CN103254427B - 一种具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法 - Google Patents
一种具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103254427B CN103254427B CN201310150901.4A CN201310150901A CN103254427B CN 103254427 B CN103254427 B CN 103254427B CN 201310150901 A CN201310150901 A CN 201310150901A CN 103254427 B CN103254427 B CN 103254427B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polymkeric substance
- sensitive
- acid
- mol ratio
- ortho ester
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种制备具有支化结构的、酸敏感、降解可控的系列聚合物的方法。此聚合物以乙二醇二缩水甘油醚A和一种二元胺酸敏感原酸酯单体B，结构式为
Description
技术领域
本发明属于生物医药、高分子医用材料技术领域，具体涉及一中具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法。
背景技术
基因治疗指将可以产生特异性蛋白的基因插入病人细胞来纠正遗传缺失或治疗后天性疾病，包括癌症、艾滋病、糖尿病等，是近二十年来兴起的新型治疗方法，有广阔的发展前景。而安全、有效的基因传递系统是制约基因治疗实施的一个主要瓶颈。目前研究最多的阳离子高分子载体是聚乙酰亚胺(PEI)。由于其质子海绵效应具有较高的转染效率。分子量低于1.8KDa的PEI几乎没有转染效果，随着分子量和支化程度的增高，其对DNA包裹能力增强，但由于细胞毒性增大，转染效果增大到一定程度后开始下降。因此，控制合适的聚合物的结构对高分子基因载体非常重要。
常见的阳离子聚合物如PEI、聚赖氨酸、壳聚糖、树装大分子等，通过静电作用与DNA形成聚电解质复合物，可有效缩合质粒DNA。但是，强烈的静电作用也限制了基因进入细胞液后从复合物中的释放，限制基因表达。医学研究表明，正常和病理情形中都存在许多pH梯度。比如肿瘤的pH值为6.8，就比血液和正常组织(约7.4)要略低些。虽然细胞内吞作用通道开始都接近7.4的生理环境，但是到内酶体是pH降到5.5-6.0，当到达溶酶体时pH会降的更低，只有4.5-5.0。细胞内不同组分的pH值梯度及显著的理化性质的变化，具有酸敏感的基因转运体系将对基因的细胞内传递产生积极影响。pH酸敏感聚合物载体可以通过改变自身大分子构象、结构对外界微环境的刺激做出响应，可以有效解决常规聚合物载体对于DNA“包装易、拆解难”的弊端，应用前景良好。
本研究中合成的具有支化结构的阳离子聚合物，通过控制其支化程度的不同，可以具有不同程度的包裹DNA能力，不同程度的细胞毒性，不同程度的酸敏感缓控释性能及不同的细胞转染效果。通过本系列聚合物的比较性实验，可以得出聚合物支化结构和细胞毒性及细胞转染效果之间的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物。该系列聚合物基因载体具有不同的支化结构、酸敏感、降解可控、生物相容性好、制备方法简单、成本低等优点。
本发明的目的在于提供上述具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物的制备方法。该制备方法工艺简单，易于控制，成本低廉。
本发明的目的在于提供上述阳离子聚合物在基因治疗中作为基因载体的应用。
本发明的目的在于提供一系列具有支化结构、具有原酸酯酸敏感基团、降解可控的聚合物。是以乙二醇二缩水甘油醚A和一种二元胺原酸酯单体B为骨架聚合而成，B的结构式为 其中，n为1-10，A和B的聚合摩尔比范围为1-2∶1。
本发明提供的具有支化结构、具有原酸酯酸敏感基团、降解可控的系列聚合物的制备方法包括以下步骤：称取含有乙二醇二缩水甘油醚结构单元的化合物A溶于DMF中，向其中按摩尔比1∶1-2(二元胺型酸敏感单体∶乙二醇二缩水甘油醚)投入二元胺型酸敏感单体B，搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h；将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水中(其中加入0.01％三乙胺)透析24-48h；产物冷冻干燥后即得。
本发明提供的具有支化结构、具有原酸酯酸敏感基团、降解可控的系列聚合物，在于A、B在聚合时的比例不同，获得的聚合物的结构和支化程度不同。当A与B摩尔比为1∶1时，聚合物主要以线性形式存在；随着A摩尔比增加，线性聚合物间开始交联(支化)，从而形成网状；当A和B摩尔比达到2∶1时，聚合物将形成三维立体网状结构，即随着A摩尔量增加，支化程度逐步提高。
本发明提供的具有支化结构、具有原酸酯酸敏感基团、降解可控的系列聚合物，其自身带有的正电荷 可以和带有负电荷的基因稳定结合成纳米级复合物，其具有的酸敏感基团和降解可控的特点，使其可以作为高效、稳定、低毒、缓控释的基因载体应用与基因治疗领域。
本发明提供的具有支化结构、具有原酸酯酸敏感基团、降解可控的系列聚合物，其和基因形成稳定的纳米级复合物的方法为将权利要求1所述的聚合物和基因药物(DNA/RNA)用去离子水溶解，混合，涡旋振荡30s，室温静止30min，聚合物即可以和DNA/RNA通过静电结合自组装成纳米复合物。
附图说明
图1为乙二醇二缩水甘油醚(n＝1)和二元胺原酸酯单体按照摩尔比为1∶1、1.5∶1和2∶1的比例合成得到的聚合物1、2、3的可能存在的结构之一。
图2为MTT法测定聚合物1、2、3细胞毒性示意图；其中，图2-2为2-1的局部放大图；
图3-1为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的粒径分析图；
图3-2为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的电位分析图；
图4为聚合物1、2、3在pH4，5，6，7.4下的降解图
图5-1、图5-2、图5-3为复合物1、2、3在pH4，5，6，7.4环境下的降解实验
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。本发明不局限于如下实施例，在本发明权利要求所阐明的范围内，可对本发明进行各种改变和等同替换。
实施例1具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备方法
取乙二醇二缩水甘油醚(n＝1)0.283g置于双颈瓶中，加入1mL DMF，搅拌溶解后，向其中加入0.5g二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型酸敏感单体摩尔比＝1∶1)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h；将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01％三乙胺)透析24-48h；精确量取1mL透析产品冷冻干燥，称取冻干后的质量，即得到1mL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物1。
取乙二醇二缩水甘油醚(n＝1)0.424g置于双颈瓶中，加入1mL DMF，搅拌溶解后，向其中加入0.5g二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型酸敏感单体摩尔比＝1.5∶1)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h；将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01％三乙胺)透析24-48h；精确量取1mL透析产品冷冻干燥，称取冻干后的质量，即得到1mL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物2。
取乙二醇二缩水甘油醚(n＝1)0.565g置于双颈瓶中，加入1mL DMF，搅拌溶解后，向其中加入0.5g二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型酸敏感单体摩尔比＝2∶1)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h；将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01％三乙胺)透析24-48h；精确量取1mL透析产品冷冻干燥，称取冻干后的质量，即得到1mL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物3。
如图1所示，将二元胺型酸敏感单体与乙二醇二缩水甘油醚在不同的摩尔比的条件下，开环加成聚合，形成微观结构为线性、支化或网状型高聚物。当两者摩尔比为1∶1时，聚合物主要以线性形式存在；随着单体2的增加，线性聚合物间开始交联(支化)，从而形成网状；当单体1∶单体2的摩尔比为1∶2，聚合物将形成三维立体网状结构(图1)。图1中所示图形只是形成聚合物的其中一些可能性，可以生成多种其他支化交联方式不同的聚合物，未在图1中显示。
实施例21HNMR检测聚合物1、2、3的结构
通过核磁共振仪确定合成聚合物1，2，3的结构。使用BRUKERAVANCE III HD(400MHz)核磁共振仪器检测1H NMR。溶剂为CD3Cl。
实施例3以MTT法测定聚合物的细胞毒性
NIH/3T3细胞接种到96孔板中(1×104个/孔)，每孔加入含10％胎牛血清DMEM培养基200μL37℃，5％CO2条件下培养24h。弃培养基，向各孔加入180μL新鲜DMEM培养基及以20μL以20mM HEPES溶液配置系列浓度的阳离子聚合物溶液，使聚合物终浓度为：1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、 100mg/mL、500mg/mL、1000mg/mL、5000mg/mL。37℃，5％CO2条件下再培养24h。每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续培养4h。终止培养，弃去孔内培养上清液，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡10min。测定各孔于570nm的吸光值，计算细胞活性(见图2)。
如图2得知，聚合物1、2、3的随着支化程度的提高，细胞毒性增加。但是聚合物1、2、3比PEI的细胞毒性小很多。PEI在浓度为25mg/mL的时候，细胞存活率为50％。而聚合物1、2、3分别在3500mg/mL、1000mg/mL和275mg/mL时，细胞存活率为50％。
实施例4复合物形成
以绿色荧光蛋白质粒pEG-N1为研究对象考察DNA和阳离子聚合物的结合情况。提取纯度＞95％的pEG-N1溶解于20mM HEPES溶液中，配置成0.1μg/μL的DNA储液；用20mM HEPES溶液将聚合物1、2、3稀释到合适浓度梯度。取50μL DNA储液(即DNA量为5μg)，向其中加入50μL复合物梯度浓度溶液，使最终体积为100μL，并使DNA∶聚合物(质量比)分别为8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。将复合物涡旋振荡30s，室温放置20min即得。
实施例5复合物粒径的测定和Zeta电位的测定
按DNA∶聚合物(质量比)8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16配置复合物，每组中DNA量均为5μg，复合物终体积为100μL。涡旋振荡30s混匀复合物，室温下静止20min。利用马尔文粒径及电位分析仪测定各复合物的粒径(见图3-1)和电位(见图3-2)。
如图3得知，当聚合物1、2、3与DNA的质量比为4∶1及更高时，聚合物均可以压缩DNA并形成稳定的、直径大小在150-250nm左右的复合物。并且随着聚合物的质量比的增大，复合物粒径变小，当质量比达到16∶1时，复合物粒径为150nm左右。在聚合物1、2、3形成的复合物中，聚合物2压缩DNA形成的复合物粒径最小，说明聚合物1、2、3均可以和DNA形成稳定的复合物，其中聚合物2的对DNA的压缩最为有效。
实施例6聚合物1、2、3在pH4，5，6，7.4环境下的降解实验
将聚合物1、2、3分别溶解在150mM CD3COOD/CD3COONa缓冲液(pH4、pH5)和150mMD3PO4/NaOD冲液(pH6、pH7.4)中，使用BRUKER AVANCE III HD(400MHz)核磁共振仪器检测1H NMR。于以下时间点(0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、144h、168h)取样检测。原聚合物中的原酸酯峰出现在5.94ppm(峰1)，降解产物峰出现在8.13-8.38ppm(峰2)处，通过检测峰1占峰1和峰2总面积的比例，可以检测聚合物1、2、3在不同pH下的降解情况(如图4)。
由图4表明，聚合物1、2、3均为酸敏感，pH越低，降解速度越快。pH为4和5时，化合物1、2、3在2-3d内几乎都降解了。pH为6时，酸性减弱，原酸酯基团的降解速度减弱，且随着聚合物的支化程度增大，降解速率逐渐变慢。pH为7.4时，降解更加缓慢，支化程度最高的聚合物3在2d只能降解10％。
实施例7复合物1、2、3在pH4，5，6，7.4环境下的降解实验
配制100mM的pH为4和5的醋酸缓冲液及pH为6和7.4的磷酸缓冲液。取DNA∶聚合物(质量比)8∶1的复合物(50μLDNA+50μL聚合物)，在pH7.4的环境下复合20min。将复合物加入200μL100mM的不同pH值的缓冲液中，测定缓冲液pH，微调至原设定的pH值。计时。
取不同时间点(3h，6h，12h，24h)的复合物经琼脂糖凝胶电泳检测载体与DNA的复合情况(见图5)。其中，图5-1、5-2和5-3分别是聚合物1、2、3在不同pH下经3h，6h，12h，24h降解的情况。由图可见，复合物1、2、3在pH4和5的环境下，均是3h就可以出现降解。复合物1在pH＝6的环境下，也是3h开始降解，并逐步完全降解；但是在pH＝7.4时，3h开始部分降解，至24h降解依旧不完全。复合物2在pH＝6的环境下，3-6h时出现不完全降解，随时间推移逐步完全降解；在pH＝7.4时，复合物2有降解，但程度很低，降解24h也不能将DNA完成释放，聚合物对DNA仍有阻滞作用。复合物3在pH6环境下，3h开始降解；在pH7.4的情况下，3h有降解，但是随着时间推移，降解程度变低。
以上结论表明，聚合物1、2、3中，聚合物2的结构最适合包裹DNA。聚合物1主要结构为线性高分子，因此在酸敏感降解后，将DNA释放；聚合物2的结构主要为带支化结构的高分子，推测其酸敏感降解后的结构和聚合物1降解前类似，因此降解产物依旧有包裹DNA的作用，所以出现降解18-24h后DNA重新被包裹、释放程度变低的可能。聚合物3的结构主要为三维立体的高支化程度的高分子，推测其酸敏感降解后的结构和聚合物2降解前类似，因此降解产物依旧有包裹DNA的作用，所以也会出现随 着时间推移，DNA被重新包裹、释放程度变低的可能，且此种重新包裹DNA的情况比聚合物2更容易发生，重新包裹程度也更大。
Claims (3)
1.一种具有支化结构、含有原酸酯酸敏感基团、降解可控的聚合物，其特征为该聚合物以乙二醇二缩水甘油醚A和一种二元胺原酸酯单体B聚合而成，结构式为其中，n为1-10，A和B的聚合摩尔比范围为1-2∶1。
2.如权利要求1所述的具有支化结构、具有原酸酯酸敏感基团、降解可控的聚合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：称取含有乙二醇二缩水甘油醚结构单元的化合物A溶于DMF中，向其中按二元胺原酸酯单体∶乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比1∶1-2投入二元胺原酸酯单体B，搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h，将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，再加入0.01％三乙胺的蒸馏水中透析24-48h，产物冷冻干燥后即得。
3.一种纳米级复合物的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的聚合物和基因药物用去离子水溶解，混合，涡旋振荡30s，室温静止30min，聚合物和基因药物通过静电结合自组装成纳米级复合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310150901.4A CN103254427B (zh) | 2013-04-27 | 2013-04-27 | 一种具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310150901.4A CN103254427B (zh) | 2013-04-27 | 2013-04-27 | 一种具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103254427A CN103254427A (zh) | 2013-08-21 |
| CN103254427B true CN103254427B (zh) | 2015-09-23 |
Family
ID=48958672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310150901.4A Expired - Fee Related CN103254427B (zh) | 2013-04-27 | 2013-04-27 | 一种具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103254427B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112494460B (zh) * | 2020-12-10 | 2022-03-11 | 浙江大飞龙动物保健品股份有限公司 | 替米考星粉剂及其制备方法 |
| CN114366711A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-04-19 | 安徽大学 | 原酸酯混溶物药用辅料、制备方法、包含该辅料的局部缓释给药制剂 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001025225A2 (en) * | 1999-09-30 | 2001-04-12 | Resolution Research Nederland B.V. | Adducts of glycidylesters of alpha, alpha-branched carboxylic acids and acrylic acids and poly(ortho ester) as intermediate for their preparation |
-
2013
- 2013-04-27 CN CN201310150901.4A patent/CN103254427B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001025225A2 (en) * | 1999-09-30 | 2001-04-12 | Resolution Research Nederland B.V. | Adducts of glycidylesters of alpha, alpha-branched carboxylic acids and acrylic acids and poly(ortho ester) as intermediate for their preparation |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Amphiphilic Block Copolymers Bearing Ortho Ester Side-Chains: pH-Dependent Hydrolysis and Self-Assembly in Water;Rupei Tang等;《Macromol. Biosci.》;20101231;第10卷;192–201 * |
| Block copolymer micelles with acid-labile ortho ester side-chains: Synthesis,characterization, and enhanced drug delivery to human glioma cells;Rupei Tang等;《Journal of Controlled Release》;20101229;第151卷;18-27 * |
| pH-Responsive Micelles Based on Amphiphilic Block Copolymers Bearing Ortho Ester Pendants as Potential Drug Carriers;Rupei Tang等;《Macromol. Chem. Phys.》;20110405;第212卷(第11期);1185–1192 * |
| Synthesis and characterization of new poly(ortho ester amidine) copolymers for non-viral gene delivery;Rupei Tang等;《Polymer》;20110109;第52卷;921-932 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103254427A (zh) | 2013-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Enhanced endosomal/lysosomal escape by distearoyl phosphoethanolamine-polycarboxybetaine lipid for systemic delivery of siRNA | |
| EP1499358B1 (en) | Ph-sensitive polymer | |
| CN105968276B (zh) | 一种酸敏感的两亲性阳离子共聚物及其纳米粒与应用 | |
| CN102335435B (zh) | 多功能聚氨酯药物载体及其制备和应用 | |
| CN104231193A (zh) | 一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法和应用 | |
| CN103254442B (zh) | 二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物及其制备方法和应用 | |
| Cheng et al. | The effect of guanidinylation of PEGylated poly (2-aminoethyl methacrylate) on the systemic delivery of siRNA | |
| Zhang et al. | PEGylated poly (amine-co-ester) micelles as biodegradable non-viral gene vectors with enhanced stability, reduced toxicity and higher in vivo transfection efficacy | |
| CN105524272B (zh) | 硫辛酸修饰的聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物的制备和应用 | |
| CN100536924C (zh) | 用聚乙烯亚胺修饰壳聚糖制备基因给药载体的方法 | |
| CN105131182B (zh) | 普朗尼克‑聚(β‑氨基酯)聚合物及其合成和应用方法 | |
| CN103656652B (zh) | 一种双敏感响应型聚合物纳米胶束及其制备方法和应用 | |
| CN102406946B (zh) | 高分子阿霉素键合药及其制备方法 | |
| CN103110954A (zh) | 胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途 | |
| CN103328542B (zh) | 由含氨基单体和杂环连接剂形成的阳离子聚合物 | |
| CN102851304A (zh) | 基于静电包衣的三元非病毒核酸递释系统及其制备方法 | |
| CN104892949A (zh) | 一种谷胱甘肽/pH双重刺激响应离子交联型聚合物纳米水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN103254427B (zh) | 一种具有支化结构、酸敏感、降解可控的系列聚合物及其制备方法 | |
| Lupi et al. | A biodistribution study of PEGylated PCL-based nanoparticles in C57BL/6 mice bearing B16/F10 melanoma | |
| CN102924653B (zh) | 聚（n-异丙基丙烯酰胺）-聚（丙烯酸或丙烯酸衍生物）共聚物及其制备方法 | |
| CN108524529B (zh) | 基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用 | |
| CN104721140B (zh) | 具有靶向可控释药和栓塞效应的两亲离子型载药囊泡的制备方法 | |
| Wang et al. | Co-delivery of 5-fluorocytosine and cytosine deaminase into glioma cells mediated by an intracellular environment-responsive nanovesicle | |
| CN109762099A (zh) | 一种聚合物-抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和用途 | |
| Luo et al. | Amphiphilic block copolymers bearing six-membered ortho ester ring in side chains as potential drug carriers: synthesis, characterization, and in vivo toxicity evaluation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201113 Address after: Room 1,020, Nanxun Science and Technology Pioneering Park, No. 666 Chaoyang Road, Nanxun District, Huzhou City, Zhejiang Province, 313000 Patentee after: Huzhou You Yan Intellectual Property Service Co.,Ltd. Address before: 214062 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800, Jiangnan University Patentee before: Jiangnan University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201211 Address after: No.1, floor 2, building 1, No.9, section 4, Hongxing Road, Jinjiang District, Chengdu, Sichuan 610011 Patentee after: Chengdu miaoshun Huize Environmental Protection Technology Co.,Ltd. Address before: 313000 room 1020, science and Technology Pioneer Park, 666 Chaoyang Road, Nanxun Town, Nanxun District, Huzhou, Zhejiang. Patentee before: Huzhou You Yan Intellectual Property Service Co.,Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150923 |