CN103243098A - 靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种，本发明同时公开了靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶在治疗L型结核分枝杆菌引起的潜伏感染的药物中的用途。本发明综合了基因治疗与免疫治疗效果的优势，专门针对体内感染的耐药结核杆菌，特别是L型结核分枝杆菌发挥治疗作用。

Description

靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶及其应用

技术领域

本发明涉及锁核酸脱氧核酶，尤其涉及一种能够靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶，同时涉及该锁核酸脱氧核酶在靶向治疗普通和耐药结核杆菌引起的感染、特别是L型耐药结核杆菌引起的潜伏和持留感染领域的用途。

背景技术

结核病位居单一病原引起病人死亡的严重传染病之首，每年有200多万人死于结核病，有近870万病例新发。过去十年以来，结核病发病率一直在持续增加，但是最近40年中没有任何特异性抗结核药物研发出来。尤其值得指出的是，目前全球至少有5000万人已感染了耐多药结核（multidrug-resistant TB,MDR）。在各种原因导致的（如艾滋病、衰老、肿瘤等）免疫低下人群中形势更为严峻，据统计在艾滋病患者中每年有50万人死于继发的结核病。我国属结核病高流行区，总数居全球第二。当前结核病已经取代狂犬病成为我国传染病中的第一位死因。

目前困扰结核病防治工作的突出问题：

第一，大量潜伏感染病例的存在。全球有20亿人存在结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的潜伏感染，通常一部分活菌会在宿主体内持续终生并随时可能活化增殖，要想从根本上根治结核病，就必须解决这一问题，然而要对潜伏感染进行及时有效的治疗十分困难；

第二，多耐菌株的流行。据统计全球每年至少有27.3万耐药结核新发病例，有10%左右的新发结核病例携有MDR株（国内某些省份统计达到11%），而在曾经治疗过的病人中高达25%，其中药物诱导产生的L型（L-form）细菌的耐药问题更为突出；

第三，再燃与复发。Mtb是一种古老的胞内寄生菌，已经进化出了真核生物样的信号转导机制，能够调控宿主细胞的转运通路，以利于其在细胞内的存活；感染人体后寄生在单核/巨噬细胞内并通过抑制吞噬体-溶酶体融合、抑制吞噬体酸化、抵抗超氧离子及活性氮介质的杀伤、形成L型等机制在胞内长期持留。体内持留状态的Mtb具有活化潜能并可伺机四处播散。由于传统的抗结核药物主要通过干扰细菌DNA或细胞壁的合成在细菌繁殖阶段发挥作用，对

内增殖缓慢的持留菌无作用，这使得抗痨治疗时间延长。Mtb的胞内持留既是潜伏感染形成的基础，也是参与多耐菌株产生以及导致治疗后再燃和复发的关键因素；

第四，防治效果的差异。结核感染后的转归取决于环境、结核菌和宿主间的相互作用，宿主的免疫素质和免疫状态是决定感染后转归的重要因素。同一标准治疗方案在不同免疫背景人群中的反应千差万别。

研究开发更为行之有效的结核病预防与治疗措施已成为当务之急。

显然，单纯依赖经典的化疗方案并不能解决以上问题，因此致力于开拓覆盖药物治疗、免疫治疗、基因治疗等措施，以对结核病进行全面、综合治疗的新领域将具有良好前景。WHO在90年代就提出了结核病药物治疗应与免疫治疗相结合的综合治疗新理念。

在体内免疫压力环境中，或通过某些治疗药物的诱导作用，结核病患者体内有部分Mtb形成L型菌或称细胞壁缺陷型菌（cell-wall deficient forms,CWDF）并在体内长期存活和持留。MtbL型的形成，与结核病的久治不愈，再燃和复发，肺外播散，多药耐药等现象的形成密切相关。利用传统的细菌学技术所作的大样本研究表明：MtbL型在活动性结核和非活动性结核患者样本中都可以大量检出，在实际临床各期结核中，正常形态的Mtb与L型实际上是同时并存的，在结核病患者体内存在着各种处于不同代谢状态的Mtb。临床药物治疗时，结核病患者体内大部分的Mtb可在1-2周内被抗结核药物杀灭，但是为了杀灭残留的细胞内持留菌仍需维持化疗5个月以上。而如果形成了L型Mtb的感染，传统的抗结核药物将不起作用。那么常规抗结核药物的治疗程序就值得推敲。Mtb形成L型之后，对常规的抗结核药物将产生抗性，菌体形态因细胞壁缺损也表现为多形性。然而正是因为缺少了细胞壁屏障，对一些特殊基因药物如锁核酸脱氧核酶而言，反而更加有利于其进入细菌体内对靶分子进行切割。

RelA是一种Mtb调节蛋白。Mtb要在

内持留，就必须承受细胞内杀菌成分对其造成的巨大生存压力。在漫长的进化过程中，Mtb发展出独特的信号传递系统，以保证其在不同的感染周期中启动不同的反应元件，调节基因的表达来适应环境。在众多压力反应（stringent response）调节元件中，RelA起着十分关键的作用。在不利条件下，它可以催化GTP过磷酸化为(p)ppGpp。(p)ppGpp是Mtb的一种信号分子，它作为RNA聚合酶的配体与其β亚单位结合后，可转导引发一系列后续的连锁反应；同时它也影响细菌σ因子与RNA聚合酶的结合。研究认为，细菌对环境压力的抵抗与耐受是RelA依赖性的，产生的(p)ppGpp信号可分别介导细菌对抗生素的抵抗、耐紫外线存活、损伤DNA的修复等。灭活RelA的Mtb在压力环境下不能够长期存活。多种与细菌细胞内持留有关的物质及细菌毒力因子基因的表达都与(p)ppGpp水平有关，包括影响细菌细胞壁合成、蛋白质分泌、哺乳动物细胞进入蛋白(mce)的产生等。在最近的研究中发现，RelA是抗结核持续感染的较好靶点之一。值得指出的是，长期持留菌与Mtb活性繁殖体之间在形态与染色性上存在差异，从肺部分离的持留菌的多形性和染色性与细菌压力条件下特别是营养缺乏状态下的表现极为相近，这与RelA的启动条件完全一致；另有研究表明，RelA与分枝杆菌细胞壁改变引起的细菌形态、菌落形成等密切相关，这对于L型细胞壁缺陷型Mtb的形成是十分重要的，因此在本研究中，选择切割其mRNA作为阻断L型Mtb细胞内持留的关键靶位。

虽然全球每年有800多万人感染了Mtb，但其中只有10%发展成为结核病。这是由于感染人群对Mtb抵抗力的遗传差异，特别是介导固有免疫反应的、抗细胞内病原体的基因差异造成的。机体的固有免疫反应不仅是感染初期最早和最重要的防线，而且在决定疾病的转归、彻底杀灭胞内菌，尤其是L型Mtb引起的细胞内潜伏感染中，也具有无可替代的关键作用。有效的抗结核免疫保护反应依赖于IFN-γ和TNF-α等免疫介质对

的激活，IFN-γ通过激活感染的

诱导产生NOS2、LRG-47等机制直接阻断Mtb的繁殖；而IFN-γ主要是由NK细胞和IL-12、IL-18等Th1型细胞因子激活的T细胞分泌的；这些Th1型细胞因子最初又是由Mtb激活Toll样受体后的树突状细胞和

产生的，与此同时Toll样受体（Toll like receptor,TLR）激活后也诱导TNF-α、IL-1β、趋化因子、防御素等前炎性细胞因子的生成，并通过一系列后续免疫反应，建立获得性免疫，从而使90%以上的感染者得到保护。Mtb包含丰富的脂类抗原，此类抗原能够通过CD1分子呈递给CD1限制性T细胞并诱导产生保护性免疫。同时还可激活免疫细胞的Toll受体，诱导产生白细胞介素12（IL-12）；而IL-12的产生在控制胞内菌感染中处于上游关键地位，IL-12受体缺陷病人由于缺乏IL-12依赖的IFN-γ的分泌而导致严重的分枝杆菌感染，这种依赖Toll样受体激活模式的固有免疫反应在机体抗结核感染过程中，尤其是在杀灭细胞内潜伏的Mtb时所起的作用是十分高效和重要的。

Toll样受体是一种模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs），目前至少包含13种受体，其中与介导病原体感染免疫反应密切相关的主要有TLR2（识别细菌脂蛋白，脂肽）、TLR4（识别LPS）、TLR9（识别细菌CpG基序）、TLR7（识别RNA基序）、TLR8（识别RNA基序），其中TLR2、TLR4、TLR8、TLR9都已经发现与机体抗结核保护性免疫反应有关。在固有免疫反应中，激活Toll样受体可产生对细胞内病原体的直接杀伤活性，在小鼠中主要是通过NO途径，在人类TLR激活后可导致

的维生素D受体等基因表达上调，介导产生一种具有直接杀伤Mtb的抗菌肽“cathelicidin”，从而影响人群对Mtb感染的敏感性；另一方面，实验表明Toll样受体激活产生的抗微生物活性如果受到抑制，就会导致宿主固有免疫反应的抑制，从而引起感染的扩散。但是，TLR2激活途径在介导机体抗结核免疫时仍然在一定程度上存在着漏洞[32]。最新研究表明，TLR7主要识别RNA基序，多种病毒的RNA基序具有TLR7激活功能，这些RNA可以是单链构象的，也可以是双链构象的。值得指出的是，TLR7的激活在介导免疫细胞的“自噬作用”（Autophagy）中效能最强。而“自噬作用”是新近才认识到的一种固有免疫防御机制，它能够打破内潜伏的Mtb对吞噬溶酶体成熟过程的阻抑，在清除细胞内感染中具有重要意义。有趣的是：利用配体激活TLR7后，刺激细胞产生“自噬作用”可以有效消除胞内菌，即使该细菌通常与TLR7不相关联。这为通过此途径治疗细胞内病原体感染提供了契机。

人们对核酸功能的理解目前已经不再局限于遗传信息携带和功能研究领域。核酶（Ribozyme）的发现使人们首次认识到核酸也可具有酶的催化功能。1997年，Santro和Joyce通过体外分子进化技术（SELEX技术）筛选发现一种能专一识别并催化切割RNA的寡脱氧核苷酸分子，称为脱氧核酶。迄今为止已发现了几十种脱氧核酶，至少能催化7种化学反应。其中一种具有10-23基序（10-23motif）的脱氧核酶（10-23DNAzyme or10-23deoxyribozyme）被认为最具应用潜力。它是在模拟生理浓度下能切割所有RNA的Mg2+依赖型DNAzyme，10-23脱氧核酶由15个脱氧核苷酸构成保守的活性中心域，两侧分别连有一条由7～10个脱氧核苷酸构成的底物结合臂。通过两边的底物结合臂与靶RNA特异性结合后，10-23DNAzyme能高效、特异地对靶mRNA进行切割，其切割的靶位为“5＇-R↓Y-3＇”序列（R=A／G,Y=U／C;↓为切割部位）。该切割位点在几乎所有的mRNA分子中普遍存在（包括所有mRNA的翻译起始密码子“AUG”序列）。由于具有较高的切割特异性、切割效率和稳定性，10-23DNAzyme较反义核酸及核酶更为优越，自被发现以来，特别是作为基因表达抑制剂在基因治疗方面，已被成功地用于病毒感染、肿瘤、心血管等疾病的基因治疗，且在细胞和动物实验水平都取得了很好的效果，对靶RNA的切割效率最高可达90%以上。《Science》等杂志评论认为10-23DNAzyme会在不久的将来走向临床，为众多疾病的治疗提供崭新的手段。

虽然与反义RNA、核酶等RNA类药物相比，10-23DNAzyme具有较好的稳定性，但化学合成的10-23DNAzyme仍面临半衰期不够长，容易受DNA酶降解等问题；而且10-23DNAzyme在针对耐药结核杆菌，特别是L型结核分枝杆菌时，存在功能单一的局限，因此需要在此方面需求新的突破。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶及其应用，从而消除上述背景技术中缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种。

其中，

SEQ ID NO:1：

1ccct^Ltaa^Lcga tcaggctagc tacaacgact^L tct^Lggtagcc cgucuguugu gugacuc57SEQ ID NO:2：

1gcccgucugu ugugugacuc ccct^Ltaa^Lcga tcaggctagc tacaacgact^L tct^Lggta57SEQ ID NO:3：

1acca^Lggt^Lcgt ggaggctagc tacaacgagt cgt^Lcga^Lagcc cgucuguugu gugacuc57

以上三段锁核酸脱氧核酶是特异DNA序列和RNA序列的杂合链，均可用现有的核酸合成仪进行方便的合成及修饰，三者均具有共同的活性中心域AGGCTAGCTACAACGA，活性中心域的两侧分别连有脱氧核苷酸构成的底物结合臂，并且底物结合臂的其中一个末端均利用TLR7激活基序杂合修饰。TLR7激活基序为GCCCGUCUGUUGUGUGACUC，其具有TLR7激活作用，为富含“u”的RNA序列。其中，u为尿嘧啶。

本发明中，采用锁核酸来增强脱氧核酶的效能。锁核酸(locked nucleicacid,LNA)是一种核酸类似物，其化学结构与一般核酸分子最大的不同之处是其五碳环中的第二个碳上的氧分子会与第四个碳形成锁状键结结构。它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点，如和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(ΔTm=3～8℃)、抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性、良好的水溶性、可自由穿入细胞膜、易被机体吸收、体内无毒性作用、高效的自动寡聚化作用、合成方法相对简单等。

其中，序列表中的t^L和a^L为锁核酸修饰的碱基。

发明人用体外转录系统和细胞培养感染模型进行研究的结果显示：所构建的此锁核酸脱氧核酶对结核杆菌生存所必须的调节子RelA mRNA在细胞外与细胞内都具有很好的靶向切割活性，能够明显抑制L型结核杆菌和有细胞壁结核杆菌在巨噬细胞内的增长，同时核酶对宿主细胞无明显的毒副作用。

发明人利用细胞培养对TLR7 RNA基序激活后的下游免疫分子的表达变化进行检测结果显示：RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶对TLR7有很好的激活作用，能够明显上调巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12的含量，明显诱导巨噬细胞自噬，增加NO含量，明显抑制L型结核杆菌和有细胞壁结核杆菌在巨噬细胞内的增长。

发明人建立了L型Mtb感染的小鼠模型，动物实验评价了所述锁核酸脱氧核酶对L型Mtb感染的治疗作用，研究表明：本发明提供的锁核酸脱氧核酶专门针对体内感染的耐药结核杆菌，特别是L型结核分枝杆菌发挥治疗作用，也就是说，所述锁核酸脱氧核酶在治疗L型结核分枝杆菌引起的潜伏感染的药物中具有很大用途。

该类药物可以采用滴鼻、喷雾、皮下注射等给药方式。

发明人对三种锁核酸脱氧核酶的联用进行生物学实验，表明：当上述三种锁核酸脱氧核酶至少两种联用时，较之一种独用，对体内感染的耐药结核杆菌，特别是L型结核分枝杆菌发挥的治疗效果更佳。

SEQ ID NO:1、2、3单独和联合应用对细胞中感染的结核分枝杆菌H37Rv直接杀伤活性的荷菌量检测结果见表1-1。从表中可以看出，V4组（SEQ ID NO:1加SEQ ID NO:3联合应用）比V1-3组（SEQ ID NO:1、2、3单独应用）杀伤细胞内感染的H37Rv的能力明显增强，结果具有显著性差异（P<0.05）；V1组（SEQID NO:1单独应用）比V3组（SEQ ID NO:3单独应用）杀伤细胞内感染的H37Rv的能力无显著性差异（P>0.05，n=20）。

表1-1 H37Rv在各药物处理组细胞内的生存能力（Log₁₀CFU/孔,n=20,

）

Table1-1Viability of H37Rv in cells from different groups（Log₁₀CFU/well,n=20,

）

^aP<0.05vs V1-3;^bP>0.05vs V3.

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明通过对

内Mtb潜伏必需的调节子RelA进行靶向特异切割，从而对

内感染的L型Mtb感染进行治疗；本发明所述的锁核酸脱氧核酶利用TLR7激活基序杂合修饰，通过具有TLR7激活功能的RNA基序激活

和其他免疫细胞，引发“自噬作用”，利用固有免疫反应促进宿主对细胞内L型的杀伤，从而实现对体内感染的Mtb的彻底清除，立意新颖；所述锁核酸脱氧核酶利用锁核酸对部分碱基进行修饰，具有较好的稳定性、穿透性、生物安全性，其行使杀菌功能具有较强的特异性，对宿主细胞无明显毒副作用，同时其杀菌机理与目标Mtb是否多耐菌株无关，因此有望解决结核病防治中的胞内潜伏、多药耐药、再燃和复发等棘手问题；综合了基因治疗与免疫治疗的优势，在杀灭Mtb的同时，既避免了多重耐药与毒副作用的产生，又具有良好的生物安全性和开发前景。

总之，本发明综合了基因治疗与免疫治疗效果的优势，专门针对体内感染的耐药结核杆菌，特别是L型结核分枝杆菌发挥治疗作用。通过锁核酸脱氧核酶对巨噬细胞内结核杆菌存活必需的调节子RelA的靶向切割，直接抑制体内L型结核杆菌的潜伏；与此同时，该核酶还通过具有TLR7激活功能的RNA基序修饰的杂合链激活巨噬细胞和其他免疫细胞，从而激发机体固有的免疫反应体系，促进宿主对细胞内持留的L型结核杆菌的杀伤，从而实现对体内感染的结核杆菌的彻底清除。

附图说明

图1为结核分枝杆菌Rel A mRNA二级结构的模拟图；

图2为Rel A mRNA的PCR扩增结果及重组质粒pET32-RelA的双酶切鉴定电泳图；

图3为Rel A基因的测序图；

图4为Rel A全长mRNA的电泳图；

图5为LDZ1～LDZ6切割活性的体外筛选结果的电泳图；

图6锁核酸脱氧核酶杀菌时间-菌量曲线；

图7巨噬细胞裂解后，正常细胞壁结核杆菌在罗氏培养基上的培养；

图8核酶处理的巨噬细胞；

图9TLR7可明显诱导巨噬细胞自噬；

图10锁核酸脱氧核酶处理感染结核杆菌的巨噬细胞；

图11结核感染模型；

图12肺组织；

图中，RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶简称为核酶。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1:本发明的3条锁核酸脱氧核酶的设计、合成

1、以锁核酸作为脱氧核酶可替代部分的合成原料，以10-23脱氧核酶结构为基本框架，用计算机软件模拟RelA-mRNA的二级结构（图1），根据模拟的结构图选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性锁核酸脱氧核酶。进行效能分析、筛选与合成、特定基序组成的RNA成分的杂合与修饰。用TLR7激活的RNA基序的富含“U”的RNA序列进行杂合修饰，修饰部位在10-23脱氧核酶特异性识别结合臂的末端。

2、按10-23脱氧核酶的切割模式针对各候选靶位设计一系列不同底物结合臂长度的相应10-23锁核酸脱氧核酶序列，计算各10-23锁核酸脱氧核酶的底物结合臂与相应候选靶点的结合自由能ΔG，选择结合自由能在-20kcal·mol(-l)<ΔG<-25kcal·mol(-l)范围内的底物结合臂作为针对各候选靶点的10-23锁核酸脱氧核酶的最适底物结合臂。

3、计算上述各10-23锁核酸脱氧核酶自身序列杂交的杂交自由能，从中选择出7条自身杂交能力最弱的锁核酸脱氧核酶作为本研究的研究对象。

4、鉴定上述各10-23锁核酸脱氧核酶的切割活性后，针对活性最高者设计对照10-23锁核酸脱氧核酶，分别设计系列对照如：一侧底物结合臂序列中含一个不与RelA-mRNA配对的碱基、两侧底物结合臂序列中各含一个不与RelA-mRNA配对的碱基、活性中心域含一个突变碱基的寡脱氧核苷酸的对照等。

表1设计、合成的靶向切割Rel A mRNA的7条锁核酸脱氧核酶

实施例2：用体外转录系统获取结核分枝杆菌RelA全长mRNA

按细菌基因组DNA抽提试剂盒（大连TaKaRa公司）的说明书提取结核分枝杆菌H₃₇Rv的基因组DNA。

根据GenBank登录的RelA mRNA编码序列设计上游引物、下游引物，由北京三博远志生物技术有限公司合成。

上游：5’-GGGATCCGATATCATGGCCGAGGACCAGC-3’

下游：5’-GCGGCCGC AAGCTTCTACGCGGCCGAGGT-3’

以结核分枝杆菌H₃₇Rv的基因组DNA为模板进行PCR反应获取RelA基因。

PCR产物回收后用核酸内切酶EcoRV/Hind III（购自大连TaKaRa公司，也可从深圳晶美公司、英国NEB公司、美国Promega公司购买）进行双酶切，克隆入载体pET-32a(+)（购自Novagen公司），构建pET32a(+)-RelA质粒。双酶切鉴定无误（图2）后双向测序结果表明扩增出的RelA基因正确（图3）。线性化后，用T7体外转录试剂盒（购自美国Promega公司，也可从Invitrogen公司，Novagen公司购买）进行体外转录反应制备RelA mRNA。

纯化产物经1.5%变性琼脂糖凝胶电泳证实成功获得了RelA的全长mRNA（1.3Kb RelA mRNA序列+0.5Kb载体序列）(图4).经OD260/OD280测定，测得浓度为约700μg/mL。OD260/OD280＝1.9，证明所获得的RNA纯度较高，可用于后续的切割实验。

结论：成功获取结核分枝杆菌生存必须的调节子全长RelA mRNA。

实施例3：各锁核酸脱氧核酶细胞外对Rel A mRNA切割效果的观察

在7个反应管内按下表加入相应试剂（μL）：

各反应管置37℃温育60min后取出，用3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。再用核酸银染试剂盒（购自北京鼎国公司，也可从北京中山公司、上海生工公司购买）进行染色后用凝胶成像系统采集图象，测定各条带的光密度值，计算切割百分率。切割百分率(%)＝切割产物条带的总光密度值/（未切割底物条带光密度值＋切割产物条带的总光密度值）×100%。

结果：LDZ4、LDZ5的切割体系在相应位置出现较为明显的特异性切割产物条带（图5）。未加用10-23脱氧核酶的阴性对照反应后未见切割产物带。经密度扫描后，LDZ4、LDZ5对RelA mRNA的切割百分率分别为51.2%和30.8%。

结论：LDZ4和LDZ5均能不同程度地对RelA mRNA产生切割作用，可用于抗结核分枝杆菌的感染，特别是结核分枝杆菌的潜伏感染。

实施例4:锁核酸脱氧核酶切割RelA mRNA的特异性观察。

作为对照，本研究还设计了三条对照脱氧核酶，分别为：LDZ4-C1，即在LDZ4的一侧底物结合域序列中设计一个不与靶mRNA配对的碱基；LDZ4-C2，即在LDZ4两侧的结合域序列中各设计一个不与靶mRNA配对的碱基；LDZ4-C3，即在LDZ4的活性中心域设计一个突变碱基。

结果：在含Tris-cl（pH7.0）：50mM，MgCl2：15μM，RelA mRNA：1.5μg的各反应体系中分别加入0.2μM的LDZ4，LDZ4-C1，LDZ4-C2及LDZ4-C3，终反应体系为10μL。37℃温育60min后终止反应，3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察。

结果：当LDZ4的一侧结合域上存在一个不与靶RelA mRNA配对的碱基时，其切割活性大大降低，但仍具有一定的活性。而当其两侧结合域上各存在一个不与靶RelA mRNA配对的碱基或其活性中心域出现一个碱基突变时，LDZ4均完全丧失切割活性（图5）。

结论：本专利的锁核酸脱氧核酶具有较高的特异性。

实施例5:锁核酸脱氧核酶细胞外与细胞内切割结核杆菌活性的研究

将H37RV接种于苏通培养基培养20d后，用比浊法将培养物用苏通培养基稀释成108/mL的菌液，加入用无菌去离子水稀释的异烟肼，使其终浓度达到0.04μg/mL，置37°C培养。L型形成后用0.22μm孔径滤菌器过滤收集培养物。

用体外诱导生成的L型Mtb（108/mL）与筛选出的锁核酸脱氧核酶（浓度）共孵育0h、12h、24h、2d、3d、4d、和7d，分别于不同时间段以RealtimeRT-PCR法（染料结合法）检测对靶RNA的降解效果，并绘制切割曲线（图6）。

制备反转录混合反应液（20μL）：dNTP(2.5mM each)2μL；10xRT Buffer2μL；反转录特异引物(1μM)0.3μL；总RNA200ng；MMLV逆转录酶(200U/μL)0.3μL；RNA酶抑制剂(40U/μL)0.3μL；无RNA酶水至20μL。反转录条件：16°C30min；42°C40min；85°C5min。反应结束后，将其放在冰上待用或-20°C保存。用脂质体将锁核酸脱氧核酶导入培养的、已经感染Mtb细菌型的巨噬细胞株RAW264.7（比例为Mtb:Mφ=10:1，加入后孵育2h、充分洗涤、加入适量含卡那霉素的新鲜细胞培养液以清除胞外菌）中，于72h加入无菌1%Tritonx-100至终浓度0.1%裂解细胞，2000r/min离心收集上清液涂布罗氏培养基，37°C培养，观察结果（图7）。

结论：筛选得到的锁核酸脱氧核酶在体外对结核杆菌具有明显抑制作用；明显抑制结核杆菌L型和结核杆菌细菌型在巨噬细胞内的增长。

实施例6:锁核酸脱氧核酶对细胞可能的毒副作用检测

用脂质体lipofection2000(美国Invitrogen公司)（将锁核酸脱氧核酶转染培养的巨噬细胞株RAW264.7中，培养48h，胰酶消化收集细胞2000r/min离心10min后，弃上清，于2.5%戊二醛溶液中4°C固定细胞2h以上，PBS(pH7.2)冲洗，1%锇酸后固定，乙醇梯度脱水，100%丙酮浸透，环氧树脂包埋、切片，将铺于铜网上的切片经枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色后，透射电镜观察细胞内部有无超微结构的改变，包括线粒体、细胞核、内质网、高尔基体等的变化状态（图8）。

结论：锁核酸脱氧核酶对巨噬细胞本身无明显损伤作用。

实施例7:RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶对TLR7激活作用的研究

用脂质体lipofection2000(美国Invitrogen公司)将Ldzyme转染培养的巨噬细胞株RAW264.7中，37°C培养48h，收集上清液，2000r/min离心10min后，留取上清，检测培养上清液（TNF-α，IL-12以ELISA法检测（北京达科为生物技术有限公司产品）和NO（碧云天公司）的含量。同时消化收集细胞，并用电镜观察自噬小体（图9）和染色观察细胞内的细菌（图10）。

细胞因子检测步骤：分别设标准孔、待测样品孔。每孔加入标准品或待测样品50μL，37°C孵育2h，洗板，然后加入酶结合物，在37°C孵育1h。洗涤，每孔加入底物溶液，37°C孵育15min。终止：依序每孔加终止溶液50μL，混匀，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后尽快加入终止液。检测：用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度。在加终止液后30min以内进行检测。以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值计算出相应的浓度。

NO检测步骤：按50μL/孔，在96孔培养板中加入不同浓度的标准品（0,1,2，5,10,20,40,60和100μM）和样品，每个样本重复3孔；按50μL/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent I；按50μL/孔，在各孔中加入室温GriessReagent II；540nm测定吸光度。以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值计算出相应的浓度。

结论：能够明显上调巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12的含量，明显诱导巨噬细胞自噬，明显抑制L型结核杆菌和有细胞壁结核杆菌在巨噬细胞内的增长。

实施例8:RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶对L型Mtb感染动物治疗作用的研究

动物（SPF级小鼠购自山东大学医学院动物中心，具有动物合格证）建模：滴鼻10⁸个细菌/次，7天一次，共3次，随机杀死一只动物，取肺组织匀浆，PCR检测结核分枝杆菌的基因，同时取匀浆液离心作细菌培养，检测是否建模成功。

动物建模成功8周后开始治疗，治疗方案为：RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶：滴鼻给药（终浓度5μmol/L50μL/次)，隔日一次，每周三次，共治疗四周；药物治疗：利福平（Rifampicin）隔日灌胃，15mg/kg/d，共治疗四周；微卡（高温灭活的治疗用母牛分枝杆菌商品制剂）：按批号说明肌注。

动物分组（随机分为8组，每组10只）。

（1）实验组合I（感染组）：

对照组(L型Mtb感染后未加治疗)

药物+微卡治疗组

药物治疗组

RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶治疗组

药物＋RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶治疗组

药物＋RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶+微卡治疗组

（2）实验组合II（正常参照组，非感染后的治疗对照）：

对照组（正常SPF级小鼠）

RNA基序修饰的锁核酸脱氧核酶滴鼻免疫组

治疗效果的生物学指标检测：

（1）器官荷菌量：（肺脾器官荷菌量检测）于第一次治疗后8周处死各组（备注：每组留2只作生存时间观察）小鼠，无菌条件下取左肺及部分脾组织精确称量，研磨、倍比稀释后接种于专用培养基上，37°C培养6周后菌落计数；

（2）疾病指数：（脏器重量指数WI）准确称取小鼠体重及肺、脾、肝各脏器重量，按WI=100×脏器重量（mg）/小鼠体重(mg)计算肺、脾、肝各脏器重量指数；

（3）病理学指标：右下肺叶及脾组织4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色观察；

（4）小鼠生存时间和存活率（T50方法）。

治疗效果的免疫学指标检测：

（1）特异性脾淋巴细胞增殖实验（MTT法，PPD刺激）；

（2）ELISA法定量检测脾淋巴细胞分泌及血浆中IFN-γ、IL-12、IL-4、IgG2a的表达量；

取脾分离各组脾淋巴细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度至5×107/L，200μL/孔加入96孔细胞培养板，每组设3个复孔，5μL/孔PPD刺激，37°C50mL/LCO2孵箱中培养72h。5000r/min离心5min，取上清，用ELISA法检测各细胞因子含量。

结论：建立了小鼠L型结核分枝杆菌感染模型（图11），核酶治疗后小鼠生存时间和存活率明显上调；特异性脾淋巴细胞增殖活性增加；脾淋巴细胞分泌及血浆中IFN-γ、IL-12、IgG2a的表达量都明显增高，而IL-4明显下调；同时进行了器官荷菌量、病理学指标（图12）等的检测。

SEQ ID NO:1加SEQ ID NO:3联合应用组小鼠肺内活菌数较其他各组均明显偏低，与SEQ ID NO:1单独处理组相比较下降0.8～1.0log，差异具有显著性意义（P<0.05）；单独应用核酶药物组与联合应用组小鼠肺内活菌数与未处理组Mtb感染小鼠比较下降1.0～2.0log，差异具有显著性意义（P<0.05）；（Table1-2）。

表1-2.各组Mtb感染小鼠的肺组织荷菌量(n=10)

Table1-2Numbers of viable bacteria in the lungs of mice infected with various pretreated Mtb(n=10).

Note:^aP<0.05vs V1-3group.

^bP<0.05vs V1-4group.

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。

Claims (3)

1.靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种。

2.如权利要求1所述的靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶在治疗L型结核分枝杆菌引起的潜伏感染的药物中的用途。

3.如权利要求2所述的靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶在治疗L型结核分枝杆菌引起的潜伏感染的药物中的用途，其特征在于：核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3中的至少两种联用。

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