CN103245648B - 一种观察血管干细胞附壁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：1）取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；2）在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；3）将步骤1）得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。本发明易于实施、操作简便、结果明确，证明了用离体耳中动脉观察荧光标记的血管干细胞附壁是可行的。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞观察方法，具体涉及一种观察血管干细胞附壁的方法。
背景技术
明确血管干细胞、内皮前体细胞参与血管生理性修复和病理性结构重构及其机制和影响因素对理解心血管疾病发生发展和开辟新治疗途径有重要意义。血管干细胞的概念虽已确立，但因其发育分化的时空依赖性，目前未有明确、具体的表征方法。
多种标志物及功能特征被共用于表征血管干细胞，也就是说，基于不同时空背景或途径分离到多种有成血管潜力的细胞都可能是候选血管干细胞，如Flk+细胞、Flk-细胞、CD34+KDR+细胞、Flk+CD31+CD34+细胞等。明确一种血管干细胞首先需证明其参与血管生理性修复或病理性结构重构，要具备这些功能，其归巢、黏附于血管壁是最基本的步骤和观察指标。
中动脉病变与致命性心血管疾病关系最密切，如冠状动脉病变与冠心病的关系，脑中动脉病变与脑中风的关系等。国内外目前观察血管干细胞、内皮前体细胞归巢、黏附一般用较深部位的大动脉，如大鼠、小鼠和兔的劲总动脉、股动脉或微血管（包括新生血管），迄今未报道在中动脉的观察。
现有一些体内观察方法，如局部植入或静脉输入荧光标记（如GFP、CM-Dil等标记）的细胞，于不同时间段，取待测靶血管进行观察；或植入/输入其他方式标记（如BrdU）的细胞，于不同时间段，取血管标本，用组织化学、荧光免疫组织化学等方法观察、评价。这两种方法共同缺点有：①不能实时观察，观察时间点的选择有盲目性和随意性，观察点的取舍有随机性，从而影响评价的准确性；②了解细胞归巢、黏附动态变化、影响因素难度大，需投入较大的时间和成本。用超顺磁性氧化铁（造影剂)标记细胞磁共振成像可在体原位实时观察细胞附壁，但超顺磁性氧化铁有细胞毒性，如何解读观察结果仍存在争议。目前尚无观察血管干细胞、内皮前体细胞附壁的体外方法或模型。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明的目的在于提供一种血管干细胞附壁的方法，该方法能够简便、直观、有效的观察血管干细胞附壁情况。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：
1）取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；
2）在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；
3）将步骤1）得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。
所述的血管干细胞为内皮前体细胞，内皮前体细胞粘附于损伤的中动脉的受损部位。
在所述损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，在完整的中动脉未观察到荧光。
所述损伤的中动脉是采用球囊内皮损伤法、金属丝内皮损伤法、夹捏法或冻伤法将完整的中动脉损伤后得到的。
所述的灌流液为任-洛液，灌流速度为1.0～2.0mL/min。
所述加入灌流液中的经荧光染料标记的血管干细胞的量为1×106个细胞/50mL灌流液。
所述的恒温恒压条件是在37℃，60cm任-洛液液柱下进行。
所述的暴露出中动脉的新鲜离体耳是将新鲜离体耳中动脉区域的毛发脱除后得到的。
所述的洗脱是采用灌流液灌流5～10min，所述的固定是采用质量浓度为2～4%多聚甲醛，灌流10～15min。
所述的荧光显微镜采用落射荧光显微镜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明的观察血管干细胞附壁的方法，首次利用中动脉进行血管干细胞附壁观察，中动脉的病变与致命性心血管疾病的关系最为密切，观察损伤的中动脉的受损部位，可以发现，血管内皮受损后启动一系列炎症反应和血管新生，包括内皮修复、血管壁结构重构过程，说明血管干细胞可能参与这些过程。
本发明利用新鲜离体耳的中动脉，采用离体器官恒压灌流的方法，将荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，灌流至离体耳的中动脉中，用倒置显微镜观察血管干细胞的附壁情况，本方法易于实施、操作简便、结果明确，证明了用离体耳中动脉观察血管干细胞附壁是可行的。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明的观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：
1）取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；
2）在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；
3）将步骤1）得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。
具体以“观察自体晚期发育的内皮前体细胞粘附于内皮受损兔耳中动脉”为例，本发明采用日本大耳白兔，兔耳中动脉指耳背部外2/3段耳中动脉（长度随兔品系及年龄为4～10cm）。注：还可以选择其他品系、肤色、的健康状态的的兔耳。
1、方法
1）实验材料：新鲜离体兔耳，采自日本大耳白兔，雄性，体重2.0～2.2kg,由西安交通大学医学实验动物中心提供。
2）晚期发育的内皮前体细胞（OECs）体外扩增及鉴定：在戊巴比妥钠麻醉下，抽取兔的两股骨的骨髓共6mL，从中分离出超过2×108单个核细胞（MNCs）。将MNCs接种于胶原蛋白1包被的培养皿中用内皮细胞基础培养基（EBM-2)及添加剂（包括肝素、抗坏血酸、庆大霉素、两性霉素B、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、表皮生长因子等，均为Clonetics公司产品）培养28天，获得4～5×107贴壁细胞。细胞呈鹅卵石状，可摄入低密度脂蛋白，能结合血凝素，CD144、caveolin-1表达阳性，CD14、CD45表达阴性，产生一氧化氮，具迁移能力，在基质Matrigel-Matrix存在时可形成管状结构。
3）荧光染料标记：用CM-Dil标记OECs，细胞在贴壁状态下2μg/mLCM-Dil PBS溶液37℃孵育5min，4℃下15min，PBS洗两遍。
4）先用任-洛液，在恒温恒压条件下，对经预处理的新鲜离体兔耳中动脉灌流5～10min，灌流液自兔耳中动脉流入，由兔耳静脉流出；
5）离体兔耳灌流法观察自体OECs附壁：对离体兔耳行CM-Dil标记的自体OECs恒压灌流，即把1×106个细胞混悬于50mL任-洛液，用后者在37℃，60cm液柱下循环灌流兔耳1小时。
实验设3组：
①、耳中动脉内皮完整组
②、耳中动脉内皮受损组
采用球囊内皮损伤法、金属丝内皮损伤法、夹捏法或冻伤法将完整的中动脉损伤后得到的。
③、胶原蛋白1抗体处理组
细胞灌流前先用含小鼠抗牛胶原蛋白1抗体（Sigma公司产品，稀释100倍）灌流液灌流20min。此后分离耳中动脉，4%多聚甲醛固定后制成5μm厚冷冻切片，直接在落射荧光显微镜下观察，若观察不到红色荧光，将切片经FITC-标记的羊抗小鼠抗体孵育后观察。
2、结果与分析
离体兔耳灌流实验表明，CM-Dil标记的自体OECs恒压灌流1小时，荧光显微镜下，耳中动脉内皮受损段可看到极强的红色荧光，在其他部位未看到荧光，在内皮完整耳中动脉未看到荧光，在经胶原蛋白1抗体处理的耳中动脉内皮受损段也未看到荧光。
耳中动脉内皮受损段冷冻切片内膜层可观察到红色荧光，内皮完整耳中动脉、经胶原蛋白1抗体处理的内皮受损段耳中动脉冷冻切片均未直接观察到荧光，胶原蛋白1抗体处理的内皮受损段耳中动脉冷冻切片经FITC-标记的羊抗小鼠抗体孵育后在内膜层可观察到极强的绿色荧光。
从上述结果可以看出，血管内皮受损后启动一系列炎症反应和血管新生（包括内皮修复、血管壁结构重构）过程。血管干细胞、内皮前体细胞可能参与这些过程。内皮受损同时使胶原暴露，离体兔耳灌流实验提示，血管内皮受损后，循环血中的OECs很快归巢、粘附于受损区，胶原蛋白1有助于细胞粘附。循环血中内源性OECs数量极少，因此研究OECs的作用或治疗潜力，OECs应尽早输入。本实施例证明用兔耳中动脉观察荧光标记的血管干细胞、内皮前体细胞附壁是可行的。与有关的其他观察方法相比，该发明不仅易于和便于实施，而且结果明确，能解决其他方法不容易解决的问题。
Claims (10)
1.一种观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：
1)取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；
其特征在于，还包括以下步骤：
2)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；
3)将步骤1)得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述的血管干细胞为内皮前体细胞，内皮前体细胞粘附于损伤的中动脉的受损部位。
3.根据权利要求2所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，在所述损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，在完整的中动脉未观察到荧光。
4.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述损伤的中动脉是采用球囊内皮损伤法、金属丝内皮损伤法、夹捏法或冻伤法将完整的中动脉损伤后得到的。
5.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述的灌流液为任-洛液，灌流速度为1.0～2.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述加入灌流液中的经荧光染料标记的血管干细胞的量为1×106个细胞/50mL灌流液。
7.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述的恒温恒压条件是在37℃，60cm任-洛液液柱下进行。
8.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述的暴露出中动脉的新鲜离体耳是将新鲜离体耳中动脉区域的毛发脱除后得到的。
9.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述的洗脱是采用灌流液灌流5～10min，所述的固定是采用质量浓度为2～4％多聚甲醛，灌流10～15min。
10.根据权利要求1所述的一种观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，所述的荧光显微镜采用落射荧光显微镜。
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