CN103214431B - 2,3-二氢苯并氮杂*类化合物或其盐及其药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学领域，涉及一类能抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的式I所示结构的2，3-二氢苯并氮杂类化合物，该类化合物是GSK-3β的小分子抑制剂，以非ATP竞争作用模式抑制GSK-3β活性，且对测试的多种蛋白激酶均无明显抑制作用，具有高的激酶选择性，可用于制备预防或治疗与GSK-3β异常所致疾病的药物。本发明进一步包括这类化合物其药学上可接受的盐、或其药物组合物在预防或治疗与GSK-3β相关疾病中的应用。所述与GSK-3β相关的疾病是糖尿病、阿尔茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌或混合性白血病，但并不受限于此。
Description
技术领域：
本发明属于药物化学领域，涉及一类能抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的2，3-二氢苯并氮杂类化合物，该类化合物是GSK-3β的小分子抑制剂，以非ATP竞争作用模式抑制GSK-3β活性，且对测试的多种蛋白激酶均无明显抑制作用，具有高的激酶选择性，可用于制备预防或治疗与GSK-3β异常所致疾病的药物。
背景技术：
糖原合成酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3，GSK-3)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，哺乳动物中含α和β两种亚型，其结构和功能都极为相似。研究表明，GSK-3抑制剂可应用于治疗糖尿病、早老年性痴呆症、癌症等复杂性疾病。在胰岛素信号转导途径中，GSK-3β通过调节糖原合成酶的活性影响糖原的合成，从而在糖代谢过程中发挥关键的调控作用。通过抑制GSK-3β的磷酸化活性，其抑制剂能有效调控机体的糖代谢，可应用于治疗II型糖尿病。GSK-3β也参与神经元的凋亡。在脑中，GSK-3β的高表达与阿尔茨海默氏病(alzheimer’s disease)、双向情感障碍(bipolar disorder)以及亨廷顿病(huntington disease)等神经系统疾病密切相关[Bhat RV，et al.，J.Neurochem，89(6)：1313-7，2004；Jope RS，et al.，Curr Drug Targets，7(11)：1421-34，2006]，抑制GSK3β的活性可以调控Tao蛋白代谢等过程，对神经元具有保护作用，其抑制剂可用于治疗阿耳茨海默氏病、双向情感障碍、亨廷顿病等多种神经退行性疾病和精神性疾病(Eldar-Finkelman，Hagit，Trends in Molecular Medicine，8(3)：126-132，2002)。在Wnt信号转导途径中，GSK-3β通过磷酸化多种底物蛋白来调节细胞的生理过程，其抑制剂对多种肿瘤，尤其是胃肠道肿瘤显示出了良好的抑制作用。
GSK-3β是胰岛素信号通道重要的负调节因子，其功能受损或过度表达均直接导致II型糖尿病(Frame，Sheelagh，Expert Opinion on Therapeutic Targets，10(3)：429-444，2006)。异常高活性的GSK-3β通过抑制糖原合成酶的活性从而阻止糖原合成是导致血糖升高的主要原因(Nikoulina SE，et al，Diabetes，49(2)：263-271，2000)；GSK-3β还直接抑制胰岛素受体，影响糖代谢平衡(Eidar FH，Pro Nat Acad Sci USA，94(18)：9660-9664，1997)。胰岛素受体和糖原合成酶分别处于胰岛素糖代谢信号通路的最上游和最下游，其活性被抑制限制了胰岛素介导的大部分生理反应。GSK-3β也是胰岛素信号通路最下游的调节因子，对它进行选择性调控可能引起较少的副作用。事实上，氯化锂作为最明确的GSK-3β抑制剂已在临床使用50多年，未见明显毒副作用。多种GSK-3β小分子抑制剂对糖尿病哺乳动物也未呈现出明显副作用(Ring DB，et al，Diabetes，52(3)：588-595，2003)。在对Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠连续注射GSK-3抑制剂CT99021[130mg/(kg·d)]达20小时，均未发现其肝、肺、脂肪等组织细胞中β连环蛋白及cyclinD1的mRNA水平升高，表明其无明显的致癌风险。
GSK-3β抑制剂具有十分明显的降糖作用，并可促进葡萄糖诱导的胰岛素释放、刺激葡萄糖摄取、提高细胞对胰岛素的敏感度等多种效应，尤其不引起体重增加和脂肪组织的堆积，也不引起血液中甘油三酯和胆固醇的增高[Frame，S.et al.，Expert Opinion onTherapeutic Targets，10(3)：429-444，2006；Cohen，P.et al.，Nature Reviews DrugDiscovery，3(6)：479-487，2004；Wagman，A.S.，et al.，Current PharmaceuticalDesign，10(10)：1105-1137，2004；Alonso，M.et al.，Current Medicinal Chemistry，11(6)：755-763，2004]，显示出治疗糖尿病和胰岛素抵抗的巨大潜力。
GSK-3β在阿耳茨海默氏病的发生发展进程中起关键的调控作用，其抑制剂也可应用于治疗阿耳茨海默氏病。阿耳茨海默氏病的主要病理学特征即是细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)和细胞内神经纤维缠结的形成和进展(Goate，A.et al.Nature，349，704-706，1991)，而GSK-3β能通过磷酸化APP促使Aβ的产生(Hanger，D.P.，et al.Neurosci.Lett.147，58-62，1992)。中枢神经系统中GSK3β含量较多，通过抑制GSK-3β的活性可减少Aβ的生成和神经纤维混乱(LeClerc，C.et al.，J.Biol.Chem.276，251-260，2001)。氯化锂作为一种明确的GSK-3β抑制剂，在治疗浓度通过干扰APP剪切可以阻止Aβ的生成(Sun，X.et al.Neurosci.Lett.321，61-64，2002)。GSK-3β抑制剂TDZD类小分子化合物NP-12对阿耳茨海默氏病表现出很好的治疗效果，已于2010年在欧洲进入II期临床实验。
Wnt信号通路在胚胎发育和分化中具有重要作用，是多种消化系统肿瘤发生发展过程中的关键信号转导途径，而GSK-3β是Wnt信号通路中的负调控因子，并在其中起着关键性的调节作用。众多研究结果证明GSK-3β能明显抑制恶性胶质瘤的生长(Aguilar-Morante，D.et al.PLoS One 5(11)，e13879，2010)，的确可以成为肿瘤调控的靶分子。在胃癌、结肠癌、胰腺癌和肝癌细胞系中，GSK-3β的含量和活性均明显偏高，其抑制剂通过对GSK-3β活性的抑制可显著降低这些癌细胞系的存活和增殖，提高癌细胞凋亡率[Shakoori A，et al.，Biochem Biophys Res Commun，334：1365-1373，2005；Mai W，et al.，Oncology，71：297-305，2006]。氯化锂是GSK-3β的活性抑制剂，它能成功地抑制人乳腺癌和结肠癌细胞的增殖，口服锂剂也能抑制移植于裸鼠身上的结肠癌细胞HCT-116的生长[Gustin JP，et al.，Proc Natl Acad Sci USA，106：2835-2840，2009]。不仅对消化系统肿瘤有治疗效果，GSK-3β抑制剂还能阻止白血病细胞的生长，因此抑制GSK-3β活性也可能有助于治疗混合性白血病[Wang Z，et al.，Nature，455：1205-1209，2008]。
目前研究开发的GSK-3β抑制剂几乎都是ATP竞争性抑制剂，即它们都作用于GSK-3β的ATP结合区。由于ATP结合区在其它蛋白激酶中均高度保守，因而此类抑制剂可能导致较多的副作用，提高其对激酶作用的选择性是研究开发的关键所在。而非ATP竞争性抑制剂作用于GSK-3β的非ATP结合区，具有更好的选择性和更小的副作用。
2002年报道了首个GSK-3β的非ATP竞争抑制剂噻二唑酮类化合物(TDZD)，对GSK-3β的IC50值为2-10μM，，而对PKA，PKC，CK-2，CDK1/cyclin B等多种激酶均无抑制(Martinez，A.et al.J.Med.Chem.45(6)：1292-1299，2002)；后续研究也表明，此类化合物只要其作用模式是非ATP竞争的，都显示出了很好的选择性(Castro，A.et al.bioorgan.med.chem.，16(1)：495-510，2008)。卤甲基芳基酮类(HMK)是另一种非ATP竞争的GSK-3β小分子抑制剂，也显示出类似的高选择性(Conde，S.et al.J.Med.Chem.，46(22)：4631-4633，2003)。2003年报道了一种短肽类GSK-3β非ATP竞争抑制剂L803-mts，对GSK-3β的IC50值为40μM，但对测试的6种其它激酶MAPK，PKA，PKB，PKC-δ和CK-2，甚至与GSK-3最密切的Cdc2均无抑制作用，表现出了极高的选择性。该肽类抑制剂在μM浓度能提高人的胚胎肾293细胞的糖原合成酶活性2.5倍(Plotkin，B.et al.JPET，305(3)：974-980，2003)，且对ob/ob大鼠每天腹腔注射400nmol，连续注射三周，也未引起血脂、体重等发生变化，组织病理学研究和血液化学成分分析也表明并未引起明显毒副作用(Kaidanovich-Beilin，O.et al.，JPET，316(1)：17-24，2006)。
中国专利(申请号：200910174456.9)中“2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂类化合物或其盐在制备GSK-3β抑制剂中的用途”，以GSK-3β的非ATP结合区为靶标，利用计算机虚拟筛选、设计和化学合成、并通过生物活性评价，发现了一类新化学骨架结构的GSK-3β非ATP竞争抑制剂。
发明内容：
本发明的目的是提供新的GSK-3β抑制剂，具体涉及新的2，3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐。这些新的化合物经体外酶抑制活性测试表明对GSK-3β的抑制活性显著强，激酶选择性评价证实具有高的激酶选择性。
本发明对现有技术(申请号：200910174456.9)的此类化合物的结构进行优化和改造，获得活性和选择性都更好的新的化合物，经体外酶抑制活性测试表明对GSK-3β的抑制活性显著强，经酶动力学测试表明对GSK-3β的抑制作用模式仍然为非ATP竞争，进一步的激酶选择性评价证实这些化合物对多种蛋白激酶Flt-1，KDR，PDGFR-β，EGFR，ErbB2，ErbB4，EPH-A2，RON均无明显抑制，表现出了高的激酶选择性。
本发明的对GSK-3β具有抑制活性的2，3-二氢苯并氮杂类化合物及其药学上可接受的盐，其结构通式如下式I所示：
其中，X任选地为O、S或N原子，优选为S原子；R1选自呋喃基、噻吩基、苄基、苯基、卤代苯基、氰基苯基、甲基苯基、硝基苯基、甲氧基苯基；R2选自卤代苯乙酰基、取代苄基，其中取代苄基的取代基独立地选自卤素、硝基、甲基、乙基、氰基、甲氧基、甲氧羰基、乙氧羰基；
本发明提供了式I结构的2，3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐，当X为硫，R2为硝基取代的苄基时，R1为噻吩基、苄基、苯基、取代苯基，其中，所述取代苯基的取代基选自卤素、硝基、甲基、甲氧基、氰基。
本发明提供了式I结构的2，3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐，当X为硫，R2取为时，R1为呋喃基、噻吩基、苄基、苯基、取代苯基，其中，所述取代苯基的取代基选自卤素、硝基、甲基、甲氧基、氰基；R1优选为苯基、呋喃基。
本发明提供了式I结构的2，3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐，当X优选为硫，R1取为苯基时，R2为卤代苯乙酰基、取代苄基，其中，所述取代苄基的取代基选自卤素、硝基、甲基、乙基、氰基、甲氧基、甲氧羰基、乙氧羰基，R2优选为4-氯代苯乙酰基、2-硝基苄基、3-甲氧羰基苄基。
本发明提供了式I结构的2，3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐，优化方案为X取为硫，R1取为苯基、呋喃基、噻吩基，R2取为2-硝基苄基、3-甲氧羰基苄基、3-氯代苯乙酰基。
本发明提供了式I结构的2，3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐，最优化方案为X取为硫，R2取为R1取为苯基、呋喃基、噻吩基。
本发明中，所述的盐为药学上可接受的盐。
本发明所述的“药学上可接受的盐”具体地可列举为与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的盐，或与甲酸、乙酸，甲磺酸、乙磺酸等有机酸形成的盐。
本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物能在微摩尔浓度抑制GSK-3β活性，可用于制备预防或治疗糖尿病、阿尔茨海默氏病、某些胃肠道肿瘤等与GSK-3β相关疾病的药物。以上所述与GSK-3β相关的疾病可以是糖尿病、阿尔茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、混合性白血病，但并不受限于此。
本发明的另一个目的是提供包含上述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明的有益效果在于：
1.本发明发现并证明了一类新的对GSK-3β具有抑制活性的2，3-二氢苯并氮杂类化合物。
2.本发明所述的新的2，3-二氢苯并氮杂类化合物在体外抑制活性实验中，结果证明对GSK-3β具有微摩尔浓度级的抑制作用。
3.本发明所述的新的2，3-二氢苯并氮杂类化合物经酶动力学实验证实其对GSK-3β的抑制作用是非ATP竞争性抑制。
4.本发明所述的新的2，3-二氢苯并氮杂类化合物在体外酶抑制活性实验中，在100μM下对Flt-1，KDR，PDGFR-β，EGFR，ErbB2，ErbB4，EPH-A2，RON激酶均无明显抑制作用。
5.本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物可用于制备预防或治疗与GSK-3β相关疾病的药物。
6.本发明所述化合物可用于制备预防或治疗糖尿病、阿尔茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、混合性白血病的药物，但不受限于此。
附图说明：
图1是已知的GSK-3β的ATP竞争型抑制剂SB 216763对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见SB 216763的曲线与对照曲线相交于Y轴，表明其是ATP竞争型抑制剂。
图2是本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物中的一个实施例LQaa对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见25μM和50μM浓度的LQaa的曲线与对照曲线相交于X轴，表明LQaa为非ATP竞争型抑制剂。
图3是本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物中的一个实施例LQja对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见25μM和50μM浓度的LQja的曲线与对照曲线相交于X轴，表明LQja为非ATP竞争型抑制剂。
具体实施方式：
下面给出实施例进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的原料为商业上可购得的或者可以很容易地由本领域技术人员根据已知文献方法制备的。
本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物的制备如以下实施例所描述。
实施例1
制备5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4-酮(LQaa)
(a).2，3-二氢-2-(2-苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPa01)
肉桂酸(28.4g，0.106mol)、邻氨基苯硫酚(13.3g，0.106mol)、适量分子筛于190℃反应6.5小时。过滤除去分子筛，滤液冷却析出白色固体，乙腈重结晶得白色晶体，产率25％。m.p.：177.6-179.9℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.30(bd，1H，NH)，7.42-7.17(m，9H，PhH)，4.91-4.87(m，1H，CH-CH2)；2.94-2.79(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：256.1(M+H)+。
(b)制备5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQaa)
向4ml重蒸干燥DMF中加入化合物ZPa01 0.255g(1mmol)和60％的NaH 0.0900g(3mmol)，室温搅拌0.5小时后，将邻硝基溴苄0.432g(2mmol)溶到3ml重蒸干燥的DMF中，冰盐浴冷却下滴加到反应液中，室温密闭搅拌1小时。反应液加水淬灭后用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤萃取液，经无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂得粗品。粗品用PE/EA(10∶3)硅胶柱层析洗脱，得白色固体0.293g，收率75％。m.p.186.7-189.5。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.03-7.17(m，13H，PhH)，5.62-5.47(m，2H，Ph-CH 2)，4.91-4.87(m，1H，Ph-CH)，3.01-2.85(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：390.9(M+H)+.
实施例2
制备5-(3-硝基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQac)
制备方法同上述LQaa，其中用3-硝基溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.359g，收率92％。m.p.196.5-198.0.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.17-8.07(d，2H，PhH)，7.74-7.13(m，11H，PhH)，5.58-5.54(d，1H，Ph-CH 2)，4.90-4.88(m，1H，Ph-CH 2)，4.87-4.84(m，1H，Ph-CH)，2.96-2.83(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：390.9(M+H)+.
实施例3：制备5-(2-溴苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQad)
制备方法同上述LQaa，其中用2-溴溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.387g，收率91％。m.p.167.6-170.4.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.62-7.07(m，13H，PhH)，5.25-5.23(m，2H，Ph-CH 2)，4.92-4.87(m，1H，Ph-CH)，2.98-2.87(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：424.0(M+H)+，426.4(M+H)+.
实施例4：制备5-(3-溴苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQae)
制备方法同上述LQaa，其中用3-溴溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.383g，收率90％.m.p.167.6-170.4.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.66-7.11(m，13H，PhH)，5.27-5.23(m，1H，Ph-CH 2)，4.94-4.90(m，1H，Ph-CH 2)，4.88-4.84(m，1H，Ph-CH)，2.94-2.82(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：424.0(M+H)+，426.1(M+H)+.
实施例5：制备5-(4-溴苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQaf)
制备方法同上述LQaa，其中用4-溴溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.342g，收率88％。m.p.153.2-157.6.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.59-7.13(m，13H，PhH)，5.31-5.27(m，1H，Ph-CH 2)，4.86-4.85(m，1H，Ph-CH 2)，4.83-4.82(m，1H，Ph-CH)，2.92-2.81(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：424.0(M+H)+，426.2(M+H)+.
实施例6：制备5-(2-氰基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQag)
制备方法同上述LQaa，其中用2-氰基溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.240g，收率65％.m.p.184.9-187.4.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.82-7.14(m，13H，PhH)，5.71-5.67(m，1H，Ph-CH 2)，5.14-5.10(m，1H，Ph-CH 2)，4.89-4.85(m，1H，Ph-CH)，2.97-2.86(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：371.2(M+H)+.
实施例7：制备5-(4-氰基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQah)
制备方法同上述LQaa，其中用4-氰基溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.360g，收率97％.m.p.170.8-173.3.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.82-7.14(m，13H，PhH)，5.71-5.67(m，1H，Ph-CH 2)，5.14-5.10(m，1H，Ph-CH 2)，4.89-4.85(m，1H，Ph-CH)，2.97-2.86(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：371.2(M+H)+.
实施例8：制备5-(3-氰基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQai)
制备方法同化合物LQaa，其中用3-氰基溴苄替换2-硝基溴苄。白色固体0.370g，收率100％，m.p.143.1-145.9。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.63-7.13(m，13H，PhH)，5.46-5.42(m，1H，Ph-CH 2)，4.87-4.85(m，1H，Ph-CH 2)，4.84-4.81(m，1H，Ph-CH)，2.93-2.84(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：371.2(M+H)+.
实施例9：制备5-(2-氯苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQaj)
制备方法同LQaa，其中用2-氯溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.379g，收率100％，m.p.167.3-172.5.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.62-7.14(m，13H，PhH)，5.26(m，2H，Ph-CH 2)，4.91-4.87(m，1H，Ph-CH)，3.01-2.86(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：380.0(M+H)+.
实施例10：制备5-(3-氯苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQak)
制备方法同LQaa，其中用3-氯溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.274g，收率72％，m.p.156.9-157.4.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.60-7.14(m，13H，PhH)，5.27-5.23(m，1H，Ph-CH 2)，4.96-4.92(m，1H，Ph-CH 2)，4.88-4.84(m，1H，Ph-CH)，2.95-2.83(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：380.0(M+H)+.
实施例11：制备5-(4-氯苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQal)
制备方法同化合物LQaa，其中用4-氯溴苄替代邻氯溴苄，白色粉末0.300g，收率79％，m.p.133.9-134.7.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.59-7.13(m，13H，PhH)，5.33-5.29(m，1H，Ph-CH 2)，4.88-4.86(m，1H，Ph-CH 2)，4.85-4.82(m，1H，Ph-CH)，2.93-2.81(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：380.0(M+H)+.
实施例12：制备5-(2-甲基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQas)
制备方法同LQaa，其中用2-甲基溴苄替代2-硝基溴苄，白色粉末0.305g，收率85％，m.p.133.2-134.6.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.61-7.13(m，13H，PhH)，5.20-5.16(m，1H，Ph-CH 2)，5.04-5.00(m，1H，Ph-CH 2)，4.90-4.85(m，1H，Ph-CH)，3.00-2.86(m，2H，CH-CH 2)，2.33(s，3H，CH3).MS(+ESI)m/z：360.1(M+H)+.
实施例13：制备5-(3-甲基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQat)
制备方法同LQaa，其中用3-甲基溴苄替代2-硝基溴苄，白色粉末0.242g，收率67％，m.p.170.1-170.8.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.59-7.02(m，13H，PhH)，5.15-5.12(m，1H，Ph-CH 2)，5.05-5.01(m，1H，Ph-CH 2)，4.89-4.85(m，1H，Ph-CH)，2.95-2.83(m，2H，CH-CH 2)，2.30(s，3H，CH3).MS(+ESI)m/z：360.1(M+H)+.
实施例14：制备5-(4-甲基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQau)
制备方法同LQaa，其中用4-甲基溴苄替代2-硝基溴苄，白色粉末0.260g，收率72％，m.p.154.6-155.0.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.58-7.06(m，13H，PhH)，5.20-5.17(m，1H，Ph-CH 2)，4.99-4.95(m，1H，Ph-CH 2)，4.88-4.83(m，1H，Ph-CH)，2.93-2.81(m，2H，CH-CH 2)，2.29(s，3H，CH3).MS(+ESI)m/z：360.1(M+H)+.
实施例15：制备5-(4-甲氧基苄基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQam)
制备方法同LQaa，其中用4-甲氧基溴苄替代2-硝基溴苄，白色固体0.224g，收率60％，m.p.110.8-113.1℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.57-6.77(m，13H，PhH)，5.25-5.21(m，1H，Ph-CH 2)，4.90-4.86(m，1H，Ph-CH 2)，4.85-4.82(m，1H，Ph-CH)，3.75(s，3H，OCH3)，2.91-2.80(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：376.1(M+H)+.
实施例16：制备5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQan)
制备方法同LQaa，其中用丙烯酰氯替代2-硝基溴苄，类白色固体0.269g，收率87％，m.p.137.8-140.2℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.64-7.07(m，9H，PhH)，7.05-7.03(m，1H，CH＝CH2)，6.48(dt，1H，CH＝CH 2)，5.88(dd，1H，CH＝CH 2)，4.69(t，1H，Ph-CH)，3.03-2.71(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：310.1(M+H)+.
实施例17：制备5-丙烯酰基-2-(2-呋喃基)-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQao)
(a).2-(2-呋喃基)-2，3-二氢-2-苯基苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(CYb01)的制备
制备方法同ZPa01，其中用3-(2-呋喃基)丙烯酸替代肉桂酸，类白色粉末，收率60％，m.p.162.7-163.6℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.19(bs，1H，NH)，7.59-7.15(m，5H，phenyl and furyl)，6.30(d，1H，furyl)，6.16(d，1H，furyl)，4.93(dd，1H，CH-CH2)，2.93-2.82(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)：246.1(M+H)+.
(b)制备5-丙烯酰基-2-(2-呋喃基)-2，3-二氢-2-苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQao)
制备方法同LQan，其中用CYb02替代ZPa01，类白色固体0.278g，收率93％，m.p.115.6-117.3℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.64-7.07(m，9H，PhH)，7.05-7.03(m，1H，CH＝CH2)，6.48(dt，1H)，5.88(dd，1H)，4.69(t，1H)，3.03-2.71(m，2H).MS(+ESI)m/z：300.1(M+H)+.
实施例18：制备5-丙烯酰基-2-(2-噻吩基)-2，3-二氢-2-苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQbi)
(a).2-(2-噻吩基)-2，3-二氢-2-苯基苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(ZPb02)的制备
制备方法同ZPa01，其中用ZPb01替代ZPa01，类白色针晶，收率66％，m.p.：172.6-173.4℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.67-7.14(m，5H，phenyl and thieyl)，6.96-6.91(m，2H，thienyl)，5.16(dd，1H，CH-CH2)，2.97-2.81(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)：262.0(M+H)+。
(b).制备5-丙烯酰基-2-(2-噻吩基)-2，3-二氢-2-苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQbi)
制备方法同LQan，其中用ZPb01替代ZPa01，类白色固体0.284g，收率90％，m.p.：113.0-115.9℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.10-6.85(m，7H)，6.81-6.68(m，1H，CH＝CH2)，6..49(dd，1H，CH＝CH 2)，5.87(dd，1H，CH＝CH 2)，4.98(dd，1H，CH-CH2)，2.90(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：316.1(M+H)+.
实施例19.
制备5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氟苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQca)
(a).2，3-二氢-2-(4-氟苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPc01)
制备方法同ZPa01，其中用4-氟肉桂酸替代肉桂酸，收率24％，m.p.：204.9-205.8℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.31(bd，1H，NH)，7.46-7.21(m，9H，PhH)，4.89-4.76(m，1H，CH-CH2)；2.99-2.78(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：274.1(M+H)+。
(b)制备5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氟苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQca)
制备方法同LQaa，其中用ZPc01替代ZPa01，类白色固体0.296g，收率96％，m.p166.5-168.8.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.37-7.02(m，12H，PhH)，5.53(q，Ph-CH 2)；4.88(dd，1H，Ph-CH)，3.29-2.52(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：309.1(M+H)+.
实施例20.
制备5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氟苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQda)
(a).2，3-二氢-2-(4-氯苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPd01)
制备方法同ZPa01，其中用4-氯肉桂酸替代肉桂酸，收率20％，m.p.：175.4-177.3℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.30(bd，1H，NH)，7.45-7.17(m，9H，PhH)，4.90-4.78(m，1H，CH-CH2)；2.94-2.75(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：291.0(M+H)+。
(b).制备5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氯苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQda)
制备方法同LQaa，其中用ZPd01替代ZPa01，类白色固体0.424g，收率100％，m.p.：206.8-207.3，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.32-7.11(m，12H，PhH)，5.53(q，2H，Ph-CH 2)；4.85(dd，1H，Ph-CH)，3.13-2.60(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：425.0(M+H)+.
实施例21.5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-溴苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQea)的制备
(a).2，3-二氢-2-(4-溴苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPe01)
制备方法同ZPa01，其中用4-溴肉桂酸替代肉桂酸，收率28％，m.p.：221.2-223.4℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.32(bd，1H，NH)，7.44-7.08(m，9H，PhH)，4.94-4.83(m，1H，CH-CH2)；2.90-2.76(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：334.0(M+H)+，336.0(M+H)+。
(b).5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-溴苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQea)的制备
制备方法同LQaa，其中用ZPf01替代ZPa01，类白色固体0.447g，收率95％，m.p.：178.0-181.5，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.37-7.01(m，12H，PhH)，5.53(q，Ph-CH 2)；4.84(dd，1H，Ph-CH)，3.21-2.55(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：469.0(M+H)+，471.0(M+H)+.
实施例22.5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-甲基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQfa)的制备
(a).2，3-二氢-2-(4-甲基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPf01)
制备方法同ZPa01，其中用4-甲基肉桂酸替代肉桂酸，收率22％，m.p.：171.4-172.7℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.30(bd，1H，NH)，7.42-7.18(m，9H，PhH)，4.90-4.87(m，1H，CH-CH2)；2.95-2.77(m，2H，CH-CH 2)；2.36(s，3H，CH3).MS(+ESI)m/z：270.1(M+H)+。
(b).5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-甲基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQfa)的制备
制备方法同LQaa，其中用ZPg01替代ZPa01，类白色固体0.392g，收率97％，m.p.：166.2-167,1，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.04-7.17(m，12H，PhH)，5.59-5.38(m，2H，Ph-CH 2)；4.93-4.85(m，1H，Ph-CH)，3.00-2.81(m，2H，CH-CH 2)；2.33(s，3H，CH3).MS(+ESI)m/z：405.0(M+H)+.
实施例23.5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-甲氧基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQga)的制备
(a).2，3-二氢-2-(4-甲氧基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPg01)
制备方法同ZPa01，其中用4-甲氧基肉桂酸替代肉桂酸，收率30％，1HNMR和MS确证结构。m.p.：165.3-167.1℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.30(bd，1H，NH)，7.50-7.12(m，9H，PhH)，4.87-4.81(m，1H，CH-CH2)；3.92(s，3H，OCH3)；2.98-2.79(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：286.2(M+H)+。
(b).5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-甲氧基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQga)的制备
制备方法同LQaa，其中用ZPh01替代ZPa01，类白色固体0.374g，收率89％，m.p.：167.8-170.2，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.14-7.09(m，12H，PhH)，5.50-5.38(m，2H，Ph-CH 2)；4.95-4.82(m，1H，Ph-CH)，3.92(s，3H，OCH3)；3.05-2.87(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：421.2(M+H)+.
实施例24.5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氰基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQha)的制备
(a).2，3-二氢-2-(4-氰基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPh01)
制备方法同ZPa01，其中用4-氰基肉桂酸替代肉桂酸，收率32％，1HNMR和MS确证结构。m.p.：193.5-193.9℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.13(bd，1H，NH)，7.95-7.02(m，8H，PhH)，5.18-4.99(m，1H，CH-CH2)；2.98-2.79(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：281.1(M+H)+。
(b).5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氰基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQha)的制备
制备方法同LQaa，其中用ZPi01替代ZPa01，类白色固体0.384g，收率93％，m.p.：172.0-173.4℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.02-7.13(m，12H，PhH)，5.31-5.17(m，2H，Ph-CH 2)；5.09-4.96(m，1H，Ph-CH)，3.02-2.78(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：416.1(M+H)+.
实施例25.5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-硝基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQia)的制备
(a).2，3-二氢-2-(4-氰基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPi01)
制备方法同ZPa0l，其中用4-氰基肉桂酸替代肉桂酸，收率27％，m.p.：188.2-189.7℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.33(bd，lH，NH)，8.42-7.07(m，8H，PhH)，5.3l-5.04(m，1H，CH-CH2)；2.90-2.65(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：301.1(M+H)+。
(b).5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(4-氰基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQia)的制备
制备方法同LQaa，其中用ZPi0l替代ZPa0l，类白色固体0.400g，收率92％，m.p.：174.9-176.2℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.38-7.11(m，12H，PhH)，5.58-5.42(m，2H，Ph-CH 2)；5.29-4.98(m，1H，Ph-CH)，3.01-2.75(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：436.1(M+H)+.
实施例26.5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-苯甲基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQja)的制备
(a).2，3-二氢-2-苯甲基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备(ZPj01)
制备方法同ZPa01，其中用苯甲基丙烯酸替代肉桂酸，收率28％，1HNMR和MS确证结构。m.p.：138.2-141.3℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.66-7.27(m，5H，PhH)，7.25-7.03(m，4H，PhH)，4.10-3.88(m，1H)，3.72(q，1H)，3.16-2.85(m，2H)，2.49(m，1H，Ph-CH).MS(+ESI)m/z：270.2(M+H)+。
(b).5-(2-硝基苄基)-2，3-二氢-2-苯甲基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQja)的制备
制备方法同LQaa，其中用ZPj01替代ZPa01，类白色固体0.396g，收率98％，m.p.：135.0-136.9℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.51-6.58(m，13H)，5.83-4.98(m，2H)，4.26-3.70(m，1H)，2.96-2.49(m，2H).MS(+ESI)m/z：405.2(M+H)+.
实施例27.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-氟苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQcb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPc01替代ZPa01，白色固体0.265g，收率81％，m.p.：141.3-143.2℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.76-7.13(m，8H，PhH)，7.08-7.04(m，1H，CH＝CH2)，6.51(dt，1H，CH＝CH 2)，5.90(dd，1H，CH＝CH 2)，4.71-4.67(m，1H，Ph-CH)，3.04-2.73(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：328.1(M+H)+.
实施例28.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-氯苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQdb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPd01替代ZPa01，白色固体0.286g，收率83％，m.p.：145.7-116.3℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.80-7.08(m，8H，PhH)，7.06-7.00(m，1H，CH＝CH2)，6.56(dt，1H，CH＝CH 2)，5.88(dd，1H，CH＝CH 2)，4.79-4.71(m，1H，Ph-CH)，3.11-2.82(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：345.1(M+H)+.
实施例29.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-溴苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQeb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPe01替代ZPa01，白色固体0.311g，收率80％，m.p.：144.6-145.5℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.83-7.19(m，8H，PhH)，7.12-7.04(m，1H，CH＝CH2)，6.50(dt，1H，CH＝CH 2)，5.95(dd，1H，CH＝CH 2)，4.87-4.74(m，1H，Ph-CH)，3.09-2.77(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：388.0(M+H)+，390.0(M+H)+.
实施例30.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-甲基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQfb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPf01替代ZPa01，白色固体0.265g，收率82％，m.p.：136.4-138.9℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.69-7.15(m，8H，PhH)，7.10-7.02(m，1H，CH＝CH2)，6.61(dt，1H，CH＝CH 2)，5.80(dd，1H，CH＝CH 2)，4.77-4.68(m，1H，Ph-CH)，3.16-2.90(m，2H，CH-CH 2)，2.43(s，3H，CH3).MS(+ESI)m/z：324.1(M+H)+.
实施例31.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-甲氧基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQgb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPg01替代ZPa01，白色固体0.244g，收率72％，m.p.：132.5-134.2℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.66-7.02(m，8H，PhH)，6.99-6.93(m，1H，CH＝CH2)，6.64(dt，1H，CH＝CH 2)，5.78(dd，1H，CH＝CH 2)，4.81-4.74(m，1H，Ph-CH)，3.94(s，3H，OCH3)，3.16-2.87(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：340.2(M+H)+.
实施例32.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-氰基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQhb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPh01替代ZPa01，白色固体0.261g，收率78％，m.p.：139.1-141.0℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.34-7.19(m，8H，PhH)，7.03-6.97(m，1H，CH＝CH2)，6.56(dt，1H，CH＝CH 2)，5.89(dd，1H，CH＝CH 2)，4.78-4.69(m，1H，Ph-CH)，3.02-2.85(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：335.0(M+H)+.
实施例33.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(4-硝基苯基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQib)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPi01替代ZPa01，白色固体0.234g，收率66％，m.p.：140.0-141.9℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.47-7.17(m，8H，PhH)，7.08-7.01(m，1H，CH＝CH2)，6.60(dt，1H，CH＝CH 2)，5.85(dd，1H，CH＝CH 2)，4.81-4.73(m，1H，Ph-CH)，3.08-2.92(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：355.1(M+H)+.
实施例34.5-丙烯酰基-2，3-二氢-2-(苯甲基[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮(LQjb)的制备
制备方法同LQan，其中用ZPj01替代ZPa01，白色固体0.294g，收率91％，m.p.：130.2.0-133.6℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.69-7.03(m，9H)，4.13-3.86(m，1H)，3.77(q，1H)，3.21-2.88(m，2H)，2.46(m，1H).MS(+ESI)m/z：324.2(M+H)+。
实施例35.5-(3-甲氧羰基苄基)-2，3-二氢-2-苯基苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQax)
(a)5-(3-羧基苄基)-2，3-二氢-2-苯基苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQaw)
取LQai 0.08g，浓盐酸2ml，一同加入封管中，100℃反应7小时，析出大量固体。反应完毕，室温冷却，抽滤，甲醇洗，得浅黄色粉末0.06g，收率70％，m.p.186.4-188.7℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.89(s，1H，COOH)，7.88(s，1H，PhH)，7.74(d，1H，PhH)，7.62-7.16(m，11H，PhH)，5.44(d，1H，Ph-CH 2)，4.94(d，Ph-CH 2)，4.98(m，1H，CH-CH2)，2.86-2.67(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：390.1(M+H)+.
(b)5-(3-甲氧羰基苄基)-2，3-二氢-2-苯基苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQax)
取LQai 0.04g，加甲醇2ml，冰水浴条件下滴加SOCl2 0.1ml，加毕，回流2小时。反应完毕，减压蒸去溶剂，制备薄层层析，PE/EA/MeOH(15∶5.5∶0.6)展开，得目标化合物，淡黄固体，收率89％，m.p.110.9-112.2℃。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.98(s，1H，PhH)，7.92(d，1H，PhH)，7.60(d，2H，PhH)，7.46-7.16(m，9H，PhH)，5.41(d，1H，Ph-CH 2)，5.00(d，1H，Ph-CH 2)，4.89(dd，1H，CH-CH2)，3.91(s，3H，OCH3)，2.98-2.86(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：404.2(M+H)+.
实施例36.5-(1-(3-氯苯基)乙酮基)-2，3-二氢-2-苯基苯并[b][1，4]硫氮杂-4(5H)-酮(LQay)
制备方法同LQaa，其中用2-溴-1-(3-氯苯基)乙酮替换2-硝基溴苄，收率65％，60.2-63.9℃。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.01(t，1H，PhH)，7.91(d，1H，PhH)，7.65-7.16(m，11H，PhH)，5.76(d，1H，Ph-CH 2)，4.61(d，1H，Ph-CH 2)，4.82(dd，1H，CH-CH2)，3.05-2.83(m，2H，CH-CH 2).MS(+ESI)m/z：408.1(M+H)+.
实施例37
本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物体外对GSK-3β的生物活性评价：
(1)体外酶抑制活性测试
采用化学发光法进行测试，荧光信号的强度与剩余ATP的量成正比，与激酶的活性成反比，与化合物抑制酶活性的强度呈正比。通过检测体系内剩余ATP的量进而推算出GSK-3β磷酸化底物GS-2时消耗的ATP量，从而反映酶的活性水平。计算该浓度下化合物的抑制率，进而测量不同浓度下的抑制率得到化合物的半抑制浓度(IC50值)。实验中采用文献已报道的非ATP竞争型的GSK-3β小分子抑制剂TDZD-8(Sigma-Aldrich，Lot#：098K4602V)作为阳性对照物以校验测试体系的可靠性。
所用的主要试剂：
GSK-3β(Millipore，Lot #：14-306)；GS-2(吉尔生化上海有限公司)；ATP·2Na(Roche)；Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay(Promega Corporation)；TDZD-8(Sigma-Aldrich，Lot#：098K4602V)
实验方法：
在96孔板上，将4μL溶于DMSO的待测化合物用14μL缓冲液稀释，再加入2μL(20ng)的GSK-3β，随后加入含有GS-2(12.5μM)和ATP(4μM)的缓冲液，于30℃下孵育30分钟，孵育完毕后加入40μL Kinase-Glo试剂，于30℃下孵育10分钟，用化学发光仪读取化学发光计数，计算半数抑制浓度(IC50值)。
实验显示，本发明的2，3-二氢苯并氮杂类化合物对GSK-3β具有微摩尔浓度级的抑制作用。表1为部分化合物的结构及活性数据。
表1
(2)动力学测试确定本发明所述化合物对GSK-3β的非ATP竞争作用模式
测试一定浓度化合物在一系列不同ATP浓度时GSK-3β的活性，计算出反应速率。通过反应速率的倒数(1/v)对ATP浓度的倒数(1/[ATP])作图得到Lineweaver-Burk图。根据直线的相交点，确定2，3-二氢苯并氮杂类化合物的作用类型。如果化合物的活性曲线与空白对照组的曲线相交于Y轴，则表明化合物与ATP存在竞争关系，如果相交于X轴，则表明化合物与ATP不存在竞争关系。已知的GSK-3β的ATP竞争型小分子抑制剂SB216763(Sigma S3442)作为参照品进行平行测试以验证测试体系的可靠性。
先将ATP储备液用缓冲液稀释到4000uM，然后用缓冲液稀释，使ATP的终浓度为：8.0μM，4.0μM，2.0μM，1.0μM，0.5μM。配制一定浓度的待测化合物，运用上述体外酶抑制活性测试方法测试其在该系列浓度ATP中酶的活性。计算反应速率并对ATP浓度进行双倒数作图，判断酶抑制剂是ATP竞争型还是非ATP竞争型。
已知阳性参照物SB 216763为ATP竞争型抑制剂，在此体系中所测得的曲线与对照曲线相交于Y轴，证明SB 216763的确是ATP竞争型抑制剂，表明本测试体系是准确可靠的。进一步通过双倒数图证明了本发明所述的2，3-二氢苯并氮杂类化合物对GSK-3β的抑制作用模式是非ATP竞争抑制(如图1，图2所示)。
(3)体外激酶选择性评价
选择上述活性结构的代表性化合物，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试它们对一系列蛋白激酶是否具有抑制作用，评价本发明化合物的激酶选择性。以酪氨酸激酶抑制剂Sull248，BIBW2992(Afatinib)，Dasatinib(达沙替尼)和PD173074作为阳性对照。
实验操作：
(a)酶反应底物Poly(Glu，Tyr)4∶1用无钾离子的PBS(10mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，pH7.2-7.4)稀释成20μg/mL，125μL/孔包被酶标板，置37℃反应12-16小时。弃去孔中液体。洗板，用200μL/孔的T-PBS(含0.1％ Tween-20的无钾离子的PBS)洗板三次，每次5分钟。于37℃烘箱中干燥酶标板1-2小时。
(b)每孔加入用反应缓冲液(50mM HEPES pH 7.4，50mM MgCl2，0.5mM MnCl2，0.2mMNa3VO4，1mM DTT)稀释的ATP溶液49μL，每孔中加入1μL待测试化合物，再加入50μL用反应缓冲液稀释的各激酶域重组蛋白启动反应，每次实验需设无ATP对照孔两孔。置37℃摇床(100rpm)反应1小时。弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。
(c)加入抗体PY99 100μL/孔(抗体用含BSA 5mg/mL的T-PBS 1∶500稀释)，37℃摇床反应0.5小时。弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。
(d)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μL/孔(抗体用含BSA 5mg/ml的T-PBS1∶2000稀释)，37℃摇床反应0.5小时。弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。
(e)加入2mg/ml的OPD显色液100μL/孔(用含有0.03％H2O2的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.4)稀释)，25℃避光反应1-10分钟。
(f)加入2M H2SO4 50μL/孔中止反应，用可调波长式微孔板酶标仪VERSAmax读数，波长为490nm。
以上实验结果按下述公式计算抑制率。
表2显示了100μM时，2，3-二氢苯并氮杂类化合物对蛋白激酶活性的抑制率，结果表明此类化合物对Flt-1，KDR，PDGFR-β，EGFR，ErbB2，ErbB4，EPH-A2，RON蛋白激酶均无明显抑制作用，表现出高的激酶选择性。
表2.化合物100μM时对蛋白激酶活性抑制率(％)
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.式I结构的2,3-二氢苯并氮杂化合物或其药学上可接受的盐，
其中
R为呋喃基、噻吩基、苄基、苯基、卤代苯基、硝基苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、氰基苯基；
X选自氧、硫或氮原子。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗由于GSK-3β异常所引起疾病的药物中的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中所述疾病为糖尿病、阿耳茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌或混合性白血病。
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