CN103232524A

CN103232524A - 反相柱分离纯化硫肽类抗生素诺卡沙星i的方法

Info

Publication number: CN103232524A
Application number: CN 201310162354
Authority: CN
Inventors: 陈依军; 朱天翼
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明涉及一种反相柱层析纯化硫肽类抗生素诺卡沙星I的方法，包括用二甲亚砜（DMSO）溶解诺卡沙星I粗品，再用反相柱层析通过梯度洗脱的方法纯化诺卡沙星I，收集仅有诺卡沙星I的洗脱液，减压蒸出有机溶剂，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，分离并蒸干萃取剂得到产品。本方法操作简单，仅通过一步柱层析的方法即可得到高纯度诺卡沙星I，纯度达98.0%以上，产率高达85.0%，且在多个步骤中采用的溶剂均可回收再利用。

Description

反相柱分离纯化硫肽类抗生素诺卡沙星I的方法

技术领域

本发明涉及反相柱分离纯化硫肽类抗生素诺卡沙星I的方法，属于抗生素分离纯化和精制技术领域。

背景技术

自1928年弗莱明发现青霉素和1942年瓦克斯曼发现链霉素以来，抗生素为人类的健康事业做出了卓越的贡献。在人们应用抗生素治疗疾病的同时，也锻炼了细菌的耐药能力，于是随着抗生素的滥用以及病原性细菌的快速进化，临床上已经出现了越来越多的耐药菌株，特别是对多种抗生素都有抗性的菌株如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP），人们面对这类菌株的快速感染率往往显得束手无策。随着临床上耐万古霉素的革兰氏阳性菌的逐渐增多，万古霉素等糖肽类的抗生素一直以来被作为抗耐药菌的最后防线的地位也变得岌岌可危。于是，寻求并且开发一些结构新颖、活性显著的新型抗耐药菌的药物已经成为新药研究的热点和难点。

诺卡沙星I是由诺卡氏菌属或拟无枝酸菌发酵获得的新型硫肽类抗生素，其结构如式1所示，诺卡沙星I独特结构使其能够通过与核糖体50S大亚基的23S rRNA以及L11蛋白形成复合物从而影响L11蛋白质的构象转化，进而抑制蛋白质的合成而达到杀菌的作用（参见：Nat Prod Rep,1999,16(2):249～263）。其在ng/ml的水平便对绝大多数革兰氏阳性菌特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP）、耐万古霉素的肠球菌（VRE）以及具有耐药性的结核杆菌有着超强的杀菌活性，并且有报道指出其对金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型也展现出了显著的治愈效果（参见：Antimicrob AgentsChemother,2004,48(10):3697～3701）。因此，在多重耐药菌频繁出现的今天，诺卡沙星I十分具有研究前景及临床应用价值。

诺卡沙星I结构复杂，主要通过微生物发酵提取的方法获得，此途径获得的诺卡沙星I纯度低，无法满足临床前及临床研究的需要，目前主要通过正相硅胶柱层析的方法对诺卡沙星I进行纯化，但这种方法纯化能力有限、回收率低、工作量大、成本高（参见：专利号99898680.0的中国发明专利）。因此，为满足研究及工业化的需要，开发一种便捷、高效、经济的诺卡沙星I纯化方法势在必行。

式1：诺卡沙星I化学结构式

发明内容

针对现有纯化方法的不足，本发明提供了一种高效、快捷、稳定的诺卡沙星I纯化方法。

本发明的技术方案如下：

一种纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，步骤如下：

1、将诺卡沙星I粗品溶解于二甲亚砜（DMSO）中，

2、将溶有诺卡沙星I粗品的DMSO溶液，利用反相硅胶柱梯度洗脱，收集仅有诺卡沙星I的组分，除去有机溶剂，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到高纯度诺卡沙星I产品。

上述步骤1中，优选的诺卡沙星I浓度为25-150mg/ml

优选的上述步骤2的柱层析纯化方法，将溶有样品的DMSO溶液加入已平衡的反相色谱柱顶端，打开色谱柱阀门，待样品液进入色谱柱材后加入一定量的洗脱液I进行淋洗，再换成洗脱液II继续淋洗。分段收集洗脱液II的流出液，并用薄层色谱监测，合并含有诺卡沙星I的组分，除去有机相，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到产品。

上述步骤2的反相柱层析纯化，优化的诺卡沙星I上样量与硅胶的质量比为1:12000--1:2000。

上述步骤2的反相柱层析纯化，优选的洗脱液I是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

洗脱液I为乙腈和水混合液时，乙腈的体积分数优选为30-45%。

洗脱液I为甲醇和水混合液时，甲醇的体积分数优选为25-35%。

上述步骤2的反相柱层析纯化，优选的洗脱液II是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

洗脱液II是乙腈和水混合液时，乙腈的体积分数优选为35-50%。

洗脱液II是甲醇和水混合液时，甲醇的体积分数优选为40-50%。

进一步地，所用反相硅胶，粒径为20-45μm，40-75μm和70-200μm中的一种或混合物。

本发明方法的优良效果如下：

1.本发明所涉及的纯化方法操作简单，重复性好。仅通过一步反相柱层析和萃取等常规操作即可获得高纯度诺卡沙星I。

2.本发明涉及的纯化方法效率高，产品质量高。采用本发明的纯化方法，诺卡沙星I的产率高达85%以上，纯度大于98%。

3.本发明涉及的纯化方法经济效果明显，环境污染小。在本发明所采用的纯化方法中，多种有机溶剂均可实现回收利用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

本发明诺卡沙星I的纯化方法所用诺卡沙星I粗品为微生物发酵所得，纯度为60-95%。所用试剂和材料均为市售。

实施例1

称取一定量粒径为40-75μm的反相硅胶，甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度分别为25，150mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:2000--1:12000）分别滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约5倍柱体积35%的乙腈洗脱，随后改用38%的乙腈洗脱约4倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集38%的乙腈洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度分别高于99.21，98.53%，收率分别为89.7，85.36%。

实施例2

称取一定量粒径为20-45μm的反相硅胶，甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度为25mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:2000--1:12000）滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约3倍柱体积45%的乙腈洗脱，随后改用50%的乙腈洗脱约3倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集50%的乙腈洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度高于98.04%，收率92.4%。

实施例3

称取一定量粒径为70-200μm的反相硅胶，甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度为25mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:12000--1:2000）滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约5倍柱体积30%的乙腈洗脱，随后改用35%的乙腈洗脱约3倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集35%的乙腈洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度高于98.41%，收率85.23%。

实施例4

称取一定量粒径为40-75μm的反相硅胶，甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度为25mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:2000--1:12000）滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约5倍柱体积35%的乙腈洗脱，随后改用38%的乙腈洗脱约4倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集38%的乙腈洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的氯仿萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度高于99.46%，收率为89.3%。

实施例5

称取一定量粒径为40-75μm的反相硅胶，甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度为25mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:12000--1:2000）滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约8倍柱体积25%的甲醇洗脱，随后改用40%的甲醇洗脱约4倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集40%的甲醇洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度高于98.42%，收率86.65%。

实施例6

称取一定量粒径为40-75μm的反相硅胶，甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度为25mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:12000--1:2000）滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约5倍柱体积35%的甲醇洗脱，随后改用50%的甲醇洗脱约3倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集50%的甲醇洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度高于98.66%，收率88.25%。

实施例7

称取一定量混合反相硅胶（混合比例为粒径20-45/40-70/70-200μm=1:1:1W/W/W），甲醇处理后，填装并平衡。诺卡沙星I粗品溶解于DMSO，浓度为25mg/mL。将溶有诺卡沙星I粗品的样品液（诺卡沙星与硅胶的质量比为1:12000--1:2000）滴加到反相硅胶柱顶端，打开阀门，待样品液面接近柱材面边缘时，加入约5倍柱体积35%的乙腈洗脱，随后改用38%的乙腈洗脱约4倍柱体积。以每管5-8mL的体积收集38%的乙腈洗脱液，薄层色谱法实时监测，合并含有诺卡沙星I的所有组分，除去乙腈后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干得到高纯度诺卡沙星I。纯度高于98.74%，收率为88.4%。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将诺卡沙星I粗品溶解于二甲亚砜（DMSO）中；

（2）将溶有诺卡沙星I粗品的DMSO溶液，利用反相硅胶柱梯度洗脱，收集仅有诺卡沙星I的组分，除去有机溶剂，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到高纯度诺卡沙星I产品。

2.根据权利要求1所述诺卡沙星I的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中诺卡沙星I粗品溶解于DMSO中。

3.根据权利要求2所述诺卡沙星I的纯化方法，其特征在于，诺卡沙星I粗品溶于DMSO后其浓度为25-150mg/mL。

4.根据权利要求1所述诺卡沙星I的纯化方法，其特征在于，步骤（2）的反相硅胶柱纯化步骤是将溶有样品的DMSO溶液加入已平衡的反相色谱柱顶端，打开色谱柱阀门，待样品液进入色谱柱材后加入一定量的洗脱液I进行淋洗，再换成洗脱液II继续淋洗，分段收集洗脱液II的流出液，并用薄层色谱监测，合并含有诺卡沙星I的组分，除去有机相，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到产品。

5.根据权利要求4所述纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，诺卡沙星I粗品上样量与反相硅胶的质量比为1:2000--1:12000。

6.根据权利要求4所述纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，洗脱液I是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

7.根据权利要求6所述纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，当洗脱液I为乙腈和水混合液时，乙腈体积分数为10-60%。

8.根据权利要求6所述纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，当洗脱液I为甲醇和水混合液时，甲醇体积分数为10-60%。

9.根据权利要求4所述纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，洗脱液II是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

10.根据权利要求9所述纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，当洗脱液II为乙腈和水混合液时，乙腈体积分数为10-50%。