CN103224967B - 制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要阐述制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法。瓜尔豆胶是从瓜尔豆种子的胚乳中提取出的一种多糖胶，是一种线性半乳甘露聚糖。由于瓜尔豆胶中侧链半乳糖含量过高与黄原胶等其他多糖共混形成凝胶的能力差，限制了应用。本办法解决了天然瓜尔豆胶无法与黄原胶等其他多糖共混形成凝胶的缺点，以精制的瓜尔豆胶为原料，通过特定酶的修饰，脱去其半乳甘露聚糖分子结构中过多的半乳糖，使其具有优良的凝胶特性。其技术要点是将酶促反应应用于半乳甘露聚糖分子中半乳糖苷的降解，与化学改性相比，酶法修饰具有反应条件温和、水溶性好等优点，适和用于食品与饲料添加剂、医药、化工及石油等诸多产业，为半乳甘露聚糖改性提供了有效的新途径。
Description
技术领域：
本发明涉及食品添加剂领域，具体地说涉及一种利用半乳糖苷水解酶制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法。
背景技术：
半乳甘露聚糖类多糖胶由于其独特的流变性与胶凝性及降血糖、降血脂、润肠减肥等特性而被广泛应用于食品和医药等诸多领域。据统计我国多糖胶的年需求量超过10万吨，但其中具有优良增粘与胶凝性质的半乳甘露聚糖类多糖胶--刺槐豆胶主要靠进口。刺槐豆胶(Locust bean gum)由洋槐树(Sophora japonica L.)的种子提取而成，该树生长缓慢，约15年后产豆，50年的树龄才能达最大产量，同时由于世界范围洋槐资源的日趋减小，导致价格不断上涨，给食品加工业带来很大的成本压力。对其他半乳甘露聚糖胶改性，生产刺槐豆胶的替代产品或结构类似物将是提高半乳甘露聚糖胶利用价值与降低其使用成本的重要途径之一。
瓜尔豆胶(Guar gum)是目前国际上最为廉价而又广泛应用的亲水胶体之一，正逐渐成为中国食品工业中用量最大的增稠剂之一，并在石油、化工及医药等领域发挥重要作用。它主要来源于印度和巴基斯坦等地干旱和半干旱地区广泛栽培的一种一年生草本抗旱农作物豆科植物瓜尔豆(Cyamposistetragonolobus)，瓜尔豆胶是从种子的胚乳中提取出的一种多糖胶，是一种线性半乳甘露聚糖。其结构是由β-(1→4)-D-甘露糖构成的主链上，通过α-(1→6)糖苷键不均匀地连接单个的D-半乳糖分支，其半乳糖与甘露糖之比约为1:2。
在半乳甘露聚糖结构中，刚性的β-(1→4)甘露聚糖主链使半乳甘露聚糖水溶液具有高黏度；半乳糖含量(<30%)较低的半乳甘露聚糖，可与其他多糖，如卡拉胶和黄原胶，形成弹性胶，并可用作冷冻多相食品体系的稳定剂。刺槐豆胶（半乳糖:甘露糖=1:4）是已发现的半乳甘露聚糖胶中半乳糖含量最低的品种，能够与黄原胶形成食品行业公认的优质凝胶,这一特殊功能决定其价格一直比瓜尔胶等半乳甘露聚糖胶高10倍以上,因此开发刺槐豆胶的替代品有着很好的商业应用前景。而在瓜尔豆胶的结构中由于半乳糖含量过高与其他多糖形成共凝胶时的能力差，限制了其在各个领域中的应用，可以通过改性优化其结构特性改变其与其他多糖形成共凝胶时能力差的缺陷。传统方法对半乳甘露聚糖的改性通常是通过化学修饰来实现，但化学改性不易控制、常常过度水解、副产物多。相比之下，酶法修饰改变多糖胶的分子结构使其获得所需特性，具有很多优点。
α-1,6-半乳糖苷酶是酶法降解多糖结构中半乳糖的关键酶。不同来源的酶，对半乳甘露聚糖的水解作用有很大差异，多数的酶对小分子底物有较高的活性而并不能有效作用于多糖，或最终的水解度较低，无法满足替代刺槐豆胶的要求。选择能有高效降解半乳甘露聚糖的基因重组α-半乳糖苷酶，其提取纯化简单、成本低，并具有反应条件温和、环境友好、降解产物的分子组成易于控制，选择性好、水溶性高等突出的优点，将成为半乳甘露聚糖改性最具潜力的新途径。
发明内容：
本发明的目的是解决天然瓜尔豆胶分子结构中半乳糖含量过高，与黄原胶等其他多糖共混时难以形成凝胶的问题。提供一种α-半乳糖苷酶修饰瓜尔豆胶的方法，即一种利用半乳糖苷水解酶制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法。
本发明以天然瓜尔豆胶为先导，通过对其半乳甘露聚糖分子结构中半乳糖的水解，进而改善其与其他多糖共混时的凝胶性能，也为同类天然半乳甘露聚糖的高值化利用和新型半乳甘露聚糖的研制提供新的途径。
制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，该方法的步骤如下：
1）配制反应底物瓜尔豆胶水溶液；
2）配制酶促反应缓冲液；
3）将所述步骤1）所得的瓜尔豆胶水溶液加入反应容器中，添加酶促反应缓冲液及半乳糖苷水解酶，形成酶促反应体系；
4）将所述步骤3）中的酶促反应体系在恒温水浴或恒温箱中保温，通过反应时间控制来酶对底物的修饰度；
5）将所述步骤4）中的反应完成后，加入乙醇，终止反应，充分混匀；
6）将所述步骤5）中的所得物质离心后，沉淀出改性瓜尔豆胶,去除游离态的半乳糖；沉淀物改性瓜尔豆胶用乙醇洗净后进行真空或冷冻干燥，最后研磨制成改性瓜尔豆胶干粉。
进一步地，所述步骤1）中的瓜尔豆胶水溶液是按1%（W/V）的浓度配制，利用具有加热功能的磁力搅拌器，边加热边搅拌至80-90℃保温，使瓜尔豆胶完全溶解，之后冷却至室温，然后在10000-12000r/min的条件下离心40-60min，除去不溶杂质，即得瓜尔豆胶水溶液。
进一步地，所述步骤2）的酶促反应缓冲液中，磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L，其中含有牛血清蛋白2mg/mL，氯化钙2mmol/L。
进一步地，所述步骤3）中的酶促反应体系构成:①天然瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②与①等体积的pH值为5.0的100mmol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含有2mg/mL的牛血清蛋白溶液和2mmol/L的氯化钙溶液；③半乳糖苷水解酶按反应体系中终浓度1.5-2U/mL的比例添加。
进一步地，所述步骤4）中的酶促反应体系在30-35℃的恒温水浴或恒温箱中保温，通过反应时间控制来酶对底物的修饰度，在反应进行一定的时间后，停止保温，加入乙醇终止反应，反应时间范围为2-20h。
进一步地，所述步骤5）中加入2倍的95-100%（V/V）的乙醇。
将所述步骤5）中的反应完成后，加入乙醇，当溶液出现沉淀即可终止反应，充分混匀，其中，反应完成的指标为：测定酶修饰瓜儿豆胶分子结构中甘露糖/半乳糖的比值，达到所需要求，即可终止反应；
进一步地，所述步骤6）中的所得物以10000-12000r/min离心15-20min；沉淀物改性瓜尔豆胶用70%（V/V）的乙醇洗净后进行真空或冷冻干燥。
进一步地，所述步骤3）中的半乳糖苷水解酶是能够高效水解半乳甘露聚糖的α-1,6-半乳糖苷水解酶。
进一步地，酶促反应缓冲液的pH值为4.5-5.0。
本发明的特点及有益效果：
本发明将酶促反应应用于半乳甘露聚糖类天然多糖的修饰，与化学改性相比，对多糖结构中的半乳糖水解效率高、水解程度易于控制；产物分离纯化简单；半乳糖苷水解酶制备容易，成本较低。
本发明采用的半乳糖苷水解酶为α-1,6-半乳糖苷酶，这种酶在自然界中分布广泛，其中一些能高效水解多糖的酶基因及氨基酸序列已经被测定，作用机理也较为明确，已转入基因工程菌中表达，获得容易，纯化简便，适于规模化生产。
附图说明：
图1：改性瓜尔豆胶水溶液硬度的变化趋势。为说明改性瓜尔豆胶水溶液硬度的变化，以天然瓜尔豆胶（G）作为对照。不同酶作用时间获得的改性瓜尔豆胶其水溶液的硬度明显提高。图2：改性瓜尔豆胶与黄原胶复配凝胶的硬度变化趋势。为说明改性瓜尔豆胶与黄原胶共混溶液凝胶硬度的改善，以天然刺槐豆胶与黄原胶共混溶液（XLB）、天然瓜尔豆胶与黄原胶共混溶液（XG）作为对照。不同酶作用时间获得的改性瓜尔豆胶与黄原胶共混溶液的硬度明显提高，酶作用8h后的改性瓜尔豆胶与黄原胶共混溶液的硬度已显著高于天然刺槐豆胶与黄原胶共混溶液。
具体实施方式：
表1：多糖胶名称简写
表2：质构仪参数设定
表3：不同酶作用时间获得的改性瓜尔豆胶中M/G比
| 样品 | 酶作用时间/h | 甘露糖/半乳糖(M/G) |
| LB | 0 | 3.6 |
| G | 0 | 2.1 |
| G1 | 2 | 2.7 |
| G2 | 4 | 3.2 |
| G3 | 8 | 5.2 |
| G4 | 12 | 8.9 |
| G5 | 16 | 11.1 |
| G6 | 20 | 13.1 |
本发明提供的利用半乳糖苷水解酶制备低半乳糖含量的瓜尔豆胶的方法如下：
1）配制反应底物瓜尔豆胶水溶液：按1%（W/V）的浓度配制，利用具有加热功能的磁力搅拌器，边加热边搅拌至90℃保温，使瓜尔豆胶完全溶解，之后冷却至室温，然后在12000r/min的条件下离心1h，除去不溶杂质，即得瓜尔豆胶水溶液备用。
2）酶促反应缓冲液配制：配制浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有牛血清蛋白2mg/mL，氯化钙2mmol/L，pH值为4.5-5.0。
3）酶促反应体系构成：①天然瓜尔豆胶溶液（1%，W/V）；②与①等体积的pH为值5.0的磷酸盐缓冲液（100mmol/L），磷酸盐缓冲液中含有2mg/mL的牛血清蛋白溶液和2mmol/L的氯化钙溶液；③半乳糖苷水解酶按反应体系中终浓度达到1.5-2U/mL的比例添加。推荐反应体系总体积设在10-1000mL范围内。
4）反应体系在30-35℃的恒温水浴或恒温箱中保温，通过反应时间来控制酶对底物的修饰度，根据对底物不同修饰度的需要，推荐反应时间为2-20h。
5）反应完成后，立即加入2倍的95-100%（V/V）的乙醇，终止反应，充分混匀之后，10000-12000r/min离心15-20min，沉淀出改性瓜尔豆胶,去除游离态的半乳糖。沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净后进行真空或冷冻干燥，最后研磨制成改性瓜尔豆胶干粉。
本发明采用的半乳糖苷水解酶为α-1,6-半乳糖苷酶，这种酶在自然界中分布广泛，其中一些能高效水解多糖的酶基因及氨基酸序列已经被测定，作用机理也较为明确，已转入基因工程菌中表达，获得容易，对半乳糖苷的降解效率高。
酶提取液的制备：构建含有高效水解半乳甘露聚糖的α-1,6-半乳糖苷酶基因的表达质粒，转入大肠杆菌Origami（DE）菌株中，经异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白，之后依次进行菌体破碎、亲和纯化、脱盐、浓缩后获得高纯度酶提取液。表达的目的蛋白通过SDS-PAGE电泳检测验证，采用Lowry法以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质浓度。酶提取液中加入终浓度分别为2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2，4℃保存备用。
酶活性测定：将0.1mL的10mmol/L pNP-半乳糖与0.8mL pH值5.0的磷酸盐缓冲液混合，于45℃预热5min后，加入0.1mL的酶液混匀，45℃条件下准确反应10min，立即加入1mL的0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应。在405nm波长处测其OD值，以对硝基酚的生成量表示酶活力。一个酶活力单位(U)定义为每分钟分解pNP-半乳糖释放1μmol对硝基酚所需的酶量。
反应获得的改性瓜尔豆胶样品中D-半乳糖含量可用棉籽糖/D-半乳糖检测试剂盒（Megazyme）测定，并用薄层层析法定性；总糖含量可以用甘露糖标准品为对照，采用蒽酮-硫酸法测定。根据半乳糖及总糖测定值，计算改性瓜尔豆胶分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值。
改性瓜尔豆胶的质构性能测定：使用Brookfield公司的CT34500质构仪测定改性瓜尔豆胶、改性瓜尔豆胶与黄原胶共混溶液的凝胶参数。将制取的多糖溶液样品趁热取3mL置于测量杯（容积10mL；直径25mm）中，冷却至室温，形成凝胶，测定质构学参数，平行测定6组。
实施例1：
称取瓜尔豆胶0.1g加入10mL水中，用加热磁力搅拌器边加热边搅拌进行溶解，最高温度控制在90℃以内，待完全溶解后冷却至室温，然后12000r/min离心1h，除去不溶杂质备用。酶促反应体系构成①10mL瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②10mL的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L），其中含有α-半乳糖苷酶（40U）以及2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2。将该混合液在30℃下保温，2h后。用双倍体积的乙醇沉淀析出游离态的半乳糖。之后，沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净，冷冻干燥。得改性的瓜尔豆胶，其分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值为2.7；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V，）的硬度为0.91g；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V）与黄原胶水溶液（0.12%，W/V）以1：1比例共混后溶液的硬度为1.58g。
实施例2：
称取瓜尔豆胶0.1g加入10mL水中，用加热磁力搅拌器边加热边搅拌进行溶解，最高温度控制在90℃以内，待完全溶解后冷却至室温，然后12000r/min离心1h，除去不溶杂质备用。酶促反应体系构成①10mL瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②10mL的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L），其中含有α-半乳糖苷酶（40U）以及2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2。将该混合液在30℃下保温，4h后。用双倍体积的乙醇沉淀析出游离态的半乳糖。之后，沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净，冷冻干燥。得改性的瓜尔豆胶，其分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值为3.2；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V，）的硬度为1.08g；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V）与黄原胶水溶液（0.12%，W/V）以1：1比例共混后溶液的硬度为1.66g。
实施例3：
称取瓜尔豆胶0.1g加入10mL水中，用加热磁力搅拌器边加热边搅拌进行溶解，最高温度控制在90℃以内，待完全溶解后冷却至室温，然后12000r/min离心1h，除去不溶杂质备用。酶促反应体系构成①10mL瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②10mL的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L），其中含有α-半乳糖苷酶（40U）以及2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2。将该混合液在30℃下保温，8h后。用双倍体积的乙醇沉淀析出游离态的半乳糖。之后，沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净，冷冻干燥。得改性的瓜尔豆胶，其分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值为5.2；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V，）的硬度为1.17g；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V）与黄原胶水溶液（0.12%，W/V）以1：1比例共混后溶液的硬度为1.92g。
实施例4：
称取瓜尔豆胶0.1g加入10mL水中，用加热磁力搅拌器边加热边搅拌进行溶解，最高温度控制在90℃以内，待完全溶解后冷却至室温，然后12000r/min离心1h，除去不溶杂质备用。酶促反应体系构成①10mL瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②10mL的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L），其中含有α-半乳糖苷酶（40U）以及2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2。将该混合液在30℃下保温，12h后。用双倍体积的乙醇沉淀析出游离态的半乳糖。之后，沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净，冷冻干燥。得改性的瓜尔豆胶，其分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值为8.9；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V，）的硬度为1.58g；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V）与黄原胶水溶液（0.12%，W/V）以1：1比例共混后溶液的硬度为2.17g。
实施例5：
称取瓜尔豆胶0.1g加入10mL水中，用加热磁力搅拌器边加热边搅拌进行溶解，最高温度控制在90℃以内，待完全溶解后冷却至室温，然后12000r/min离心1h，除去不溶杂质备用。酶促反应体系构成①10mL瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②10mL的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L），其中含有α-半乳糖苷酶（40U）以及2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2。将该混合液在30℃下保温，16h后。用双倍体积的乙醇沉淀析出游离态的半乳糖。之后，沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净，冷冻干燥。得改性的瓜尔豆胶，其分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值为11.1；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V，）的硬度为1.67g；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V）与黄原胶水溶液（0.12%，W/V）以1：1比例共混后溶液的硬度为2.50g。
实施例6：
称取瓜尔豆胶0.1g加入10mL水中，用加热磁力搅拌器边加热边搅拌进行溶解，最高温度控制在90℃以内，待完全溶解后冷却至室温，然后12000r/min离心1h，除去不溶杂质备用。酶促反应体系构成①10mL瓜尔豆胶水溶液（1%，W/V）；②10mL的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L），其中含有α-半乳糖苷酶（40U）以及2mg/mL的BSA和2mmol/L的CaCl2。将该混合液在30℃下保温，8h后。用双倍体积的乙醇沉淀析出游离态的半乳糖。之后，沉淀物用70%（V/V）的乙醇洗净，冷冻干燥。得改性的瓜尔豆胶，其分子结构中甘露糖/半乳糖（M/G）值为13.1；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V，）的硬度为1.08g；改性瓜尔豆胶水溶液（0.24%，W/V）与黄原胶水溶液（0.12%，W/V）以1：1比例共混后溶液的硬度为2.67g。
尽管参照实施例对所公开的涉及一种利用半乳糖苷水解酶制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法进行了特别描述，以上描述的实施例是说明性的而非限制性的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所以的变化和修改都在本发明的范围内。
Claims (7)
1.制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
1)配制反应底物瓜尔豆胶水溶液；
2)配制酶促反应缓冲液，酶促反应缓冲液中，磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L，其中含有牛血清蛋白2mg/mL，氯化钙2mmol/L；
3)将所述步骤1)所得的瓜尔豆胶水溶液加入反应容器中，添加酶促反应缓冲液及半乳糖苷水解酶，形成酶促反应体系，所述酶促反应体系为:①天然瓜尔豆胶水溶液按1％(W/V)的浓度配制；②与①等体积的pH值为5.0的100mmol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含有2mg/mL的牛血清蛋白溶液和2mmol/L的氯化钙溶液；③半乳糖苷水解酶按反应体系终浓度1.5-2U/mL的比例添加；
4)将所述步骤3)中的酶促反应体系在恒温水浴或恒温箱中保温，通过反应时间来控制酶对底物的修饰度；
5)将所述步骤4)中的反应完成后，加入乙醇，终止反应，充分混匀；
6)将所述步骤5)中的所得物质离心后，沉淀出改性瓜尔豆胶,去除游离态的半乳糖；沉淀物改性瓜尔豆胶用乙醇洗净后进行真空或冷冻干燥，最后研磨制成改性瓜尔豆胶干粉。
2.根据权利要求1所述的制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于：所述步骤1)中的瓜尔豆胶水溶液是按1％(W/V)的浓度配制，边加热边搅拌至80-90℃保温，使瓜尔豆胶完全溶解，之后冷却至室温，然后在10000-12000r/min的条件下离心40-60min，除去不溶杂质，即得瓜尔豆胶水溶液。
3.根据权利要求1所述的制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于：所述步骤4)中的酶促反应体系在30-35℃的恒温水浴或恒温箱中保温，反应时间为2-20h。
4.根据权利要求1所述的制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于：所述步骤5)中加入2倍的95-100％(V/V)乙醇。
5.根据权利要求1所述的制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于：所述步骤5)中的所得物质以10000-12000r/min离心15-20min；沉淀物改性瓜尔豆胶用70％(V/V)的乙醇洗净后进行真空或冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于：所述步骤3)中的半乳糖苷水解酶是能够高效水解半乳甘露聚糖的α-1,6-半乳糖苷水解酶。
7.根据权利要求1所述的制备低半乳糖含量瓜尔豆胶的方法，其特征在于：所述步骤3)中酶促反应缓冲液的pH值为4.5-5.0。
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| CN103224967A (zh) | 2013-07-31 |
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