CN103240187A - 离心微流碟片及自样本分离目标物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种离心微流碟片及自样本分离目标物的方法，以及利用密度梯度在此离心微流圆分离与收集目标物或细胞的方法。

Description

离心微流碟片及自样本分离目标物的方法
技术领域
本发明是有关于一种分离方法，且特别是有关于一种离心微流碟片及自样本分离目标物的方法。
背景技术
微流技术广泛地应用于生物、医药以及生化的领域之中，切片基底(chip-based)的微流装置以及离心基底(centrifugal-based)的微流装置为两大主要范畴。对于离心基底(centrifugal-based)的微流装置而言，旋转产生的离心力被用以分离或净化(purify)生物样本。
离心装置的操作期间，第一组样本例如细胞、血液或生物流体等在旋转前被注入且贮存在碟片上，而下一组样本必须在旋转期间被保留。由于样本的非连续流输入的设计，离心微流装置不适于处理大量的样本。因此，离心微流平台在商业成就上相当有限，一般仅作为研究工具。。
发明内容
本发明提供一种离心微流碟片及自样本分离目标物的方法，以及利用密度梯度在此离心微流圆分离与收集细胞的方法。当此离心微流碟片适用于连续流体输入的自动工作站时，可轻易地处理大量的样本。
本发明提供一种离心微流碟片，至少包括一样本入口、一分离槽以及一收集槽。样本入口用以载入血液或生物样本。分离槽连接样本入口，其中分离槽包含一弧形部。收集槽连接分离槽。
本发明提供一种离心微流碟片，至少包括一样本入口、一分离槽、一沉降槽、一试剂入口以及一收集槽。样本入口用以载入血液或生物样本。分离槽连接样本入口，其中分离槽包含一弧形部。沉降槽连接分离槽。试剂入口用以载入一试剂，其中试剂入口经由一联结通道连接至收集槽。收集槽连接分离槽，其中样本的一第一流径不同于试剂的一第二流径。
本发明提供一种自样本分离目标物的方法，包括提供一离心微流碟片，其中离心微流碟片至少包括一样本入口、一分离槽、一沉降槽、一试剂入口以及一收集槽。样本入口用以载入血液或生物样本。分离槽连接样本入口，其中分离槽包含一弧形部。沉降槽连接分离槽。收集槽通过与分离槽彼此之间的至少一流道相互连接。接着，引入样本至离心微流碟片的样本入口。之后，旋转离心微流碟片，以驱动样本经由分离槽与沉降槽向外流动，其中目标物自分离槽内的样本分离出来，并进一步流至收集槽。
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。
附图说明
图1A根据本发明的一实施例示出离心微流碟片的三维视图；
图1B示出图1A的离心微流碟片的剖示图；
图1C示出图1A的离心微流碟片的另一剖示图；
图2根据本发明的一实施例示出离心微流碟片沿着厚度方向的局部剖示图；
图3根据本发明的一实施例示出离心微流碟片沿着厚度方向的另一局部剖示图；
图4根据本发明的一实施例示出自动工作站；
图5A示出细胞株MCF7的流率与回收比之间的关系；
图5B示出不同种类的细胞株的回收比。
附图标记说明：
100：离心微流碟片；
102：样本入口；
103：连接通道；
103a、104b：端；
104：分离槽；
105：密度梯度溶液；
106：沉降槽；
107：流道；
108：收集槽；
110：传送通道；
112：废料出口；
120：试剂入口；
122：汇流点；
124：联结通道；
400：自动工作站；
410：蠕动泵；
420：旋转平台；
B1：第一缓冲液；
B2：第二缓冲液；
BS：血液样本；
HC：大细胞；
LC、LC’：小细胞；
R：试剂；
V1～V6：夹紧阀。
具体实施方式
在所有附图中，沿用了相同的附图标记并详细描述以指明相同元件。在以下参考附图的详细阐述中，本发明将更为浅显易懂。
本发明提供一种离心微流碟片，以及利用密度梯度处理(例如分离、收集和/或标记)离心微流碟片内的细胞或目标分子的方法。此外，本发明提出一种自动工作站，用以操作离心微流碟片以及执行生物样本的处理。
本发明所公开的离心微流碟片或其分离方法可应用于处理不同种类的样本，包括所有的血液样本、血浆流体、尿液或者其他体液或生物流体。
在肿瘤(tumor)转移的过程中，在初步位置的侵入性肿瘤细胞倾向于使细胞流泻至血流，转移至其他细胞而生长成新肿瘤。然而，血流中的这些转移细胞(metastasized cells)是难以定位的，因为这些转移细胞与血液细胞(hematologic cells)相比是非常稀少的(大约每一亿个细胞中仅有一个肿瘤细胞)。值得注意的是，在血液内循环的这些转移细胞例如循环性癌细胞(CTCs)，可有助于提供肿瘤转移和/或特殊疗法的疗效所相关的潜在预测信息。为实验所需，这些罕见细胞(rare cells)例如循环性癌细胞，可自血液样本分离或收集。
在以下实施例中，所有血液作为生物样本的范例，而自所有血液分离与收集的罕见细胞可用于描述离心微流碟片以及自动工作站的运作。
图1A根据本发明的一实施例示出离心微流碟片的三维视图。图1B示出图1A的离心微流碟片的剖示图，而图1C示出图1A的离心微流碟片的另一剖示图。图1B示出了图1A的离心微流碟片的深部(下层)的剖面，而图1C示出了图1A的离心微流碟片的浅部(上层)的剖面。图1B与图1C的剖面是横切于图1A的离心微流碟片的厚度方向。离心微流碟片100可以是圆形或椭圆形碟片，且离心微流碟片100可以是由数个切片组装或彼此堆叠后制造而得。离心微流碟片100的材质可以是塑胶材料，例如聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)或其它热塑性塑料。离心微流碟片100的直径可以是在6与18厘米之间，举例而言，以12厘米为最佳。
请参照图1A至图1C，离心微流碟片100至少包括样本入口102、分离槽104、沉降槽106、收集槽108以及废料出口112。样本入口102位于离心微流碟片100的中央部位，且样本可通过样本入口102载入至离心微流碟片100。分离槽104通过连接通道103与样本入口102连接。连接通道103与分离槽104共同设计成自中央的样本入口102向外盘旋的螺旋形。分离槽104具有弧形以及分离槽104的弧形部(弧形部沿着离心微流碟片的圆周边缘)，且弧形部的尺寸大约为3厘米。连接通道103的尺寸大约为0.5厘米(连接通道103连接样本入口102至圆周部分)。
沉降槽106配置环绕分离槽104，但与分离槽104两者之间存在间距且相互分离。沉降槽106通过多个位于彼此之间的流道107与分离槽104连接，以致入射流体可在分离槽104与沉降槽106之间流动。连接通道103的一端103a物理连接样本入口102，而分离槽104的一端104b物理连接汇流点122。
如图1C所示，离心微流碟片100包括试剂入口120，位于离心微流碟片100的中央位置，而反应试剂可以通过试剂入口120载入至离心微流碟片100。试剂入口120与样本入口102皆为圆形开口，但试剂入口120与样本入口102为不同尺寸，并以同心(concentric)的方式配置于不同高度。位于上层的试剂入口120具有大于位于下层的样本入口102的尺寸。试剂入口120通过联结通道124连接汇流点122。汇流点122还通过传送通道110连接收集槽108。汇流点122垂直延伸而与位于上层的传送通道110及位于下层的分离槽104相通。废料出口112连接收集槽108，以使不必要的流体或运转(running)溶液自废料出口112排出。此外，储存在收集槽108的分离或收集样本可以自离心微流碟片100移除。
图2根据本发明的一实施例示出离心微流碟片沿着厚度方向的局部剖示图。请参照图1A至图2，图2集中在分离槽以及沉降槽的部分，以求显示出细胞或分子分离的原理。密度梯度溶液105在样本载入前，首先被载入至分离槽104以及沉降槽106。密度梯度溶液105例如是Ficoll-Paque溶液(Ficoll-paqueTMplus GE Healthcare，No.17-1440-02)。在离心微流碟片旋转100的期间，离心力驱动流体(流体样本以及缓冲液)自中央的样本入口102径向地向外流动，向外沿着连接通道103与分离槽104的螺旋形，接着朝向配置靠近于离心微流碟片100的圆周边缘且环绕分离槽104的沉降槽106向外流动。意即，流体样本例如血液样本，其包含了小细胞(light cells)LC以及大细胞(heavy cell)HC，自样本入口102载入并且流动至分离槽104(流向如箭头所示)。通过离心力的作用以及密度梯度溶液105的筛选，小细胞LC或小分子悬浮在分离槽104中，并自分离槽104进一步流动至收集槽108(流向如箭头所示)，而大细胞HC或大分子沉降并冲刷至沉降槽106。样本的流径起始于试剂入口102，沿着连接通道103、分离槽104及沉降槽106，且样本的部分终止于收集槽108。
通过调整流动条件和/或密度梯度溶液105的密度，目标细胞或分子可轻易地自生物样本脱离，且停留于收集槽108中。
当目标细胞或分子被收集在收集槽108内，可执行进一步的处理以制造目标细胞或分子。举例而言，在目标细胞抽出(withdrawal)之前，目标细胞可被进一步标记在收集槽108内。在这种情况下，标记试剂自试剂入口120而非样本入口102载入，并通过联结通道124、汇流点122、传送通道110而至收集槽108(如图1A所示)。试剂或标记试剂的流径起始于试剂入口120，经由汇流点122、传送通道110而终止于收集槽108，并无进入到分离槽104或沉降槽106内。
图3根据本发明的一实施例示出离心微流碟片沿着厚度方向的另一局部剖示图。图3集中在收集槽的部分，以求显示出细胞标记(cell labeling)的原理。如图3的上半部所示，小细胞LC被收集至收集槽108(流向如箭头所示)。后来，试剂R例如化学试剂、荧光染料(fluorescent dye)、抗体(antibodies)、免疫标示物(immuno-marker)、量子点(quantum dots)、磁珠(magnetic bead)或其它标记或样本配置材料被载入至收集槽108并培养小细胞LC(图3的中段部所示)，接着在培养之后可得到标记的小细胞LC’(图3的下半部所示)。最后，注入洗涤缓冲液(washing buffer)以冲洗出未反应的标记试剂。标记过程可以是任何有效的标记过程，例如免疫标记(immuno-labeling)、荧光标记(fluorescence labeling)或磁珠标记(magnetic bead labeling)。
在本实施例中，标记过程仅仅执行一次，但如有需要，收集于收集槽内的目标物可被执行数次标记例如复数标记或复合标示标记(multi-markerlabeling)。
根据本发明的数个实施例，离心微流碟片可与自动工作站同时运作。
图4根据本发明的一实施例示出自动工作站。自动工作站400包括至少一蠕动泵(peristaltic pump)410、旋转平台420以及夹紧阀(pinch valve)V1～V6。外部的蠕动泵410可驱动流体或缓冲溶液，以提供血液样本稳定的流率。夹紧阀V1～V6允许快速的流体输送及关断(shut-off)，以致整个工作站可以轻易地程序化。旋转平台420可由马达提供动力，以使离心微流碟片于高速下旋转而得到高生产率支配(throughput handing)。自动工作站400接受连续的流体输入，通过蠕动泵410持续推送流体样本(例如血液样本)与缓冲液，并在离心微流碟片100运转期间持续注入血液样本。自动工作站400的流动机制(flow mechanism)如图4所示，而流向是由箭头所标记。举例而言，夹紧阀V1～V4分别控制了血液样本BS、第一缓冲液B1、试剂R以及第二缓冲液B2的载入。通过蠕动泵410的驱动，混合了试剂R与第二缓冲液B2，并通过夹紧阀V6的控制而注入至外部试剂入口。第一缓冲液B1可以是电泳缓冲液(running buffer)，而第二缓冲液B2可以是洗涤缓冲液。试剂R可包括一或多种荧光染料、抗体、免疫标示物或甚至标记磁珠(labeledmagnetic beads)。
自动工作站的流体样本(例如血液样本包含小细胞与大细胞)的制造步骤可概括如下：引进血液样本至自动工作站内的离心微流碟片；通过旋转平台旋转离心微流碟片，以驱动血液样本径向地向外流动至分离槽，其中血液样本的小细胞流动至收集槽，而大细胞沉淀至沉积槽；以及自收集槽收集小细胞。运作细节可如以下步骤举例说明：
(a)将血液样本、Ficoll-paqueTM plus溶液、缓冲液以及试剂溶液填入至贮藏管。
(b)离心微流碟片于每分钟转速2000至4000转下旋转。
(c)旋转期间，以每分钟流速50至5000微升(μl)自样本入口载入并推送Ficoll-paqueTM plus溶液至离心微流碟片。
(d)以每分钟流速50至5000微升推送磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffered solution)/缓冲液至离心微流碟片。
(e)以每分钟流速50至2000微升自样本入口载入并推送血液样本与缓冲液至离心微流碟片。
(f)以每分钟流速50至5000微升推送磷酸盐缓冲溶液/缓冲液至离心微流碟片。
(g)自试剂入口，以每分钟流速50至1000微升载入并推送试剂溶液至离心微流碟片。
(h)离心微流碟片于每分钟转速0至500转下旋转10至60分钟，用于培养。
(i)离心微流碟片于每分钟转速2000至4000转下旋转。
(j)以每分钟流速50至5000微升推送磷酸盐缓冲溶液/缓冲液至离心微流碟片。
(k)停止旋转并引出收集槽内收集到的细胞。
为具体描述碟片平台(disk platform)的效能，些许癌细胞株(cancer celllines)被用于代表目标细胞。这些细胞株是乳癌细胞株MCF7与MDA-MB-231、摄护腺(prostate)癌细胞株PC3以及结肠直肠(colorectal)癌细胞株Colo205。血液样本是自健康人体的自愿者所收集到的，大约100个癌细胞被混合至1毫升的所有血液中，以模拟罕见细胞的真实情况。
为了决定碟片平台的最理想流速，本实验准备了由anti-EpCAM-PE所标记的尖端(spiked)MCF7并与1毫升的血液混合的样本进行实验。图5A示出细胞株MCF7的流率与回收比之间的关系。结果指出本实验的最理想流速为每分钟500微升，且回收比(recovery ratio)例如收获量大约为0.9(90％)。利用每分钟流速500微升进行进一步的实验，针对了不同种类的癌细胞株进行测试。图5B示出不同种类的细胞株的回收比。利用碟片平台的不同种类的细胞株的回收比在60％至90％之间，通常是高于70％。这些结果说明了离心微流碟片与自动工作站可自所有血液有效地分离与收集非常微量的细胞例如罕见细胞。
在本发明所公开的离心系统中，连续流动(continuous-flow)微流的运作可提供显著的优点，包括大量样本体积(上至20毫升)、操作简单以及降低污染。如先前所述，样本入口与试剂入口的相对位置可以同心或偏心(eccentric)的方式配置，而离心微流碟片可通过位于离心微流碟片的中心部的转轴或不具有旋转主轴而旋转。
先进的离心微流碟片在生物、生化及医药(medicinal)的领域中具有许多潜在的应用。离心微流碟片与全自动样本制备相容，且可用于容纳机动样本体积(在0.5至20毫升之间)。离心微流碟片可达到上至60％至90％的高回收比。另外，事实上，利用离心微流碟片的自动工作站结合了连续密度梯度分离与复合标示标记。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的范围。

Claims (20)

1.一种离心微流碟片，其特征在于，至少包括：
一样本入口，用以载入血液或生物样本；
一分离槽，连接该样本入口，其中该分离槽包含一弧形部；以及
一收集槽，连接该分离槽。
2.根据权利要求1所述的离心微流碟片，其特征在于，还包括一试剂入口，用以载入一试剂，其中该试剂入口的一流径位于不同于该样本入口的一流径的位置。
3.根据权利要求1所述的离心微流碟片，其特征在于，该分离槽具有一弧形部。
4.根据权利要求3所述的离心微流碟片，其特征在于，该分离槽的该弧形部配置环绕该离心微流碟片的一中心。
5.根据权利要求1所述的离心微流碟片，其特征在于，还包括至少一沉降槽，其中该沉降槽自该分离槽径向地向外配置，且该分离槽与该沉降槽是通过彼此之间的至少一流道相互连接。
6.根据权利要求1所述的离心微流碟片，其特征在于，该收集槽位于自该分离槽径向地向外且靠近于该离心微流碟片的圆周边缘。
7.根据权利要求2所述的离心微流碟片，其特征在于，还包括：
一联结通道，连接于该收集槽与该试剂入口之间；以及
至少一废料出口，连接该收集槽。
8.一种离心微流碟片，其特征在于，至少包括：
一样本入口，用以载入血液或生物样本；
一分离槽，连接该样本入口，其中该分离槽包含一弧形部；
一沉降槽，连接该分离槽；
一试剂入口，用以载入一试剂，其中该试剂入口经由一联结通道连接至该收集槽；以及
一收集槽，连接该分离槽，其中该样本的一第一流径不同于该试剂的一第二流径。
9.根据权利要求8所述的离心微流碟片，其特征在于，该样本的该第一流径起始于该试剂入口，沿着该分离槽而连接至该收集槽。
10.根据权利要求8所述的离心微流碟片，其特征在于，该试剂的该第二流径起始于该试剂入口，经由该联结通道而连接至该收集槽。
11.根据权利要求8所述的离心微流碟片，其特征在于，该分离槽的该弧形部配置环绕该离心微流碟片的一中心。
12.根据权利要求8所述的离心微流碟片，其特征在于，该沉降槽配置环绕该分离槽，且该分离槽与该沉降槽是通过彼此之间的至少一流道相互连接。
13.根据权利要求8所述的离心微流碟片，其特征在于，该收集槽位于自该分离槽径向地向外且靠近于该离心微流碟片的圆周边缘。
14.一种自样本分离目标物的方法，其特征在于，包括：
提供一离心微流碟片，其中该离心微流碟片至少包括：
一样本入口，用以载入血液或生物样本；
一分离槽，连接该样本入口，其中该分离槽包含一弧形部；
一沉降槽，连接该分离槽；以及
一收集槽，通过与该分离槽彼此之间的至少一流道相互连接；
引入该样本至该离心微流碟片的该样本入口；以及
旋转该离心微流碟片，以驱动该样本经由该分离槽与该沉降槽向外流动，其中该目标物自该分离槽内的该样本分离出来，并进一步流至该收集槽。
15.根据权利要求14所述的分离方法，其特征在于，还包括一沉降槽，用以接收该样本的非目标物的部分。
16.根据权利要求14所述的分离方法，其特征在于，还包括在引进该样本之前，将一密度梯度溶液填入至该分离槽。
17.根据权利要求14所述的分离方法，其特征在于，在旋转该离心微流碟片期间，一离心力驱动该样本的非目标物的部分流至该沉降槽，且避免该样本的该目标物进入该沉降槽。
18.根据权利要求17所述的分离方法，其特征在于，还包括通过连接该离心微流碟片的该收集槽的一出口，自该收集槽引出该目标物。
19.根据权利要求18所述的分离方法，其特征在于，还包括注入一化学溶液至该收集槽，以致于自该收集槽引出该目标物之前，在该收集槽执行标记或样本配置。
20.根据权利要求19所述的分离方法，其特征在于，该化学溶液包括一或多种的化学试剂、荧光染料、抗体、免疫标示物、量子点、磁珠、标记材料或样本配置材料。
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