CN103237548A - A2b腺苷受体拮抗剂用于治疗肺高血压的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开内容通常涉及通过将治疗有效量的A2B受体拮抗剂给予患者来治疗具有肺高血压、或与其相关的症状的患者。
Description
相关申请的引用
按照35U.S.C.§119(e),本申请要求于2010年6月30日提交的美国临时申请序列号61/360,289的益处,将其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及通过给予治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂而在需要其的患者中治疗肺高血压(pulmonary hypertension)的方法。
背景技术
最初在1973年,肺高血压(PH)由世界卫生组织(WHO)分类为原发性(特发性)或继发性的,其取决于对于风险因子的可识别原因的存在或不存在。该分类已经经历了一系列的变化。在2008年在Dana Point,California举行的肺高血压的第四届世界研讨会期间采用了目前的分类。这种新的分类包括5组肺高血压:
第1组:肺动脉高血压(PAH);
第1’组:肺静脉闭塞性疾病(PVOD)和/或肺毛细血管多发性血管瘤(PCH);
第2组:起因于左心脏疾病的肺高血压;
第3组:起因于肺病和/或缺氧的肺高血压;
第4组:慢性血栓栓塞性肺高血压(CTEPH);以及
第5组:具有尚不清楚的多因素机制的肺高血压。
参见,例如,Simonneau et al.,J Am Coll Cardio,54(1):S43-54(2009)。
肺动脉高血压(PAH),PH的第I组,是肺血管系统的严重的、渐进的、和危及生命的疾病,其特征在于严重的血管收缩和在肺动脉壁中细胞的异常增殖。这种异常增殖导致在肺中血管的严重收缩,并且,作为推论,导致非常高的肺动脉压。这些压力使得心脏难以泵送足够量的血液通过肺供氧合作用。当心脏相对于这些高压努力泵送时,患有PAH的患者遭受极端的呼吸短促。患有PAH的患者通常发展肺血管阻力(PVR)的显著增加和肺动脉压(PAP)的持续升高,其导致最终右心室衰竭和死亡。诊断患有PAH的患者具有不良预后,并且,相同地,具有受到损害的生活质量,如果不加以治疗,其平均预期寿命为自诊断时的2至5年。
PH的第3组经常相关于潜在的慢性肺病如慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化。第3组的最主要的原因是肺泡缺氧,其是由于肺病、呼吸的受损控制、或居住在高海拔地区。该组包括慢性支气管扩张、囊性纤维化、和新确定的综合征,其特征在于肺纤维化(主要为肺的下区)和气肿(主要为肺的上区)的组合。对于患有第3组肺高血压的患者目前没有认可的药物治疗。
各种因素有助于PH的发病机制,包括肺细胞的增殖,其可以促进血管重建(即,增生)。例如,肺血管重建的发生主要是通过PH患者的动脉内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。Steiner,et al.,Interleukin-6 overexpressioninduces pulmonary hypertension,Circ.Res.,可获自http://circres.ahajournals.org(2009)。另外,已发现,PH可以起源于肺动脉平滑肌细胞和肺内皮细胞的过度增殖。同上。更进一步,晚期PAH的特征可以在于远端肺小动脉的肌化、同心内膜增厚、和血管腔的梗阻(通过增殖内皮细胞)。Pietra et al.,J.Am.Coll.Cardiol.,43:25S-32S(2004)。
除肺细胞的增殖以外,在PH患者的血清和/或肺中还可以发现细胞因子、生长因子、和趋化因子的改变的表达。这些改变的表达表明在疾病的发病机制中可能的炎性机制或介导。例如,已经证明,在PH患者的血清和肺中生长因子内皮素-1(ET-1)和炎性细胞因子白细胞介素(IL-6)会升高。A.Giaid,et al.,“Expression of endothelin-1 in the lungs of patients withpulmonary hypertension”N.Engl.J.Med.,329(26):1967-8(1993)和Steiner,etal.(2009)。
到目前为止,在升高的ET-1(或IL-6)水平的降低和在PH的发病机制中通过抑制A2B受体之间尚未作出直接相关性。相反,本技术领域已表明用于增加ET-1和IL-6的各种方法,包括A2B腺苷受体的激活,作为其它疾病模式的一部分。例如,本领域中已知,在支气管平滑肌细胞和成纤维细胞中A2B受体的激活会增加IL-6释放。Zhong,et al.“A2B adenosinereceptors increase cytokine release by bronchial smooth muscle cells,”Am.J.Resp.Cell.Mol.,30:118-125(2004)和Zhong et al.,“Synergy between A2BAdenosine Receptors and Hypoxia in activating human lung fibroblasts,”Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.32:2-8(2005)。然而,仅描述了与A2B受体拮抗剂的刺激有关的支气管组织炎症和成纤维细胞分化,因为它涉及哮喘的发病机制。因此,在本领域中仍然需要提供治疗PAH的新方法,包括血管重建成分、增殖成分、和疾病的炎性成分。
发明内容
本发明涉及令人惊讶和意外的发现:利用A2B腺苷受体拮抗剂可以治疗患有肺高血压的患者。可以预期,通过A2B腺苷受体拮抗剂,可以降低与肺高血压患者有关的过度增殖、血管重建、以及细胞因子和趋化因子的升高水平,从而治疗与其相关的疾病和/或症状。
还惊奇地发现,可以通过多种机制(包括但不限于通过内皮细胞、平滑肌细胞、炎性细胞)和多种介质(包括但不限于IL-6、IL-8、内皮素、血栓素、胶原蛋白降解产物和细胞外基质蛋白)来实现A2B腺苷受体拮抗剂预防和治疗肺高血压的效应。因此预期,相比于靶向单一途径的药剂,如内皮素拮抗剂或磷酸二酯酶抑制剂,借助于这些多种机制和多种介质,在肺高血压的治疗中,A2B腺苷受体拮抗剂是更为有效的。
已经发现,A2B受体高水平表达在人肺动脉内皮细胞(HPAEC)和人肺平滑肌细胞(HPASM)中。此外,已经发现,通过给予这样的拮抗剂,可以减少血管壁增厚,在肺高血压患者中观测到的重建的一种形式。在与组织重建有关的人肺动脉平滑肌细胞(HPASM)中还减少胶原蛋白、其它细胞外基质蛋白、和细胞外基质酶的表达。另外,通过拮抗剂,可以减少HPASM(与PAH患者中的血管重建有关的细胞)的增殖和迁移。更进一步地,现在已发现,给予A2B腺苷受体拮抗剂可以减少ET-1的生产,其是通过激活在HPAEC中的受体所诱导。通过降低ET-1,预期,还可以降低与肺高血压有关的HPASM的增殖。所有这些发现表明,通过给予A2B腺苷受体拮抗剂可以有效地治疗患者中的肺高血压。还预期,通过治疗肺高血压来改善右心室功能。
在起因于肺病(PH的第3组)的肺高血压的临床前模型中,拮抗剂显示出可以减小血管病和右心室收缩压(RVSP),从而改善肺血管重建,并且增加氧饱和并改善肺功能。
鉴于上述并且在其方法方面之一中,本发明涉及用于治疗肺高血压的方法,该方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予需要其的患者。在一个方面中,肺高血压是选自第1、1’、2、3、4或5组肺高血压中的一种或多种。在一个方面中,肺高血压是肺动脉高血压(PAH)或肺高血压的第1组。在另一个方面中,肺高血压是这样的肺高血压,其起因于肺病和/或缺氧、或肺病的第3组和/或缺氧。
在一种实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是8环黄嘌呤衍生物。在另一种实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是以下式I或II的化合物,或它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药:
其中:
R1和R2独立地选自氢、可选取代的烷基、或基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,以及E是可选取代的烷氧基、可选取代的环烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基、可选取代的杂环基、可选取代的烯基或可选取代的炔基,条件是当D是共价键时E不能是烷氧基;
R3是氢、可选取代的烷基或可选取代的环烷基;
X是可选取代的亚芳基或可选取代的杂亚芳基;
Y是共价键或亚烷基,其中一个碳原子可以可选地被-O-、-S-、或-NH-取代,并且可选地被羟基、烷氧基、可选取代的氨基、或-COR16取代,其中R16是羟基、烷氧基或氨基;
条件是,当可选的取代基是羟基或氨基时,它不能与杂原子相邻;以及
Z是可选取代的单环芳基或可选取代的单环杂芳基;或
Z是氢,当X是可选取代的杂亚芳基时,Y是共价键时;
条件是,当X是可选取代的亚芳基时,Z是可选取代的单环杂芳基。
在另一种实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是选自由以下组成的组中的化合物,或它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药:
1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]-甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-苄基吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丁基-8-(1-{[3-氟苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-(苯乙基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丁基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-甲基-3-仲丁基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-环丙基甲基-3-甲基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-甲基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-乙基-3-甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(2-甲氧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)-苯基]乙基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(4-羧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
2-[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基(1,3,7-三氢嘌呤-8-基))吡唑基]-2-苯基乙酸;
8-{4-[5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(3-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(4-氟苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-正丁基-8-[1-(6-三氟甲基吡啶-3-基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-({5-[4-(三氟甲基)苯基]异噁唑-3-基}甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}苯甲酸;
1,3-二丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-(1H-1,2,3,4-四唑-5-基)苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
6-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}吡啶-2-羧酸;
3-乙基-1-丙基-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)异噁唑-3-基]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-3-乙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;以及
3-乙基-1-(2-甲基丙基)-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。
在本发明的另一种实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是具有以下式III的前药,以及它们的药用盐:
式III
其中:
R10和R12独立地是低级烷基;
R14是可选取代的苯基;
X1是氢或甲基;以及
Y1是-C(O)R17,其中R17独立地是可选取代的低级烷基、可选取代的芳基、或可选取代的杂芳基;或
Y1是-P(O)(OR15)2,其中R15是氢或被苯基或杂芳基可选取代的低级烷基。
式III的化合物或前药包括但不限于以下化合物:
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]乙酸甲酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]2,2-二甲基丙酸甲酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]丁酸甲酯;以及
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]磷酸二氢甲酯,
或它们的药用盐。
在本发明的又一个实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是3-乙基-1-丙基-8-(1-(3-(三氟甲基)苄基)-1H-吡唑-4-基)-1H-嘌呤-2,6(3H,7H)-二酮或3-乙基-1-丙基-8-(1-((3-(三氟甲基)苯基)甲基)吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮(始终称作“化合物A”或“Comp A”),其具有以下化学式:
或其药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药,其中术语前药如在式III中所定义。
在它的另一个方法方面中,本发明涉及在人肺动脉平滑肌细胞(HPASM)中抑制胶原蛋白、其它细胞外基质蛋白、和细胞外基质酶的过度表达的方法,该方法包括使这些细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
在它的又一个方法方面中,本发明涉及降低IL-6、IL-8、G-CSF、和/或血栓素释放自肺动脉平滑肌细胞的方法,该方法包括使这些细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
在另一个方面中,本发明涉及在肺动脉内皮细胞中降低IL-8和/或ET-1表达的方法,该方法包括使这些细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
在再一个方面,本发明涉及抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖或迁移的方法,该方法包括使上述细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
在另一个方面中,本发明涉在需要其的患者中抑制血管壁增厚的方法,该方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
在再一个方面中,本发明涉及在需要其的患者中降低右心室收缩压(RVSP)和/或右心室肥大的方法,该方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
另外,在一个方面中,本发明涉及在需要其的患者中改善肺功能的方法,该方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
附图说明
按照以下详细描述并结合附图可以最好地理解本发明。附图中包括以下图:
图1示出了在人肺动脉内皮细胞(HPAEC)中腺苷受体的4种亚型(A1、A2A、A2B、和A3)的mRNA表达,其是利用定量实时RT-PCR获得的,如在实施例3中所描述的。如可以看到的,在腺苷受体的4种亚型中A2B表达是最高的。
图2示出了在人肺动脉平滑肌细胞(HPASM)中腺苷受体的4种亚型(A1、A2A、A2B、和A3)的mRNA表达,其是利用定量实时RT-PCR获得的,如在实施例3中所描述的。如可以看到的,在腺苷受体的4种亚型中A2B表达是最高的。
图3A-C示出了在肺组织病理学方面的差异:对照小鼠(3A);腺苷脱氨酶(ADA)-/-小鼠(3B);以及在用A2B腺苷受体拮抗剂(化合物A)治疗以后的腺苷脱氨酶(ADA)-/-小鼠(3C)。程序是如在实施例13中所描述的。如在3C中可以看到的,通过用A2B腺苷受体拮抗剂进行的治疗大幅减少了由腺苷丰度引起的血管壁增厚。
图4A-I示出了在暴露于博莱霉素的野生型和A2B受体敲除(KO)小鼠中的血管变化。图4A、4D、和4G分别示出了来自暴露于盐水的野生型小鼠的远端动脉、近端动脉、和前腺房肺动脉。图4B、4E和4H分别示出了来自暴露于博莱霉素的野生型小鼠的远端动脉、近端动脉、和前腺房肺动脉。图4C、4F和4I分别示出了来自暴露于博莱霉素的A2B受体KO小鼠的远端动脉、近端动脉、和前腺房肺动脉。暴露于博莱霉素的野生型小鼠显示围绕远端肺小动脉和更近端肺动脉的增加的肌肉发达,这表明,这些小鼠具有PAH的经典的形态特征。暴露于博莱霉素的A2B受体KO小鼠并不呈现这些血管变化,这表明,A2B受体涉及PH的发病机制。
图5示出了在用对照、不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA(N-乙基羧酰胺腺苷)、以及NECA(10μM)连同化合物A,一种A2B腺苷受体拮抗剂(100nM),温育细胞18小时以后,在HPAEC中趋化因子(IL-8)的水平,如通过ELISA测得的。NECA剂量依赖性地增加IL-8的释放并且IL-8的NECA诱导释放受到化合物A的抑制,这表明,A2B受体的激活诱导了IL-8的释放。按照在实施例5中描述的程序来获得数据。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图6示出了在用对照、不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA、以及NECA(10μM)连同化合物A(100nM)温育细胞18小时以后,在HPAEC中内皮素(ET-1)的水平,如通过ELISA测得的。在HPAEC中,NECA剂量依赖性地增加ET-1的释放并且ET-1的NECA诱导释放受到化合物A的抑制,这表明,A2B受体的激活会诱导ET-1的释放。按照在实施例6中描述的程序来获得数据。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图7示出了在用对照、不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA、以及NECA(10μM)连同化合物A(100nM)温育细胞18小时以后,在HPASM中炎性细胞因子(IL-6)的水平,如通过ELISA测得的。在HPASM中,NECA剂量依赖性地增加IL-6的释放并且IL-6的NECA诱导释放受到化合物A的抑制。按照在实施例7中的程序来获得数据。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图8示出了在用对照、不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA、以及NECA(10μM)连同化合物A(100nM)温育18小时以后,在HPASM中趋化因子(IL-8)的水平,如通过ELISA测得的。在HPASM中,NECA剂量依赖性地增加IL-8的释放并且IL-8的NECA诱导的释放受到化合物A的抑制。按照在实施例7中的程序来获得数据。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图9示出了在用对照、不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA、以及NECA(10μM)连同化合物A(100nM)温育细胞18小时以后,在HPASM中G-CSF的水平,如通过ELISA测得的。在HPASM中,NECA剂量依赖性地增加G-CSF的释放并且G-CSF的NECA诱导的释放受到化合物A的抑制。按照在实施例7中的程序来获得数据。
图10示出了借助于用载体介质、NECA(10μM)介质、NECA(10μM)和化合物A(100nM)介质、或NECA(10μM)介质和抗IL-6抗体处理18小时的HPASM,平滑肌细胞迁移的速率。将条件介质,其收集自用载体、NECA(10μM)或化合物A(100nM)处理18小时的HPASM,加入到Boyden室检测系统的下孔作为化学引诱物。允许HPASM迁移24小时。(A):NECA介质增加平滑肌细胞迁移并且上述增加受到化合物A或抗IL-6抗体的抑制。(B):提出机制的说明,其中,通过激活A2B腺苷受体,NECA激活平滑肌,其释放IL-6。释放的IL-6又将增强平滑肌细胞迁移,*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图11示出了在用对照、不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA、以及NECA(10μM)连同化合物A(100nM)温育细胞18小时以后,在HPASM中血栓素B2(有效的动脉血管收缩剂)的水平,如通过ELISA测得的。在HPASM中,NECA剂量依赖性地增加血栓素的释放和血栓素B2的NECA诱导释放。按照在实施例9中的程序来获得数据。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图12A-C示出了在用化合物A处理以后在组织重建中重要的各种胶原蛋白、细胞外基质蛋白、和细胞外基质酶的表达水平。按照在实施例10中的程序来获得数据。如可以看到的,A2B受体的激活诱导一些这些基因的释放(A和B),但上述诱导受到化合物A的抑制(C)。
图13A-B示出了用载体(对照介质)、NECA(10μM,NECA介质)或NECA和化合物A(100nM)处理18小时的HPAEC的结果。按照实施例11,细胞上清(1:1稀释在SM无血清培养基中)用来温育HPASM持续18小时。在18小时时,与对照-HPAEC介质相比,NECA-HPAEC介质增加了HPASM的细胞数目。(A)NECA本身并不增加HPAEC的增殖(数据未示出)。该发现表明,由NECA诱导的并释放自HPAEC的某种介质可以能够促进HPASM的增殖或防止HPASM的细胞死亡。(B):用两种化合物A的处理抑制了NECA诱导的增殖。因此,腺苷激活的HPAEC能够诱导HPASM的增殖,并且这由在HPAEC中的A2B受体所介导。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图14示出了在HPASM中的NOTCH3表达,其中用NECA(10μM)或NECA(10μM)和化合物A(100nM)温育HPASM1.5小时。NECA增加了NOTCH3的表达并且NECA的这种效应受到化合物A.的抑制。*,p<0.05,与对照相比;#,p<0.05,与NECA(10μM)相比。
图15示出了在实施例14中的剂量时间表。
图16示出了在博莱霉素处理以后腺苷水平和A2BR的表达均增加。(A)腺苷水平,通过HPLC测得,来自小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF),其中小鼠用PBS或博莱霉素(BLM)处理并在第33天处死。A2BR(B)转录物水平,来自经PBS或BLM处理的小鼠的新鲜冰冻肺。
图17提供了图片和图表,其显示在博莱霉素暴露以后的增加的肺血管肌化以及化合物A的抑制效应。将化合物A(10mg/kg/天)加入饮食中,并向PBS和BLM组提供对照饮食。(A)免疫染色α-SMA以确定在实质(软组织,parenchyma)中的肌成纤维细胞(灰色信号)(上图片)和血管的肌肉壁(箭头和下图片)。进行形态分析以确定在所有治疗组中在每只小鼠的5-7个血管中存在的肌化的程度(B)以及在所有组中在每只小鼠的肺实质的10个随机微象形图中观测到的肌化血管的数目(C)。结果表示为平均值±SEM,N=5-8,对于所有治疗组。显著性水平:***P<0.001是指在PBS和BLM治疗组之间的比较。显著性水平:#P<0.05,##0.001<P<0.01是指在BLM和BLM+化合物A或BLM+A2BR-/-之间的ANOVA比较(Zhou etal.J Immunol182:8037-46(2009))。
图18提供了图表,其示出了在博莱霉素处理以后的心血管生理学以及化合物A的效应。A2BR的拮抗或敲除会在用博莱霉素治疗的小鼠中抑制RVSP的增加。将化合物A(10mg/kg/天)加入饮食,并向PBS和BLM组提供对照饮食。结果表示为平均值±SEM,N=6-8,对于所有治疗组。显著性水平:***P<0.001和**0.001<P<0.01是指在PBS和BLM治疗组之间的比较。显著性水平:###P<0.001是指在BLM和BLM+化合物A或BLM+A2BR-/-治疗组之间的ANOVA比较。
图19示出了在肺中的血管周纤维化。A2BR的拮抗或敲除会在肺中抑制博莱霉素诱导的血管周纤维化。用Masson三色染色代表性的组织切片以揭示用PBS、BLM、BLM+化合物A治疗的小鼠和BLM暴露A2BR-/-小鼠的胶原纤维(灰色信号)。星号表示其中存在纤维性纤维的区域。
图20示出了在博莱霉素治疗以后的肺功能测量结果以及化合物A的效应。在用博莱霉素治疗的小鼠中A2BR的拮抗或敲除可以改善肺功能。(A)肺的动态阻力,(B)组织阻尼(阻力)参数和(C)准静态弹性,其反映在给定容积下对肺的弹性回缩压。在气管切开和麻醉的小鼠中利用Flexivent系统进行测量。(D)通过脉搏血氧定量法并利用MouseOx系统,在清醒小鼠中确定动脉氧合作用水平。实验组包括用PBS、PBS和化合物A、BLM、BLM和化合物A治疗的小鼠或用BLM治疗的A2BR-/-小鼠。结果表示为平均值±SEM,n=8-9,对于所有治疗组。显著性水平:***P<0.001是指在PBS和BLM治疗组之间的比较。显著性水平:###P<0.001、##0.001<P<0.01和#P<0.05是指在BLM和BLM+化合物A治疗组之间的ANOVA比较。
图21示出了在博莱霉素治疗以后的白细胞介素(IL)-6水平以及化合物A的效应。A2BR的拮抗或敲除可以降低博莱霉素诱导的IL-6(在BALF中)和在BALF(A)和血浆(B)中的血浆IL-6蛋白水平,其是在治疗方案以后的第33天加以收集,并且利用ELISA加以确定。实验组包括用PBS、PBS和化合物A、BLM、BLM和化合物A治疗的小鼠或用BLM治疗的A2BR-/-小鼠。结果表示为平均值±SEM,n=4-6,对于所有治疗组。显著性水平:***P<0.001是指在PBS和BLM治疗组之间的比较。显著性水平:###P<0.001是指在BLM和BLM+化合物A治疗组之间的ANOVA比较。
图22示出了在用博莱霉素治疗以后在肺中的血浆ET-1水平和ET-1表达。A2BR的拮抗或敲除会在肺血管壁中抑制博莱霉素诱导的血浆ET-1和ET-1的表达。(A)通过ELISA确定的在血浆中ET-1的蛋白水平。(B)来自用PBS、BLM、BLM+化合物A治疗的小鼠和用BLM治疗的A2BR-/-小鼠的ET-1的免疫荧光染色(浅灰色)。箭头表示血管壁的位置。
具体实施方式
在更详细地描述本发明以前,将首先定义以下术语。
应当理解的是,本发明并不限于所描述的具体实施方式,因此当然可以变化。还应当明了,本文中所使用的术语仅用来描述具体实施方式,而不是限制性的,因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。
必须指出的是,如在本文中和在所附的权利要求中所使用的,除非上下文清楚地另有规定,否则单数形式“一个”、“一种”、和“该”包括复数指称。因此,例如,提及“途径(处理,thread)”则包括多种途径。
1.定义
除非另有定义,否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有如由本发明所属的技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如在本文中所使用的,以下术语具有以下含义。
如在本文中所使用的,术语“包含”或“(包括)含有”是指,组合物和方法包括但不限于列举的要素。当用来限定组合物和方法时,“基本上由……组成”将是指不包括对于所陈述的目的的组合具有任何实质意义的其它要素。因此,基本上由如本文中所定义的要素组成的组合物将不排除并未显著影响本发明的基本和新颖特点的其它材料或步骤。“由……组成”将是指不包括大于痕量元素的其它成分和实质性方法步骤。由每个这些过渡术语限定的实施方式在本发明的范围内。
当用于数字指定以前时,例如,温度、时间、量、和浓度(包括范围),术语“约”表示近似值,其可以变化(+)或(-)10%、5%或1%。
如上文所述,本发明涉及治疗肺高血压的方法,该方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予需要其的患者。
术语“治疗”是指患者体内的疾病的任何治疗,包括:(i)预防疾病,其使临床症状不发展;(ii)抑制疾病,即,阻止临床症状的发展;和/或(iii)缓解疾病,即,引起临床症状的消退。仅通过举例的方式,治疗可以包括改善右心室功能和/或减轻症状,包括但不限于劳力性呼吸困难、疲劳、胸痛、以及它们的组合。
如在本文中所使用的,术语“肺高血压”或“PH”是指在肺动脉、肺静脉、或肺毛细血管中血压的增加。肺高血压的详细描述和分类可以参见,例如,Simonneau et al.,J Am Coll Cardio,54(1):S43-54(2009)和整个文本。
如在本文中所使用的,术语“肺动脉高血压”或“PAH”用来包括特发性PAH、家族性PAH、肺静脉闭塞性疾病(PVOD)、肺毛细血管多发性血管瘤(PCH)、新生儿的持续性肺高血压、或与另一种疾病或病症有关的PAH,如但不限于胶原血管病、先天性全身至肺分流(包括艾森门格综合征)、门静脉高压、HIV感染、药物和毒素、甲状腺疾病、糖原贮积症、戈谢病、遗传性出血性毛细血管扩张症、血红蛋白病、骨髓增生性疾病、或脾切除术。
术语“细胞外基质蛋白”是指蛋白、或编码蛋白的基因,作为为动物细胞提供结构支撑(除进行各种其它功能以外)的动物组织的细胞外部分的一部分。细胞外基质蛋白的实例包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。
术语“细胞外基质酶”是指蛋白、或编码蛋白的基因,其涉及在正常生理过程,如胚胎发育、生殖、和组织重建,以及在疾病过程,如关节炎和转移中,细胞外基质的分解。非限制性实例包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP18、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、和MMP28。
术语“胶原蛋白”是指一种或多种蛋白质或编码上述蛋白质的基因,其具有细长原纤维的形式并大多存在于动物纤维组织如腱、韧带和皮肤。胶原蛋白的非限制性实例包括COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL7A1、COL8A1、COL8A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL10A1、COL11A1、COL11A2、COL12A1、COL13A1、COL14A1、COL15A1、COL16A1、COL17A1、COL18A1、COL19A1、COL20A1、COL21A1、COL22A1、COL23A1、COL24A1、COL25A1、EMID2、COL27A1、COL28A1和COL29A1。
术语“患者”通常是指哺乳动物,如,例如,人。
术语“治疗有效量”是指化合物(如A2B腺苷受体拮抗剂)的量,当给予需要这种治疗的患者时,其足以实现治疗(如上文所定义的)。治疗有效量将随着待使用制剂的特定活性或递送途径、患者疾病状态的严重性、和年龄、身体状况、其它疾病状态的存在、以及患者的营养状态而变化。另外,患者可能正接受的其它药物将影响待给予的治疗剂的治疗有效量的确定。
术语“A2B腺苷受体”或“A2B受体”是指腺苷受体的亚型。其它亚型包括A1、A2A和A3。
术语“A2B腺苷受体拮抗剂”或“A2B受体拮抗剂”是指抑制或以其它方式调节A2B腺苷受体的表达或活性的任何化合物、肽、蛋白质(例如,抗体)、siRNA。在一种实施方式中,拮抗剂选择性地抑制A2B受体(相对于腺苷受体的其它亚型)。在另一种实施方式中,拮抗剂对于A2B受体是部分选择性的。可以利用在实施例2中的程序来筛选作为假定拮抗剂的化合物。拮抗剂的实例包括但不限于在下面的部分中讨论的那些拮抗剂。
在一种实施方式中,A2B受体拮抗剂是具有以下化学式的化合物:
并且命名为3-乙基-1-丙基-8-(1-(3-(三氟甲基)苄基)-1H-吡唑-4-基)-1H-嘌呤-2,6(3H,7H)-二酮或3-乙基-1-丙基-8-(1-((3-(三氟甲基)苯基)甲基)吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。它有时被始终称作“化合物A”或(Comp A)。该化合物描述于美国专利6,825,349中,将其全部内容通过引用并入到本文中。
术语“烷基”是指单价支链或非支链饱和烃链,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。通过基团来举例说明该术语,如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正丁基、正己基、正癸基、十四烷基等。
术语“取代的烷基”是指:
1)如上文所定义的烷基基团,具有1、2、3、4或5个取代基,优选1至3个取代基,其选自由烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇(thiol)、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个取代基取代,其选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2;或
2)如上文所定义的烷基基团,其被1-10个原子所中断,上述原子独立地选自氧、硫和NRa-,其中Ra选自氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环基。所有取代基可以可选地进一步被烷基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、或-S(O)nR20取代,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2;或
3)如上文所定义的烷基基团,其具有如上文所定义的1、2、3、4或5个取代基并且也由如上文所定义的1-10个原子所中断。
术语“低级烷基”是指具有1、2、3、4、5、或6个碳原子的单价支链或非支链饱和烃链。通过基团来举例说明该术语,如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正丁基、正己基等。
术语“取代的低级烷基”是指:如上文所定义的低级烷基,其具有如针对取代的烷基所定义的1至5个取代基,优选1、2、或3个取代基;或如上文所定义的低级烷基,其被如针对取代的烷基所定义的1、2、3、4、或5个原子所中断;或如上文所定义的低级烷基,其具有如上文所定义的1、2、3、4或5个取代基并且还由如上文所定义的1、2、3、4、或5个原子所中断。
术语“亚烷基”是指支链或非支链饱和烃链的二基,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子,优选1-10个碳原子,更优选1、2、3、4、5或6个碳原子。通过基团来举例说明该术语,如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基异构体(例如,-CH2CH2CH2-和-CH(CH3)CH2-)等。
术语“低级亚烷基”是指支链或非支链饱和烃链的二基,其优选具有1、2、3、4、5、或6个碳原子。
术语“取代的亚烷基”是指:
(1)如上文所定义的亚烷基基团,具有1、2、3、4、或5个取代基,所述取代基选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2;或
(2)如上文所定义的亚烷基基团,其被1-20个原子所中断,上述原子独立地选自氧、硫和NRa-,其中Ra选自氢、可选取代的烷基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基和杂环基,或选自羰基、羧酸酯、羧基酰胺和磺酰基的基团;或
(3)如上文所定义的亚烷基基团,其具有如上文所定义的1、2、3、4或5个取代基并且还被如上文所定义的1-20个原子所中断。取代的亚烷基的实例是氯亚甲基(-CH(Cl)-)、氨基亚乙基(-CH(NH2)CH2-)、甲基氨基亚乙基(-CH(NHMe)CH2-)、2-羧基亚丙基异构体(-CH2CH(CO2H)CH2-)、乙氧基乙基(-CH2CH2O-CH2CH2-)、乙基甲基氨基乙基(-CH2CH2N(CH3)CH2CH2-)、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)乙烷(-CH2CH2O-CH2CH2-OCH2CH2-OCH2CH2-)等。
术语“芳烷基”是指共价连接于亚烷基基团的芳基基团,其中芳基和亚烷基在本文中加以定义。“可选取代的芳烷基”是指共价连接于可选取代的亚烷基基团的可选取代的芳基基团。通过苄基、苯乙基、3-(4-甲氧基苯基)丙基等来举例说明这样的芳烷基基团。
术语“烷氧基”是指基团R21-O-,其中R21是可选取代的烷基或可选取代的环烷基,或R21是基团-Y11-Z11,其中Y11是可选取代的亚烷基并且Z11是可选取代的烯基、可选取代的炔基;或可选取代的环烯基,其中烷基、烯基、炔基、环烷基和环烯基是如在本文中所定义的。优选的烷氧基基团是可选取代的烷基-O-并且包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基、三氟甲氧基等。
术语“烷硫基”是指基团R21-S-,其中R21是如针对烷氧基所定义的。
术语“烯基”是指支链或无支链的不饱和烃基的单价基团,其优选具有2至20个碳原子,更优选2至10个碳原子以及甚至更优选2至6个碳原子并且具有1-6个,优选1个双键(乙烯基)。优选的烯基基团包括次乙基(ethenyl)或乙烯基(-CH=CH2)、1-亚丙基或烯丙基(-CH2CH=CH2)、异亚丙基(-C(CH3)=CH2)、二环[2.2.1]庚烯等。在烯基连接于氮的情况下,双键不能是氮的α位。
术语“低级烯基”是指如上文所定义的烯基,其具有2至6个碳原子。
术语“取代的烯基”是指如上文所定义的烯基,具有1、2、3、4或5个取代基,并且优选1、2、或3个取代基,其选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“炔基”是指不饱和烃的单价基团,其优选具有2至20个碳原子,更优选2至10个碳原子并且甚至更优选2至6个碳原子以及具有至少1个和优选1-6个乙炔(三键)不饱和的部位。优选的炔基基团包括乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(或丙-1-炔-3-基,-CH2C≡CH)等。在炔基连接于氮的情况下,三键不能是氮的α位。
术语“取代的炔基”是指如上文所定义的炔基基团,其具有1、2、3、4或5个取代基,并且优选1、2、或3个取代基,该取代基选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“氨基羰基”是指基团-C(O)NR22R22,其中每个R22独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基、杂环基,或者其中两个R12基团相连以形成杂环基团(例如,吗啉代)。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1-3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“烷氧基羰基氨基”是指基团-NR30C(O)OR31,其中R30是氢或烷基并且R31选自由氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、和取代的杂环基组成的组。
术语“氨基磺酰基”是指基团-SO2NR32R33,其中R32和R33独立地选自由氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、和取代的杂环基组成的组并且其中R32和R33可选地和与其结合的氮连接在一起以形成杂环基团或取代的杂环基团,并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、和取代的杂环基如在本文中所定义。
术语“叠氮基”是指基团N3-。
术语“氨基羰基氨基”是指基团-NR34C(O)NR35R36,其中R34是氢或烷基,并且R35和R36独立地选自由氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、和取代的杂环基组成的组,并且其中R35和R36可选地和与其结合的氮连接在一起以形成杂环基团或取代的杂环基团,并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、和取代的杂环基如在本文中所定义。
术语“烷氧基氨基”是指基团-NR37OR38,其中R37是氢或烷基并且R38选自由氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、和取代的杂环基组成的组。
术语“酰氨基”是指基团-NR23C(O)R23,其中每个R23独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基、或杂环基。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1-3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“酰氧基”是指基团-O(O)C-烷基、-O(O)C-环烷基、-O(O)C-芳基、-O(O)C-杂芳基、和-O(O)C-杂环基。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被以下基团取代:烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、或-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“芳基”是指6至20个碳原子的芳族碳环基团,其具有单环(例如,苯基)或多环(例如,联苯基)、或多个稠环(例如,萘基或蒽基)。优选的芳基包括苯基、萘基等。
术语“亚芳基”是指如上文所定义的芳基基团的双基。通过基团来举例说明该术语,如1,4-亚苯基、1,3-亚苯基、1,2-亚苯基、1,4’-二亚苯基等。
除非由对于芳基或亚芳基取代基的定义另有限制,否则上述芳基或亚芳基可以可选地被1至5个取代基,优选1至3个取代基取代,上述取代基选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1-3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“芳氧基”是指基团芳基-O-,其中芳基基团是如上文所定义的,并且包括同样如上文所定义的可选取代的芳基基团。术语“芳硫基”是指基团芳基-S-,其中芳基是如上文中所定义的。
术语“氨基”是指基团-NH2。
术语“取代的氨基”是指基团-NR24R24,其中每个R24独立地选自由氢、烷基、环烷基、羧基烷基(例如,苄氧基羰基)、芳基、杂芳基和杂环基组成的组,条件是两个R14基团不都是氢,或基团–Y12-Z12,其中Y12是可选取代的亚烷基以及Z12是烯基、环烯基、或炔基。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1-3个取代基取代,所述取代基选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“羧基烷基”是指基团-C(O)O-烷基或-C(O)O-环烷基,其中烷基和环烷基是如在本文中所定义并且可以可选地进一步被以下基团取代:烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、或-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“环烷基”是指3至20个碳原子的碳环基团,其具有单环或多个稠环。上述环烷基基团包括例如单环结构如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等,或多环结构如金刚烷基、二环[2.2.1]庚烷、1,3,3-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基、(2,3,3-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基),或与其稠合有芳基基团的碳环基团,例如茚满等。
术语“取代的环烷基”是指具有1、2、3、4或5个取代基,以及优选1、2、或3个取代基的环烷基基团,上述取代基选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个取代基取代,其选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“环烯基”是指3至10个碳原子的非芳族环状烷基基团,其具有单个或多个环以及具有至少一个>C=C<环不饱和并且优选>C=C<环不饱和的1至2个部位。
术语“卤素”或“卤基”是指氟基、溴基、氯基、和碘基。
术语“酰基”表示基团-C(O)R25,其中R25是氢、可选取代的烷基、可选取代的环烷基、可选取代的杂环基、可选取代的芳基、和可选取代的杂芳基。
术语“杂芳基”是指源自芳族环状基团(即,完全不饱和的)的基团,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个碳原子和在至少一个环内选自氧、氮和硫的1、2、3或4个杂原子。上述杂芳基基团可以具有单环(例如,吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如,中氮茚基、苯并噻唑基、或苯并噻吩基)。杂芳基的实例包括但不限于[1,2,4]噁二唑、[1,3,4]噁二唑、[1,2,4]噻二唑、[1,3,4]噻二唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、中氮茚、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、二氮杂萘、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉等以及N-氧化物和N-烷氧基-氮衍生物,其包含杂芳基化合物,例如吡啶-N-氧化物衍生物。
术语“杂亚芳基”是指如上文所定义的杂芳基基团的双基。通过基团来举例说明该术语,如2,5-咪唑烯(imidazolene)、3,5-[1,2,4]噁二唑烯(oxadiazolene)、2,4-噁唑烯(oxazolene)、1,4-亚吡唑基(pyrazolene)等。例如,1,4-亚吡唑基是:
其中A表示连接点。
除非由针对杂芳基或杂亚芳基取代基的定义另有限制,否则上述杂芳基或杂亚芳基基团可以被1至5个取代基,优选1至3个取代基可选取代,上述取代基选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基组成的组。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1-3个取代基取代,其选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“杂芳烷基”是指共价连接于亚烷基基团的杂芳基基团,其中杂芳基和亚烷基在本文中加以定义。“可选取代的杂芳烷基”是指共价连接于可选取代的亚烷基基团的可选取代的杂芳基基团。通过3-吡啶基甲基、喹啉-8-基乙基、4-甲氧基噻唑-2-基丙基等来举例说明上述杂芳烷基基团。
术语“杂芳氧基”是指基团杂芳基-O-。
术语“杂环基”是指单价饱和或部分不饱和基团,其具有单环或多个稠环,其在环内具有1至40个碳原子和1至10个杂原子,优选1、2、3或4个杂原子,上述杂原子选自氮、硫、磷、和/或氧。杂环基团可以具有单环或多个稠环,并且包括四氢呋喃基、吗啉代、哌啶基、哌嗪基、二氢吡啶并等。
除非由针对杂环取代基的定义另有限制,否则上述杂环基团可以被1、2、3、4或5个,以及优选1、2或3个取代基可选取代,上述取代基选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基、硫醇、烷硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳组成的组基。除非由定义另有限制,否则所有取代基可以可选地进一步被1-3个取代基取代,其选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR20,其中R20是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2。
术语“硫醇”或“硫基(thio)”是指基团-SH。
术语“烷硫基”是指基团-S-烷基,其中烷基如在本文中所定义。
术语“取代的烷硫基”是指基团-S-取代的烷基。
术语“芳硫基”是指基团-S-芳基,其中芳基如在本文中所定义。
术语“杂芳基硫醇”或“杂芳基硫基”是指基团-S-杂芳基,其中杂芳基基团是如上文所定义的并且包括同样如上文所定义的可选取代的杂芳基基团。
“杂环硫基”是指基团-S-杂环基。
术语“亚砜”是指基团-S(O)R26,其中R26是烷基、芳基、或杂芳基。“取代的亚砜”是指基团-S(O)R27,其中R27是取代的烷基、取代的芳基、或取代的杂芳基(如本文中所定义的)。
术语“砜”是指基团-S(O)2R28,其中R28是烷基、芳基、或杂芳基。“取代的砜”是指基团-S(O)2R29,其中R29是取代的烷基、取代的芳基、或取代的杂芳基(如在本文中所定义的)。
术语“酮基”或“氧代”是指基团-C(O)-。术语“硫代羰基”是指基团-C(S)-。术语“羧基”是指基团-C(O)-OH。
“可选的”或“可选地”是指其后描述的事件或情况可以发生或可以不发生,并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况不发生的实例。
术语“式I、式II、或式III的化合物”旨在涵盖如所披露的本发明的化合物、以及上述化合物的药用盐、药用酯、前药、水合物和多晶型物。另外,本发明的化合物可以具有一个或多个不对称中心,因而可以制备成外消旋混合物或制备成单独的对映体或非对映异构体。在本发明的任何给定化合物中存在的立体异构体的数目取决于存在的不对称中心的数目(存在2n种可能的立体异构体,其中n是不对称中心的数目)。通过在合成的某些适当阶段解析(拆分)中间物的外消旋或非外消旋混合物、或通过用常规方式解析本发明的化合物,就可以获得单独的立体异构体。单独的立体异构体(包括单独的对映体和非对映异构体)以及立体异构体的外消旋和非外消旋混合物包括在本发明的范围内,除非另有特殊说明,否则所有这些是通过本说明书的结构加以描述。
“异构体”是具有相同分子式的不同的化合物。
“立体异构体”是这样的异构体,其差别仅在于原子在空间的排列方式不同。
“对映体”是一对立体异构体,其彼此是非重叠的镜像。一对对映体的1:1混合物是“外消旋”混合物。在适宜的情况下,术语“(±)”用来表示外消旋混合物。
“非对映异构体”是这样的立体异构体,其具有至少两个不对称原子,但其彼此是非镜像的。
绝对立体化学性能是按照Cahn-Ingold-Prelog R-S系统加以规定的。当化合物是纯对映体时,在每个手性碳原子处的立体化学特性可以通过R或S来规定。绝对构型未知的解析化合物可以称为(+)或(-),其取决于它们在钠D线的波长处旋转偏振光的平面的方向(右旋或左旋)。
术语“互变异构体”是指化合物的替代形式,其差别在于质子的位置,如烯醇、酮基、和亚胺烯胺互变异构体,或杂芳基的互变异构形式,其包含环原子,该环原子连接于环NH部分和环=N部分如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑、和四唑。
如在本文中所使用的,术语“前药”是指式I、II或III的化合物,上述化合物包括化学基团,其在体内可以被转化和/或可以被分裂自分子的其余部分,以提供活性药物、其药用盐、或其生物活性代谢物。适宜的基团在本领域中是众所周知的并且尤其包括:对于羧酸部分,前药,该前药选自,例如,酯,其包括但不限于那些酯,它们源自烷基醇、取代的烷基醇、羟基取代的芳基和杂芳基等;酰胺;羟甲基、醛和其衍生物。上述前药的结构可以具有下面所示的式III。
在许多情况下,本发明的化合物借助氨基和/或羧基基团或与其类似基团的存在能够形成酸式盐和/或碱式盐。术语“药用盐”是指这样的盐,其保留式I、II、或III的化合物的生物有效性和性能,并且其是非生物的或另外非期望的。药用碱加成盐可以制备自无机碱和有机碱。衍生自无机碱的盐包括(仅举例说明)钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐以及镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺以及叔胺的盐,如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、二(取代的烷基)胺、三(取代的烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、取代的烯基胺、二(取代的烯基)胺、三(取代的烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、取代的环烷基胺、二取代的环烷基胺、三取代的环烷基胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、取代的环烯基胺、二取代的环烯基胺、三取代的环烯基胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺、三杂芳基胺、杂环胺、二杂环胺、三杂环胺、混合的二胺和三胺,其中在胺上的至少两个取代基是不同的并且选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、杂芳基、杂环等组成的组。还包括这样的胺,其中两个或三个取代基与氨基氮一起形成杂环或杂芳基基团。
适宜的胺的具体实例包括(仅举例说明)异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙)胺、三(正丙)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。
药用酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。从其可以衍生盐的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。从其可以衍生盐的有机酸包括醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
如在本文中所使用的,“药用载体”包括所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌药以及抗真菌药、等渗剂以及吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的应用在本技术领域中是众所周知的。除非任何常规的介质或药剂与活性组分不相容,否则可以设想其在治疗组合物中的应用。辅助的活性组分也可以加入到组合物中。
2.命名法
借助于式I的代表性化合物来说明本发明的化合物的命名和编号,其中R1是正丙基,R2是正丙基,R3是氢,X是亚苯基,Y是-O-(CH2),并且Z是5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]-噁二唑-3-基,其被命名为:8-{4-[5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]-噁二唑-3-基甲氧基]-苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。
3.方法
如上文所述,本发明涉及治疗肺高血压的方法。该方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予需要其的患者。
肺高血压、分类和临床参数
通过本发明的方法治疗的肺高血压病症可以包括按照世界卫生组织(WHO)或Dana Point,California(2008)分类认可的任何一种或多种病症(参见,例如,Simonneau et al.,J Am Coll Cardio,54(1):S43-54(2009))。
1.肺动脉高血压(PAH)
1.1.特发性PAH
1.2.可遗传的
1.2.1.骨形态生成蛋白受体2型(BMPR2)
1.2.2.激活素受体样激酶1型(ALK1),内皮糖蛋白(有或没有遗传性出血性毛细血管扩张症)
1.2.3.未知
1.3.药物和毒素诱导的
1.4.伴有
1.4.1.结缔组织病
1.4.2.人免疫缺陷病毒(HIV)感染
1.4.3.门静脉高血压
1.4.4.先天性心脏病
1.4.5.血吸虫病
1.4.6.慢性溶血性贫血
1.5新生儿的持续性肺高血压
1’.肺静脉闭塞性疾病(PVOD)和/或肺毛细血管多发性血管瘤(PCH)
2.起因于左心脏疾病的肺高血压
2.1.收缩功能障碍
2.2.舒张功能障碍
2.3.瓣膜病
3.起因于肺病和/或缺氧的肺高血压
3.1.慢性阻塞性肺病
3.2.间质性肺病
3.3.具有混合限制性和阻塞性模式的其它肺病
3.4.睡眠障碍性呼吸
3.5.肺泡通气不足症
3.6.慢性高原缺氧暴露
3.7.发育异常
4.慢性血栓栓塞性肺高血压(CTEPH)
5.具有尚不清楚的多因素机制的肺高血压
5.1.血液性疾病:骨髓增生性疾病、脾切除术
5.2.全身性疾病:结节病、肺朗格汉斯细胞组织细胞增生症、淋巴管肌瘤病、神经纤维瘤病、血管炎
5.3.代谢病:糖原贮积症、戈谢病、甲状腺疾病
5.4.其它:肿瘤阻塞、纤维性纵隔炎、透析以后的慢性肾功能衰竭
在一个方面中,肺高血压病症包括PAH(WHO第1组),例如特发性PAH、家族性PAH或与另一种疾病或病症有关的PAH。
在基线处的肺高血压可以是轻度、中度或重度的,如例如通过WHO功能类(其是在肺高血压患者中疾病严重性的度量)测得的。WHO功能分类是New York Heart Association(NYHA)系统的改写并且通常用来定性评估活动耐量,例如在监测疾病进展和对治疗的反应中(Rubin(2004)Chest126:7-10)。在WHO系统中认可4种功能类:
第I类:没有导致身体活动的限制的肺高血压;一般身体活动并不引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或近晕厥;
第II类:肺高血压,其导致身体活动的略有限制;在休息时患者感到舒适;一般身体活动引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或近晕厥;
第III类:肺高血压,其导致身体活动的显著限制;在休息时患者感到舒适;低于普通的活动引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或近晕厥;
第IV类:肺高血压,其导致不能在没有症状的情况下进行任何身体活动;患者显现右心脏衰竭的体征;甚至在休息时也可以存在呼吸困难和/或疲劳;任何身体活动会增加不舒适。
在一个方面中,本发明的方法涉及治疗第I类,还称作无临床症状的肺高血压。
在一个方面中,受治疗者在基线处呈现至少WHO第II类的肺高血压(例如,PAH),例如WHO第II类或第III类。
在另一个方面中,受治疗者在基线处呈现在休息时至少约30mmHg的平均PAP,例如至少约35、至少约40、至少约45或至少约50mmHg。
本发明的方法,当应用于受治疗者时,可以实现以下一个或多个目标:
(a)相对于基线,将一个或多个血流动力学参数调节到更正常的水平,例如降低平均PAP或PVR,或升高肺毛细血管楔压(PCWP)或左心室舒张期末压(LVEDP);
(b)相对于基线,改善肺功能,例如增加运动能力,如在6分钟步行距离(6MWD)的测试中所说明性地测得的,或降低Borg呼吸困难指数(BDI);
(c)相对于基线,改善一种或多种生活质量参数,例如在健康调查功能表的至少一项上增加得分;
(d)相对于基线,普遍改善病症的严重性,例如通过移动到较低的WHO功能类;
(e)相对于在没有治疗的情况下的期望(例如,在临床试验设置中,如通过与安慰剂的比较测得的),改善在治疗一段时间以后的临床结果,包括改善的预后,延长到临床恶化的时间或降低临床恶化的可能性,延长生活质量(例如,延缓到较高的WHO功能类的进展或减缓一种或多种生活质量参数如健康调查参数的下降),和/或增加寿命;和/或
(f)将一种或多种分子标志物调节到更正常的水平,上述分子标志物可以预测临床结果(例如,内皮素-1(ET-1)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)或B型利尿钠肽(BNP)的血浆浓度)。
用于治疗肺高血压或尤其是PAH的A2B腺苷受体拮抗剂的治疗有效量可以取决于待治疗的特定肺高血压病症、病症的严重性、个体的体重和其它参数,并且基于本发明披露的内容可以容易地由医生或临床医生来确定而无需过多的实验。然而,下文描述了预期的剂量。
下文描述了用来测量肺高血压治疗的有效性的各种临床参数和标准并且在本领域中也是已知的。因此,可以通过这些参数或标准来测量A2B腺苷受体拮抗剂的有效性。另外,与其它药剂相比,借助于这些临床参数或标准、以及在非临床设置中,可以确定A2B腺苷受体拮抗剂的相对有效性。上述非临床设置的实例包括但不限于动物模型。在实施例中提供了动物模型的非限制性实例。
A.临床参数的改善
在一个方面中,在治疗期间或以后,待治疗的受治疗者经历以下至少之一
(a)相对于基线,将一种或多种血流动力学参数(其表明肺高血压病症)调节到更正常的水平;
(b)相对于基线,增加运动能力;
(c)相对于基线,降低Borg呼吸困难指数(BDI);
(d)相对于基线,改善一种或多种生活质量参数;和/或
(e)移动到较低的WHO功能类。
可以使用运动能力的任何适当的度量;尤其是在6分钟步行试验(6MWT)中获得的适当的度量,其测量在6分钟内受治疗者可以行走多远,即,6分钟步行距离(6MWD)。
Borg呼吸困难指数(BDI)是用于评估感知的呼吸困难(呼吸不适)的数值尺度。它测量在完成6分钟步行试验(6MWT)以后呼吸暂停的程度,其中BDI为0表示没有呼吸暂停并且10表示最大呼吸暂停。
在各个方面中,有效量的肺高血压治疗会将一种或多种血流动力学参数(其表明肺高血压病症)调节到更正常的水平。在一个这样的方面中,相对于基线,降低平均PAP,例如至少约3mmHg,或至少约5mmHg。在另一个这样的方面中,降低了PVR。在又一个这样的方面中,升高了PCWP或LVEDP。
在各个方面中,相对于基线,有效量的肺高血压治疗可以改善肺功能。可以使用肺功能的任何度量;说明性地,增加了6MWD或降低了BDI。
在一个这样的方面中,从基线增加6MWD至少约10米,例如至少约20米或至少约30米。在许多情况下,将发现,本实施方式的方法可有效增加6MWD多达50米或甚至更多。
在另一个这样的方面中,如按照6MWT说明性地测得的,BDI从基线降低至少约0.5指数点。在许多情况下,将发现,本实施方式的方法可有效降低BDI多达1个全指数点或甚至更多。
健康调查可以提供自我报告、多项目尺度,其测量8个健康参数:身体功能、起因于身体健康问题的角色限制、身痛、一般健康、活力(精力和疲劳)、社会功能、起因于情绪问题的角色限制、以及心理健康(心理困扰和心理健康)。该调查还提供身体组成部分汇总和心理组成部分汇总。
在各个方面中,有效量的肺高血压治疗可以改善受治疗者的生活质量,说明性地,如通过在调查中记录的一种或多种健康参数测得的。例如,相对于基线,在至少一种身体健康相关参数(身体健康、角色身体、身痛和/或一般健康)和/或在至少一种心理健康相关参数(活力、社会功能、角色情绪和/或心理健康)方面得到改善。在任何一种或多种参数的尺度上,这样的改善可以呈现增加至少1点的形式,例如至少2或至少3点。
B.预后的改善
在另一种实施方式中,本发明的治疗方法可以改善患有肺高血压病症的受治疗者的预后。这种实施方式的治疗可以(a)在治疗期间降低临床恶化事件的可能性,和/或(b)从基线降低血清脑钠利肽(BNP)浓度,其中,在基线处,从在受治疗者中病症的首次诊断的时间不大于约2年。
在各个方面中,自首次诊断的时间可以是,例如,不大于约1.5年,不大于约1年,不大于约0.75年或不大于约0.5年。在一个方面中,在诊断以后,可以基本上立即开始给予A2B腺苷受体拮抗剂,例如,在约1个月内或在约一周内。
在本实施方式中,治疗期间足够长,以产生所指出的效应。通常,治疗持续越长,则益处将越大和越持久。说明性地,治疗期间可以是至少约一个月,例如至少约3个月,至少约6个月或至少约1年。在一些情况下,给予可以持续基本上受治疗者的寿命的剩余部分。
临床恶化事件(CWE)包括死亡、肺移植、用于肺高血压病症的住院治疗、心房间隔切开术、开始另外的肺高血压治疗或它们的集合。因此,在治疗期间,本发明的治疗可以有效地降低死亡、肺移植、肺高血压的住院治疗、心房间隔切开术和/或开始另外的肺高血压治疗的可能性至少约25%,例如至少约50%,至少约75%或至少约80%。
到肺高血压病症的临床恶化的时间被定义为自开始A2B腺苷受体拮抗剂治疗方案到首次出现CWE的时间。
按照本实施方式,肺高血压病症可以包括在上述WHO或Venice(2003)分类中的任何一种或多种病症。在一个方面中,病症包括PAH(WHO第1组),例如特发性PAH、家族性PAH或伴有另一种疾病的PAH。
在该实施方式的各个方面中,在基线处的受治疗者呈现至少WHO第II类的PH(例如,PAH),例如第II类、第III类或第IV类(如上所述)。
在一种更具体的实施方式中,受治疗者在基线处具有至少约30mmHg的静息PAP,例如至少约35mmHg或至少约40mmHg。
C.寿命的延长
在又一种实施方式中,本发明的治疗方法可以延长患有肺高血压病症的受治疗者的生命:自开始治疗,至少约30天。该方法的变量和说明方式如上文所述。
D.延长到临床恶化的时间
在又一种实施方式中,本发明的方法可以在患有肺高血压病症的受治疗者中延长到临床恶化的时间,并且减小临床恶化事件的可能性至少约25%。此方法的变量和说明方式如上文所述。
E.其它治疗目标
在上文描述的任何方法中,受治疗者可以是男性或女性。例如,可以按照上述方法中的任何方法,包括所指示的其变量和说明方式,将A2B腺苷受体拮抗剂给予女性受治疗者。可替换地,按照上述方法中的任何方法,包括所指示的其变量和说明方式,可以将A2B腺苷受体拮抗剂给予男性受治疗者,例如生殖上活跃的男性受治疗者。
在另一种实施方式中,本文提供的方法可用于治疗生殖上活跃的男性受治疗者的肺高血压病症,其中并不显著损害受治疗者的生育力。在本说明书中,“并不显著损害”是指通过治疗并没有显著减少精子发生以及并没有诱导激素变化,其表明或伴有减少的精子发生。男性生育力可以例如,通过来自精液样品的精子计数直接加以评估,,通过激素的变化如促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、抑制素B和睾丸素间接加以评估。
在一种实施方式中,提供了用于治疗受试者的PAH的方法,其中PAH伴随有以下中的一种或多种:(a)先天性心脏缺损,(b)门静脉高压,(c)使用不同于减食欲剂的药物或毒素,(d)甲状腺疾病,(e)糖原贮积症,(f)戈谢病,(g)遗传性出血性毛细血管扩张症,(h)血红蛋白病,(i)骨髓增生性疾病,(j)脾切除术,(k)肺静脉闭塞性疾病和/或(l)肺毛细血管多发性血管瘤。该方法的变量和说明方式如上文所阐述。
另外,在另一种实施方式中,提供了用于治疗受试者的分类为WHO第2-5组的肺高血压病症的方法。在一种具体实施方式中,肺高血压病症被分类为WHO第3组。该方法的变量和说明方式如上文所阐述。在一个方面中,上述病症包括左心房或心室心脏疾病和/或左侧心脏瓣膜病。在另一个方面中,上述病症伴随有以下中的一种或多种:慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性肺病(ILD)、睡眠障碍性呼吸、肺泡通气不足症、慢性高原缺氧暴露、发育异常、近端和/或远端肺动脉的血栓栓塞性梗阻、非血栓性肺栓塞、结节病、组织细胞增生症X、淋巴管瘤病、和/或肺静脉压迫性病变。
如下文所讨论的,可以以各种方式来给予A2B腺苷受体拮抗剂。
治疗肺高血压的方法
许多因素涉及肺高血压的发病机制,包括:1)血管重建,如内壁增厚;2)人肺动脉平滑肌细胞(HPASM)和人肺内皮细胞(HPAEC)的过度增殖;3)细胞因子的升高水平,包括炎性细胞因子IL-6(Steiner,et al.(2009))、IL-8、内皮素、血栓素(在HPASM和HPAEC中)。
PH的第3组经常相关于潜在的慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化。该组包括慢性支气管扩张、囊性纤维化、和新确定的综合征,其特征在于肺纤维化(即在肺的下区)和气肿(即在肺的上区)的组合。
现在已发现,可以通过给予A2B腺苷受体拮抗剂来治疗伴随肺高血压的许多因素。尤其是,已经发现,通过给予A2B腺苷受体拮抗剂,可以减轻壁增厚形式的血管重建、和肺组织的增殖。另外,已经发现,将A2B腺苷受体拮抗剂给予HPASM或HPAEC会降低IL-6(另一种炎性分子)的水平,如颗粒集落刺激因子(G-CSF),和/或趋化因子,如IL-8。更进一步地,已经发现,通过给予A2B腺苷受体拮抗剂,可以抑制HPASM的增殖和迁移。
这些发现的前提是令人惊讶和意外的发现:A2B腺苷受体高度表达在HPASM和HPAEC中。其结果示于通过在实施例3中的协议获得的图1和图2中。事实上,A2B受体亚型的表达比其它三种亚型(包括A1、A2A、和A3)高得多。为了证实A2B腺苷受体拮抗剂可以治疗肺高血压,进行了许多体内试验。
首先,检查动物模型以确定借助于A2B拮抗剂的治疗是否可以减轻血管壁增厚。如在图3和4中可以看到的以及如在实施例4和13中所描述的,化合物A减轻在ADA敲除小鼠中的血管壁增厚以及暴露于博莱霉素的A2B受体KO小鼠不再发展血管壁增厚,这表明在肺高血压的发病机制中A2B受体是关键的。
其次,检查HPAEC和HPASM以确定A2B受体的激活接着上述受体的灭活(借助于A2B拮抗剂)是否将影响伴随炎症的各种细胞因子和趋化因子以及伴随重建和增殖的其它蛋白质的释放。在这些实施例中,用N-乙基羧酰胺腺苷(NECA)(其是稳定的A1和A2受体激动剂)来处理细胞。在给予NECA以后测量蛋白活性,然后在给予A2B受体拮抗剂以后再次测量蛋白活性。
令人惊讶地发现,腺苷激动剂会剂量依赖性地增加ET-1,一种有效的血管收缩剂,并且通过给予化合物A会显著减少ET-1。参见,实施例6,图6。类似地,发现,化合物A会减少在HPASM中的血栓素B2释放。参见,实施例8,图11。这些结果表明,A2B受体的激活会诱导ET-1和血栓素B2的释放。因此,可以预期,通过抑制ET-1和血栓素的释放,还可以抑制起因于血管收缩的潜在的血管重建。
当它涉及血管重建时,还已发现,通过给予化合物A会减少某些胶原蛋白、细胞外基质蛋白、和细胞外基质酶(例如,ADAMTS1、ADAMTS8、CDH1、MMP7、MMP12、HAS1、ITGA7、COL1A1、COL8A1和CTGF)的表达(图12A-C)。这表明,A2B受体的激活会诱导伴随组织重建的那些基因的释放。
在HPAEC和HPASM中均看到IL-8,一种趋化因子(其是炎性反应中的主要介质)的释放的减少。预期,通过减少IL-8,还可以抑制肺高血压的炎性机制的建议的成分。
在给予化合物A以后,观测到炎性细胞因子、IL-6和G-CSF(颗粒集落刺激因子)的释放的减少(图7-9)。这些结果表明,A2B受体的激活会诱导这些细胞因子的释放。这进一步表明,通过本文描述的拮抗剂可以调节肺高血压的炎性成分。
还已观察到,通过激活A2B腺苷受体,NECA会激活平滑肌,其释放IL-6,而它又将增强平滑肌细胞迁移(图10A-B)。如观测到的上述增强受到化合物A的抑制(图10A)。
因为它涉及到平滑肌细胞的增殖,所以观测到在通过激动剂诱导以后化合物A和安贝生坦(内皮素受体的一种已知的拮抗剂)均减少增殖(图13A-B)。如上所述,化合物A抑制ET-1的释放。因此,当用单独的化合物A或连同已知的内皮素拮抗剂处理时,可以减少增殖(图13C)。
为了进一步证实A2B腺苷受体拮抗剂可以治疗肺高血压,测试了平滑肌细胞的NOTCH3的表达。预期,肺高血压的特征在于在小肺动脉平滑肌细胞中NOTCH3的过度表达。另外,疾病的严重性还可以相关于在肺中NOTCH3蛋白的量。参见,Li,X.,et al.,“Notch3signaling promotes thedevelopment of pulmonary arterial hypertension”Nature Medicine,15(11):1289-1297(2009)。如在图14中可以看到的,在平滑肌细胞中,通过给予拮抗剂,可以减少激动剂诱导的NOTCH3表达。
在起因于肺病(PH的第3组)的肺高血压的临床前模型中,化合物A已表明可以减少血管病和右心室收缩压(RVSP)(图18),改善肺血管重建(图17),抑制纤维化(图19),并减少细胞因子和ET-1的释放以及改善肺功能(图20-22)。因此,这些结果突显了在伴有慢性肺损伤的肺高血压的发病机制中A2B受体的作用并证实了A2B受体拮抗剂可用于治疗肺高血压。
因此,现在预期,通过给予A2B腺苷受体拮抗剂,可以治疗肺高血压,尤其是PAH和肺高血压的第3组,两者是潜在的疾病和炎性成分。因此,在一种实施方式中,提供了用于在需要其的患者中治疗肺高血压的方法,所述方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
在本发明的一种实施方式中,肺动脉高血压选自特发性PAH、家族性PAH、或与另一种疾病或病症有关的PAH。在另一种实施方式中,上述方法用于治疗肺部炎症。在一种实施方式中,患者是人。
如下文更加充分描述的,可以以各种不同的方式来给予拮抗剂,包括全身给予、口服给予、静脉内给予、肌内给予、腹膜内给予、和吸入给予。
4.A2B腺苷受体拮抗剂
在一个方面中,本发明提供了通过将A2B腺苷受体拮抗剂给予需要其的患者来治疗肺高血压的方法。A2B腺苷受体拮抗剂是抑制或以其它方式调节A2B受体的活性的任何化合物。A2B腺苷受体拮抗剂在本领域中是已知的。例如,已鉴定了受体的多种小分子抑制剂。示例性化合物包括:
另外的A2B腺苷受体拮抗剂是8环黄嘌呤衍生物,其中环状取代基可以是芳基、杂芳基、环烷基、或杂环基,所有所述环状基团是如上文所定义的可选取代的。8环黄嘌呤衍生物的实例可以参见整个文献,参见,例如,Baraldi,P.et al.“Design,Synthesis,and Biological Evaluation of New8-Heterocyclic Xanthine Derivatives as Highly Potent and Selective HumanA2B adenosine receptor antagonists”,J.Med.Chem.,(2003),还参见WO02/42298、WO03/02566、WO2007/039297、WO02/42298、WO99/42093、WO2009/118759、和WO2006/044610,并且将其全部内容通过引用并入本文中。
预期各种A2B腺苷受体拮抗剂可用于本发明。上述化合物描述在美国专利6,825,349、7,105,665、和6,997,300中,将其全部内容通过引用并入本文中。在一种实施方式中,本发明涉及式I或II的化合物,或它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药的应用。
其中:
R1和R2独立地选自氢、可选取代的烷基、或基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,并且E是可选取代的烷氧基、可选取代的环烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基、可选取代的杂环基、可选取代的烯基或可选取代的炔基,条件是当D是共价键时E不能是烷氧基;
R3是氢、可选取代的烷基或可选取代的环烷基;
X是可选取代的亚芳基或可选取代的杂亚芳基;
Y是共价键或亚烷基,其中一个碳原子可以可选地被-O-、-S-、或-NH-取代,并且被羟基、烷氧基、可选取代的氨基、或-COR16可选取代,其中R16是羟基、烷氧基或氨基;
条件是,当可选的取代基是羟基或氨基时它不能相邻于杂原子;以及
Z是可选取代的单环芳基或可选取代的单环杂芳基;或
当X是可选取代的杂亚芳基以及Y是共价键时Z是氢;
条件是,当X是可选取代的亚芳基时,Z是可选取代的单环杂芳基。
在一种实施方式中,式I和II的化合物是那些化合物,其中R1和R2独立地是氢、可选取代的低级烷基、或基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,以及E是可选取代的苯基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、或可选取代的炔基,尤其是其中R3是氢的那些化合物。
在该组中,第一类的化合物包括那些化合物,其中R1和R2独立地是被环烷基可选取代的低级烷基,优选正丙基,并且X是可选取代的亚苯基。在该类中,化合物的子类是那些化合物,其中Y是亚烷基,包括这样的亚烷基,其中碳原子被氧取代,优选-O-CH2-,更尤其是其中氧是与亚苯基的连接点。在该子类中,在一种实施方式中,Z是可选取代的噁二唑,特别是可选取代的[1,2,4]-噁二唑-3-基,尤其是[1,2,4]-噁二唑-3-基,其可选地被可选取代的苯基或被可选取代的吡啶基取代。
第二类的化合物包括那些化合物,其中X是可选取代的1,4-亚吡唑基。在该类中,化合物的子类是那些化合物,其中Y是共价键、亚烷基、低级亚烷基,以及Z是氢、可选取代的苯基、可选取代的吡啶基或可选取代的噁二唑。在该子类中,一种实施方式包括这样的化合物,其中R1是被环烷基可选取代的低级烷基,以及R2是氢。另一种实施方式包括那些化合物,其中Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-以及Z是可选取代的苯基;或Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-以及Z是可选取代的噁二唑,尤其是3,5-[1,2,4]-噁二唑;或Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-以及Z是可选取代的吡啶基。在该子类中,还包括那些化合物,其中R1和R2独立地是被环烷基可选取代的低级烷基,尤其是正丙基。在其它实施方式中,包括那些化合物,其中Y是共价键、-(CH2)-或-CH(CH3)-以及Z是氢、可选取代的苯基、或可选取代的吡啶基,尤其是其中Y是共价键以及Z是氢。
目前,可用于本发明的化合物包括但不限于:
1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]-甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-苄基吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丁基-8-(1-{[3-氟苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-(苯乙基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丁基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-甲基-3-仲丁基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-环丙基甲基-3-甲基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-甲基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-乙基-3-甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(2-甲氧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)-苯基]乙基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(4-羧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
2-[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基(1,3,7-三氢嘌呤-8-基))吡唑基]-2-苯基乙酸;
8-{4-[5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(3-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(4-氟苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-正丁基-8-[1-(6-三氟甲基吡啶-3-基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-({5-[4-(三氟甲基)苯基]异噁唑-3-基}甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}苯甲酸;
1,3-二丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-(1H-1,2,3,4-四唑-5-基)苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
6-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}吡啶-2-羧酸;
3-乙基-1-丙基-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)异噁唑-3-基]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-3-乙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;从及
3-乙基-1-(2-甲基丙基)-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮
或它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药。
预期,上述A2B腺苷受体拮抗剂的前药也可用于本发明的方法。示例性的前药在美国专利7,625,881中教导,将其全部内容通过引用并入本文中。因此,在一种实施方式中,可用于本发明的方法中的化合物包括具有以下式III的前药:
式III
其中:
R10和R12独立地是低级烷基;
R14是可选取代的苯基;
X1是氢或甲基;以及
Y1是-C(O)R17,其中R17独立地是可选取代的低级烷基、可选取代的芳基、或可选取代的杂芳基;或
Y1是-P(O)(OR15)2,其中R15是氢或被苯基或杂芳基可选取代的低级烷基;
以及它们的药用盐。
式III的一组化合物是那些化合物,其中R10和R12是乙基或正丙基,尤其是那些化合物,其中R10是正丙基以及R12是乙基。在另一种实施方式中,R14是3-(三氟甲基)苯基并且X1是氢。
一个亚组包括式III的那些化合物,其中Y1是-C(O)R17,尤其是那些化合物,其中R17是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正丁基、或正戊基,更具体地,其中R17是甲基、正丙基、或正丁基。另一亚组包括式III的那些化合物,其中Y1是-P(O)(OR15)2,尤其是其中R15是氢。
式III的化合物或前药包括但不限于以下化合物:
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]乙酸甲酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]丁酸甲酯;以及
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]磷酸二氢甲酯,
或它们的药用盐。
5.合成反应参数
术语“溶剂”、“惰性有机溶剂”或“惰性溶剂”是指在所描述的连同其进行的反应的条件下为惰性的溶剂[包括,例如,苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃(“THF”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)、氯仿、甲叉二氯(或二氯甲烷)、乙醚、甲醇、吡啶等]。除非有相反的规定,否则在本披露内容的反应中所使用的溶剂是惰性有机溶剂。
术语“足量(q.s.)”是指添加足以达到规定的功能,例如,使溶液达到所期望的体积(即,100%)的量。
制备可用于本发明的方法中的化合物的合成的实施例可以参见美国专利6,825,349、6,997,300、7,125,993、7,521,554、和7,625,881。
反应方案I
式II,其中R3=H
其中X、Y、Z、R1、R2、和R3是如上文所定义的。
步骤1-式(2)的制备
通过还原步骤,化学式(2)的化合物制备自化学式(1)的化合物。可以使用常规还原技术,例如使用在氨水溶液中的连二亚硫酸钠;优选借助于氢和金属催化剂来进行还原。在惰性溶剂中,例如甲醇,在有催化剂存在的条件下,例如10%钯碳催化剂,并在氢气的气氛下,优选在压力下,例如在约30psi下,进行反应约2小时。当反应基本上完成时,通过常规方式来分离式(2)的产物,以提供式(2)的化合物。
步骤2-式(3)的制备
然后,在有碳二亚胺(例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)存在的条件下使式(2)的化合物与式Z-Y-X-CO2H的羧酸反应。在质子溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇等,优选甲醇)中,在约20-30°C,优选约室温的温度下,进行反应约12-48小时,优选约16小时。当反应基本上完成时,常规分离式(3)的产物,例如通过在减压下除去溶剂,然后洗涤产物。可替换地,可以在没有任何进一步纯化的条件下进行下一个步骤。
式(3)的化合物的替代制备
可替换地,通过与卤化剂的反应,例如亚硫酰氯或亚硫酰溴,优选亚硫酰氯,首先将式Z-Y-X-CO2H的羧酸转化成式Z-Y-X-C(O)L的酰基卤,其中L是氯或溴。可替换地,可以使用草酰氯、五氯化磷或磷酰氯。优选在没有溶剂的条件下,利用过量卤化剂,例如在约60-80°C的温度下,优选约70°C,进行反应约1-8小时,优选约4小时。当反应基本上完成时,常规分离式Z-Y-X-C(O)L的产物,例如通过在减压下除去过量卤化剂。
然后,在惰性溶剂(例如乙腈)中,在有叔碱(例如三乙胺)存在的条件下,使产物与式(2)的化合物反应。在约0°C的初始温度下进行反应,然后允许升温至20-30°C,优选约室温,持续约12-48小时,优选约16小时。当反应基本上完成时,常规分离式(3)的产物,例如通过用水稀释反应混合物,滤出产物,然后用水接着用醚洗涤产物。
步骤3-式II的制备,其中R3是氢
然后,通过环化反应,将式(3)的化合物转化成式II的化合物。在质子溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇等,优选甲醇)中,在有碱(例如氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾,优选含水氢氧化钠)存在的条件下,并在约50-80°C、优选约80°C的温度下,进行反应约1-8小时,优选约3小时。当反应基本上完成时,常规分离式II的产物,例如通过在减压下除去溶剂,用含水酸酸化残余物,滤出产物,然后洗涤和干燥产物。
式III的化合物的合成
在反应方案II中示出用于制备式I的化合物的方法,其中Y是可选取代的低级烷基、可选取代的芳基、或可选取代的杂芳基。
反应方案II
其中R10、R12、R14、X1和Y1是如上文所定义的。
通常,在极性溶剂(例如N,N-二甲基甲酰胺)中使式(4)的化合物与式Y1OCHX1Cl(5)的化合物反应。在约30至80°C的温度下,优选约60°C,并在有碱(优选无机碱,例如碳酸钾)存在的条件下,进行反应约8-24小时。当反应基本上完成时,通过常规方式(例如制备层析法)来分离式III的产物。
可以通过在美国专利号6,825,349中披露的那些技术或在美国专利申请序列号10/719,102(公开号2004/0176399,其全部内容以引用方式结合于本文)中披露的那些技术来制备式(4)的起始化合物。
当Y1是-C(O)R17时,其中R17是杂环,式(5’)(RC(O)OCHX1Cl)的化合物是商用的或者可以如下所示加以制备,其中使用吡啶作为实例。
通常,在惰性溶剂(例如二氯甲烷)中,并在有季盐(例如四丁基硫酸铵)存在的条件下,使式(a)的羧酸与式(b)的氯甲基衍生物反应。在约0°C的温度下,并在有碱(优选无机碱,例如碳酸氢钠)存在的条件下,进行反应,接着在室温下反应约2-10小时。当反应基本上完成时,通过常规方式分离产物,氯甲基吡啶-3-羧酸酯(5’)。
可以如反应方案III所示来制备氨基甲酸酯衍生物。
反应方案III
其中R10、R12和R14是如上文所定义的,以及RaRbNH表示胺。
通常,在极性溶剂(例如N,N-二甲基甲酰胺)中,在约0°C的温度下,并在有碱(优选无机碱,例如碳酸钾)存在的条件下,使式RaRbNH的胺与氯甲酸氯甲酯反应约1小时。然后,添加在极性溶剂中的式(1)的化合物的0°C溶液,并使混合物反应24小时,允许温度上升到室温。当反应基本上完成时,通过常规方式(例如制备层析法)来分离产物。
为了制备氨基甲酸酯衍生物的醚衍生物,使衍生物与适当的氯甲醚常规反应。
在反应方案IV中,示出了用于制备式III的化合物的方法,其中Y1是-P(O)(OH)2。
反应方案IV
步骤1
通常,在极性溶剂(例如N,N-二甲基甲酰胺)中,在约30-90°C的温度下,并在有碱(优选无机碱,例如碳酸钾)存在的条件下,使式(6)的化合物与式(4)的化合物反应约4-24小时。当反应基本上完成时,通过常规方式来分离式(7)的产物并加以纯化(例如制备层析法)。
步骤2
在惰性溶剂(例如二氯甲烷)中,借助于强酸,例如三氟乙酸,或可替换地弱酸如甲酸,来常规地去保护式(7)的产物。在约室温下进行反应约4-24小时。当反应基本上完成时,通过常规方式来分离式III的产物并加以纯化(例如制备层析法),其中Y1是-P(O)(OH)2(8)。
式(2)的原始材料
如下所示,式(2)的化合物,二叔丁基氯甲基磷酸酯,制备自二(叔丁氧基)膦基-1-醇。
步骤1
通常,在含水溶剂中,并在有弱碱(例如碳酸氢钾)存在的条件下,使式(a)的化合物,二(叔丁氧基)膦基-1-醇,与氧化剂(例如高锰酸钾)反应。在约0°C的温度下最初进行反应,然后在约室温下进行反应约1小时。当反应基本上完成时,通过常规方式来分离式(b)的产物,二叔丁基磷酸氢酯,例如通过如此形成的磷酸酯的酸化和过滤。
步骤2
最初,在惰性溶剂(例如丙酮)中,并在约0°C的温度下,通过二叔丁基磷酸氢酯和四甲基氢氧化铵的反应来制备(b)的四甲基铵盐。通过常规方式来分离二叔丁基磷酸氢酯的四甲基铵盐,例如通过除去溶剂。
然后,在惰性溶剂(例如1,2-二甲氧基乙烷)中,使二叔丁基磷酸氢酯的四甲基铵盐与二卤甲烷衍生物(例如二溴甲烷或氯碘甲烷)反应。在约60-90°C的温度下进行反应。当反应基本上完成时,通过常规方式来分离式(6)的产物。
6.联合疗法
可以连同其它肺高血压疗法一起来给予A2B腺苷受体拮抗剂,包括医疗疗法和/或辅助供氧。可以预期,通过降低血管壁重建,拮抗剂可以增强目前的肺高血压疗法的肺血管舒张效应,如钙通道阻滞剂、内皮素拮抗剂、PDE5抑制剂、前列环素等。在本领域中认可的用来治疗肺高血压的医疗疗法包括治疗剂,如强心苷、血管扩张剂/钙通道阻滞剂、前列环素、抗凝血剂、利尿剂、内皮素受体阻断剂、磷酸二酯酶5型抑制剂、一氧化氮吸入剂、精氨酸补充剂以及它们的组合。
尤其是,可以预期,当连同内皮素受体阻断剂或拮抗剂一起时,包括但不限于安贝生坦。
可以连同A2B腺苷受体拮抗剂一起使用任何种类的血管扩张剂/钙通道阻滞剂。实例包括但不限于硝苯地平、地尔硫卓、氨氯地平、以及它们的组合。
另外,可以连同A2B腺苷受体拮抗剂一起使用任何种类的前列环素。实例包括但不限于依前列醇、曲前列素(treprostinil)、伊洛前列素、贝前列素、以及它们的组合。
就给予而言,可以预期,同时或依次地给予两种或更多种药剂。如果同时给予两种或更多种药剂,则可以作为单剂量或作为分开剂量来给予它们。另外,预期,主治医生将能够容易确定所需要的另外药剂的剂量、剂量方案、和给予的优选途径。以制药领域中众所周知的方式来制备上述组合物(参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Co.,Philadelphia,PA17th Ed.(1985)和“Modern Pharmaceutics”,Marcel Dekker,Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes,Eds.)。
7.给予
可以通过给予具有类似效用的药剂的任何可接受的方式,例如如在以引用方式结合于本文的那些专利和专利申请中所描述的,以单个或多个剂量,来给予本发明的化合物,其包括直肠途径、口腔途径、鼻内途径和透皮途径,通过动脉内注射,静脉内方式,腹膜内方式,胃肠道外方式,肌内方式,皮下方式,口服方式,局部方式,作为吸入剂,或经由浸渍或涂布装置如例如支架,或动脉插入的圆柱形聚合物。
一种给予方式是胃肠道外方式,尤其是通过注射。其中可以加入本发明的新组合物并通过注射给予的形式包括含水或油混悬剂、或乳剂,并连同芝麻油、玉米油、棉子油、或花生油,以及酏剂、甘露醇、右旋糖、或无菌水溶液、和类似的药物载体。在盐水中的水溶液还常规用于注射,但在本发明的范围内是较少优选的。还可以采用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(以及它们的任何适宜的混合物)、环糊精衍生物、和植物油。可以例如通过使用涂层,如卵磷脂,通过保持所需要的颗粒尺寸(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂,来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂,例如,对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等,来预防微生物的作用。
通过将所需量的本发明的化合物加入适当溶剂并连同如上文所列举的各种其它成分,根据需要,接着过滤灭菌,来制备无菌可注射溶液。通常,通过将各种经灭菌的活性组分加入无菌载体,其包含基本分散介质和所需的其它成分(来自上文所列举的那些成分),来制备分散体。在用于无菌可注射溶液的制备的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,其产生活性组分加上任何另外的所期望的组分(来自其先前无菌过滤的溶液)的粉末。
口服给予是给予本发明的化合物的另一种途径。给予可以是经由胶囊剂或肠溶衣片剂等。在制备包括至少一种本发明的化合物的药物组合物时,通常通过赋形剂来稀释活性组分和/或将活性组分封闭在这样的载体内,上述载体可以具有胶囊剂、香囊、纸或其它容器的形式。当赋形剂作为稀释剂时,它可以是固体、半固体、或液体材料(如上述),其作为活性组分的赋形剂、载体或介质。因此,组合物可以具有以下形式:片剂,丸剂,散剂,锭剂,香囊,扁囊剂,酏剂,混悬剂,乳剂,溶液,糖浆剂,气雾剂(作为固体或在液体介质中),软膏剂,其包含,例如,按重量计可达10%的活性化合物,软和硬明胶胶囊剂,无菌可注射溶液,和无菌包装散剂。
适宜赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆剂、和甲基纤维素。配方(制剂)可以另外包括:润滑剂如滑石粉、硬脂酸镁、和矿物油;湿润剂;乳化剂和悬浮剂;防腐剂如甲基苯甲酸酯和羟苯丙酯;甜味剂;和增香剂。
可以配制本发明的组合物,以在通过采用本领域中已知的程序给予患者以后提供活性组分的快速、持续或延迟释放。用于口服给予的控释递药系统包括渗透泵系统和溶解系统,其包含涂有聚合物的贮器或药物-聚合物基质配方。在美国专利号3,845,770、4,326,525、4,902,514、和5,616,345中给出了控释系统的实例。用于本发明的方法的另一种剂型采用透皮递送装置(“贴剂”)。这样的透皮贴剂可以用来提供受控量的本发明的化合物的连续或不连续输注。用于递送药剂的透皮贴剂的结构和应用在本领域中是众所周知的。参见,例如,美国专利号5,023,252、4,992,445和5,001,139。这样的贴剂可以被构造用于药剂的连续、脉冲式或按需递送。
这些组合物优选被配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指物理上分散的单位,其适合作为用于人受试者和其它哺乳动物的单位剂量,每个单位包含预定量的适合于产生所希望的治疗效应的活性材料,以及适宜的药物赋形剂(例如,片剂、胶囊剂、针剂)。式I的化合物在广泛的剂量范围内是有效的并且通常给予药物有效量。优选地,对于口服给予,每个剂量单位包含10mg至2g的本发明的化合物,更优选10至700mg,而对于胃肠道外给予,优选10至700mg的本发明的化合物,更优选约50至200mg。然而,应当明了,实际给予的本发明的化合物的量将由医师根据有关的情况来确定,包括待治疗的病症,选择的给予药途径,给予的实际化合物以及其相对活性,个别患者的年龄、体重、以及反应,患者症状的严重性等。
为了制备固体组合物如片剂,将主要的活性组分与药物赋形剂进行混合以形成固体预配制组合物,其包含本发明的化合物的均匀混合物。当称这些预配制组合物为均匀的时候,它是指活性组分被均匀分散在整个组合物中,使得组合物可以容易地被细分成相同有效的单位剂型如片剂、丸剂以及胶囊剂。
本发明的片剂或丸剂可以被涂布或用其它方式被复合以提供一种具有延长作用的优点的剂型,或保护片剂或丸剂免受胃中酸条件的作用。例如,片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量成分,后者具有在前者之上的外皮的形式。可以用肠溶层来分隔两种成分,其中肠溶层用来阻止在胃中的崩解以及允许内成分完整进入十二指肠或被延迟释放。各种材料可以用于这样的肠溶层或包衣,上述材料包括许多高分子酸以及高分子酸与这样的材料如虫胶、十六醇、以及醋酸纤维素的混合物。
用于吸入法或吹入法的组合物包括在药用水溶剂或有机溶剂、或其混合物中的溶液和悬浮液,以及散剂。液体或固体组合物可以包含如上文所述的适宜的药用赋形剂。优选地,通过口服或鼻呼吸途径给予这些组合物以获得局部或全身效应。可以通过使用惰性气体来雾化在优选的药用溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置吸入雾化溶液,或雾化装置可以连接于面罩帐状物、或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送剂型的装置,优选口服或鼻途径,给予溶液、混悬剂、或散剂组合物。
以下实施例用来说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当明了,在以下实施例中披露的技术表示由本发明的发明人发现的在本发明的实施中运作良好的技术,因此可以被认为构成其实施的优选方式。然而,根据本发明,本领域技术人员应当明了,可以对披露的具体实施方式进行许多变化,并仍然获得相同或类似的结果而没有偏离本发明的精神和范围。
剂型实施例1
制备了包含以下组分的硬明胶胶囊:
混合以上组分并填充入硬明胶胶囊中。
剂型实施例2
利用以下组分来制备片剂剂型:
掺合上述成分并压制以形成片剂。
剂型实施例3
制备包含以下成分的干粉吸入剂剂型:
组分 重量%
活性组分 5
乳糖 95
混合活性组分与乳糖并将混合物加入到干粉吸入装置中。
剂型实施例4
各自包含30mg活性组分的片剂制备如下:
使活性组分、淀粉和纤维素通过第20号目美国筛并充分混合。混合聚乙烯吡咯烷酮的溶液和所得的粉末,然后使其通过16目美国筛。在50°C至60°C下干燥如此制得的颗粒并通过16目美国筛。然后将先前通过第30号目美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、和滑石粉加入到颗粒中,在混合以后,用压片机对其进行压制以产生各自重量为120mg的片剂。
剂型实施例5
各自包含25mg活性组分的栓剂制备如下:
组分 量
活性组分 25mg
饱和脂肪酸甘油酯至 2,000mg
使活性组分通过第60号目美国筛并悬浮在先前用必需的最小热量熔化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倒入标称2.0g容量的栓剂模具中并使其冷却。
剂型实施例6
各自包括50mg活性组分/5.0mL剂量的混悬剂制备如下:
掺合活性组分、蔗糖和黄原胶,并通过第10号目美国筛,然后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠在水中的溶液混合。用一些水稀释苯甲酸钠、增香剂、和着色剂,并在搅拌下添加。然后添加足量的水以产生所需要的容体。
剂型实施例7
可以制备皮下剂型如下:
组分 量
活性组分 5.0mg
玉米油 1.0mL
剂型实施例8
制备具有以下组成的注射制剂:
剂型实施例9
制备具有以下组成的局部制剂:
除水以外,合并所有上述组分并在搅拌下加热至60℃。然后,在60℃和剧烈搅拌下,添加足量水,以乳化组分,然后添加水足量100g。
实施例
通过参照以下实施例来进一步限定本发明。本领域技术人员将明了,可以对途径和方法进行许多改进而没有偏离本发明的范围。
缩写词
除非另有说明,否则所有温度是以摄氏度(°C)为单位。另外,在这些实施例以及在其它地方,缩写词具有以下含义:
方法和试剂
细胞和试剂
HPASM和HPAEC以及细胞培养基获自Lonza Group Ltd.(Basel,瑞士)。由Gilead Sciences,Inc.(Foster City,California)合成化合物A,如以下在实施例1中所讨论的。其它化合物获自Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)。
细胞培养和处理
在平滑肌生长培养基(SMGM-2)中生长HPASM。在内皮生长培养基(EGM-2)中生长HPAEC。在处理以前,将细胞接种于24-孔板中并允许生长至~80%汇合。洗涤细胞,然后在无血清基础培养基中并在存在或不存在腺苷受体激动剂和拮抗剂的条件下温育。在增殖测定中,在收集自用载体或NECA处理的HPAEC细胞的50%培养基中温育HPASM。
实时RT-PCR
利用实时RT-PCR并借助于Stratagene PCR装置(La Jolla,California)来确定基因表达。Zhong H.,et al.“A2B adenosine receptors increase cytokinereleased by bronchial smooth muscle cells,“American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology,30(1):118-125(2004)。
IL-6、IL-8、G-CSF、内皮素-1、和血栓素B2的测量
利用来自Invitrogen(Carlsbad,California)的人30-plex luminex试剂盒来测量IL-6和G-CSF。利用ELISA(分别获自Invitrogen,AssayDesigns(AnnArbor,Michigan)、和Caymen Biomedicals(Ann,Arbor,Michigan)的试剂盒)来测量IL-8、内皮素-1、血栓素B2。
实施例1:化合物A以及其前药的合成
A.提供6-氨基-1-乙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮的制备
乙醇钠的溶液制备自钠(4.8g,226mmol)和干乙醇(150mL)。向该溶液中添加氨基-N-乙基酰胺(10g,113mmol)和氰基乙酸乙酯(12.8g,113mmol)。在回流下搅拌该反应混合物6小时,冷却,然后在减压下从反应混合物除去溶剂。将残余物溶解在水(50mL)中,并用盐酸将pH调节至7。使混合物在0°C下静置过夜,并且滤出沉淀物,用水洗涤并空气干燥,以提供6-氨基-1-乙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮。1H-NMR(DMSO-d6)δ10.29(s,1H),6.79(s,2H),4.51(s,1H),3.74-3.79(m,2H),1.07(t,3H,J=7.03Hz);MS m/z155.98(M+),177.99(M++Na)
B.6-[2-(二甲基氨基)-1-氮杂乙烯基]-1-乙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮的制备
在40°C下加热6-氨基-1-乙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮(0.77g,5mmol)在无水N,N-二甲基乙酰胺(25mL)和N,N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(2.7mL,20mmol)中的悬浮液90分钟。然后在减压下除去溶剂,并且用乙醇研制残余物,过滤,并用乙醇洗涤,以提供6-[2-(二甲基氨基)-1-氮杂乙烯基]-1-乙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮。1H-NMR(DMSO-d6)δ10.62(s,1H),8.08(s,1H),4.99(s,1H),3.88-3.95(m,2H),3.13(s,3H),2.99(s,3H),1.07(t,3H,J=7.03Hz);MS m/z210.86(M+),232.87(M++Na)
C.6-[2-(二甲基氨基)-1-氮杂乙烯基]-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮的制备
在80°C下搅拌6-[2-(二甲基氨基)-1-氮杂乙烯基]-1-乙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮(1.5g,7.1mmol)在二甲基甲酰胺(25mL)中的溶液、碳酸钾(1.5g,11mmol)和正丙基碘(1.54g,11mmol)的混合物5小时。冷却反应混合物至室温,过滤,蒸发溶剂,然后产物6-[2-(二甲基氨基)-1-氮杂乙烯基]-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮本身用于下一步反应。
D.6-氨基-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮的制备
将6-[2-(二甲基氨基)-1-氮杂乙烯基]-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮(2.1g)的溶液溶解在甲醇(10mL)和28%氨水溶液(20mL)的混合物中,并在室温下搅拌72小时。然后在减压下除去溶剂,并用硅胶柱和借助于层析法来纯化残余物,用二氯甲烷/甲醇(15/1)的混合物进行洗脱,以提供6-氨基-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮。1H-NMR(DMSO-d6)δ6.80(s,2H),4.64(s,1H),3.79-3.84(m,2H),3.63-3.67(m,2H),1.41-1.51(m,2H),1.09(t,3H,J=7.03Hz),0.80(t,3H,J=7.42Hz);MS m/z197.82(M+)。
E.6-氨基-1-乙基-5-亚硝基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮的制备
经10分钟,分成多份,将亚硝酸钠(2g,28.4mmol)加入到6-氨基-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮(1.4g,7.1mmol)在50%乙酸/水(35mL)的混合物中的溶液中。在70°C下搅拌混合物1小时,然后在减压下浓缩反应混合物至低容积。滤出固体,并用水洗涤,以提供6-氨基-1-乙基-5-亚硝基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮。MS m/z227.05(M+),249.08(M++Na)
F.5,6-二氨基-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮的制备
向6-氨基-1-乙基-5-亚硝基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮(300mg)在甲醇(10mL)中的溶液添加10%钯碳催化剂(50mg),并在30psi的氢气下氢化混合物2小时。通过硅藻土来过滤混合物,并在减压下从滤液除去溶剂,以提供5,6-二氨基-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮。MS m/z213.03(M+),235.06(M++Na)
F.N-(6-氨基-1-乙基-2,4-二氧代-3-丙基(1,3-二氢嘧啶-5-基))(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)羧酰胺的制备
向5,6-二氨基-1-乙基-3-丙基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮(100mg,0.47mmol)和1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-羧酸(0.151g,0.56mmol)在甲醇(10mL)中的混合物中添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.135g,0.7mmol),然后在室温下搅拌反应混合物过夜。在减压下除去溶剂,并利用Biotage来纯化残余物,用10%甲醇/二氯甲烷进行洗脱,以提供N-(6-氨基-1-乙基-2,4-二氧代-3-丙基(1,3-二氢嘧啶-5-基))(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)羧酰胺。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.59(s,1H),8.02(s,1H),7.59-7.71(m,4H),6.71(s,2H),5.51(s,2H),3.91-3.96(m,2H),3.70-3.75(m,2H),1.47-1.55(m,2H),1.14(t,3H,J=7.03Hz),0.85(t,3H,J=7.42Hz)。
G.3-乙基-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮的制备
在100°C下搅拌N-(6-氨基-1-乙基-2,4-二氧代-3-丙基(1,3-二氢嘧啶-5-基))(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-3-基)羧酰胺(80mg,0.17mmol)、10%含水氢氧化钠(5ml)、和甲醇(5ml)的混合物2小时。冷却混合物,在减压下除去甲醇,并且用水稀释残余物并用盐酸加以酸化。滤出沉淀物,用水、然后用甲醇洗涤,以提供3-乙基-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.57(s,1H),8.15(s,1H),7.60-7.75(m,4H),5.54(s,2H),4.05-4.50(m,2H),3.87-3.91(m,2H),1.55-1.64(m,2H),1.25(t,3H,J=7.03Hz),0.90(t,3H,J=7.42Hz);MS m/z447.2(M+)。
H.[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]磷酸二氢甲酯的制备
步骤1-二叔丁基氯甲基磷酸酯的制备
二叔丁基磷酸氢酯的制备
在0°C下,向二(叔丁氧基)膦基-1-醇(0.78g,4mmol)和碳酸氢钾(0.6g,2.4mmol)在水(4mL)中的搅拌溶液中添加(分成多份)高锰酸钾(0.44g,2.8mmol)。允许混合物升温至室温,并搅拌1小时。然后添加脱色炭(60mg),并在60°C下搅拌混合物15分钟,然后过滤。用水(30mL)洗涤由此获得的固体,并在60°C下用另外的100mg脱色炭处理合并的滤液20分钟。过滤混合物,并使滤液冷却至0°C,然后在搅拌下用浓盐酸(2mL)小心酸化。滤出沉淀物,用冷水洗涤,以提供作为白色固体的二叔丁基磷酸氢酯。
二叔丁基磷酸氢酯的四甲基铵盐的制备
将在步骤a)中获得的二叔丁基磷酸氢酯的溶液溶解在丙酮(10mL)中并冷却至0°C。向该溶液中添加四甲基氢氧化铵(2.4mL,2.6mmol)的10%水溶液,并在减压下蒸发均匀溶液,以提供固体,其结晶自回流1,2-二甲氧基乙烷,以提供作为白色固体的四甲基铵二叔丁基磷酸氢酯。
将在步骤b中获得的四甲基铵二叔丁基磷酸氢酯溶解在回流的1,2-二甲氧基甲烷(15mL)中,并添加氯碘甲烷(3.2g,18.1mmol),然后回流混合物90分钟。在减压下除去溶剂,然后同样地使用残余物,二叔丁基氯甲基磷酸酯,而没有进一步纯化。
步骤2
将3-乙基-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮(0.47g,1mmol)的溶液溶解在20mL的N,N-二甲基甲酰胺中,并添加碳酸钾(0.42g,4mmol),接着二叔丁基氯甲基磷酸酯(0.34g,1.32mmol),然后在60°C下搅拌混合物过夜。冷却反应混合物,并滤出沉淀物,用乙酸乙酯洗涤。在减压下浓缩滤液,并且通过制备性薄层层析法来纯化残余物,并用4%甲醇/二氯甲烷进行洗脱,以提供叔丁基[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]甲基乙基磷酸甲酯(0.26g),作为无色油。
步骤3
将叔丁基[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]甲基乙基磷酸甲酯(80mg,0.12mmol)的溶液溶解在二氯甲烷(6mL)中并添加三氟乙酸(0.72mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。在减压下除去溶剂,并用醚研制白色固体残余物,然后通过过滤加以收集,从而提供[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]磷酸二氢甲酯(41mg)。
NMR1H-NMR(DMSO-d6)δ8.70(s,1H),8.15(s,1H),7.74(s,1H),7.69-7.71(m,1H),7.60-7.63(m,2H),6.12(d,2H,J=5.4Hz),5.54(s,2H),4.06(q,2H,J=13.8Hz),3.84(t,2H,J=7.4Hz),1.52-1.62(m,2H),1.25(t,3H,J=7.0Hz),0.87(t,3H,J=7.4Hz);MS m/z579.02(M++Na)
实施例2:腺苷受体测定
为了筛选A2B拮抗剂,通常使用两种类型的测定:1)放射性配体结合测定,用来确定给定化合物可以结合于A2B受体(如下所述)以及2)功能测定(cAMP测定或其它测定),用来确定化合物是激动剂(激活受体)或是拮抗剂(抑制受体的激活)。
用于A2B腺苷受体的放射性配体结合测定用来确定化合物对A2B腺苷受体的亲合力。同时,进行相对于其它腺苷受体的放射性配体结合测定以确定化合物对A1、A2A和A3腺苷受体的亲合力。与其它腺苷受体相比,对于A2B受体,化合物应具有更高的亲和力(至少3倍)。
针对A2B受体的cAMP测定经常用来证实,化合物是拮抗剂并且将阻断A2B受体介导的cAMP的增加。
针对A2B腺苷受体的放射性配体结合
基于以下测定,可以筛查假定为A2B受体的拮抗剂的化合物的必要的活性。将人A2B腺苷受体cDNA稳定转染到HEK-293细胞(称作HEK-A2B细胞)。用PBS洗涤HEK-A2B细胞的单层一次,并收获在包含10mMHEPES(pH7.4)、10mM EDTA和蛋白酶抑制剂的缓冲液中。在设置4下并在polytron中均化这些细胞1分钟,然后在4°C和29000g下离心15分钟。用包含10mM HEPES(pH7.4)、1mM EDTA和蛋白酶抑制剂的缓冲液洗涤细胞沉淀物一次,然后再悬浮在补充有10%蔗糖的相同缓冲液中。将冷冻的等分部分保持在-80°C下。通过在补充有1单位/mL腺苷脱氨酶的TE缓冲液(50mM Tris和1mM EDTA)中混合10nM3H-ZM241385(Tocris Cookson)和不同浓度的测试化合物以及50μg膜蛋白来开始竞争测定。温育测定90分钟,通过利用Packard Harvester的过滤加以停止,然后用冰冷TM缓冲液(10mM Tris,1mM MgCl2,pH7.4)洗涤四次。在有10μM ZM241385存在的条件下确定非特异性结合。利用GraphPad软件来计算化合物的亲合力(即,Ki值)。
针对其它腺苷受体的放射性配体结合
将人A1、A2A、A3腺苷受体cDNA稳定转染到CHO或HEK-293细胞(称作CHO-A1HEK-A2A、CHO-A3)中。利用如上所述的相同协议,膜制备自这些细胞。通过在TE缓冲液(50mM Tris和1mM EDTA的CHO-A1以及HEK-A2A)或补充有1单位/mL腺苷脱氨酶的TEM缓冲液(50mMTris、1mM EDTA和10mM MgCl2,用于CHO-A3)中,混合0.5nM3H-CPX(用于CHO-A1)、2nM3H-ZM241385(HEK-A2A)或0.1nM125I-AB-MECA(CHO-A3)与不同浓度的测试化合物和透视膜,来开始竞争测定。温育测定90分钟,通过利用Packard Harvester的过滤加以停止,然后用冰冷TM缓冲液(10mM Tris,1mM MgCl2,pH7.4)洗涤四次。在有1μM CPX(CHO-A1)、1μM ZM214385(HEK-A2A)和1μMIB-MECA(CHO-A3)存在的条件下来确定非特异性结合。利用GraphPad软件来计算化合物的亲合力(即,Ki值)。
cAMP测量结果
将单层的转染细胞收集在包含5mM EDTA的PBS中。用DMEM洗涤细胞一次,并再悬浮在包含1单位/mL腺苷脱氨酶的DMEM中,密度为100,000500,000个细胞/mL。将100μL细胞悬液混合于包含各种激动剂和/或拮抗剂的25μL,并在37°C下保持反应15分钟。在15分钟结束时,添加125μL的0.2N HCl以停止反应。在1000rpm下离心细胞10分钟。除去100μL的上清并乙酰化。利用来自Assay Design的直接cAMP测定来测量在上清中的cAMP的浓度。
将A2A和A2B腺苷受体耦合于Gs蛋白质,因此用于A2A腺苷受体(如CGS21680,CAS#20225-54-9)或用于A2B腺苷受体(如NECA)的激动剂会增加cAMP累积,而相对于这些受体的拮抗剂会防止由激动剂诱导的cAMP累积的增加。将A1和A3腺苷受体耦合于Gi蛋白质,因此用于A1腺苷受体(如CPA)或用于A3腺苷受体(如IB-MECA)的激动剂会抑制由毛喉素诱导的cAMP累积的增加。相对于A1和A3受体的拮抗剂可以防止在cAMP累积中的抑制。
基于以上测定协议,本领域技术人员知道确定化合物是否是A2B受体拮抗剂的拮抗剂。
实施例3:在HPASM和HPAEC中腺苷受体的表达
该实施例表明,在腺苷受体的4种亚型(A1、A2A、A2B、和A3)中,A2B在人肺动脉细胞中具有最高表达。
利用定量实时RT-PCR并利用上述方法,确定了在人肺动脉内皮细胞(HPAEC)和人肺动脉平滑肌细胞(HPASM)中腺苷受体的4种亚型A1、A2A、A2B、和A3的表达。
结果示于图1(HPAEC)和图2(HPASM)中。如在附图中可以看到的,在两种细胞类型中,在AdoR的4种亚型中,如就β-肌动蛋白的百分比而言所示,A2B表达令人惊讶地是最高的。在两种细胞类型中均未检测到A1和A3的表达。
实施例4:博莱霉素诱导的血管壁增厚是由A2B受体介导的
该实施例表明A2B受体在博莱霉素诱导的血管壁增厚中的作用并由此证明了其参与肺高血压的发病机制。
博莱霉素是由细菌细菌轮枝链霉菌产生的一种糖肽抗生素。它是一种已知的抗癌剂并具有伴随的严重的并发症,其包括肺纤维化和受损的肺功能。已提出,博莱霉素会诱导对氧中毒的敏感性,并且最近的研究支持了促炎细胞因子IL-18和IL-1β在博莱霉素诱导的肺损伤的机制中的作用。
图4A-I示出了在暴露于博莱霉素的野生型和A2B受体敲除(KO)小鼠中的血管变化。每4天,对小鼠进行腹膜内注射博莱霉素(0.35单位)或盐水,时间为33天。在协议结束时,对肺进行H&E染色。图4A、4D、和4G分别示出了来自暴露于盐水的野生型小鼠的远端动脉、近端动脉、和前腺房肺动脉。图4B、4E和4H分别示出了来自暴露于博莱霉素的野生型小鼠的远端动脉、近端动脉、和前腺房肺动脉。图4C、4F和4I分别示出了来自暴露于博莱霉素的A2B受体KO小鼠的远端动脉、近端动脉、和前腺房肺动脉。暴露于博莱霉素的野生型小鼠显示围绕远端肺小动脉和更近端肺动脉的增加的肌肉发达,这表明这些小鼠具有肺高血压的经典的形态特征。有趣的是,暴露于博莱霉素的A2B受体KO小鼠并不呈现这些血管变化,这表明A2B受体涉及肺高血压的发病机制。
实施例5:在内皮细胞中IL-8的释放
该实施例表明,A2B受体的激活会诱导IL-8的释放,以及A2B腺苷受体拮抗剂可以抑制上述诱导。
在存在或不存在不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA(N-乙基羧酰胺腺苷)和化合物A(100nM)的条件下,在基础培养基中温育HPAEC18小时。NECA是A1和A2亚型的已知的腺苷激动剂。通过ELISA来测量IL-8的量(以pg/mL表示)。结果示于图5。如在图5中可以看到的,在18小时时,NECA剂量依赖性地增加IL-8的释放。A2B腺苷受体拮抗剂,化合物A,会显著降低NECA(10μM)的这种效应,这表明,A2B受体的激活会诱导IL-8的释放。
实施例6:自HPAEC的内皮素-1释放
类似于实施例5,该实施例表明,A2B受体的激活会诱导ET-1的释放,并且可以通过A2B腺苷受体拮抗剂来抑制上述诱导。
在存在或不存在不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA和化合物A(100nM)的条件下温育HPAEC18小时。通过上文讨论的ELISA协议来测量ET-1的量(以pg/mL表示)。结果示于图6。如在图6中可以看到的,在18小时时,NECA剂量依赖性地增加ET-1的释放。通过A2B腺苷受体拮抗剂,化合物A,可以显著降低NECA(10μM)的这种效应,这表明,A2B受体的激活会诱导ET-1的释放。
实施例7:自HPASM的细胞因子释放
类似于实施例5和6,该实施例表明,在肌细胞中A2B受体的激活也会诱导细胞因子的释放,其可以受到A2B腺苷受体拮抗剂的抑制。
在存在或不存在不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA和化合物A(100nM)的条件下温育HPASM18小时。在18小时时,NECA剂量依赖性地增加IL-6(参见,图7)、IL-8(参见,图8)和G-CSF(图9)的释放。A2B腺苷受体拮抗剂,化合物A,会显著降低NECA(10μM)的这些效应,这表明A2B受体的激活会诱导这些细胞因子的释放。
实施例8:平滑肌细胞迁移
该实施例表明,NECA会增加平滑肌迁移并且上述增加可以受到A2B腺苷受体拮抗剂,化合物A或抗IL-6抗体,的抑制。
条件介质收集自用载体、NECA(10μM)、NECA(10μM)和化合物A(100nM)、或NECA(10μM)和抗IL-6抗体(1ng/mL,购买自Invitrogen)处理18小时的HPASM,然后加入Boyden室检测系统的下孔中作为化学引诱物。允许HPASM迁移24小时。如图10A所示,NECA增加了平滑肌细胞迁移并且上述增加受到化合物A或抗IL-6抗体的抑制。还观测到,IL-8中和抗体并不影响细胞迁移。因此,该实施例表明,通过激活A2B腺苷受体,NECA会激活平滑肌,其释放IL-6。释放的IL-6又将增强平滑肌细胞迁移(参见图10B,用于说明)。
实施例9:自HPASM的血栓素B2释放
该实施例表明,在HPASM中,A2B受体的激活会诱导血栓素B2的释放,已知其会诱导肺血管收缩。
在存在或不存在不同浓度(0.1μM、1μM、和10μM)的NECA和化合物A(100nM)的条件下温育HPASM18小时。如在图11中可以看到的,在第18小时时,NECA剂量依赖性地增加血栓素B2的释放。化合物A会显著降低NECA(10μM)的这种效应,这表明,A2B受体的激活会诱导血栓素B2的释放。
实施例10:胶原蛋白、其它细胞外基质蛋白质、和细胞外基质酶的表达
在有NECA(10μM)或NECA(10μM)连同化合物A(100nM)存在的条件下温育HPASM1.5小时。对分离自HPASM的RNA进行实时RT-PCR阵列,其专注于涉及组织重建的基因。NECA增加了ADAMTS1、ADAMTS8、CDH1、MMP7、MMP12、HAS1、ITGA7、COL1A1、COL8A1和CTGF的mRNA表达(图12A-B)。化合物A会降低NECA的这些效应(图12C),这表明,A2B受体的激活会诱导这些基因的释放。
实施例11:NECA-激活的HPAEC对HPASM的增殖的影响
该实施例表明,在HPAEC中的A2B受体可以增加ET-1的释放,其反过来诱导HPASM的增殖。另一方面,用A2B腺苷受体拮抗剂进行的处理会抑制上述诱导。
细胞上清收集自用载体(对照介质)、NECA(10μM,NECA介质)或NECA和化合物A(100nM)处理18小时的HPAEC。这些有或没有安贝生坦(30nM)的细胞上清(1:1稀释在Murashige和Skoog(MS)基础培养基中)用来温育HPASM18小时。计数细胞。结果示于图13A。与对照-HPAEC介质相比,在18小时时,NECA-HPAEC介质增加了HPASM的细胞数目。该发现表明,由NECA诱导的并释放自HPAEC的某些介质可以能够促进HPASM的增殖或防止HPASM的细胞死亡。
如在图13A中所示,用化合物A和安贝生坦进行处理会抑制NECA诱导的增殖。具体地,数据表明,化合物A(可获自Gilead Sciences,Inc.)会抑制内皮细胞的激活,其反过来会减少ET-1的释放。安贝生坦,ETA(内皮素A)受体的一种拮抗剂,会抑制由NECA激活的HPASM诱导的HPASM的增殖。因此,腺苷激活的HPAEC能够诱导HPASM的增殖,并且这是由在HPAEC中的A2B受体所介导,其导致ET-1的增加的释放。
实施例12:在HPASM中NOTCH3的NECA诱导的表达
预期,肺高血压的特征可以在于在小肺动脉平滑肌细胞中NOTCH3的过度表达。另外,疾病的严重性还可以相关于在肺中NOTCH3蛋白的量。参见,Li,X.,et al.,“Notch3signaling promotes the development ofpulmonary arterial hypertension”Nature Medicine,15(11):1289-1297(2009)。
用NECA(10μM)或NECA(10μM)和化合物A(100nM)来温育HPASM1.5小时。通过定量实时RT-PCR并利用上述方法来测量NOTCH3的表达。
结果示于图14。如在图中可以看到的,NOTCH3的基因表达和由NECA诱导的NOTCH3表达的增加受到化合物A的抑制。因此,进一步预期,利用A2B腺苷受体拮抗剂可以治疗肺高血压。
实施例13:在ADA缺乏小鼠的肺中血管壁增厚的衰减
该实施例说明,在腺苷依赖性肺损伤模型中,用A2B腺苷受体拮抗剂进行的治疗可以减弱血管壁的增厚。
所使用的模型系统是腺苷依赖性肺损伤的腺苷脱氨酶(ADA)缺乏小鼠模型。按照在Blackburn,M.et al.“Adenosine Deaminase-deficient MiceGenerated Using a Two-stage Genetic Engineering Strategy Exhibit aCombined Immunodeficiency”J.Biol.Chem.,273(9):5093-5100(1998)中描述的方法来获得小鼠。
该实施例遵循在Sun CX,et al.“Role of A2B adenosine receptorsignaling in adenosine-dependent pulmonary inflammation and injury,”J.Clin.Invest.,116(8):2173-2182(2006)(将以引用方式结合于本文)中描述的协议。
从分娩至产后第21天,对所有ADA缺乏小鼠保持ADA酶疗法,以预防在肺泡发展中的缺陷。Banerjee,et al.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.30-38-50(2004)。在产后第21天停止ADA酶疗法,以及3天以后对小鼠进行腹膜内注射1mg/kg的化合物A,每天两次,时间为14天。
肺收集自产后第38天小鼠并加以常规制备,用于切片和H&E染色。组织获自对照(ADA+)小鼠(图3A)、ADA缺乏小鼠(图3B)、和用化合物A加以治疗的ADA缺乏小鼠(图3C)。切片代表来自每个治疗组的6-8只不同小鼠。如在图中可以看到的,相比于ADA+小鼠,ADA-/-小鼠显示血管壁增厚的增加。另外,在经化合物A治疗的ADA-/-小鼠中增厚被大幅减小。
实施例14:腺苷A2B受体调节伴随有慢性肺疾病的肺高血压
该实施例说明了在伴随有慢性肺损伤的肺高血压的发病机制中A2B腺苷受体的作用,并且表明A2B腺苷受体拮抗剂可用于治疗这样的肺高血压。
方法:用腹腔内方式,用0.035单位/小鼠的博莱霉素(BLM)、或载体(磷酸盐缓冲盐水(PBS))来治疗雄性C57BL6小鼠,每周两次,时间为4周。当确立了肺纤维化时,在第15天,向小鼠提供包含A2B受体拮抗剂、化合物A(~10mg/kg/天剂量)的特殊食物,时间为接着的18天(图15)。相比之下,对照组接收正常饮食。
在第33天,进行右心室收缩压(RVSP)、全身血压、心率和肺功能测量。另外,收集肺,用于α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的免疫组织化学(IHC)。
统计分析:利用单向ANOVA并借助于Newman-Keuls后检验分析了所有数据。用于进行统计分析的软件是Graph-Pad Prism v5.00(La JollaCA)。在所有相关的附图中,显著性水平:*P<0.05,**0.001<P<0.01,***P<0.001是指在PBS和BLM组之间的比较;显著性水平:#P<0.05,##0.001<P<0.01,###P<0.001是指在BLM和BLM+化合物A组之间的比较。在附图中的所有数值表示5-8只小鼠/组的平均值+SEM(标准误差或平均值)。
结果:肺高血压(PH)经常相关于潜在的慢性肺疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化。在一些分类系统中,PH被分为五组并且伴随有肺病的PH被归类为第3组(例如,Simonneau et al.,“Updated ClinicalClassification of Pulmonary Hypertension,”J Am Coll Cardiol54:S43-54(2009))。
这里,借助于用博莱霉素(BLM)的治疗,建立了肺纤维化动物模型。如上所述,BLM是由细菌轮枝链霉菌产生的一种糖肽抗生素,其是一种已知的抗癌剂并具有相关的严重的并发症,其包括肺纤维化和受损的肺功能。如图16A-B所示,在博莱霉素治疗以后,通过HPLC测得的自小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)的腺苷水平、和自新鲜冰冻肺的A2BR表达水平显著增加。
以博莱霉素暴露以后血管重建的变化以及化合物A的效应按照图17A是显而易见的,其示出了α-SMA的免疫染色以确定在实质(上图片)和血管的肌肉壁(箭头和下图片)中的肌成纤维细胞(灰色信号)。BLM显著增加血管肌化的程度(图17B)和肌化血管的数目(图17C),在经化合物A治疗的小鼠或A2BR-/-小鼠中其增加被减弱。另外,如图18所示,BLM显著增加RVSP(左图片)和RV肥大(右图片)。然而,在经化合物A治疗的小鼠或A2BR-/-小鼠中,上述增加也被减小。另外,BLM增加了血管周纤维化,如在肺中的总胶原蛋白水平所示,在经化合物A治疗的小鼠或A2BR-/-小鼠中其增加同样被减弱(图19)。
图20A-B包括许多肺功能测量结果,其示出博莱霉素治疗和化合物A的效应。在所有的情况下,BLM对肺功能具有显著影响(例如,肺的增加的动态阻力(A),增加的组织阻尼(B),增加的准静态弹性(C)和减少的动脉氧合作用水平(D))。然而,通过化合物A的治疗或在A2BR-/-小鼠中,所有上述效应均被减小。
类似于实施例7和8,在BLM PH动物模型中,BLM显著增加白细胞介素(IL)-6水平(图21)和ET-1(图22)的释放,并且与上述观测结果一致,通过化合物A的治疗或在A2BR-/-小鼠中,上述增加显著减小。
总之,和对照小鼠相比,暴露于BLM的小鼠具有增加的RVSP。在治疗组之间没有观测到全身性收缩血压或心率的变化。在BLM暴露小鼠中,肺功能的测量结果揭示了增加的气道阻力以及气道和组织顺应性的降低,其与肺纤维化的发展一致。αSMA的IHC呈现在BLM暴露以后新肌化血管的增加。A2B受体的阻滞能够抑制BLM诱导的RVSP的增加以及减弱BLM在肺功能中的影响和降低肺血管肌化的程度。
这些结果突显了A2B受体在伴随有慢性肺损伤的肺高血压的发病机制中的作用并且证实了A2B受体作为用于治疗肺高血压的有效靶。
应当明了,本领域技术人员将能够设计各种安排,虽然在本文中未明确描述或示出,但其可以具体实施本发明的原理并且包括在其精神和范围内。另外,本文中陈述的所有条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和由本发明的发明人促成的概念,并且被解释为非限制于上述具体引用的条件。另外,本文中详述本发明的原理、方面、和实施方式的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外,意图是,上述等同物包括目前已知的等同物和在将来开发的等同物,即,开发的任何要素,其实施相同功能,而不论其结构。因此,本发明的范围并不旨在限于本文所示和描述的示例性实施方式。的确,本发明的范围和精神体现于所附权利要求。
Claims (44)
1.一种在需要其的患者中治疗肺高血压的方法,所述方法包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述肺高血压是肺动脉高血压(PAH)。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述肺动脉高血压选自特发性PAH、家族性PAH、或与另一种疾病或病症有关的PAH。
4.根据任何前述权利要求所述的方法,其中,所述方法用于肺部炎症的治疗。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述肺高血压是由于肺病和/或缺氧引起的肺高血压。
6.根据任何前述权利要求所述的方法,其中,所述患者是人。
7.根据任何前述权利要求所述的方法,其中,所述给予是全身给予。
8.根据权利要求1至5中的一项所述的方法,其中,所述给予是口服。
9.根据权利要求1至5中的一项所述的方法,其中,所述给予是静脉内给予。
10.根据权利要求1至5中的一项所述的方法,其中,所述给予是肌内给予。
11.根据权利要求1至5中的一项所述的方法,其中,所述给予是腹膜内给予。
12.根据权利要求1至5中的一项所述的方法,其中,所述给予是通过吸入。
13.根据任何前述权利要求所述的方法,其中,所述A2B受体拮抗剂是8环黄嘌呤衍生物。
14.根据任何前述权利要求所述的方法,其中,所述A2B受体腺苷拮抗剂是式I或II的化合物、或者其药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药:
其中:
R1和R2独立地选自氢、可选取代的烷基、或基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,并且E是可选取代的烷氧基、可选取代的环烷基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基、可选取代的杂环基、可选取代的烯基或可选取代的炔基,条件是当D是共价键时E不能是烷氧基;
R3是氢、可选取代的烷基或可选取代的环烷基;
X是可选取代的亚芳基或可选取代的杂亚芳基;
Y是共价键或亚烷基,其中一个碳原子可以可选地被-O-、-S-、或-NH-取代,并且可选地被羟基、烷氧基、可选取代的氨基、或-COR16取代,其中R16是羟基、烷氧基或氨基;
条件是,当所述可选的取代基是羟基或氨基时,它不能与杂原子相邻;以及
Z是可选取代的单环芳基或可选取代的单环杂芳基;或者
当X是可选取代的杂亚芳基以及Y是共价键时Z是氢;
条件是,当X是可选取代的亚芳基时,Z是可选取代的单环杂芳基。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,R1和R2独立地是氢、可选取代的低级烷基、或基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,并且E是可选取代的苯基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、或可选取代的炔基。
16.根据权利要求14所述的方法,其中,R3是氢。
17.根据权利要求14所述的方法,其中,R1和R2独立地是可选地被环烷基取代的低级烷基并且X是可选取代的亚苯基。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,Y是亚烷基,其中碳原子被氧取代。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,Y是-O-CH2-并且所述氧是与亚苯基的连接点。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,Z是可选取代的噁二唑。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,Z是被可选取代的苯基或被可选取代的吡啶基可选取代的[1,2,4]-噁二唑-3-基。
22.根据权利要求14所述的方法,其中,X是可选取代的1,4-亚吡唑基。
23.根据权利要求22所述的方法,其中,Y是共价键、亚烷基、低级亚烷基,并且Z是氢、可选取代的苯基、可选取代的吡啶基或可选取代的噁二唑。
24.根据权利要求23所述的方法,其中,R1是可选地被环烷基取代的低级烷基并且R2是氢。
25.根据权利要求22所述的方法,其中,Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-并且Z是可选取代的苯基,或者Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-并且Z是可选取代的噁二唑,尤其是3,5-[1,2,4]-噁二唑,或者Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-并且Z是可选取代的吡啶基。
26.根据权利要求25所述的方法,其中,R1和R2独立地是可选地被环烷基取代的低级烷基。
27.根据权利要求22所述的方法,其中,Y是共价键、-(CH2)-或-CH(CH3)-并且Z是氢、可选取代的苯基、或可选取代的吡啶基。
28.根据权利要求27所述的方法,其中,Y是共价键并且Z是氢。
29.根据权利要求1所述的方法,其中,所述受体拮抗剂选自由以下组成的组:
1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]-甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-苄基吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丁基-8-(1-{[3-氟苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-(苯乙基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丁基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-甲基-3-仲丁基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-环丙基甲基-3-甲基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-甲基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-乙基-3-甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(2-甲氧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)-苯基]乙基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(4-羧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
2-[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基(1,3,7-三氢嘌呤-8-基))吡唑基]-2-苯基乙酸;
8-{4-[5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(3-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(4-氟苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-正丁基-8-[1-(6-三氟甲基吡啶-3-基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-({5-[4-(三氟甲基)苯基]异噁唑-3-基}甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}苯甲酸;
1,3-二丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-(1H-1,2,3,4-四唑-5-基)苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
6-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}吡啶-2-羧酸;
3-乙基-1-丙基-8-[1-(2-吡啶基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)异噁唑-3-基]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-3-乙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;以及
3-乙基-1-(2-甲基丙基)-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮
或者它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药。
32.根据权利要求31所述的方法,其中,所述化合物选自由以下组成的组:
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]乙酸甲酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]2,2-二甲基丙酸甲酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]丁酸甲酯;以及
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]磷酸二氢甲酯。
33.根据权利要求1所述的方法,进一步包括给予另外的治疗剂,所述另外的治疗剂选自由强心苷、血管扩张剂/钙通道阻断剂、前列环素、抗凝血剂、利尿剂、内皮素受体阻断剂、磷酸二酯酶5型抑制剂、一氧化氮吸入剂、精氨酸补充剂以及它们的组合组成的组。
34.根据权利要求33所述的方法,其中,所述另外的治疗剂是内皮素受体阻断剂。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述内皮素受体阻断剂是安贝生坦。
36.根据权利要求35所述的方法,其中,与所述A2B腺苷受体拮抗剂同时或顺序地给予所述另外的治疗剂。
37.一种在肺动脉平滑肌细胞中抑制胶原蛋白、细胞外基质蛋白、和/或细胞外基质酶的过度表达的方法,所述方法包括使所述细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
38.根据权利要求37所述的方法,其中,所述胶原蛋白、所述细胞外基质蛋白、和/或所述细胞外基质酶选自ADAMTS1、ADAMTS8、CDH1、MMP7、MMP12、HAS1、ITGA7、COL1A1、COL8A1或CTGF。
39.一种在肺动脉平滑肌细胞中降低IL-6、IL-8、G-CSF、和/或血栓素表达的方法,所述方法包括使所述细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
40.一种在肺动脉内皮细胞中降低IL-8和/或ET-1表达的方法,所述方法包括使所述细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
41.一种抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖或迁移的方法,所述方法包括使所述细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
42.一种在需要其的患者中抑制血管壁增厚的方法,所述方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
43.一种在需要其的患者中降低右心室收缩压(RVSP)和/或右心室肥大的方法,所述方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
44.一种在需要其的患者中改善肺功能的方法,所述方法包括将治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂给予所述患者。
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