CN103232967A - 单分离胚胎的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种单分离胚胎的方法。该方法包括在系统(20)内提供多个胚胎(40)和在流体中感测(34)多个胚胎中的至少一个胚胎。该方法还包括在表面(28)上分配(26)所述多个胚胎中的至少一个胚胎。

Description

单分离胚胎的方法

本申请是2010年9月27日提交的申请号为201010299388.1的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明提供一种单分离（singulating embryos）胚胎的方法。

背景技术

植物的无性繁殖对于有些物种而言已表明产生大量的基因相同的胚胎，所述胚胎每个都具有长成正常植物的能力。这样的胚胎通常必须在实验室条件下进一步培养，直到它们达到自养“苗”状态为止，自养“苗”状态的特征在于经由光合作用产生它们自己的食物、抵抗干旱、产生能够穿透土壤的根、和抵御土壤微生物的能力。有些研究人员已用生产出的被称为人造种子的人工种子作试验，在人工种子中将单个植物体细胞或合子胚封装在种皮中。在授予Carlson等的美国专利No.5,701,699中公开了这样的人造种子的例子，该美国专利的公开内容在此以参考的方式明确并入。

典型的人造种子包括种壳、合成配子体和植物胚胎。不包括植物胚胎的人造种子在本领域被称为“种子坯（seed blank）”。这样的种子坯通常为具有封闭端和开口端的圆柱形囊。将合成配子体放置在种壳内，以基本上充满种壳的内部。通常被称为子叶约束物(cotyledonrestraint)的纵向延伸的多孔硬插入物可被设置在合成配子体内的中心，并包括部分延伸通过子叶约束物长度的位于中央的空腔。空腔具有在其中接纳植物胚胎的尺寸。公知的植物胚胎包括胚根端和子叶端。首先将植物胚胎淀积在子叶约束物的子叶端的空腔内，并通过至少一个端密封将该植物胚胎密封在种子坯内。在端密封中存在薄弱点，以允许胚胎的胚根端穿透端密封。

已经存在可用于大量生产上述类型的人造种子的自动化方法。在名称为“System and Method of Embryo Delivery for ManufacturedSeeds”、并转让给华盛顿的Weyerhaeuser Company of Federal Way的美国专利申请No.10/982,951中描述了一种这样的自动化方法，该美国专利申请的公开内容在此以参考的方式明确并入。

当前，从生长介质手工采集胚胎，并将胚胎物理放置在板上，以便回收并插入种子坯中。尽管这样的手工过程是有效的，但它们不是没有它们的局限性。作为非限制性示例，这样的手工操作是耗时耗力的，并因此昂贵。作为生产大量可用于插入人造种子中的体细胞胚的过程的一部分，需要使该过程的手工劳动成分最小化。

发明内容

提供本发明内容以便以简单的方式介绍将在以下的具体实施方式中详细说明的概念的选择。本发明内容不打算确定要求保护的主题的关键特征，也不打算在确定要求保护的主题的范围中用作帮助。

提供了一种单分离（singulating embryos）胚胎的方法。该方法包括在系统内提供多个胚胎和在流体中感测多个胚胎中的至少一个胚胎。该方法还包括在表面上分配多个胚胎中的至少一个胚胎。

附图说明

当结合附图时，本发明的上述方面及许多附带的优点将通过参考以下的详细说明而变得更好地理解，其中：

图1是根据本发明的一个实施例，利用单分离胚胎的方法的系统的一个示例的示意图；

图2A是根据本发明的一个实施例，单分离胚胎的方法的流程图；

图2B是图2A的流程图的继续；

图3A是根据本发明的另一实施例，单分离胚胎的方法的流程图；以及

图3B是图3A的流程图的继续。

具体实施方式

图1示意性地描绘了根据本发明的一个实施例，用于实现单分离胚胎的方法的自动化系统20。系统20与用于装配人造种子的组件（assembly）(未示出)联合的方式适当地安装，或者与这样的组件距离较远。

系统20包括胚胎储存组件22、可编程逻辑控制器(PLC)24、放置机构26、和胚胎淀积组件28。胚胎储存组件22包括单分离容器30、升降机机构32、和传感器34。单分离容器30合适地为具有多个胚胎40悬浮在诸如无菌超纯水的流体中的容器。优选地，将流体搅动至足以悬浮所有胚胎40的程度。单分离容器30安装在升降机机构32上。

升降机机构32包括基板50，基板50与诸如螺旋驱动或剪刀式升降机的公知的升降机52连接，以帮助维持单分离容器30的出口处基本上恒定的压头（head）。在本公开的含义和本文中使用的范围内，术语“基本上”意在包括产生几乎恒定的流体流率的工程允许偏差。

尽管使用升降机52来帮助维持大致恒定的压头，但也可接受已知的维持基本恒定的压头的其他装置。作为非限制性示例，可将泵(未示出)安置成与单分离容器30流体连通，以维持基本恒定的流率。因此，这样的装置是可接受的等效物，并在本发明的范围之内。此外，尽管维持基本恒定的压头是优选的，但如以下更详细地描述的，可变压头同样在本公开的范围之内。

通过流过管道60的流体在单分离容器30与放置机构26之间输送胚胎40。如以下更详细地描述地，管道60在单分离容器30与放置机构26之间延伸，并且传感器34邻近管道60适当设置，以感测和/或检测管道60内的胚胎40。

在说明和示例性的实施例中，由升降机52控制胚胎40通过管道60的流率。具体地，并且如众所周知，管道60内的流率与管道60在放置机构26处的出口和单分离容器30中的液面之间的垂直距离的平方根成正比。当单分离容器30中的流体减少时，通过升降机机构32升高单分离容器30的高度。升降机52以与管道60内流体的流率成正比的固定速率升高单分离容器30，以维持基本恒定的流率。在其他实施例中，可升高或降低升降机52，以分别增大或减小流率。

管道60包括大到足以允许单个胚胎40在任何给定的时间进入管道60的入口内径。尽管多个胚胎40可纵向地位于管道60内，但希望仅单个胚胎可在任何给定的时间进入管道60。同样优选的是，管道60是透明或半透明的诸如有机硅的材料，以允许管道60内的胚胎被传感器34检测。

传感器34是用于检测胚胎40何时离开单分离容器30的公知的基于激光的视觉传感器。一种这样的传感器34是由日本大阪的Keyence公司制造和销售的No.LV-H300/100系列型。在管道60可操作地设置在传感器34的部件之间的情况下，传感器34被适当安装至基板50。传感器34又与PLC24通信。

系统20可包括与单分离容器30连通的公知的第二传感器(未示出)。该第二传感器用于测量单分离容器30中流体的静压头。一种这样的传感器是由日本大阪的Keyence公司制造和销售的No.FW-H07型。这样的传感器将超声波用于测量距离。尽管超声波传感器是优选的，但包括基于激光和雷达的其他类型的传感器也在本公开的范围之内。第二传感器与PLC24通信。

公知的PLC24适当具有操作员接口，以控制单分离过程和升降机机构32的升高和降低。一种这样的PLC24是由日本东京的KoyoElectronics IndustriesCo.,Ltd.制造和销售的DirectLOGIC205ModularProgrammable Logic Controller(DL205PLC)。

可对PLC24编程，以在系统20的操作期间与升降机机构32、传感器34、第二传感器、以及放置机构26交接，以及允许操作者调整操作参数。操作参数，诸如放置在胚胎淀积组件28上的胚胎40的数量、胚胎40之间的间隔、以及胚胎40在胚胎淀积组件28上的位置，都可按照需要编程。

可对PLC24编程，以便在胚胎流过管道60时通过跟踪胚胎来控制胚胎40在胚胎淀积组件28上的间隔和位置。在这样的实施例中，PLC24包括时钟或定时器和登记器（registry）。一个这样的登记器是胚胎位置登记器(“ELR”)。ELR包括表示沿管道60长度的位置的二进制登记域（binary registers）。作为示例，ELR可将管道60分离成五十个登记域，代表管道60中的五十个连续位置。第一登记域位置相应紧邻传感器34，而最后一个登记域位于管道60连接至放置机构26的末端处。如以下更详细地描述的，ELR跟踪和记录作为胚胎在管道60内的路径的时间函数。

放置机构26包括机械臂80。可控制机械臂80相对于胚胎淀积组件28的运动，以将管道60的出口定位在胚胎淀积组件28上的开放位置上方。一种合适的机械臂80是由纽约Mattituck的Ultramotion制造和销售的No.DA25-HT17-8NO-B/4型的Ultramotion机械臂。为了获得机械臂80预期的运动，放置机构26还包括诸如由加利福尼亚Torrance的Oriental Motor U.S.A.Corp.制造和销售的No.PK266E2.0A型步进电动机(未示出)。

机械臂80具有两个自由度，以提供胚胎40在胚胎淀积组件28上的精确放置。在这点上，优选的是，机械臂80沿着箭头70所指示的轴纵向平移。此外，机械臂80沿垂直于箭头70、即进出页面的轴运动。机械臂80上的管道60的出口相对于垂直轴成一定角度适当取向，使得当流体退出管道60时，流体不垂直于胚胎淀积组件28。

还希望机械臂80与ELR、传感器34、和/或第二传感器组合，由PLC34控制。作为非限制性示例，如果传感器34检测到胚胎40，则其向PLC24发送指示胚胎存在的信号。该信号按“真”进入ELR。如果传感器34没有检测到胚胎40，则该登记域为“假”。“真”被登记器记录为“1”，而“假”被登记器记录为“0”。

ELR中登记器的数量为管道60长度的函数。例如，如果管道60为20英寸长并具有五十个登记域，则各登记域表示0.4英寸的管道60。此外，在该示例中，胚胎从传感器34到放置机构26的行进时间大约为一秒。结果，ELR的各登记器代表大约20毫秒的时间。时钟每隔20毫秒更新登记器，使得登记域向前偏移，并且用“1”或“0”更新各登记域。此外，按照操作者控制胚胎淀积在胚胎淀积组件28上的间隔的需要，机械臂80的速度同样每隔20毫秒进行更新和编程，以匹配胚胎之间的间隔。

胚胎淀积组件28包括单分离框架82和排水容器84。该单分离框架82相应包括在留住胚胎的同时允许流体通过的支撑材料。支撑材料还优选地在支撑材料与胚胎之间提供颜色对比，使得在胚胎与支撑材料之间存在对比。适合用于系统20的一种这样的支撑材料为尼龙，No.03-125/45型。排水容器84相应地支持真空装置(未示出)，用于流体去除和帮助将胚胎保持在固定的位置。

可通过参考图2A-2B最好地理解根据本公开的一个实施例构建的系统20的操作方面。操作顺序的开始通过启动系统20通过方框102所指示的使ELR归零，由起动框100表示。此外，启动流体流动通过系统20，并且升降机机构32以维持整个系统20基本恒定的液压头的速率，升高单分离容器30。这由方框104图解。

由方框110所指示，启动定时器，传感器34确定在管道60中是否检测到胚胎40并由判定框106指示。如果传感器34检测到胚胎40，则由方框108所指示，将“1”置于ELR的第一登记器位置。其后，如判定框112所指示，评价定时器的值，以确定是否已到达诸如20毫秒的预定时段。如果传感器34没有检测到胚胎，则PLC将向前前进至方框112并评估定时器是否已超时。

如果定时器没有超时，则ELR返回至方框106，以评估是否已检测到胚胎。如果定时器已超时，则由方框114所指示，ELR使登记器向前移动一个位置。此外，如方框116所指示，重置定时器。

如方框118所指示，PLC评估在最后一个ELR登记器中是否是“1”，“1”指示胚胎40在管道60的最端部处的存在。如果在最后一个登记器中为“0”，指示在最后一个登记器中没有胚胎的，则由方框120所指示，PLC确定ELR的每个登记器是否均为“0”。如果每个登记器为空，则如方框122所指示的，停止机械臂80，并且PLC返回至方框110以启动增量定时器（increment timer），并如方框106所指示地评估传感器34是否再次检测到胚胎。

返回参考方框118，如果ELR中的最后一个登记器包含“1”，则PLC评估ELR中的任何其他登记器是否包含“1”，从而指示另一胚胎在管道60中的存在。这由方框124指示。如方框126所表示，如果ELR中没有其他的登记器包含“1”，则将机械臂80的速度设定为最低速度。这可通过包含的探查表格实现，该探查表格包含作为管道60中胚胎数量的函数的预定机械臂速度。这样的探查表格为本领域的普通技术人员所公知。

如上所述，如果在ELR的一个或多个其他登记器中有“1”，则PLC通过参考探查表格，基于ELR中最后一个和倒数第二个登记器位置设定机械臂速度。这由方框128指示。其后，如方框130所指示的，将输出速度发送至机械臂80。

在将胚胎淀积在单分离框架82上之前，评估机械臂80相对于单分离框架82的宽度的“X”位置。具体地，如方框132所指示的，评估机械臂80的“X”位置，以确定该机械臂80是否已达到单分离框架82的最大宽度。如果是，则如方框134所指示，机械臂80沿单分离框架82的纵向方向、或“Y”方向向前前进一个位置，并且使机械臂80沿“X”方向的方向反向。

在机械臂80的“X”位置反向之后，由方框136所指示，PLC将“X”位置归零。其后，如方框138所指示，将胚胎淀积在单分离框架82上。返回至方框132，如果没有达到“X”位置，则绕过方框134和136，并如方框138所表示的，将胚胎淀积在单分离框架82上。

希望的是，对PLC24编程，以控制机械臂80，使得该机械臂80将胚胎淀积在单分离框架82上预定的位置。作为非限制性示例，可对PLC24编程，使得机械臂80将胚胎以它们的侧面（on their sides）淀积在单分离框架82上。在这样的位置中，子叶端和胚根端都接触单分离框架82的支撑材料，或者仅子叶端或胚根端接触单分离框架82的支撑材料。作为另一非限制性示例，机械臂82可将胚胎淀积在支撑材料上，使得随后的胚胎与在前的胚胎间隔开。因此，这样的预定位置及其等效物在本发明的范围之内。

在将胚胎淀积在单分离框架82上之后，并如方框140所指示的，ELR确定淀积在单分离框架82上的胚胎是否已达到预期的数量。如为“否”，则ELR返回至方框110，并重复评估。如果已将最大数量的胚胎淀积在单分离框架82上，则如方框142所指示，现在结束该过程。

可通过参考图3A和3B最好地理解单分离胚胎的备选方法的操作。应指出的是，图3A和3B的该备选实施例与参考第一实施例所描述的部件相同的部件，具有相同的附图标记。

操作顺序的开始通过启动系统20，如方框102所指示使ELR“归零”来由起动框100表示。同时，启动流体流动通过系统20并由方框204指示。由方框206所指示的启动增量定时器1，并且如方框208中所指示，计算单分离速率、或数据点。

如判定框210所指示，将胚胎单分离速率与设定点相比较，以确定胚胎单分离速率是否等于设定点。单分离速率定义为每单位时间检测到的胚胎的数量。为了计算它，在运动的时间窗中检测到的胚胎的数量除以窗(在时间上)的大小，例如最后60秒中50次测到。由于总是使用最近的窗，所以窗在时间上向前“运动”。如果胚胎单分离速率不等于设定点，则调整静压头设定点。如果需要降低单分离速率，则降低静压头设定点。这由方框212指示。然后，由第二传感器测量单分离容器30内的液体的静压头。以上描述了一种这样的超声波传感器。这由方框214指示。

仍然参考图3A，如方框216所指示，相对于设定点进行液体静压头的比较，以确定静压头是否等于设定点。如果静压头不在设定点，则如方框218所指示的，调整通过升降机机构32的单分离容器30的升高速率。总之，单分离速率控制器调整静压头设定点(即流体/胚胎的目标流率)，并且静压头控制器调整单分离壶的升高速率，以求驱使静压头到达其目标(即设定点)。如方框220所指示，在静压头的调整之后，计算ELR的长度(即登记域的数量)。基于传感器(34)与管道(60)的出口之间的距离和流体的流率(即静压头)计算ELR的长度。由于流率(压头)升高，所以流体/胚胎的速度在管道(60)中提高，这继而减少了检测与在s-框架(82)上放置之间的时间。要求的登记域数量这时在方框220中除以定时器2的时间。如方框221所示，继方框220之后，启动第二增量定时器。

传感器34确定在管道60中是否检测到胚胎40并由判定框106指示。如果传感器34检测到胚胎40，则由方框108所指示，将“1”置于ELR的第一登记器位置。其后，如判定块222所指示的，评估第二增量定时器，以确定是否已到达诸如20毫秒的预定时段。如果传感器34没有检测到胚胎，则PLC将向前前进至方框222，以确定第二定时器是否已超时。

如果第二增量定时器没有超时，则ELR返回至方框106，以评估是否已检测到胚胎。如果第二增量定时器已超时，则由方框114所指示，ELR使登记器向前移动一个位置并将“1”置于下一登记器位置。此外，如方框116所指示，重置第二增量定时器。

如由判定框118所指示，PLC评估在最后一个或“触发”ELR登记器中是否为“1”，“1”指示胚胎40在管道60的最端部处的存在。如果在最后一个登记器中为“0”，指示在最后一个或触发登记器中没有胚胎，则由判定块224所指示的，PLC确定第一增量定时器是否已超时。如果第一增量定时器没有超时，则由方框221所指示，PLC将返回以启动第二增量定时器。然而，如果第一增量定时器已超时，则如方框206所指示的，PLC返回以启动定时器1。

返回至判定框118，如果ELR中的最后一个或触发登记器包含“1”，则如方框138所表示，PLC将胚胎淀积在单分离框架82上。在将胚胎淀积在单分离框架82上之后，评估机械臂相对于单分离框架82宽度的“X”位置。具体地，如方框132所指示，评估机械臂80的“X”位置，以确定该机械臂80是否已达到单分离框架82的最大宽度。如果它已达到单分离框架82的最大宽度，如方框134所指示，则机械臂80沿单分离框架82的纵向方向、或“Y”方向向前前进一个位置，并且使机械臂80沿“X”方向的方向反向。在使机械臂的“X”位置反向之后，由方框136所指示，PLC使“X”位置归零。

如果在方框132中没有达到“X”位置，则如方框226所指示，机械臂80沿“X”轴移动一个位置。这样做使机械臂80移动至单分离框架82上的下一开放位置。因此，去除多个胚胎中的至少一个胚胎可与诸如静压头和流率的数据点同步。

其后，如方框140所指示的，PLC确定淀积在单分离框架82上的胚胎是否已达到预期的数量。如果胚胎计数没有达到预期的数量，则程序返回至方框204，并重复该过程。如果已将最大数量的胚胎淀积在单分离框架82上，则如方框142所指示的，现在结束该过程。

尽管已图解和描述了说明性的实施例，但应意识到的是，在不偏离本发明的精神和范围内，能在其中作出各种变化。作为非限制性示例，传感器34可设置在沿管道60的任一点处。在一个备选实施例中，传感器34可邻近机械臂80设置。在这样的备选实施例中，可对PLC24编程，以便其一从传感器34接收到输入信号，就起动机械臂80淀积感测到的胚胎。邻近机械臂80定位传感器34，在具有恒定的或不恒定的流体流动的系统20中起作用。此外，可在多种系统中实现本发明的方法，因此，提供所描述的用于实现该方法的系统仅是为了说明的目的而不是意在限制。

Claims (7)

1.一种单分离胚胎的方法，其包括：

(a)在储存容器中提供不包括人胚胎的多个胚胎；

(b)获得与所述储存容器相关的数据点；

(c)确定离开所述储存容器的胚胎的流率；以及

(d)作为所述数据点和所述流率的函数，同步所述多个胚胎中的至少一个胚胎的去除。

2.根据权利要求1所述的方法，其中获得数据点包括监控所述储存容器，以确定静压头。

3.根据权利要求1所述的方法，其中同步所述多个胚胎中的至少一个胚胎的去除包括：

升高所述储存容器，以增大离开所述储存容器的胚胎的流率。

4.根据权利要求1所述的方法，其中同步所述多个胚胎中的至少一个胚胎的去除包括：

降低所述储存容器，以减小离开所述储存容器的胚胎的流率。

5.根据权利要求1所述的方法，其中同步所述多个胚胎中的至少一个胚胎的去除包括：

将所述数据点与预定的设定点进行比较。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述数据点为静压头。

7.根据权利要求1所述的方法，其还包括在表面上淀积所述多个胚胎中的至少一个胚胎。

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