CN103249829A - 用于自动化精子操作的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于自动化计算机控制地跟踪和操作游动样品的系统和方法。本发明的系统和方法适于跟踪和操作精子，尤其适于精子卵浆内注射(ICSI)操作。本发明亦涉及用于保持诸如精子等游动细胞和诸如卵母细胞等非游动细胞的装置。本发明的装置包含具有空气出口的密封室、用于游动细胞的一个孔以及用于非游动细胞的另一个孔。

Description

用于自动化精子操作的系统和方法
发明领域
本发明涉及用于自动化跟踪和操作游动样品的系统和方法。本发明亦涉及用于保持游动细胞和非游动细胞的装置。
发明背景
精子操作广泛用于临床实践和研究，其使用小型工具(例如微量移液管)与精子相互作用。例如，在用于体外受精的医学操作精子卵浆内注射(ICSI)中，通过微量移液管吹打/固定精子、将其吸入微量移液管中并自微量移液管分配至卵母细胞(即卵细胞)中。
精子操作一般手动进行。操作者经由操纵杆来控制微量移液管的运动，以在光学显微镜下在物理上吹打/操作精子。精子固定需要微量移液管将精子尾挤压(吹打)至表面(例如，皮氏培养皿的底部)上。因此，精子固定可以是具有严格技术要求的具挑战性的操作。因健康精子的快速移动(25μm/秒)所致，精子可快速移出显微镜的视野。操作者需要通过注视显微镜的目镜来小心地监测精子的运动并且手动移动显微镜载物台以将精子保持在视野内，同时试图移动微量移液管吹打精子尾(厚度小于1 μm)以进行固定。
与使用微量移液管用于精子操作不同，EPO专利公布号19803651公开了使用脉冲激光器将精子固定在培养基中的方法。此方法提供了用于精子固定的备选方法，但是未将精子固定程序自动化。其亦不能进行诸如吸取和分配精子等其它操作。美国专利号7,875,845公开了使用光学镊子在系统的不同区域之间移动微观粒子(例如精子)的系统。PCT公布号W02010115167公开了使用介电电泳(DEP)场提取和分离微观粒子(例如精子)的系统。
工业和学术界已非常关注精子和其它生物材料的辅助分析。美国专利号7,526,116和7,720,272公开了在显微镜载玻片上的关注区域内自动化鉴定精子的系统。美国专利号7,252,642和美国专利申请公布号2011149287、2011147591、2007245812和20040146848公开了用于定量样品内总精子浓度的方法、视频可视化系统以及用于观察精子样品的显示工具。美国专利号7,521,696公开了用于分析荧光标记的生物材料的方法。使用者在图像中使用荧光来手动示踪生物材料。美国专利号7,042,639、7,106,502和7,268,939公开了利用图像处理技术来鉴定、探测和跟踪显微镜标本(例如生物细胞)的成像系统。美国专利申请公布号2010046823公开了用于视觉跟踪移动目标(例如生物细胞)的自动化系统和方法。
美国专利号4,402,614和4,176,953公开了一种方法，其将一束光对准精子，并测定每单位时间来自精子的光反射以测定精子活力。美国专利号7,838,210公开了用于分选精细胞的方法。美国专利号7,943,384、7,758,811和7,799,569公开了基于精子的某些特征(例如DNA含量)来将精细胞分选和分类的系统。美国专利号4,896,967和美国专利号4,896,966公开了使用辐射遥感方法和信号处理来推断精细胞、细菌和粒子的运动的光学系统。美国专利号7,855,078公开了能够基于一种或多种特征来分离精子的流式细胞仪。美国专利公布号2011061472公开了用于分离精子和用于确定精液样品中精子质量的微流体装置。
在计算机辅助的精子分析(CASA)领域已开发数种算法来示踪精子轨迹、测定精子速度和评估精子能量学(L. Shi, J. Nascimento, C. Chandsawangbhuwana, E. Botvinick和M. Berns, "An automatic system to study sperm motility and energetics(研究精子活力和能量学的自动系统)," Biomed. Microdevices,第10卷,第573-583页, 2008; L. Z. Shi, J. M. Nascimento, M. W. Berns和E. L. Botvinick, "Computer-based tracking of single sperm(基于计算机的单精子示踪)," J. Biomed. Opt.,第11卷, 2006; M. Berezansky, H. Greenspan, D. Cohen-Or和O. Eitan, "Segmentation and tracking of human sperm cells using spatiotemporal representation and clustering(利用时空表征和聚类划分和示踪人精细胞)," Progr. Biomed. Opt. imaging Proc.,第6512卷, 2007; H. Oku, M. Ishikawa, N. Ogawa, K. Shiba和M. Yoshida, "How to track spermatozoa using high-speed visual feedback(如何利用高速视觉反馈跟踪精子),"载于Proc. Annu. lnt. Conf. IEEE Eng, Med. Biol. Soc. EMBC, 2008，第125-128页;以及R. P. Amann和D. F. Katz, "Reflections on CASA after 25 years(25年后对CASA的感想)," J. Androl.,第25卷,第317-325页, 2004)。
然而，前述计算机辅助的精子分析法仅与可视精子分析有关，并且不能将精子操作自动化。鉴于以上，需要的是用于进行自动化精子操作的系统和方法。自动化精子操作克服了哺乳动物精子操作中的固有限制。为了实现自动化精子操作，以下可为必需的：(1)集成有多个机动化定位装置和成像装置的系统；(2)用于实时跟踪精子的空间位置的计算机视觉算法；和(3)用于控制机动化定位器来操作精子的运动控制法。
吸持移液管(holding pipette)为用于在ICSI中固定单卵母细胞的标准工具。寻找卵母细胞并使其固定很费时。亦需要的是用于固定多个卵母细胞和用于在同一装置上容纳精子以显著促进ICSI的装置、优选一次性装置。
关于基于真空的细胞保持装置存在数个现有专利。美国专利申请公布号2007048857和欧洲专利公布号1752221公开了通过捕获孔施用负压吸力的细胞捕获板。类似地，美国专利申请公布号20050250197和美国专利号5,262,128亦公开了经由通孔和真空施用的细胞捕获装置。这些专利文件的装置的通孔在装置表面上。
还没有用于ICSI用途的能够固定多个卵母细胞并在同一装置上容纳精子的细胞保持装置。需要的是这样的装置设计，其(1)能够有效捕获/释放多个卵母细胞并保持精子；(2)能够在装置上适当容纳细胞和液体培养基；和(3)为一次性和低成本的。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供用于在显微镜下自动化跟踪和操作游动样品的系统，其特征在于所述系统包含：(a)第一定位器，所述第一定位器适于支持含有游动样品的基底，以及适于控制所述基底的运动，所述第一定位器与主机可操作地连接；(b)控制操作工具运动以操作基底中的游动样品的第二定位器，所述第二定位器与主机可操作地连接；(c)用于观察基底中的游动样品和操作工具的显微镜工具，所述显微镜工具与主机可操作地连接；(d)能够安装在显微镜工具上的图像获取装置，所述图像获取装置与主机可操作地连接，并且所述图像获取装置能够向主机提供游动样品和操作工具的图像；和(e)主机，所述主机包含用于处理由图像获取装置提供的图像的工具、用于第一定位器的运动控制以自动跟踪游动样品的工具以及用于第二定位器的运动控制以使用操作工具自动操作游动样品的的工具。
在另一个实施方案中，本发明提供在显微镜下自动化操作游动样品的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(a)将含有游动样品的基底置于第一定位器上，所述第一定位器安装在具有图像获取装置的显微镜工具上；(b)使用图像获取装置获取游动样品和用于操作游动样品的微量移液管工具的显微图像；(c)使用第一定位器，基于游动样品和微量移液管工具的图像来自动跟踪基底上的游动样品；(d)使用与微量移液管工具连接的第二定位器，将微量移液管工具自动移至相当接近游动样品的位置；和(e)使用用于操作游动样品的微量移液管工具自动固定游动样品。
在本发明的方面，所述游动样品包括精子。
亦公开了用于保持游动细胞和非游动细胞的装置。因此，在另一个实施方案中，本发明提供用于保持游动细胞和非游动细胞的装置，所述装置包含：(a)能够接收游动细胞的一个或多个孔；(b)具有空气出口的密封室；和(c)能够接收非游动细胞的一个或多个孔，所述用于非游动细胞的一个或多个孔各自包含可操作用于保持非游动细胞通孔阵列，阵列中的每个通孔均在相对端具有开口，所述通孔将用于非游动细胞的孔与密封室连接。
在另一个实施方案中，本发明提供用于保持游动细胞和非游动细胞的装置，所述装置包含：(a)具有上表面和下表面的第一工具，所述上表面具有用于非游动细胞的至少一个孔，所述用于非游动细胞的至少一个孔包含用于保持非游动细胞的通孔阵列，阵列中的每个通孔从上表面延伸至下表面；和(b)与所述下表面连接的第二工具，所述第二工具具有用于游动细胞的至少一个孔以及这样的区域，所述区域配置用于在所述下底面与所述之间在所述孔下界定室，使得阵列中的通孔将所述室与用于非游动细胞的孔连接，所述室具有空气出口。
在本发明的方面中，所述游动细胞为精子，所述非游动细胞为卵母细胞。
附图简述
一个或多个实施方案的简述在本文中仅以实例的方式并参考以下附图来提供，其中：
图1阐述根据本发明的一个实施方案的自动化精子操作系统的示意图。
图2阐述根据本发明的一个实施方案的精子固定操作程序。
图3阐述根据本发明的一个实施方案的精子吸取操作程序。
图4阐述根据本发明的一个实施方案的在微量移液管内吸取和定位的多个精子的方案。
图5阐述根据本发明的一个实施方案的精子分配操作程序。
图6阐述根据本发明的一个实施方案的清除粘附在微量移液管外的碎屑的操作程序。
图7阐述根据本发明的一个实施方案的清除微量移液管内的阻塞物的操作程序。
图8阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置的侧截面图。
图9显示根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置顶部的透视图。
图10显示根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置基部的透视图。
图11阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置基部和顶部的组件。
图12阐述在ICSI操作期间根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置的侧截面图。
图13A阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置的通孔阵列结构的俯视图。
图13B阐述通过截面F-F的在图13A中阐述的结构的侧截面图。
图13C阐述通过截面E-E的在图13A中阐述的结构的侧截面图。
图14A阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置的精子孔设计的俯视图。
图14B阐述通过截面D-D的在图14A中阐述的精子孔的侧截面图。
图15A阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置的室的俯视图。
图15B阐述通过截面G-G的在图15A中阐述的精子孔的侧截面图。
图16阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子和固定/释放卵母细胞的装置的空气出口和管道之间的连接。
图17阐述根据本发明的一个实施方案的用于保持精子的装置的精子孔和用于固定/释放卵母细胞的多个孔的设计。
发明详述
1.定义
本文所用“自动的/自动化的”意指游动样品的操作没有人操作者控制(例如手动和/或基于操纵杆的控制)或者其中人为干涉限于输入数据。将软件(图像处理和运动控制)和硬件集成在计算机中以减少或消除操作者介入。
本文所用“控制软件/算法”意指以计算机程序的形式执行的运动控制律(例如比例-积分-微分)，所述计算机程序使利用本发明所示系统和方法的游动样品的跟踪和操纵自动化。
本文所用“图像处理”意指以下控制软件，其能够从通过图像获取装置、照相机/显微镜实时获取的图像中提取数据或信息、分析和应用所述数据或信息，并因此利用本发明所示系统和方法自动鉴定并跟踪游动样品和微量移液管。
本文所用“操作”意指游动样品的固定、吸取和/或分配，所述游动样品例如精子或任何其它单细胞或多细胞微生物实体。
本文所用“机动化的”意指定位装置装备有经由控制算法和策略控制的一个或多个电动机。
本文所用“运动控制”意指对定位装置(机动化平台、显微操作器和机动化压力装置)运动的计算机控制，以使用本发明所示硬件和方法进行游动样品的操作。
本发明公开了用于自动化操作游动样品的系统和方法。本发明亦提供用于保持游动样品例如游动细胞和非游动细胞的装置。
2.用于自动化跟踪和操作游动样品的系统
根据本发明一个实施方案的用于自动化跟踪和操作游动样品的系统的示意图如图1所示。根据此实施方案，用于自动化跟踪和操作游动样品的系统1可包含以下部件：
(i)主机10，其可包含用于运动控制和图像处理的控制软件/算法；
(ii)显微镜3，例如倒置光学显微镜；
(iii)图像获取装置，例如照相机6，可将其安装在显微镜3上；和
(iv)至少两个机动化定位装置(“定位器”)2、7，例如多自由度机动化平台2或多自由度机动化微型机器人/显微操作器7，其可分别能够控制用于保持诸如精子12等游动样品的基底17的运动，和用于操作游动样品的诸如微量移液管4等操作工具的运动；和
(v)与主机10连接或安装在主机10上的至少两个定位器控制装置15、16，其用于递送控制信号至两个定位器2、7用于两个定位器的受计算机控制的运动控制。
系统1亦可包含用于游动样品吸取和分配的机动化压力装置。所述机动化压力装置可包含注射器8和机动化平台9。
所述系统亦可包含基底，例如用于保持或容纳精子12的保持装置或容器17。
所述系统亦可包含隔振台11，以使显微镜、图像获取装置和定位装置的振动降至最低。
机动化定位装置2、7、显微镜3、图像获取装置6、压力装置8、9可受主机10控制以便使游动样品的操作自动化。
虽然本发明系统的该具体配置可用于精子的跟踪和操作，但应明确理解的是，这只是说明性实例以及本发明可容易地适于跟踪和操纵具有或不具有尾部的任何其它游动样品。其它游动样品可包括单细胞或多细胞微生物实体。
参考图1，可将含有精子和精子培养基的基底17置于多自由度机动化平台2上，可将所述平台安装在显微镜3上。可将微量移液管4 (其可以是直的微量移液管或成角度的微量移液管(玻璃毛细管))与微量移液管支架5连接以操纵精子12。可将照相机6安装在显微镜3上，以向系统提供精子12和微量移液管4的显微图像。多个机动化定位装置，例如多自由度机动化平台或显微操作器可用于在自动化精子操作中执行程序。所述多自由度机动化平台2可用于移动基底1，由此精子可出现在显微镜3的视野中。所述多自由度机动化显微操作器7可用于控制微量移液管4的运动。所述机动化压力装置可用于精子吸取和分配。可将注射器8 (其可包含在压力装置内)与微量移液管4连接。单自由度机动化装置9可用于控制注射器8内的活塞，以调整微量移液管4内的压力。主机10可用于自动控制多个机动化定位装置2、7、9和自动处理来自显微镜3和照相机6的图像。
3.用于自动化跟踪和操作游动样品的方法
在一个实施方案中，本发明提供自动跟踪和操作游动样品的方法。自动跟踪和操作游动样品的方法可如下开始：通过将含有游动样品的基底置于第一定位器上，所述第一定位器能够移动所述基底，使得所述游动样品可出现在具有图像获取装置的显微镜的视野中。可将所述第一定位器、显微镜工具和图像获取装置与主机连接。主机可包含用于运动控制和图像处理的控制软件。游动样品和用于操作游动样品的微量移液管的显微图像可使用图像获取装置自动获取。基于包含在显微图像中的信息，主机可使用第一定位器自动跟踪基底上的游动样品。利用跟踪信息，可使用与微量移液管连接的第二定位器将微量移液管自动移至与游动样品相当接近的位置，并且可使用用于操作靶游动样品的微量移液管基本上固定游动样品。
尽管下文所示方法可能涉及精子的自动跟踪和操作，但应明确理解的是，这只是说明性实例以及本发明可容易地适于跟踪和操作具有或不具有尾部的任何其它游动样品。其它游动样品可包括单细胞或多细胞微生物实体。
根据本发明的一个实施方案的自动化精子选择和固定方法的程序如图2所示。图2说明了一个精细胞的选择和固定；然而应理解的是，所述方法可用于选择和固定多于一个精细胞。所述程序可通过选择一个精细胞开始。图2(a)所示的精子选择步骤可以是手动的或自动化的。人操作者可首先通过计算机鼠标点击或靠近精子头51来选择关注精子或靶精子，如图2(a)所述。此步骤可允许人操作者基于精子形态和活力来选择所需精子，从而运用他/她的专业知识。或者，靶精子的选择亦可在无需人操作者的情况下经由图像处理自动化。然后可跟踪精子头51以提供对每张连续图像的精子位置的视觉反馈，所述图像通过包含在本发明系统中的图像获取装置捕获。可确定从精子头51至照相机的视野中心的空间距离。可将此空间距离输入控制器中，本发明系统的主机可使用其控制多自由度机动化平台来将该空间距离调节至零，使得可将精子保持在视野中心，如图2(b)所示。对于通过照相机捕获的每张连续图像，距离计算和多自由度机动化平台的运动可通过本发明的系统自动进行，以将精子维持在视野中心。
在本发明的一个实施方案中，精子尾跟踪算法可用于定位每帧图像中精子的尾52位置。精子尾所定位于或近似定位于并通过图2(b)中的方框100指出的区域(本文称为‘尾区’)，可通过将精子平均运动方向的换算值加入精子头位置51的各空间分量来计算。精子的平均运动方向可通过对许多最新的精子运动方向值取平均值来获得。例如，精子的平均运动方向可通过对约30个最新的精子运动方向值取平均值来获得。本领域普通技术人员应理解的是，少于30个精子运动方向值或多于30个精子运动方向值亦可用于获得精子的平均运动方向。根据照相机捕获帧速率和主机实时处理图像的计算能力，使用的运动方向值的数目范围可为15-60。给定图像帧中的精子运动方向，可通过从给定图像帧中的精子头位置减去前一图像帧中的精子头位置来计算。精子的平均运动方向可用于避免误差，所述误差由在照相机获取的连续图像(即图像帧)之间精子运动方向的突然局部变化所引起。然后精子尾跟踪算法可能能够通过从尾区中的图像提取闪烁特征来证实尾存在于尾区。闪烁特征例如可通过首先获得六个连续尾区图像帧之间的绝对差来计算。由前述的减法运算得到的图像可以是灰度图像。然后可将这些灰度图像加在一起形成尾区的闪烁特征图像(flicker feature image)。大于0 (非黑像素)的闪烁特征图像中的像素值代表暂时变化的区域(例如运动的精子尾)。闪烁特征图像中高强度的区域(即像素值远大于0的区域)对应于较大的暂时变化的区域。相比之下，闪烁特征图像中像素值0 (黑像素)代表无显著暂时变化(例如未变化的背景)。通过使用先前的尾区图像帧，闪烁特征图像代表在先前和当前图像帧中的尾位置史。本领域普通技术人员应理解的是，少于6个连续的尾区图像帧或多于6个连续的尾区图像帧可用于提取闪烁。用于建立闪烁特征图像的连续尾区图像帧的数量范围可为2帧-30帧。可需要最少2帧以进行用于闪烁特征计算的绝对减法运算。如果闪烁特征图像的像素总数超过特定阈值，那么可认为存在尾，否则可认为缺失尾或不存在尾。可通过将其中存在尾的尾区图像的像素总值与其中不存在尾的情形进行比较，来用实验获得阈值。一旦证实精子尾存在于尾区区域之内，则精子尾跟踪算法可找到精子尾上的位置。可通过在尾区的闪烁图像中找到具有最高像素强度值的区域，来获得精子尾上的相对位置。然后可对精子头51和精子尾52位置取平均值来定位用于精子尾固定的精子尾的中点位置50，如图2(b)所示。
用于控制微量移液管4的本发明系统的显微操作器可随后经历一系列运动来移动微量移液管4，以吹打/挥击/卷曲精子的中点位置50来固定精子。如图2(c)所示利用显微操作器(在图2中未显示)，可将微量移液管4自动移向精子尾的中点位置50。如在图2(d)中所述，微量移液管4可随后将精子尾压在容器(例如皮氏培养皿)的下表面上。如在图2(e)中所述，微量移液管4可随后翻转精子尾以将精子固定在下表面上。最后，可将微量移液管4放回至视野的左边，为下一次精子固定化操作做好准备，如图2(f)所示。
应理解的是，前述尾跟踪算法仅为用于定位精子上的位置用于固定化的一个实例。其它视觉信息，例如精子运动方向、精子速度和精子角速度可用于定位精子上的位置或靠近精子的位置用于进行固定化。
精子吸取法的操作程序如图3所示。如图3(a)所示，精子吸取可由使用相同的图像处理法来跟踪精子头51开始，所述图像处理法可用于自动化精子固定化。可利用图像处理自动识别微量移液管4的尖端。可计算微量移液管尖端和精子头之间的空间距离。然后显微操作器可经由运动控制将微量移液管4自动移至靠近精子头位置51，如图3(b)所示。
然后人操作者可输入(例如，经由计算机鼠标点击)微量移液管4中精子要到达的所需终点位置60，如图3(c)所示。或者，所需位置60可在没有人输入的情况下经由图像处理自动限定。然后可自动控制本发明系统的机动化压力装置来将精子吸入微量移液管中。可将规定终点和跟踪的精子头51之间的空间距离输入控制器中，本发明的系统可使用所述控制器控制机动化压力装置，将精子移至微量移液管内的指定终点，如图3(d)所示。所述精子吸取法亦可应用于吸取多个精子。可将多个精子吸入微量移液管中并且所述多个精子以两个精子之间的恒定间距(距离d)放置，如图4所示。通过装载多个精细胞，对于注入多个卵母细胞，所述系统无需返回精子库。
自动化精子分配法的操作程序如图5所示。图5显示这样的方案，其中可在精子卵浆内注射(ICSI)过程中，将一个精子分配进卵104的胞质102中。可设置(自动地或通过使用者经由鼠标点击)靠近微量移液管4尖端的区域101并可首先记录此区域的图像，如图5(a)所示。本发明的自动化系统可控制机动化压力装置，用精细受控压力使精子分配出微量移液管4。当精子头51从微量移液管4中出来并出现在区域101内时，可通过人视觉探测或经由主机内图像处理器提供的指令自动地视觉探测精子头51，如图5(b)所示。系统可随后停止机动化压力装置。
在ICSI中，可将精子样品连同培养基置于基底(例如皮氏培养皿)中。然后可加入矿物油来覆盖培养基和精子。在精子操作过程中，微量移液管周围的碎屑可容易地粘附在微量移液管外表面或阻塞微量移液管内部。因此，可能需要经常清洁微量移液管以减少由碎屑引起的不利影响。图6显示可用于清洁粘附在微量移液管4外部的碎屑620的操作程序。可通过显微操作器将微量移液管4提起(达距离L)至空气中(如图6(b)所示)，并且自动降至其原始位置。当微量移液管4穿过空气-矿物油界面时，大部分碎屑620可通过矿物油640的表面张力去除。
清洁微量移液管内的阻塞碎屑720的操作程序如图7所示。首先可通过显微操作器将微量移液管4移入矿物油740中，如图7(a)所示。然后可通过本发明系统的机动化压力装置提供压力脉冲，以将一定量的精子培养基推出微量移液管4，如图7(b)所示。可在微量移液管4的尖端形成培养基泡750。微量移液管内的大部分阻塞碎屑720可排入泡750中。然后可将微量移液管4浸回培养基730中并吸取一定量的培养基，如图7(c)所示。
应理解的是，用于维持精子的本领域已知的任何培养基均可用于本发明的系统和方法。在一个方面，所述培养基可以是本领域已知的任何粘性培养基，所述粘性培养基可用于减慢精子的移动性并利于精子跟踪和固定化(参见例如J Assist Reprod Genet. 2010年1月; 27(1): 13-16)。
4.用于游动细胞和非游动细胞的装置
在一个实施方案中，本发明涉及用于保持游动细胞和非游动细胞的装置。本发明的装置可包含用于游动细胞的至少一个孔，和用于非游动细胞的至少一个孔。所述用于非游动细胞的至少一个孔可包含用于基本保持非游动细胞的通孔阵列，阵列中的每个通孔可在相对端具有开口。所述通孔可将用于非游动细胞的孔与密封室连接。所述密封室可包含空气出口。
虽然本文提供的实例涉及本发明的装置在精子卵浆内注射(ICSI)中的用途，但应明确理解的是，这只是说明性实例以及本发明可容易地适于其它细胞操作程序。
本发明公开了能够批量保持/释放卵母细胞和精子用于ICSI用途的首个一次性装置。
参考图8，根据本发明的一个实施方案的装置80可包含精子孔或储存器920以及卵母细胞孔930。装置80亦可包含与卵母细胞孔930流体连通的密封室950。精子孔920可能能够接收精子917和用于精子的培养基914。可加入矿物油912来覆盖培养基914。精子孔920可设计为防止矿物油912溢流。
继续参考图8，卵母细胞孔930可能能够接收卵母细胞培养基919。在将卵母细胞915转入卵母细胞孔930中之后，可通过密封室950施用低负压。可将每个卵母细胞915基本上固定在通孔945之上，所述通孔945可设计成将卵母细胞孔930与密封室950连接，使得密封室950和卵母细胞孔930可以是流体连通的。然后可将装置80转移至用于ICSI操作的倒置显微镜的载物台上。在将所有卵母细胞915用精子917注入之后，可经由密封室950施用低正压，卵母细胞915可自通孔945中释放以收集。
在一个实施方案中，可将本发明的装置构建为具有两个或更多个部件的结构。可配置所述两个或更多个部件使得它们可装配成所述装置。在一个实施方案中，可将所述装置构建成具有两个部件的结构：上部或顶部和基部。
参考图9，本发明装置的上部或顶部900可包含卵母细胞储存器930和储存器930内的通孔945的阵列。
参考图10，本发明装置的底部或基部1000可包含精子储存器920、具有通道955的凹陷940以及用于将通道955与压力控制装置(未显示)连接的连接器或空气出口。可配置凹陷940用于接纳本发明装置的顶部。在顶部和基部耦合之后可封闭通道955，从而形成所述装置的密封室。完整的装置组件如图11所示。亦可提供浇口960，作为用于例如使用注射成型来利于制造的特征。
应理解的是所述装置的部件的其它设计可为可能的。例如，可在顶部塑造能够接收非游动细胞的孔。可将空气出口塑造成独立部件。因此，各功能部件的位置和模制部件的数量可能不同。因此，在一个实施方案中，本发明的装置可以是具有至少两个部件的组件，一个部件包含能够接收非游动细胞的一个或多个孔，和一个部件包含能够接收游动细胞的一个或多个孔。
在诸如ICSI等操作期间，可能需要适当定向卵母细胞的极体以避免穿透卵母细胞的极体。当卵母细胞旋转时，旋转期间的平移运动可致使卵母细胞改变其在像平面的位置或逃离出显微镜的视野。为了使平移运动降至最低，根据本发明的一个实施方案，可将卵母细胞孔的中心设计成与装置965的旋转轴一致，如图11所示。
卵母细胞孔区的侧横断面图如图12所示。可将卵母细胞储存器1330的壁1332设计成以特定角度α倾斜。倾斜角α可小于注射微量移液管4弯曲角β，由此在注射期间，注射微量移液管4的运动可不被卵母细胞孔1330的壁1332干扰/接触。可将卵母细胞孔1330的深度设计为深至足以容纳完全覆盖卵母细胞的培养基。
ICSI通常在倒置显微镜上进行。参考图12，可将自卵母细胞孔1330底部1334到装置底部1336的距离设计成在倒置显微镜上物镜1370的工作距离之内。卵母细胞孔底部上的通孔阵列1345可与密封室1350连接。当向密封室1350施用负压/正压时，卵母细胞以批量方式保持在通孔阵列1345上/自通孔阵列1345释放。
通孔阵列的一个可能的设计如图13A和13B所示。阵列中通孔的数量可不同，这取决于待注入精子的卵母细胞的数量。在超排卵患者中，用于ICSI的卵母细胞数量不同，尽管其在限定范围之内。通孔阵列的图案可对利于卵母细胞在负压下自我分配起重要作用并影响注射效率。通孔可以基本为正方形或基本为矩形的图案区1445排列。可使图案1445的中心位于卵母细胞孔1430底部的中心。图案区1445可按大小排列，由此在将卵母细胞转移至所述区域时，可以最小行程将卵母细胞吸至通孔。两个通孔之间的孔距可足以防止注射微量移液管在注射期间与邻近卵母细胞接触。对于哺乳动物卵母细胞，约0.4 mm的孔距可为合适的。可将通孔直径设计成在注射期间基本保持卵母细胞，同时防止卵母细胞变形。通孔的适当直径对于小鼠卵母细胞可为约30微米-约40微米，对于仓鼠卵母细胞可为约35微米-约45微米，以及对于人卵母细胞可为约45微米-约55微米。
参考图13C，可围绕卵母细胞孔的周边在下表面上打开腔957，由此使用注射成型将卵母细胞底部构建得尽可能薄而平可为可行的。可使围绕顶部和基部之间的室区的接触区保持足够大以保证容易和可靠的结合。可安排通孔的位置以使通孔可整齐排列在室区内。
在一个实施方案中，可将本发明装置中精子孔的位置设计成相对靠近卵母细胞孔，如图11所示。本发明装置的精子孔1520的通过图14A的截面D-D的侧截面图如图14B所示。与卵母细胞孔相似，可将精子孔1520的壁1522设计成以特定角度α倾斜。倾斜角α可小于微量移液管弯曲角β，由此在精子吹打和吸取期间，注射微量移液管可不干扰/接触精子孔的壁。将精子孔1520的深度设计为深至足以容纳足够的培养物或其它介质和矿物油。为了获得对精子清晰的显微镜聚焦，可将自精子孔底部到装置底部的距离设计成在倒置显微镜上物镜的工作距离之内。精子孔的下表面可以是无特征的平面。
本发明装置的密封室的设计可关键地影响气泡的生成。气泡不利地影响卵母细胞成像，致使ICSI操作困难。为了减少气泡生成的风险，如图15A和15B所示，一个实施方案可以是将室1650的角倒圆。本发明人已经通过实验证明此设计方法减少气泡生成的有效性。
参照图16，连接器或空气出口1755可例如经由管1756将密封室与压力泵(未显示)连接。可将连接器的内径设计成适合标准薄软塑料管，使得由管的意外弯曲造成的压力扰动降至最低。保持压力平衡亦可对降低气泡生成的可能性至关重要。
本发明用于游动细胞和非游动细胞的装置可包含多于一个精子孔和/或多于一个卵母细胞孔。图17说明了具有用于保持精子的精子孔171和用于固定/释放卵母细胞的多个孔172a、172b、172c的装置170的设计。可将多个孔172a、172b、172c中的每一个与对应的密封室173a、173b、173c连接。或者，可将多个孔与一个密封室连接(未显示)。图17说明了具有上部170a和基部17b的装置。
继续参考图17，在一个实施方案中，本发明的装置可在用于非游动细胞和游动细胞的每个孔周围包含肩或坝174，以容纳携有非游动细胞和游动细胞的样品及矿物油。坝174可用于适当维持孔内培养基的温度和pH。应理解的是，类似的坝可包含在与图11所示装置相似的装置中，所述装置具有用于保持精子的一个孔和用于保持卵母细胞的一个孔。
硅不是光学透明的，并且硅微型品制造为昂贵的。尽管玻璃为光学透明的，但是在玻璃上加工显微特征亦不适于细胞保持装置的大量制造。考虑成本和技术可行性，可选择注射成型来制造本发明的装置，通过激光技术钻取通孔。本发明装置的两部分结构可通过注射成型单独制作。材料选择可以是医用级LexanTM，其适于注射成型、光学透明且机械坚固，由此注射微量移液管不能划伤卵母细胞孔和精子孔的下表面。因此，在装置上保持的卵母细胞和精子可利用倒置显微镜清晰成像。所选材料亦可具有良好的热性能以在ICSI期间承受约37摄氏度而无显著的结构形变。可在ICSI操作期间保持此恒定温度，以满足标准化ICSI操作的要求。
本领域技术人员应理解的是，本文所述一个或多个实施方案的其它变化为可能的并且可在不背离本发明范围的情况下实施。

Claims (34)

1. 一种用于自动化跟踪和操作显微游动样品的系统，其特征在于所述系统包含：
(a)第一定位器，所述第一定位器适于支持含有游动样品的基底，以及适于控制所述基底的运动，所述第一定位器与主机可操作地连接；
(b)控制操作工具运动以操作基底中的游动样品的第二定位器，所述第二定位器与主机可操作地连接；
(c)用于观察基底中的游动样品和操作工具的显微镜工具，所述显微镜工具与主机可操作地连接；
(d)能够安装在显微镜工具上的图像获取装置，所述图像获取装置与主机可操作地连接，并且所述图像获取装置能够向主机提供游动样品和操作工具的图像；和
(e)主机，所述主机包含用于处理由图像获取装置提供的图像的工具、用于第一定位器的运动控制以自动跟踪游动样品的工具以及用于第二定位器的运动控制以使用操作工具自动操作游动样品的工具。
2. 权利要求1的系统，其特征在于所述系统还包含与操作工具连接的压力装置，以使用所述操作工具自动控制游动样品的吸取和分配，所述压力装置与主机可操作地连接。
3. 权利要求1的系统，其特征在于所述系统还包含隔振台，所述隔振台适于支持第一定位器、第二定位器、显微镜工具和图像获取工具。
4. 权利要求1的系统，其特征在于所述第一定位器为安装在显微镜工具上的多自由度机动化平台。
5. 权利要求1的系统，其特征在于所述第二定位器为多自由度机动化显微操作器。
6. 权利要求2的系统，其特征在于所述压力装置包含机动化平台和注射器，配置所述机动化平台以自动控制注射器内的活塞。
7. 一种自动化操作显微游动样品的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(a)将含有游动样品的基底置于第一定位器上，所述第一定位器安装在具有图像获取装置的显微镜工具上；
(b)使用图像获取装置获取游动样品和用于操作游动样品的微量移液管工具的显微图像；
(c)使用第一定位器，基于游动样品和微量移液管工具的图像来自动跟踪基底上的游动样品；
(d)使用与微量移液管工具连接的第二定位器，将微量移液管工具自动移至相当接近游动样品的位置；和
(e)使用用于操作游动样品的微量移液管工具自动固定游动样品。
8. 权利要求7的方法，其特征在于步骤(a)包括将含有多个显微游动样品的样本放在基底上，以及其中所述方法还包括在样本内选择靶显微游动样品。
9. 权利要求8的方法，其特征在于所述靶显微游动样品的选择通过计算机自动完成或通过操作者手动完成。
10. 权利要求7的方法，其特征在于所述显微游动样品含有尾，以及其中所述游动样品通过利用微量移液管工具将所述尾自动压在基底上来固定。
11. 权利要求10的方法，其特征在于所述方法还包括用于自动确定或接近尾的位置以及基于所述位置固定所述游动样品的步骤。
12. 权利要求7的方法，其特征在于所述方法还包括使用与微量移液管工具连接的机动化压力装置自动吸取所述游动样品的步骤。
13. 权利要求12的方法，其特征在于所述方法还包括选择微量移液管工具内所述游动样品要到达的所需终点，以及利用机动化压力装置将所述游动样品自动吸至微量移液管工具内的所需终点。
14. 权利要求12的方法，其特征在于所述方法还包括将多个游动样品自动吸入微量移液管工具中。
15. 权利要求12的方法，其特征在于所述方法还包括利用与微量移液管工具连接的机动化压力装置将精子自动分配出微量移液管工具的步骤。
16. 权利要求7的方法，其特征在于所述游动样品为精子。
17. 权利要求7的方法，其特征在于所述显微游动样品包含尾部和头部，以及其中步骤(c)包括：计算头部的近似位置、计算尾部的近似位置、计算所述显微游动样品的近似运动方向、计算所述显微游动样品的近似速度以及计算所述显微游动样品的近似角速度。
18. 权利要求7的方法，其特征在于通过将所述显微游动样品的样本连同培养基置于基底中并用矿物油相覆盖所述培养基和样本，来将所述显微游动样品置于基底上。
19. 权利要求18的方法，其特征在于所述方法还包括用于自动清洁微量移液管工具的外表面的方法，其中所述用于自动清洁微量移液管工具的外表面的方法包括以下步骤：(i)使用所述第二定位器利用显微操作器将微量移液管通过矿物油自动举出培养基并举入空气中；和(ii)利用所述第二定位器将微量移液管工具自动降低至培养液中。
20. 权利要求19的方法，其特征在于所述方法还包括用于自动清洁微量移液管工具内部的方法，其利用与微量移液管工具连接的机动化压力装置自动排出培养基，从而清洁微量移液管工具的内表面。
21. 一种用于保持游动细胞和非游动细胞的装置，所述装置包含：
(a)能够接收游动细胞的一个或多个孔；
(b)具有空气出口的密封室；和
(c)能够接收非游动细胞的一个或多个孔，用于非游动细胞的一个或多个孔各自包含可操作用于保持非游动细胞通孔阵列，阵列中的每个通孔均在相对端具有开口，所述通孔将用于非游动细胞的孔与密封室连接。
22. 权利要求21的装置，其特征在于在培养基中提供所述游动和非游动细胞，以及其中所述装置包含围绕用于所述游动和非游动细胞的每个孔的一个或多个坝，所述一个或多个坝能够容纳适于维持培养基温度和pH的物质。
23. 权利要求21的装置，其特征在于将所述装置制作成两个或更多个部件，将所述两个或更多个部件配置以装配成所述装置。
24. 权利要求21的装置，其特征在于所述装置包含具有至少两个部件的组件，一个部件包含能够接收非游动细胞的一个或多个孔，以及另一个部件包含能够接收游动细胞的一个或多个孔。
25. 权利要求21的装置，其特征在于所述装置为一次性的。
26. 权利要求21的装置，其特征在于将用于非游动细胞的一个或多个孔各自的中心配置成基本上靠近所述装置的旋转轴。
27. 权利要求21的装置，其特征在于用于游动细胞的一个或多个孔和用于非游动细胞的一个或多个孔含有斜壁。
28. 权利要求21的装置，其特征在于所述装置由光学透明的材料制造。
29. 权利要求21的单个装置，其特征在于配置所述装置以与倒置显微镜一起使用。
30. 权利要求21的单个装置，其特征在于用于游动细胞的一个或多个孔在操作上靠近用于非游动细胞的一个或多个孔。
31. 权利要求21的单个装置，其特征在于所述密封室包含圆角。
32. 权利要求21的装置，其特征在于所述下表面限定斜面，以及其中所述空气出口位于高于所述斜面的位置。
33. 权利要求21的装置，其特征在于所述游动细胞为精子而所述非游动细胞为卵母细胞。
34. 权利要求21的装置，其特征在于所述装置配置用于精子卵浆内注射或其它显微注射操作。
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