粒的最长轴或沿着球形珠粒的任何轴的大小。"半径"是指上述直径的一半。在优选特征中，所述珠粒的半径大于多核苷酸的长度。

在本文描述的方法中，对于单一多核苷酸，在每个循环中，仅结合单个探针/碱基和单个连接珠粒。在这种情况下，以复数形式提及"珠粒"应理解为单数形式或反映一起进行的多个反应但各自针对单一多核苷酸。

单分散性珠粒，其具有基本上均一的大小（例如具有直径标准偏差小于5%的大小），可以用于本发明，因为它们提供反应的非常均匀的可重复性。

可以由能够形成适宜载体的任何材料制备珠粒。适用于本发明的方法的非磁性聚合物珠粒可获自Invitrogen以及可获自Qiagen、Serotec、Merck、Promega（仅举几例）。非磁性珠粒可以由本领域公知的许多不同材料制备，例如，由塑料制备，例如由聚苯乙烯制备。

然而，为了有助于操作和分离，磁性珠粒是优选的。如在本文中所使用的，术语"磁性的"是指珠粒能够具有当被放置在磁场中时赋予它的磁矩，因而在磁场的作用下是可位移的。换句话说，可以通过磁团聚容易地除去磁性珠粒，其提供在用测试碱基或探针温育珠粒以后或在从多核苷酸切割它们以后快速、简单和有效的分离任何未连接珠粒的方式。相对于在现有技术的许多测序方法中所使用的荧光团，这提供明显的优势。

因此，通过施加磁场，例如利用永磁体，可以在适宜的表面上除去未结合的磁性颗粒。

磁珠包括响应于磁场的磁响应材料，例如，顺磁性材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料。因此，可以使用铁、镍和钴以及金属氧化物如Fe₃O₄、BaFe₁₂O₁₉、CoO、NiO、Mn₂O₃、Cr₂O₃和CoMnP。磁响应材料可以仅是珠粒的一种成分，其余部分可以由磁响应材料与其附着的聚合物材料组成。

在珠粒中磁响应材料的量并不是关键的并且可以在宽范围内变化，例如，整个颗粒的按重量计约1%至约75%。范围可以是2%至50%，3%至25%或5%至15%。可以将磁响应材料分散于整个聚合物，施加为在聚合物表面上的涂层或以任何其它方式并入或固定，其将磁响应材料固定于聚合物。因此，磁响应材料可以形成珠粒的核或核心。

形成珠粒的其余部分的聚合物材料可以是可以形成为固体珠粒的任何材料。适宜聚合物的实例是聚酯、聚醚、聚烯烃、聚环氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚异戊二烯。在许多聚合物中，交联可用于赋予珠粒结构完整性和刚性。

还可以使用超顺磁性珠粒例如由Sintef在EP-A-106873中描述的那些超顺磁性珠粒，其使得能够避免甚至具有高渗透性的珠粒的磁团聚和凝集（clumping）。另外，由Invitrogen出售的作为Dynabead的磁性颗粒特别适用于本发明。

使用磁性珠粒特别有利的是，可以将珠粒"下拉"到多核苷酸上，其可以被固定于固体载体上，以能够将珠粒标记的碱基或探针更加快速地并入多核苷酸，或能够将珠粒更加快速地结合于碱基或探针，其已并入多核苷酸但还未被标记。

根据在本领域已知的和在文献中描述的技术，在并入多核苷酸以前或以后，以任何方便的方式，可以直接或间接地将信号单元，例如珠粒，连接于测试互补碱基或探针，但要确保信号单元（如果它较大，例如珠粒），并不阻止它所连接的探针或碱基进入目标多核苷酸，或防止所需要的反应发生，例如，聚合、连接或切割反应。

因此，可以直接将碱基或探针连接于信号单元，如珠粒。通过本领域已知的方法（例如耦合化学）可以容易地实现上述连接，以及方便地，可以将碱基或探针直接结合于信号单元。当信号单元较大时，可以连接一个以上的碱基或探针，使得信号单元作为载体，例如，碱基或探针可以用来涂布载体。

可替换地，可以将信号单元，例如珠粒，间接连接于测试互补碱基或探针。因此，可以通过可以直接连接于信号单元的一个或多个其它分子将碱基或探针连接于信号单元。这些可以产生共价或非共价连接。在优选方面，信号单元可以携带一个或多个连接部分或间隔区（spacer），其对于碱基或探针或对于并入碱基或探针的标记具有亲和力。优选地，经由结合伴侣来实现这种间接结合。在这种情况下，信号单元可以方便地携带或提供有能够结合于碱基或探针的结合部分，使得借助于结合对的至少两个结合伴侣进行结合。如本文所指的，"结合对"是指分子对，其形成特定的和稳定的相互作用。实例包括DNA:DNA、配体:受体、抗体:抗原相互作用。上述结合部分在本领域中是公知的，例如可以使用生物素/链霉亲和素，其中将碱基或探针结合于生物素基团并用链霉亲和素涂布珠粒。

在优选方面，可以将碱基或探针连接于信号单元，其中通过生物素/链霉亲和素结合或通过生物素/抗生物素蛋白结合，其中生物素和链霉亲和素形成结合伴侣。因此，链霉亲和素或抗生物素蛋白涂布的信号单元，例如珠粒，可以用来结合碱基或探针，其被连接于生物素基团。可以使用的其它结合对包括异羟洋地黄毒甙元:抗异羟洋地黄毒甙元（digoxigenin:antidigoxigenin）。

在特别优选的方面，借助于可切割的连接物（优选但不一定包括结合对），将碱基或探针连接于所述信号单元。这使得所述信号单元能够释放。如上文提到的，在优选方面，所述可切割连接物具有可通过限制酶切割的限制部位。方便地，它的产生可以通过使用至少部分单链寡核苷酸，其是结合伴侣，在杂交以后其一起形成识别和限制部位。

在结合于多核苷酸以前，可以将测试碱基或探针连接于信号单元。在这方面，可以将碱基或探针的单个拷贝或多个拷贝连接到每个信号单元（如果大小允许），例如当信号单元是载体如珠粒时。优选地，所述信号单元，例如珠粒，携带至少100、500、1000、10000或100000个探针。这些探针可以是相同或不同的，但优选为单组探针。在不同探针被携带在相同信号单元上但它们并不形成单组探针（即指向单一置换）的情况下，每组的探针优选可借助于它们的结合对区别，例如可以借助于可区别的切割部位连接它们。当使用非终止碱基时，可以将一个以上的碱基结合于每个信号单元，但数目应保持较低以避免均聚物并入。

可替换地，在被连接于信号单元以前，可以首先将碱基或探针结合于多核苷酸序列。在这种情况下，信号单元可以方便地携带或提供有如上文描述的结合伴侣对中的一个。

在本发明的方法中，有色的透明珠粒可以用作信号单元并可以加以检测。一种或多种不同颜色的不同珠粒可以用作标记。因此，当信号单元将用来提供序列信息时，在本发明中，可以使用两种、三种或四种不同的珠粒颜色。尤其是，可以同时使用一种或多种不同珠粒颜色并且可以加以检测（如下文进一步详细描述的）。因此，不同的珠粒颜色可以用来检测不同的测试探针或碱基是否已并入多核苷酸，例如结合于待测序的一个碱基的四种碱基可以标记有四种不同颜色的珠粒，以及连接于结合碱基的珠粒的颜色可以识别碱基，因而识别它在多核苷酸中的互补碱基。当同时将所有四种碱基施用于多核苷酸时，这是特别有利的。因此，特定珠粒颜色可以具体识别特定碱基或探针。可以结合探针和/或碱基的区别（基于使用特定酶的切割）一起来使用这样的方法（如上文描述的）。

可以通过它们对例如三种或四种颜色，对其存在过滤物质，其尽可能地具有非重叠滤波曲线（filter curve）的过滤效应，来检测不同颜色（作为信号单元）。通过以不同量结合这些物质，例如，10种不同量，则理论上可以区分1000或10000种不同的信号单元，例如珠粒。由于滤波曲线的某些重叠，可以需要减少数目，但可以区分256种不同珠粒，从而能够通过利用针对256种置换的每一种的探针在任何时间读取可达4个碱基，以及通过基于切割反应的区别来读取另外的碱基。

作为对滤波珠粒（filtering bead）的替换方案，可以通过进行标记来产生有色珠粒，例如，用染料例如荧光染料来涂布上述珠粒。另外，可以使用不同颜色强度的珠粒。然而，优选地，在本发明的方法中，由信号单元（例如珠粒）携带的标记是非荧光的。

不同大小的信号单元可以用作标记。可以同时使用2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同大小的标记并加以检测。不同大小的标记，例如珠粒，将能够识别它们所连接的不同的碱基或探针，在本发明的方法中其将是特别有利的，其中同时将不同的碱基或探针加入多核苷酸。借助于它所结合的标记的大小可以确定并入的碱基以及将此信息加入源于切割反应的序列信息。

当使用不同大小和/或颜色的信号单元作为用于碱基或探针的标记时，可以必要的是，在结合于多核苷酸以前单独地标记碱基或探针，或使用不同的接头或亲和结合对以将特定碱基或探针特异性地结合于特定信号单元。在前一种情况下，在测序反应以前进行标记，并将每组探针（例如ANNN）或碱基（例如A）连接于不同的信号单元。可以将每组的多个探针或碱基连接于每种信号单元以提供可达256种不同的信号单元（例如）。在结合于多核苷酸目标以后进行标记的情况下，因为信号单元类型的变化受限于可以容纳的独特的结合伴侣的数目，所以可以使用的不同信号单元类型的数目取决于可以使用的独特的结合伴侣的数目。如果独特的寡核苷酸用作结合伴侣，这可以是较大的。

另外通过使用不同的珠粒大小、颜色和/或强度以及不同的切割酶（如前面所讨论的）的组合，可以复合使用（multiplex）上述方法。因此，信号单元的不同亚组，其可以是一系列的颜色、颜色强度和/或大小，可以用于本发明的方法。信号单元的上述亚组的检测可以需要各种不同参数的测量，例如珠粒大小的磁性检测和珠粒颜色的光检测。

因此，在用于每个碱基的每个测序循环中，可以一起或分开地加入不同组的待测试的探针或核苷酸，其取决于将使用的检测技术。因此，可以一起加入所有测试探针或核苷酸，如果可以借助于不同的切割酶（以及可能的其所连接的信号单元）来区分它们，例如，借助于4种不同类型的切割识别部位来表示4种可能碱基中的每一种。可替换地，可以分开地或以组的形式加入探针，如果那些组可以加以区分，例如，2种的2组，其中在每一种情况下使用2种可区别的探针。在此类型的另外的替换方案中，可以一起或以组的形式加入探针，但可以分开地或以可区别的组切割它们。因此，在本发明的方法中，使用具有不同核酸酶识别部位的探针，使得响应于特定限制酶的加入的信号单元的释放能够识别结合的探针（基于所使用的限制酶和确定的信号单元），因而使得能够识别目标核苷酸。

取决于信号单元，信号单元的检测可以是通过光、磁、电或电化学方式，尤其是当信号单元是珠粒时。例如，可以借助于磁场来检测珠粒的大小以及其存在。方便地，在芯片上实施本发明的方法，即，其中所述载体是芯片。在特别优选的实施方式中，可以利用设备来进行信号单元（或标记单元）（例如珠粒）和信号或标记单元的检测，其中上述设备包括表面，其提供有用于检测信号或标记单元的装置。

这种方法主要是下文相对于珠粒加以描述，但还可以应用于其它信号单元，其具有较大的尺寸以及其可以在表面上加以检测，其中通过下文所描述的技术。上述表面可以包括一个或多个元件，其提供依赖于珠粒的存在或不存在的输出。在优选的实施方式中，可以通过在PCT/GB2010/00324中描述的方法来光学地检测珠粒，例如利用其中描述的设备。

在这样的方法中，可以将多核苷酸连接于表面，其提供有用于检测珠粒的装置。因此，表面可以提供有一个或多个光敏元件，其中设置每个光敏元件以检测与其相邻的珠粒。因此，优选地，在所述方法中，所述表面提供有一个或多个感应元件，优选光敏元件。

可替换地，可以代替或连同其它元件一起使用光敏元件，其中上述其它元件能够检测珠粒例如Hall元件。在表面上或表面内提供的一个或多个光敏元件能够输出依赖于珠粒的存在或不存在的信号，以及由每个光敏元件提供的信号因此将表明是否存在珠粒，因而表明是否存在并入的碱基或探针。在这种检测方法中，通过一个或多个光敏元件直接检测珠粒本身。可以设置珠粒以发射光，其可以通过光敏元件检测，例如，它可以是发荧光的，虽然在优选方面，当它阻止光到达提及的光敏元件时检测珠粒。因此，优选地，所述检测是通过检测光变化，其源于在光敏表面上信号单元例如珠粒的存在。

因此，珠粒在元件上有效地投射阴影。使用的光源可以是背景光（ambient light），或可以提供专用光源。通过照明表面，可以更加容易地检测任何这样的阴影，其产生自珠粒的存在或光自光敏元件的阻碍。另外，为了防止外部光源影响结果，优选地，通过适宜的外罩（housing），使光敏元件屏蔽外界光。

因此，光敏元件能够测量由表面接收的光量，其可以确定珠粒的存在或不存在。可以通过单个光敏元件或通过光敏元件组来检测珠粒，其取决于珠粒的大小、光敏元件和珠粒离表面的距离。因此，可能的是，单个光敏元件可以检测一个珠粒，或2、3、4个珠粒，但更可能的是，4、9、16或更多光敏元件可以检测一个珠粒。当不存在珠粒时，通过每个光敏元件检测的光量和因而由光敏元件输出的信号，可以用作参比点，相对于其可以比较其它测量结果。由光敏元件接收的光的减少（即，由珠粒的阴影所产生的）将导致信号的输出不同于当珠粒不存在时的输出。如下文所讨论的，当珠粒存在时，由每个光敏元件接收的光量将取决于各种因素，其包括珠粒大小、每个光敏元件的大小和连接于表面的多核苷酸的长度。

"表面"优选提供有设置以形成阵列的多个光敏元件。光敏元件可以是在表面上或形成表面的外层或可以包括在表面内，例如，可以存在于一个或多个其它材料层的下方。光传感器或光敏元件的阵列是本领域公知的，并且包括例如在照相机或CMOS有源像素传感器中所使用类型的电荷耦合器件。可以对上述CCD或CMOS图像芯片进行改性（modification）（如下文中进一步讨论的）。表面可以是上述装置的底面。

可以将其序列待确定的多核苷酸连接于一个或多个光敏元件或放置在一个或多个光敏元件（其存在于表面内或表面上）之上，以使得能够从连接的珠粒产生输出。优选地，单一多核苷酸可以与光敏元件或元件组有关并且可以检测。可以在一个以上的光敏元件或元件组上进一步划分多核苷酸序列，以使得能够更容易地确定序列，即对于待确定的序列的部分，其中通过不同的光敏元件，但在每一种情况下测序单一多核苷酸。

当珠粒存在时，珠粒可以在表面上和在光敏元件或光敏元件组上投下阴影，因而减少由光敏元件接收的光量。例如，珠粒可以减少由光敏元件接收的光量约10-100%，例如尤其是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%。可以理解，提供的输出将取决于所使用的珠粒的大小、在表面上存在的单个光敏元件的大小和拴住的珠粒与表面的距离。因此，相同大小或大于光敏元件的珠粒可以防止大多数光落到光敏元件上。当珠粒存在或连接于光敏元件时，可以通过测量输出的信号来校准每种光敏元件和珠粒大小组合。

可能的是，特定珠粒大小的选择取决于在表面内或表面上的光敏元件的大小。尤其是，对于多核苷酸的测序，其中相对彼此顺次地加入4种碱基和/或不同的探针，可以选择珠粒，其对应于在表面内或在表面上一个或多个光敏元件的大小。可替换地，对于多核苷酸的测序，其中同时将所有4种碱基和/或不同的探针加入多核苷酸以及其中基于它们的切割酶（以及可选地它们的珠粒大小）来区分碱基或探针，珠粒大小将优选小于元件或元件组的大小。因此，可以选择珠粒，当连接于表面时其将减少光量至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%。例如，1μm直径珠粒可以连同1.75x1.75μm的光敏元件一起使用，或2.8μm直径珠粒可以连同3.2x3.2μm的光敏元件一起使用。

通过每个光敏元件并通过用不同颜色的光照明表面，在表面上可以检测不同颜色珠粒。因此，通过表面并通过用不同颜色光的照明，可以检测2种、3种、4种或更多种不同颜色珠粒。表面可以能够对所施用的每种颜色珠粒/光颜色组合提供输出。

光敏元件能够将接收的光能转换成电压，其然后可以被转换成数字数据。以这种方式，包括元件的表面本身能够检测分子的存在，其中通过检测连接于上述分子的珠粒。无需采用外部贵重仪器来检测连接于分子的信号或标记的存在。表面本身能够检测分子。

如上所述，已知的CMOS或CCD检测器适用于检测珠粒。例如，在本发明的方法中，在移动电话中所使用类型的图像芯片可以用于检测珠粒。因此，例如CMOS或CCD图像传感器的表面可以形成在本发明的检测步骤中使用的表面。

已开发了CMOS光检测器（或有源像素传感器），基本上用于消费相机应用，例如在网络摄像机或移动电话中。可获得这种检测器的两种变体，即裸模变体（裸片变体，bare die variant）或具有用保护玻璃包装并连接于垫片（其被连接于用于焊接的外部垫片）的模具的变体。裸模变体可以直接用于本发明，而压模变体（packaged die variant）CMOS光检测器可以通过除去玻璃盖改变。对于两种变体，可以优选的是，除去微透镜和颜色滤波器的层，其通常覆盖像素，这是因为在透镜和滤波器下的表面通常是玻璃层，其是优选的，尤其用来避免珠粒的非特异性连接。可以制造CMOS或其它光检测器而没有另外的微透镜/滤光层，其是用于移动电话所需要的，直接用于本发明。因此，特别适用的CMOS图像芯片可以用于本发明。

特别地，表面可以包含至少3兆像素（2048x1536个光敏元件）或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12兆像素。利用标准沉积过程，可以沉积与至少1、5、10、15、20、25、30、35或37%的光敏元件有关的多核苷酸。在图像芯片上存在的光敏元件或像素通常具有相同大小，虽然可以产生大小的差异。像素可以是例如0.5x0.5μm至10x10μm，例如1x1μm、2x2μm、3x3μm、4x4μm、5x5μm或6x6μm，以及特别地，像素可以是1.75x1.75μm或3.2x3.2μm。

可以对表面例如对图像芯片的表面另外进行改性，以有助于分子连接于表面。特别地，图像芯片可以涂布有金或可以改性以具有连接的硅烷或抗异羟洋地黄毒甙元基团。可以使用的金层的厚度并不是关键的，条件是没有太多的光被阻止到达光敏元件。例如，金层可以为5至50nm。以这样的方式来使表面改性的方法在本领域中是已知的。可以通过真空沉积或通过由高度浓缩的金溶液沉积来进行金涂布。可以通过例如在室温下用在干丙酮中的5%氨基丙基三乙氧基硅烷（CAS:019-30-2）温育表面1小时，来实现表面的氨基硅烷改性。氨基硅烷表面可以作为本身直接加入所期望的分子，或可以通过加入双官能团交联剂来进一步改性，如间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯（m-maleididibenzoyl-N-hydroxysulfo-succinimide ester），以能够将分子结合于表面。通过首先用聚-1赖氨酸溶液（10%聚-1赖氨酸v/v和10%PBS）将表面涂覆底层（prime），然后通过加入在Invitrogen CNB0011涂层缓冲液A中的抗异羟洋地黄毒甙元1:100来实现抗异羟洋地黄毒甙元改性。

另外，表面可以配有流动池（flow cell），其使得流体能够流动到和从表面流动。因此，流动池可以用来施加珠粒或珠粒标记碱基/探针或未标记碱基/探针。另外，表面可以设置读取器，其能够检测和读取来自在表面内或在表面上的每个感应元件的信号。可以由计算机接收来自每个元件的输出。可以容易地制作流动池以包含一个以上的芯片，例如，它可以用64个图像芯片来产生。在这种情况下，可以用同一控制单元来控制所有芯片。

另外或可替换地，可以改变或适应表面的形状，以有助于珠粒结合于并入的碱基或探针或有助于在每个位置或像素处珠粒标记碱基/探针的结合，以及使得能够产生灵敏而准确的方法。因此，可以改变或调整表面，例如具有一定形状，以使得在每个位置处珠粒能够结合。

因此，表面可以成一定形状以使得珠粒能够连接或结合于每个感应元件（例如光敏元件）。单独的凹槽可以与每个感应元件或感应元件组有关或由每个感应元件或感应元件组所定位，其使得每个珠粒能够连接于以及与在表面上的单个或单独感应元件或感应元件组有关。凹槽可以使珠粒能够仅定位于单个元件上以及防止珠粒在一个以上感应元件或感应元件组上移动。

可替换地，可以用障碍物包围每个感应元件或感应元件组，以确保珠粒仅连接于以及结合于上述感应元件或感应元件组。因此，可以在表面上围绕一个或多个感应元件放置障碍物。

凹槽和障碍物的组合还可以用于表面上。通常，将具有与其连接的多核苷酸的感应元件将适合于具有与其相关联的凹槽或障碍物。可以使在表面上的一个或多个元件适应，虽然通常可以使所有元件适应，例如，以具有与其相关联的凹槽和/或障碍物。

以这种方式，表面的适应，例如，凹槽和/或障碍物的使用，使得能够产生更加灵敏而准确的方法以及可以使得能够测序更长的多核苷酸。因此，表面可以适应以使得在每个位置处单个珠粒能够结合。因此，每个感应元件或感应元件组和其周围的障碍物或凹槽可以具有适宜的大小以结合单个珠粒。因此，可以使感应元件和/或障碍物/凹槽适应于和表面一起使用的任何特定珠粒大小。可以利用本领域公知的技术来调整表面。

另外，为了使得目标多核苷酸能够连接于检测器的敏感区（例如对于光或磁性），改性可以是必要的。这可以例如通过平版印刷法来实现，例如限定金层的区域（island），其可以在目标固定于表面的一端连接于硫醇改性，或通过限定被硅烷化的区域。

可以在表面上的不同位置处同时测序不同的多核苷酸。要做到这一点，将有必要在开始测序以前确定它们在表面上的位置。可替换地，可以产生多核苷酸的重叠片段并随机放置在表面上的单独位置供测序。在这种情况下，在测序以前，不必要确定每个片段在表面上的位置，这是因为在已完成测序以后可以将重叠序列拼合在一起。

通过示例的方式，上述方法可以实施如下。首先，应分离和制备供测序的目标多核苷酸。然后应直接或间接地将目标多核苷酸连接于固体载体（如上文描述的）。在含水反应混合物中，在使得它们能够结合于目标多核苷酸的条件下，加入在上述方法中使用的测试互补碱基和/或探针（其可以携带信号单元，例如珠粒）。可以同时或在加入可选的信号单元标记测试互补碱基和/或探针以前或以后加入为实现共价结合所必要的酶（例如连接酶和可选的聚合酶）。在已经实现共价结合以后，应洗涤复合物以除去未结合的碱基和/或探针。在此步骤以后，可以进行信号单元检测（如上文描述的）或可以加入信号单元以标记复合物。在后者情况下，可以在适合于在结合伴侣之间发生结合的条件下加入携带有关结合伴侣的信号单元，然后在洗涤以除去未结合的信号单元例如珠粒以后可以确定信号单元的存在或不存在。

如果仅在它们的释放以后检测信号单元，则可以在没有检测的情况下进行洗涤和珠粒结合步骤。进行珠粒的释放（如上文描述的），即通过酶促切割，例如通过连续限制酶的加入。可以从反应混合物除去释放的携带信号单元的探针和/或碱基，然后识别信号单元。

当在以上步骤中一次使用一组以上的探针时，可以通过进行那些步骤仅足够的次数来完成循环，使得使用所有组，例如，当16组探针连同4种区分识别部位和切割酶一起使用时，每组步骤可以进行4次，其中每当完成测序步骤时评估4组探针的结合。在完成循环并在该循环中已确定待测序的一个或多个碱基以后，可以重复循环。因此，优选地，如上文描述的方法包括以下步骤：加入有关酶，洗涤复合物以除去未结合酶、探针、碱基或珠粒。

附图说明：

现将通过非限制性实施例并参照附图来描述本发明，其中：

图1示出了通过逐步连接和切割的测序，其中利用与本发明的方法相关的方法。因此，将其序列待确定的多核苷酸（DNA）固定于固体载体，其中多核苷酸具有突出部分（AGC）。产生探针，其也具有突出部分（在相对于多核苷酸的突出部分的相反链上），其中最外面的碱基是已知的并且其它2个碱基是简并的。探针标记有4种不同的珠粒，各自表示一种碱基，并被并入多核苷酸。利用连接酶，将具有相对于多核苷酸的互补突出部分的探针并入多核苷酸。因此借助于珠粒特性，可以检测探针的加入以及已知的碱基。在已确定珠粒标记以后，利用核酸酶，可以在箭头所示位置切割多核苷酸/探针复合物。这切割了复合物，致使在原始多核苷酸中末端C残基的除去，然后可以使少一个碱基的多核苷酸经受另一轮的探针的连接和切割。

图2示出3D印刷单元，其置于包装的图像芯片上以产生流动池。

图3示出流动池的横截面，其中流动池置于粘合（glued）和结合于印刷电路板的"裸模（bare die）"图像芯片上。

图4示出另一个流动池的3D图片，其中该流动池具有较好的流体流动特性，并置于粘合和结合于印刷电路板的"裸模"图像芯片上。

图5示出图像芯片的完整系统的示意图。

图6示出在实施例1中描述的测序程序。

图7示出在实施例1中描述的测序程序，其中使用了多种切割酶。

具体实施方式：

实施例1：通过顺次连接和切割进行的测序

仪器的制备

将Micron MT9T001（Aptina）3兆像素CMOS数字图像感应器焊接到印刷电路板（PCB）上并通过连接于来自Analog Devices的Blackfin微控制器来测试功能，该微控制器是一种使用PPI（并行外围接口）的微控制器。

在焊接于PCB以后，通过金刚石切割器，从CMOS数字图像感应器，小心除去保护玻璃，并通过用纯乙醇进行洗涤来清洗芯片表面。通过使内室暴露于丙酮15分钟除去微透镜和Bayer滤波器，其后通过用塑料牙签小心刮划除去上层。

流动池的装配

通过3D印制（printing），由塑料制备流动池（图2），使得它适合与MT9T001CMOS数字图像感应器的大小并使得流体能够流动到活性表面和从活性表面流动，其中通过可以经由柔性塑料管连接的入口和出口（10）。

使环氧胶的薄层分布于边缘，例如，通过相对于流体胶的薄层冲压。然后将它放置在芯片上，并使得环氧胶硬化。对于一些芯片，在此阶段除去微透镜和Bayer滤波器。在定位盖玻片以前，使连同NTC电阻器一起的电阻器网络（用作温度传感器）适应区室（compartment）。与控制电路的电连接是通过连接器，其突出通过在流动池中的切口（14）。

将盖玻片放置在顶部，从而覆盖内室和外室，并且外室通过入孔（12）填充有环氧胶，通过出孔（13）使空气排出。从而密封内室，并保护芯片的外区和所有开放的接合线。

基于晶片（裸模）的芯片装置

在装配Bayer滤波器以及任何其它滤波器和透镜以前，从正常生产线除去晶片。可替换地，这些可以在进一步制备以前用NaOH除去。用来增强聚合物固定（锚定，anchorage）的任何制备现在可以方便地进行，例如金属化（metallisation），其中利用保护连接区域的掩模。以正常方式测试晶片并切成芯片（裸模）。图3和图4示出芯片装置。借助于金线并通过粘接（15）将芯片（25）连接于板。将反应室单元放置在芯片的顶部。然后首先将它粘合到芯片，接着通过入口（12）将包含粘接连接的封闭容积填充环氧胶，同时在出口（13）处放出空气。

通过塑料管（11），将反应容积连接于流体供给和排出单元。这可以用于在一个单元中的小批量生产（通过透明塑料3D印制），同时其对于较大系列，它可以产生自，例如在两侧具有空腔的塑料片和扁平的透明片。通过研磨或通过模塑，前者可以产生自扁平片。

成像装置与控制和图像采集单元的连接

如图5所示，连接成像装置（17）。可以在Blackfin控制单元（18）中捕获图像，其中利用硬件加速（从图像芯片直接存取（memory access）到RAM）。可以通过晶体或通过Blackfin来产生相对于图像芯片的时钟信号。通过利用uClinux分布，测试程序ppifcd_test，其连同程序包一起分配，可以捕捉到RAM磁盘文件。这描述于uClinux wiki，参见以下链接：http://docs.blackfin.uclinux.org/doku.php？id=frame_capture_device。在此链接中的文本的拷贝作为附录1，但需改性以除去非功能性连接。

然后可以经网络（如果使得具有以太网控制器的开发板）将此文件转移到计算机（19），其中通过利用NFS、tftp、ftp等，或利用USB。

成像装置与流体供应单元的连接

如图5所示，进一步将成像装置（17）连接于流体供应单元。流体供应由多个单独的流体容器（20）组成，各自配有其自身的电机控制注射器以驱使流体通过管道（21）流到分流管（22）并进一步到成像装置（17）。将使用过的流体排入容器。

图像芯片的硅烷化：

通过在NaOH（1M）中浸泡芯片1小时，用水冲洗并在氮气流下干燥，来官能化表面。为了产生带负电荷的表面，利用HCl（1M）代替NaOH来重复此程序。为了硅烷化，在室温下，用在干丙酮中的5%溶液（容积/容积）(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（CAS:919-30-2）来覆盖图像芯片1小时。然后用丙酮洗涤图像芯片三次，其中利用5分钟温育时间。然后在乙醇中冲洗芯片，并其后在N₂气体下干燥。通过异双功能接头间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯（m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester）（s-MBS）（20mM）在PBS（0.1M NaH₂PO₄,0.15M NaCl,（pH7.2））中的溶液中温育图像芯片5小时进行交联。然后在PBS中洗涤图像芯片，浸泡在去离子水中，然后浸泡在乙醇中，最后在氮气流中干燥。

固定DNA到图像芯片的制备和连接

将待测序的DNA连接于在芯片表面上的固定DNA。通过共价键，将固定DNA连接于芯片。可以通过退火两个寡核苷酸来制备固定DNA，其中上述两个寡核苷酸形成双链DNA分子，其包含在一端的硫醇以及其中另一端是粘性的。（它还可以通过适宜质粒的部分的PCR扩增形成，其中引物之一被5'-硫醇化。然后利用限制酶将获得粘性末端。）为了激活5'硫醇，需要将二硫键（S-S）还原成自由硫醇（H-S）。这是通过在Tris-HCl（0.1M,pH7.5）中的还原剂Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐（Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride）（TCEP）（10mM）中温育制备的固定DNA两小时来实现。然后按照指导手册通过Biospin30柱（Bio-Rad）并通过用NaPi缓冲液（NaH₂PO₄（0.1M,pH6.5）、NaCl（0.15M））洗脱DNA来纯化固定DNA。然后在NaPi缓冲液中稀释固定DNA至0.01μM的最终浓度。将还原和纯化的固定DNA立即施用于图像芯片并在潮湿环境下温育5小时。然后用NaPi冲洗图像芯片，在NaPi中的巯基乙醇（10mM）中阻滞1小时，接着再次用NaPi冲洗。然后用NaCl（1.5M）在NaH₂PO₄（10mM,pH7.0）中的溶液冲洗它，并用这种溶液温育5分钟，以消除多核苷酸与芯片表面的非特异性结合。其后，用5x SSC（0.075M柠檬酸钠,0.75MNaCl（pH7.0））、用0.1%的吐温20、用恰好5x SSC冲洗它，并存储于4°C下的5x SSC中直到进一步使用。

通过顺次连接和切割进行测序

珠粒：链霉亲和素涂布的2.8μm

顺磁性珠粒

探针：探针的4种不同的混合物由34个碱基对组成，其中在一端具有5'端突出3个碱基突出端以及在另一端具有多种生物素。在每种探针混合物（A、C、G、和T）中，一个碱基保持不变，在突出端中的其它碱基则是完全变化的。选择用来固定的碱基是最靠近连接点的碱基。探针的5'端并不包含磷酸盐以避免在两个探针之间的连接。

用于测序的目标和珠粒的制备

为了确保在测序反应中所使用的限制酶的识别序列（EarI，在图6中）并不存在于待测序的DNA中，进行借助于上述酶的切割步骤。然后在雾化器或HydroShear装置（设置为3000个碱基对的平均长度）中将DNA剪切成片段。可以通过在琼脂糖凝胶上分离DNA，接着通过纯化期望长度的片段，来减小尺寸分布。在剪切过程中获得的在DNA中的单链缺口需要使用T4DNA连接酶。DNA聚合酶用来填充或除去突出端（例如，DNA聚合酶I，较大（克林诺）片段）。

在图6中目标以标记为31的片段示出。适配体（衔接子，adapter）32是固定适配体。在第一测序步骤中，适配体33需要用于随后连接于测序探针。如果这些适配体具有大约相同长度，则以相同量来提供它们。适配体32包含互补于在载体上的固定DNA的粘性末端的区，因而可以被连接于它们。适配体33包含限制部位（阴影线区域），其用来除去连接于生物素（空心圆）的珠粒，以及是足够长以使得酶能够接近珠粒进行操作。

如在来自Dynal的产品指南中描述的并利用程序"核酸的固定"来制备珠粒。

进一步的程序如下，参照图6。

将适配体连接于目标：通过2步连接，将两个适配体（32和33）连接于目标DNA。首先，过量供应一种适配体，连同400粘性单元（U）的T4DNA连接酶。在25°C下进行连接2小时。然后利用PCR纯化来纯化连接产物，其将除去非连接的适配体片段（由于它们的较小尺寸）。在纯化以后，过量供应其它适配体，连同400粘性单元（U）的T4DNA连接酶。除期望的产物32-31-33以外，将出现产物32-31-32、33-31-33和一些自连接的目标DNA。在上述方法中，32-31-32和33-31-33产物并不是有害的，这是因为它们将分别仅关联于图像芯片或关联于珠粒。自连接的目标DNA将并不关联于芯片或珠粒。

然而，如果连接在一起的两个适配体（32-33）足够小以致通过PCR纯化被除去，则仅需要1次连接，以及通过加入过量的按比例（其使得它们以相同概率连接于31，如下文描述的）的两种适配体来进行。

过量供应两种适配体，连同400粘性单元（U）的T4DNA连接酶，并按一定比例，其使得它们以相同概率连接于31。在25°C下进行连接2小时。除期望产物32-31-33以外，还出现许多32-33连接产物（连接在一起的两个适配体）、产物32-31-32和33-31-33，以及自连接的目标DNA。通过在琼脂糖凝胶上的分离，接着DNA纯化，来除去产物32-33和自连接的目标DNA。在上述方法中，32-31-32和33-31-33产物并不是有害的（如上文所讨论的）。

将产物加入图像芯片：将小部分的得到的产物混合物加入装配的流动池，以及400U的T4DNA连接酶。

将产物连接于在图像芯片上的固定DNA：将32-31-33产物连接于固定DNA的粘性末端（在图6中的34），其是在像素窗口中过量制备。在25°C下进行连接10分钟。此后，用适用于珠粒结合的缓冲液洗去未反应分子和酶。

加入和检测链霉亲和素涂布的珠粒：加入大约2x10⁶个珠粒并温育30分钟。每分钟轻轻摇动装配的流动池5秒。通过小心洗涤来除去所有未结合的珠粒。记录珠粒的图像，同时施加向上磁场以稳定珠粒。

检查珠粒密度：检查图像以看到5至10%的像素具有被加以定位以主要在一个像素上产生阴影的珠粒。如果存在太少的珠粒，则重复来自"将产物加入图像芯片"的程序。

利用Earl进行切割，除去带有切割的片段的珠粒：用限制酶缓冲液进行洗涤，然后在它的反应缓冲液中加入1U的核酸酶Fast Digest（FD）Earl（Fermentas）并在37°C下进行切割5分钟。用适合于T4DNA连接酶的缓冲液洗去连接于释放片段的核酸酶和珠粒。记录剩余珠粒的图像，同时施加向上磁场。

还进行这种方法，其中使用对于适配体具有特异性的不同的限制酶。在这种情况下，用限制酶缓冲液进行洗涤，然后在它的反应缓冲液中加入适量的限制酶并进行切割，直到已切割大多数探针。如上述，洗涤连接于释放片段的核酸酶和珠粒。如上述，记录剩余珠粒的图像。

通过顺次连接和切割进行测序

加入4种探针混合物之一：连同400U的T4DNA连接酶和它的反应缓冲液一起加入A型探针（35）。

连接配对探针：在25°C下温育10分钟期间，使得配对探针退火并连接于切割的片段。用适用于珠粒结合的反应缓冲液洗去连接酶以及未结合的探针。

加入和检测链霉亲和素涂布的珠粒：如上文所述，加入珠粒并记录图像。

释放测序珠粒，记录供证实：按照之前描述为"利用Earl进行切割，除去带有切割的片段的珠粒"的程序。

重复上述步骤，每次加入不同的（C、G或T，然后再次A）探针类型。重复进行，直到在每个循环中登记的珠粒的数目大大减少或在大多数像素中读取固定序列，其表明已完成大多数目标读数。

根据本发明的测序方法，其中在逐步连接和切割方法中使用多种切割酶，进行如下。所使用的方案示于图7。

如上文所述，使用探针的4种不同的混合物，其中每种探针混合物具有用于不同限制酶的限制部位。适配体（33）具有这些限制部位的一种。方法进行如下：

通过顺次连接和切割进行的测序

加入4种探针混合物中的一种：连同400U的T4DNA连接酶和它的反应缓冲液一起加入探针。

连接配对探针：在25°C下温育10分钟期间使得配对探针退火和连接于切割的片段。用适用于珠粒结合的反应缓冲液洗去连接酶以及未结合的探针。

加入和检测链霉亲和素涂布的珠粒：如上文所述，加入珠粒并记录图像。

释放测序珠粒：加入识别4种探针混合物之一的限制酶。在完成酶反应以后，洗去酶和释放的探针，并记录剩余珠粒的图像，同时施加向上磁场。然后，重复此步骤，其中通过逐个地分别加入识别探针混合物2、3和4的限制酶。

通过加入探针混合物重复上述步骤，直到在每个循环中记录的珠粒的数目极大减少或在大多数像素中读取固定序列，其表明已完成大多数的目标读数。

实施例2：用于图像芯片的表面改性的程序，其中通过利用APTES 硅烷化以及与戊二醛交联

此程序是硅烷化芯片表面的可替换方式。该程序是Howarter et al（2006,Langmuir,22,p11142-11147）、Aksyonov et al（Anal.Biochem.,2006,348,p127-138）、和Wang et al（J.Agric.Food Chem.,2007,55,p10509-10516）的那些程序的改进。具有5'-胺基的DNA可以结合于交联剂的醛基团，以及胺基可以构成固定DNA的部分，其是以与在实施例1中5'-硫醇基团连接于固定DNA的相同方式。

1、在1M的NaOH溶液中浸泡芯片1小时。

2、用去离子水充分冲洗芯片并在氮气流下干燥。

3、用1M的HCl溶液处理芯片1小时以产生带负电荷的表面。

4、用去离子水充分冲洗芯片并在氮气流下干燥。

5、将芯片移动到手套箱，其中湿度和氧气水平为0.1ppm。用5%的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）在无水甲苯中的溶液处理芯片1小时。

6、用无水甲苯冲洗。

7、将芯片移动到标准大气压，然后用甲醇并其后用去离子水冲洗。在去离子水中温育24小时以完全水解在芯片上的APTES分子。

8、在氮气下干燥芯片。

9、在约120°C下烘焙1小时。

10、对于交联：在10×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中的5%戊二醛溶液中浸泡芯片过夜。

11、用去离子水洗涤并在氮气流下干燥。

12、在干燥以后，可以将醛改性载玻片存储在4°C的暗处。

附录1

PPI帧捕获（frame capture）装置

PPI帧捕获装置（PPIFCD）是CMOS相机，经由并行外围接口，其连接于Blackfin。它旨在仅捕捉单帧。目前支持两个相机传感器。

此处参见：v4l_blackfin_camera，对于支持若干传感器的v4l视频驱动程序。

Micron MT9T001

可以利用Micron MT9T001来制备PPIFCD。它利用标准内部IC总线和可编程标志来控制相机（例如，来除去备用方式等）。

使用PPIFCD的程序

ppifcd_test

PPIFCD帧捕获驱动程序测试应用目的在于查看数字图像传感器是否可以有效地拍摄照片，其通过PPI端口连接于目标板。其记录行时间（row_time）、总帧时间（total_frame_time）、总帧捕获时间（total_frame_capture_time）、和拍摄的相片。如果印制数据是如预期的，则情况合格，否则失败。

fcd

此程序服务基于CGI的网页，其使得用户能够指定设置、捕获帧、和证实相机的整体操作。

配置uClinux内核

Blackfin PPI支持若干子插件板，PPIFCD是一种。然而，如果启用两者，则PPI驱动程序将与PPI相机帧捕获驱动程序发生冲突。当PPI驱动程序试图记录用于字符装置（char device）的相同主设备号（major number）时，将在内核日志中看到这种情况（即，dmesg）。

以下是用于BF533和BF537STAMP板的一些配置设置。为获得任何一种上述程序，指定以下内容：

在定制供应商/用户设置下

==选择Blackfin测试程序==

启用PPIFCD测试程序

==选择Blackfin app程序==

启用用于PPI帧捕获驱动程序的基于CGI的测试应用程序

BF533-STAMP板

如此处描述的，已知，在以下设置下BF533-STAMP板与PPIFCD一起运行：

在定制内核设置下

==选择装置驱动程序==

==选择字符装置==

启用[*]Blackfin BF53x可编程标志驱动程序

启用[*]Blackfin BF5xx PPI相机帧捕获驱动程序

[]Blackfin BF5xx PPI驱动程序

==选择I2C支持==

启用I2C支持

启用I2C设备接口

选择I2C硬件总线支持

启用Generic Blackfin和HHBF533/561开发板I2C支持

选择BFIN I2C SDA/SCL选择

设置（2）SDA是PF[0:15]

设置（1）SCL是PF[0:15]

BF537-STAMP板

BF537具有内置的两线接口外围并且不同于BF333，并不需要通用的I2C支持。

在定制内核设置下

==选择装置驱动程序==

==选择字符装置==

启用[*]Blackfin BF53x可编程标志驱动程序

启用[*]Blackfin BF5xx PPI相机帧捕获驱动程序。

[]Blackfin BF5xx PPI驱动程序

==选择I2C支持==

启用I2C支持

启用I2C设备接口

选择I2C硬件总线支持

启用Blackfin TWI I2C支持。

Claims (24)

1.一种用于确定优选固定在固体载体上的多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

（i）使所述多核苷酸接触至少第一和第二测试探针，所述至少第一和第二测试探针各自包含可以互补于在所述多核苷酸中的一个或多个碱基的部分，以及可选地至少一个测试互补碱基，所述至少一个测试互补碱基各自可以互补于在所述多核苷酸中的碱基，以及当所述测试互补探针的所述测试第一或第二互补部分互补于在所述多核苷酸中的所述一个或多个碱基时，通过所述第一或第二探针与所述多核苷酸的连接，将所述第一或第二测试互补探针共价结合于所述多核苷酸；

（ii）加入第一酶，所述第一酶能够除去所述第一测试探针的至少一部分和通过切割反应测序的所述多核苷酸的至少一个碱基，如果所述第一测试探针结合于所述多核苷酸，然后顺次地加入至少第二酶，所述第二酶能够除去所述第二测试探针的至少一部分，如果所述第二测试探针结合于所述多核苷酸，其中每种所述酶是不同的并且对于所述第一或第二探针具有特异性；

（iii）可选地，用至少两种不同的测试互补探针和至少两种酶，重复步骤（i）和（ii），其中所述酶可以相同或不同于在步骤（ii）中所用的酶，直到具有互补于所述一个或多个碱基的部分的测试探针已结合于所述多核苷酸，以及可选地测试互补碱基已结合于所述多核苷酸；

（iv）通过确定在步骤（i）、（ii）或（iii）期间所述测试互补碱基和/或探针是否结合于所述多核苷酸，确定结合于所述多核苷酸的所述一个或多个碱基的所述测试探针的测试互补碱基和/或互补部分，以确定所述多核苷酸的所述一个或多个碱基；

其中进行步骤（i）至（iv）的每个循环一次或多次，以及在每个循环中确定所述序列的一个或多个碱基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（i）中使用至少第一、第二、第三和第四测试探针，所述测试探针各自包含可以互补于在所述多核苷酸中的一个或多个碱基的部分，以及在步骤（ii）中使用至少第一、第二、第三和第四酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，在每个循环中，确定一个碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（i）中使用至少第一和第二测试探针，所述至少第一和第二测试探针各自包含可以互补于在所述多核苷酸中的一个或多个碱基的部分，在步骤（ii）中使用至少第一和第二酶，以及在每个循环中确定所述序列的一个以上的碱基。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，进行至少两个循环。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述酶是核酸酶，所述核酸酶具有与它的识别部位分开的切割部位，所述测试探针包含针对所述核酸酶的识别部位，以及在所述方法中使用的各种酶具有不同的识别部位。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酶是限制酶，优选IIb型限制酶，以及在所述方法中使用的各种酶是不同的限制酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，确定步骤（iv）包括确定与所述测试探针和/或测试互补碱基有关的信号的存在、不存在或水平，其中信号的存在指示所述测试碱基和/或探针的结合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述切割步骤以前和以后，确定与所述测试探针和/或测试互补碱基有关的信号水平，以及在切割以后信号的降低指示所述测试碱基和/或探针。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，通过与所述测试探针和/或测试互补碱基有关的信号单元提供所述信号。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，将所述信号单元连接于所述测试探针和/或测试互补碱基。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述方法中，将结合对的第一结合伴侣连接于所述测试探针和/或测试互补碱基，将所述信号单元连接于所述结合对的第二结合伴侣，以及将所述第一结合伴侣连接于所述第二结合伴侣。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中，所述信号单元是珠粒。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述珠粒的半径大于所述多核苷酸的长度。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述探针或在所述信号单元和所述测试互补探针和/或碱基之间的所述连接包括用于限制酶的识别部位，并且所述酶是在所述方法中使用的酶。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述珠粒是磁性的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述互补碱基或探针终止于另外的互补碱基或探针的结合。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中，在所述互补碱基和/或探针结合于所述多核苷酸以前或以后，将所述信号单元连接于所述互补碱基和/或所述探针。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二探针包括第一组和第二组探针，并将不同的信号单元连接于每组探针和/或测试碱基的至少两个探针，检测与所述不同的信号单元有关的信号以确定哪一个测试互补碱基和/或探针结合于所述多核苷酸，从而确定所述目标序列的一个或多个碱基的序列，其中确定的一个或多个碱基不同于在步骤（ii）期间通过确定被切割的探针所确定的一个或多个碱基。

20.根据权利要求10至19中任一项所述的方法，其中，利用设备检测所述信号单元，所述设备包括提供有用于检测所述信号单元的装置的表面。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述表面提供有一个或多个感应元件，优选光敏元件。

22.根据权利要求10至21中任一项所述的方法，其中，所述检测是通过检测光变化，所述光变化是由于在光敏表面上所述信号单元的存在。

23.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中，除去所述珠粒和/或通过它的磁性检测。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述固体载体是芯片。

Images