CN103201374B - 在过滤器上分离并且培养活细胞或者从它们之中提取遗传物质的装置和方法 - Google Patents

Abstract

该发明涉及一种用于在过滤器上分离活细胞或提取它们的遗传物质的方法，其特征在于所述方法包括：至少临时地将过滤器（108，308）固定到隔室（102，302）的下部开口上的步骤（202，402），该隔室还具有空气入口；将带有所述细胞的液体注入所述隔室的步骤（204，404）；以密封方式将针（180）至少临时地固定到所述隔室开口的步骤（205，405），过滤器设置在针和隔室的内部空间之间；利用所述针刺穿具有相对于环境压力为负压的真空管（185）的盖子（186）的穿透步骤（206，406）；以及利用真空管的负压抽吸液体使其通过所述过滤器的抽吸步骤（210，410），所述过滤器拦截所述细胞。

Description

在过滤器上分离并且培养活细胞或者从它们之中提取遗传物质的装置和方法

技术领域

本发明涉及一种用于在过滤器上分离和/或培养活细胞或者固定细胞的装置，从而进行所有的细胞分析（细胞学、免疫化学、FISH测试，等等）或者从在过滤器上分离的活细胞或者固定细胞中提取遗传物质，如果需要的话放大后提取遗传物质。本发明尤其适用于分离和/或培养在液体尤其是血液中存在的特殊细胞，或者从这些特殊细胞中提取遗传物质。

背景技术

特殊的血液细胞，例如肿瘤细胞或者滋养细胞，以非常小的比例存在并且在进行细胞学分析之前必须对其进行计数。

众所周知，要将基于甲醛的结合缓冲液加入到血液样品中以固定目标细胞，然后得到的液体通过多孔过滤器。该过滤器接着用于在实验室的显微镜下检查其上的目标细胞。然而，使用此过程是不可能得到活细胞的。

既然如此，发明者已经确定出获得活细胞将有可能在良好的条件下识别出特定的标记，以在诊断肿瘤或滋养细胞的遗传异常中应用分子生物学、细胞遗传学和FISH（“荧光原位杂交”的缩写）技术。

本发明的目的是通过以下手段来弥补这些缺点并满足这个要求：实现了在与标准实验室测试兼容的条件下收集活细胞，活细胞随后可以在适宜的生长因素中在适当的介质中培养。

本发明还涉及从在过滤器上分离的细胞中提取遗传物质，如果有必要的话放大后再提取，并且还涉及靶向治疗的敏感性和耐药性或者遗传异常的变异和基因表达水平的检测。

本发明尤其适用于对液体尤其是血液中存在的特殊细胞的DNA或RNA的收集和潜在的均匀放大。

例如从文献PCT/FR2006/000562中获知，基于甲醛的结合缓冲液被添加到血液样品中用以固定被寻求的目标细胞，并且得到的液体随后通过多孔过滤器。接着在实验室的显微镜下分析该过滤器以检测位于其上的细胞。接着可以在过滤器上抽样细胞进行分析，例如采用遗传分析。

然而，由于涉及工作时间、材料和精度，这个过程不能以合理的成本被大规模复制。既然如此，大规模的复制和降低的成本使分子生物学分析能够应用在肿瘤细胞和滋养细胞中。此外，使用甲醛固定细胞并不能获得质量良好的遗传材料：DNA被部分地降解并且与周围蛋白质之间形成桥梁，并且RNA的提取实际上也是不可能的。

发明内容

本发明的目的是通过以下手段弥补这些缺点并满足这个要求：实现了在与标准实验室试验相兼容的条件下所考虑的细胞中收集大部分条件良好的细胞物质，尤其是RNA和DNA。还应该注意到本发明可以使用有或没有甲醛的固定液来分离固定细胞。

为了这个目的，根据一个方面，本发明涉及一种用于分离位于过滤器上的固定或者活细胞的装置，特征在于其包括：

-隔室，其具有用于容纳携带所述细胞的液体的内部容积、下部开口以及空气入口；

-过滤器，其形成一个单一的单元，当液体通过过滤器时，至少暂时地通过所述隔室开口拦截所述细胞，

-针，其形成单一的防渗单元，至少暂时地，通过所述隔室开口，过滤器设置于针和隔室的内部容积之间，所述针被设计成刺穿相对于环境压力为负压的真空管的塞子以通过所述过滤器抽吸液体。

由于这些特征，该装置能够在过滤器上分离并收集感兴趣的固定后的活细胞，或者处于与它们的培养完美兼容的条件下的活细胞以便进行细胞学特性检测、以及细胞遗传学检测、用于其他任何细胞检测或者从细胞中提取遗传物质。

这种收集直接地在过滤器上进行几乎不会丢失所需的细胞。在这种方式中，在良好的条件下，以及与实验室中常规培养相兼容的条件下，可以以降低的成本收集考虑中的细胞的一大部分。分离后的细胞可以在培养前或培养后用于细胞或分子生物学测试。

构成本发明的装置还能以快速和高效的方式从特殊细胞中收集细胞物质，例如，在下面各阶段完成后：

-过滤阶段，在该阶段中液体的主要部分和所述其它细胞通过具有微孔的过滤器，微孔具有大小位于所述特殊细胞和其它细胞的直径之间的中间直径，

-细胞溶解阶段，不管后面是否有DNA和/或RNA在所述隔室中放大以及

-在过滤器上从溶解后的细胞中收集遗传物质的阶段。

构成本发明的装置具有多个优点：

1/过滤可以在支架上或者将装置握在一个人的手里进行，从而显著地节省了时间和材料（尤其，避免了使用真空泵以及适配器箱），

2/过滤可以在无菌罩中进行。

3/过滤可以在装置处于倾斜位置，甚至几乎水平时进行。

4/条件是完全标准化，取样管以具有预定真空量的标准化方式生产。

5/使用条件包括加强安全条件，以使得其可以完全地在无菌罩内进行操作；再者，一旦真空管被填充，它可以像正常的血液取样管一样被移除，因为采集的血液不会与操作者接触。

根据特定的特征，本发明的装置如上面简要描述的那样，还包括位于隔室和保护筒之间的连接装置，保护筒包围针并且设计成至少部分地在液体被吸入到过滤器的过程中包围真空管。

由于这些设置，可以防止使用者不小心被针扎到。此外，通过使用保护筒作为导引，真空管的定位变得更容易。真空管在抽吸过程中还被更牢固地保持在原位，这能防止其被移除或挪动以使得空气从位于真空管塞子中的针的旁边进入真空管。因为使用者不能在无意中碰到针所以使样品污染的风险最小化。

根据特定的特征，本发明的装置，如上面简要描述的，至少临时地包括所述保护筒。

以这种方式，确保了对针、样品和使用者的保护。

根据特定的特征，所述连接装置是临时性的并且使保护筒能够与真空管和针共同地被移除。

以这种方式，在保护筒与隔室分离之后，能够保证对针和使用者的保护。

根据特定的特征，所述保护筒包括可移除的膜，密封其面向连接装置的开口，穿过开口真空管被插入到保护筒中。

由于这些设置，使用者在插入真空管之前移除膜。该膜为使用者和针提供更好的保护并且减少了样品污染的风险。

根据特定的特征，本发明的装置还包括由手术钢制成的可移除的过滤器支撑，其设计成暂时地连接到隔室的下部开口。

由于这些设置，过滤器能够与其支架一起被移除，用于培养或分析收集在过滤器上的细胞或者用于从它们之中提取遗传物质。另外，手术钢对收集在过滤器上的细胞是无毒害的。

根据特定的特征，所述环的厚度被设计成使其能够被扫描。

根据特定的特征，所述环带有标识符。

以这种方式，该标识符以及所收集的细胞可以与患者相关联。由此避免发生错误。

根据特定的特征，本发明的装置还包括与所述隔室相关的移动装置，其用于对过滤器支撑施加力并且释放所述过滤器。

由于整个过滤模块都是无菌的并且使用通常适用于分子生物学的标准而制备，因此可以避免过滤器上的活细胞或者遗传物质发生任何的污染或变坏。隔室里容纳的物质以无菌状态保存同时在合适的层流罩下面进行处理。以这种方式，所有分离和培养细胞的阶段或者分析细胞的遗传物质的阶段都可以在无菌条件下进行。

根据特定的特征，本发明的装置包括以不可渗透并且可移除的方式连接到隔室的可移除的端件；它被设计成限制移动装置和隔室的相对运动，该相对运动能够施加所述力用于释放所述过滤器支撑。

由于这些设置，过滤器支架被确保保持在原位。此外，端件可以保护它不受飞溅和污染。

以这种方式，过滤器在过滤过程中被保持住并且接着被释放以使其可以通过移除端件以及分别使可移动装置和隔室运动而被取回，该运动用于施加释放过滤器支撑的力。

根据第二方面，本发明涉及一种在过滤器上分离活细胞或者提取它们的遗传物质的方法，特征在于其包括：

-至少暂时地将过滤器连接到隔室的下部开口的步骤，其中隔室还具有空气入口，

-将携带有所述细胞的液体插入所述隔室的步骤，

-以不可渗透的方式将针至少暂时地连接到所述隔室的开口的步骤，过滤器设置在针和隔室的内部容积之间，

-使用所述针穿透相对于环境压力为负压的真空管的塞子的步骤以及

-利用真空管的负压，通过所述过滤器抽吸液体的步骤，所述过滤器保持所述细胞。

根据特定的特征，如上面简要地描述的本发明的方法还包括：

-将保护筒至少暂时地固定到隔室的步骤，接着所述保护筒包围针并且

-真空管在穿透阶段被插入到保护筒中。

由于该方法的优点、目的和特定特征与上面简要描述的本发明的装置相类似，就不在这里重复了。

附图说明

本发明的其他优点、目的和特征将在下面的描述中呈现，下面的描述参照附图进行只是起到解释作用而绝不是详尽无遗，其中

-图1示意性地示出构成本发明的装置的一个初始实施例的各部件组装的透视图，

-图2A到2D，示意性地示出装置的初始实施例在使用前彼此垂直的轴向剖面图，

-图3A到3O，示意性示出构成本发明的装置的初始实施例的各实施步骤的正视图或者横截面图，

-图4，以流程图示出构成本发明的方法的一个具体初始实施例的各实施步骤，

-图5，示意性地示出构成本发明的装置的第二个具体实施例的各部件组装透视图，

-图6A到6D，示意性地示出装置的第二个实施例在使用前彼此垂直的轴向剖面图，

-图7A到7L，示意性示出构成本发明的装置的第二个实施例的各实施步骤的正视图或者横截面图，

-图8，以横截面图示出过滤器支撑集成到构成本发明的装置的第二个实施例中，

-图9，以流程图示出构成本发明的方法的第二个具体实施例的各实施步骤，

-图10示意性地示出装置的具体实施例在使用前的状态，

-图11示意性地示出图10所示的装置的实施例在移除保护膜之后以及插入真空管之前的状态，

-图12示意性地示出图10和11所示装置的实施例在插入真空管之后的状态，

-图13示意性地示出图10到12所示的装置的实施例处于移除真空管和保护筒的过程中的状态以及

-图14作为流程图示出，表示构成本发明的方法的一个具体实施例的各实施步骤。

具体实施方式

在下面对附图的描述中，一种系统被设想用于液体尤其是血液的过滤，其包括用于移除过滤器支撑的装置。然而，本发明并不是局限于这些优选的实施例，而是可以延伸到包括用于容纳液体的隔室的任意系统，过滤器至少暂时地安装到这个隔室的开口上并且针至少暂时地以防漏的方式安装到隔室的开口上以刺穿预先封装的真空管的塞子，针将所抽吸的液体运送通过过滤器并且目标细胞被拦截在过滤器上。

针具有设计用于刺穿真空管的塞子的极细的针尖（参见图3B到3D）以及设计用于容纳隔室或者过滤器支撑的下端的较宽的孔径。真空管具有相当大的负压以及大于要被过滤的液体体积的容积。

在针可以从隔室移除的优选的实施例中，一旦隔室被包含有目标细胞的液体填充，为了收集细胞，针的孔径配置在隔室的开口上方并且真空管的塞子接着被针的细尖穿透。借助于负压，液体的过滤通常在60秒内自动进行。

以这种方式，可以通过手握装置进行过滤，这将节省大量的时间和材料，尤其是因为这样不再需要为泵上的隔室设置真空泵或者适配器盒。

此外，过滤可以在无菌罩中进行，以使装置可以倾斜甚至水平放置。

现在将对具有可移除的过滤器支撑以及用于将过滤器支撑从隔室移除而不会碰到过滤器支撑的装置的实施例进行描述，

图1示出容器或者隔室102、端件104、密封件106、具有支撑108的过滤器、可移动装置110、密封件112和具有空气入口（未示出）的塞子114。

隔室102为圆筒形状。它的上端被塞子114以除了空气入口之外不可渗漏的方式密封。隔室102的下端在其外表面上具有间断的环，环上具有引导可移动装置110上的支腿的空隙，所述环引导可移动装置110的主体。

可移动装置110通常为圆筒形状并且具有两个朝向端件104延伸的支腿并且支腿在该方向上一起变窄以使得在它们之间具有一个间隔，间隔的大小小于过滤器支撑108的直径。如后面接着要描述的，这种特定的形状，支腿116明显地朝向彼此弯曲，使得可移动装置110在其从端件104移除后，能够向过滤器支撑108施加压力以使其与其过滤器一起从隔室102释放，同时可移动装置朝向过滤器支撑108移动。

可移动装置110的支腿116的端部以及隔室102的下端被设计成插入到细胞培养盒中或井中。另一方面，间断的环在隔室102的端部的直径被设计成使得隔室可以支撑在细胞培养盒或井的边缘上。

端件或适配器104设置在隔室102的下部开口，其夹紧隔室102的外壁并且具有直径小于隔室102的直径的下部狭窄开口以使得隔室不可渗透、无菌并且可拆卸。

端件或适配器104的下部狭窄开口足够长以使针的口径形成密封的机械配合（参见图3B到3D）。

与具有侧面凸耳118的隔室102的下端形状相配合，端件104具有旋转锁紧装置用于以已知的方式夹紧所述凸耳。以这种方式，端件104确保过滤器支架在过滤阶段保持在原地不动。另外，端件104保护过滤器不受飞溅和污染危害。

当连接时，隔室102的下端具有向由过滤器支撑108支撑的过滤器排放物质的开口，过滤器支撑本身一方面通过隔室102的下端和另一方面通过端件104保持在适当的位置。

过滤器支撑108在该第一实施例中的形状为环状圆盘。过滤器为微孔的并且熔附于过滤器支撑108的下面，然后过滤器与过滤器支撑一起插入到隔室102的下端。

可移动的过滤器支撑108优选地为环形的并且由手术钢制作而成。手术钢实际上对收集在过滤器上的细胞无毒害。此外，由手术钢制作的过滤器支撑比由塑料制作的支撑更容易移动且更坚固。所述环的厚度优选地被设计成使其能被扫描。该环优选地带有标识符。以这种方式，该标识符以及收集的细胞能与患者相关联。由此避免错误的发生。

或者，过滤器支撑108可以由PVC制作而成并且厚度小于或等于0.4mm，并且优选小于0.3mm。例如，它的外部直径为12.6mm。连接到过滤器支撑108上的过滤器的直径例如为5.9mm。

隔室102、端件104以及可移动装置110例如由聚丙烯制作而成。密封件106和112例如由有机硅塑料制作而成。

图2A和2C为构成本发明的装置的第一实施例的轴向剖面图，其中图1示出的部件已经组装在一起。图2B和2D分别为图2A和2C中的部件的放大细节图。与图1相关的元件在图2A和2D中示出。

图3A表示处于贮藏状态的正视图。图3B表示端件104插入到针180的开口181中，针180具有另一个极细的斜面端182以使其容易刺穿真空管的塞子。针180的开口181优选地由塑料制作而成。针180的端部182优选地为金属的。针180能够设置在液体（未示出），例如血液，通过隔室上部开口被引导进入隔室102之前或之后放置在端件104上。

图3C示出一旦针180无渗漏地接合到端件104，真空管185的塞子186开始被刺穿时的状态。

图3D示出塞子186被针180完全地刺穿，将负压真空管185的内部通过过滤器连接到保持有包含目标细胞的液体的隔室102的容积。真空管185的内部容积大于被过滤的液体的体积。

在抽吸过程中，位于隔室102中的液体里的某些特殊细胞，其直径较大，被过滤器108拦住同时大部分的液体，容纳物以及如果必要还有溶解细胞和尺寸小于被收集细胞的细胞通过过滤器108被抽吸进入真空管185。

接着，如图3E和3F所示，端件104在旋转而从凸耳118释放之后被移除。接着，如图3G和3H所示，隔室102的端部被插入到细胞培养盒或井130中。

如上面描述和在图3I中示出的，邻近可移动装置110的支腿116的端部和隔室102的下端被设计成插入到培养盒或井中。相反，位于隔室102端部的间断的环的直径使其能够支撑在培养盒或井130的边缘上。

更精确地，如图3J和3K所示，可移动装置110在该位置仍然可以平行于隔室102的轴线而移动。

如图3N和3M所示，在移动过程中，当操作者的手指移动移动装置的支腿116时，向过滤器支撑108施加垂直向下的压力并且将其从隔室102的下端释放。过滤器和其支撑108接着落入细胞培养盒或井130中。

最后，如图3O所示，隔室102和移动装置110从细胞培养盒或井130中移除。

图4对这些实施阶段作出了总结。

在阶段202中，装置的各个部件被组装到一起。在阶段203，塞子114被移除。在阶段204，端件104被插入到针180的开口181中。在阶段205，包含有被分离并且有可能被培养的细胞的液体，例如血液，通过隔室102的上端被引入。

在阶段206，针180的尖端182定位于接近塞子186中心的位置并且向隔室102施压以使针刺穿塞子186直到针的端部到达处于负压或者真空压力的真空管185的内部容积。

在阶段210，过滤通过将比目标细胞小的细胞，任意的溶解细胞，以及隔室102中的大部分液体抽吸进入真空管而实现，目标细胞被阻拦在过滤器108上。

在阶段212，真空管185和针180被移除。在阶段214，端件104被移除。在阶段216，隔室102的端部被插入到细胞培养盒或井中。

在阶段218，可移动装置和隔室分别被移动以向过滤器支撑108施加力并且将其释放以使得过滤器支撑与过滤器一起落入细胞培养盒或井130中。在阶段220，隔室102和可移动装置110从细胞培养盒或井130中移除。

在阶段222，细胞培养以已知的方式在细胞培养井130中进行。注意到支撑108围绕着过滤器的上表面，该表面保存有分离在过滤器上的细胞，防止细胞脱离过滤器。

在阶段222，目标活细胞的培养在过滤器上进行，过滤器覆盖有Matrigel薄层，（或者与Matrigel层接触，Matrigel层预先放置在孔板和/或培养瓶的底面上，在底面上搁置有该Matrigel层，Matrigel为一个注册商标）例如，其包括设计成培养目标细胞的因素。

在阶段224，当希望对细胞或者它们的遗传物质进行观察时，使用手术钳将过滤器支撑108取回；过滤器支撑108的上表面上的水平圆柱形孔，或者凹槽的存在使上述过程变得很方便。

过滤器支撑108接着能够放置在载玻片上并且过滤器覆盖有圆盘形盖玻片，盖玻片的直径与过滤器空的上表面相适应。细胞分析或者它们的遗传物质的提取用已知的方法进行。

图5示出容器或隔室302，端件304，密封件306，过滤器支撑308，可移动装置310，密封件312以及塞子314。

隔室302大体为圆筒形。其上端借助塞子314形成除了空气可进入（未示出）的无渗漏密封。隔室302下端的外表面上具有与隔室302的主体分离开的圆筒350，它们彼此仅通过侧带352形式的机械连接而相接。该圆筒350的外直径与可移动装置310主体的内直径相匹配，以使其随着自身的移动而被引导。圆筒350配设有设计成允许可移动装置310的支腿316插入到其中并在纵向上滑动的开口。

可移动装置310大体为圆筒形，其具有两个朝向端件304延伸并在该方向上变窄以在它们之间形成尺寸小于过滤器支撑308的间隔的支腿316。如后面描述的，这种特定的形状，支腿316明显地向彼此弯曲使得可移动装置310在其从端件304移除后，随着可移动装置朝向过滤器支撑308移动而推动过滤器支撑308使其从隔室302释放。

为了与隔室302具有侧面凸耳318的下端的形状相匹配，端件304具有旋转锁紧装置用于以已知的方式夹紧所述凸耳。以这种方式，端件304确保了在过滤阶段使过滤器支撑保持在原位。此外，端件304保护过滤器不会遭受飞溅和污染的危害。

在装配时，隔室302的下端具有朝向由过滤器支撑308所支撑的过滤器排放物质的开口，过滤器支撑308本身一方面通过隔室302的下端另一方面通过端件304保持在原位。

如图8所示，过滤器支撑308在第二个实施例中具有容纳离心管（Eppendorftube）的形状。

具体为：

-支撑308的内部上面部分的形状与离心管的内部上面部分的形状相同，使得所述支撑的上部开口可以采用离心管的塞子封闭并且

-支撑308的外部上面部分与离心管的内部上面部分相符合，使得过滤器支撑308能够插入到离心管的顶部中。

此外，过滤器支撑308作用为立柱以允许拦截在过滤器上的细胞发生溶解并且将细胞溶解物和遗传物质从过滤器支撑离心转移到离心管。

过滤器支撑308优选地由聚碳酸酯塑料制作而成。隔室302，端件304以及可移动装置310例如由聚丙烯生产而成。密封件306和312例如由硅树脂制作而成。

图6A和6C为构成本发明的装置的第二个实施例的相互垂直的轴向剖面图，其中图5示出的部件已经被组装起来。图6B和6D分别为图6A和6C中的部件的放大细节图。图5中描述的部件在图6A到6D中示出。

图7A表示装置处于贮藏状态的正视图。图7B到7D与图3B到3D相同，除了端件的参考标记为304。

如图7E到7F所示，端件304在其旋转释放凸耳318之后被移除。接着，如图7G,7H和7I所示，隔室302的端部被插入到支撑有离心管的支撑328中。

如图7J和7K所示，可移动装置310接着平行于隔室302的轴而被降低。随着它的移动，操作者用手指移动可移动装置310的支腿316从而在过滤器支撑308上施加向下的压力并且将其从隔室302的下端释放。过滤器支撑308接着下降进入离心管中。

最后，如图7L所示，隔室302和可移动装置310被移除。

图9对这些阶段的实施进行了总结。

在阶段402，装置的各个部件被组装到一起。在阶段403，塞子被移除。在阶段404，塞子304被插入到针180的开口181中。在阶段405，包含有被过滤并且有可能被培养的细胞的液体，例如血液，通过隔室302的上端被引导进入。

在阶段406，针180的尖端182定位在大约塞子186的中心位置并且向隔室302施加力以使针刺穿塞子186直到针的端部到达处于负压甚至真空压力下的真空管185的内部容积。

在阶段410，过滤通过将小于目标细胞的细胞和任意的溶解细胞以及隔室302中的大部分液体抽吸进入真空管185而实现。

在阶段412，真空管185和针180被移除。在阶段414，端件304被移除。在阶段416，隔室302的端部被插入到离心管的支撑中。

在阶段418，可移动装置和隔室分别被移动以向过滤器支撑施加压力使其下落进入离心管。最后，在阶段420，隔室302和可移动装置310被移除并且由离心管的塞子所取代。

离心管接着以已知的方法投入使用，例如应用在溶解、离心过滤和遗传物质收集阶段中，这些阶段带有或不带有全基因组的预放大。

在阶段422和424，在离心过滤之后，对收集在离心管底部的遗传物质，尤其是目标细胞的DNA和RNA进行分析。扩增的DNA作为阵列用于探测靶向治疗的灵敏度或阻抗的变化。此外，或替代地，cDNA（“c”表示互补）通过RT转换（逆转换）以及扩增从RNA中获得，其作为阵列用于探测靶向治疗的灵敏度或阻抗的基因表达水平。这种遗传物质从胚胎滋养层中获得，胚胎滋养层通过对采自于孕妇的血液进行过滤而得到，这种遗传物质能够用于识别潜在的遗传异常。

通过在实时定量PCR（“聚合酶链式反应”）过程中使用成对的正向和反向引物以及成对的探针，对确定体积的扩增遗传物质，尤其是DNA进行采样来探测靶向治疗的灵敏度或阻抗的变化。

研究靶向治疗的灵敏度或阻抗变化的原理在具体实施例中的实施在下面进行描述。等位基因的分析或者“SNP基因型分析”（SNP为单核苷酸多态性的首字母缩写）使得关于基因偶尔变化的出现或消失的信息被收集起来。等位基因检测的第一阶段422为一个实时定量PCR反应，其采用两种引物以及两个探针，例如TaqMan（注册商标）来扩增目标细胞的序列。其中一个探针识别变异序列同时另一个识别正常序列。这两个探针与不同的荧光物质相关联，例如“VIC”荧光物质用于探测正常序列的杂交并且“FAM”荧光物质用于探测变异序列的杂交。第二阶段424，使用等位基因分析程序检测由FAM和/或VIC荧光物质产生的初始荧光和最终荧光。该程序允许各种序列出现在每个被辨别的样品中：

-VIC荧光单独增多表示正常序列的纯合子特征（homozygousprofile），

-FAM荧光单独增多表示变异序列的纯合子特征，

-VIC和FAM荧光同时增多表示杂合的特征。

探针在两个引物之间成对出现并且根据与它们关联的荧光而显示变异的发生或消失。

在其它实施例中，确定体积的遗传物质，尤其是RNA，通过RT（“反转录”的首字母缩写）转换成cDNA并且被扩增，其被采样用于通过使用成对的正向和反向引物以及探针在定量实时PCR（“聚合酶链式反应”的首字母缩写）过程的多个周期中探测靶向治疗的灵敏度和阻抗的基因表达水平，多个周期例如为50个周期。

在上面描述的每一个实施例中，过滤器优选地由聚碳酸酯塑料生产，并且对其进行亲水性表面处理。使用这种过滤器增强了对特殊细胞的拦截并且当其它细胞具体地经历溶解时减小了其它细胞或它们的内容物的粘附。

过滤器孔径的大小优选地集中在比用于相同的固定细胞，即硬化细胞的对应值小的范围之内，例如小1μm。

例如，如果固定细胞的孔径集中在7.5μm，过滤器的孔径集中在一个较低的值，例如6.5μm。由于直径的差量，实际上没有孔径大于7μm的过滤器。

对于本发明在血液细胞中的应用，过滤器的孔密度在50,000到200,000孔/cm²之间并且大约为100,000孔/cm²。

由于使用聚碳酸酯塑料过滤器，对负压的要求远低于现有技术的系统，差不多低了四倍，这就防止了收集在过滤器上的目标细胞变坏。

在存在替代变化的情况下，过滤器支撑108或308机械地连接到可移动装置直到力被施加以通过朝向培养井或离心管移动隔室而将过滤器支撑从可移动装置释放。隔室102或302的下端与可移动装置110或310的角色互换以使得后者将过滤器支撑支持在培养井或离心管的载玻片上或者载玻片前方，当向隔室的上端施加压力时，隔室将过滤器支撑释放，这对于本领域技术人员来说是能够从前面实施例的描述中容易地改变而得到的。

图10到14涉及本发明的具体实施例以及构成本发明的方法，其使用保护导筒来保护真空管。

虽然这些具体实施例补充了上面描述的一个或其它实施例，但是已经决定使它们适应图1到4所示出的实施例以产生图10到14。

图10到13示出隔室102、可移动装置110和通过两部分连接装置504和520连接到隔室的保护筒502。

保护筒包括连接装置部分504、磨砂部分506、透明部分508以及位于面对隔室102的开口上的膜510。

部件520形成在隔室102的端部里面。图13示出包括有4个位于与隔室102共轴的筒部件的侧面上的插脚。在该实施例中，部件504包括四个形状与上面的插脚相对应的凹槽。这些凹槽524为椭圆形，从设计用于容纳插脚522的开口向保护筒502的内部延伸以使得通过沿图13中的箭头方向旋转保护筒502而使得每个插脚522进入对应的凹槽524并且将保护筒502紧固到隔室102上。

保护筒连接到包含有下面的针180的端件上。针180嵌入部件524的下部，该下部面向隔室502。部件524借助4个辐条通过施加压力而安装到部件506上。这些辐条位于部件504上并且插入到位于部件506上的四个凹槽里。

部件506用于遮住针180。透明部分508用于使用者检查过滤所处的阶段和是否完成。

膜510覆盖并密封筒502的整个下部开口，其配置有从筒502延伸一个较短距离的横向部分（如图10所示）。这个横向部分使膜510可以容易地被移除。

膜510保护使用者使其避免接近针180。膜510还能保护针使其不会被堵住和/或发生污染。

筒502被小心地着色，例如蓝色，绿色或者黄色，这取决于过滤装置的使用目的（分别是细胞学，分子生物学以及培养研究）

注意到在图11中，在被过滤的液体进入隔室102之后，膜510被移除，安装有塞子186的真空管185插入到保护导筒502中。接着如上面描述的，向真空管185施加力使针180刺穿塞子186。

在图12示出的装配生产中，真空管185中的负压引起隔室102中的液体发生过滤。

注意到在图11中，在被过滤液体被引入隔室102之后，膜510被移除，安装有塞子186的真空管185插入到保护导筒502中。接着，如早前描述的，向真空管185施加推力使针180刺穿塞子186。

在图12示出的装配生产中，真空管185中的负压引起隔室102中的液体发生过滤。

如图13所示，当过滤完成时，保护筒502和其围绕的针180被共同移除。

图14总结了这些实施阶段。

在阶段602，装置的各个部件被组装在一起。在阶段603，塞子114被移除。在阶段604，包含有被分离的并且有可能被培养的细胞的液体，例如血液通过隔室102的上端被引导。

在阶段605，真空管185插入到保护筒502，其具有将针180的尖端182定位在塞子的近似中心位置的效果，并且施加相反的力使针180刺穿塞子186直到针的端部到达在阶段606中处于负压甚至真空压力的真空管185的内部容积。

在阶段610，通过将小于目标细胞的细胞和任意的溶解细胞，以及隔室102中的大部分液体抽吸进入真空管而实现过滤，目标细胞被拦截在过滤器108上。

在阶段612，保护筒502，真空管185和针180被移除。

下面的阶段已经参照并且依据其它的实施例进行了描述。因此，在这里不再对它们进行描述。

从前面的描述可以理解，当保护筒连接到隔室，可以保护使用者使其不会因为不小心被针扎到。此外，通过由保护筒提供的引导使真空管的定位变得方便。真空管在过滤过程中还可以被牢固地保持不动，防止其被移除或移动，由此允许空气通过位于真空管塞子中的针的附近而进入真空管。由于使用者不能在无意中碰触到针，使得样品被使用者污染的风险降到最低。

优选地，如图10到13所示，构成本发明的装置至少暂时地包括所述保护筒。在其它实施例中，在使用前立即进行组装。

优选地，如图10到13所示，连接装置是暂时的并且使保护筒能够与真空管共同被移除。在替代的变化存在的情况下，这两个部件在两个连续的步骤中被移除。

在实施例中，构成本发明的装置以一整套设备的形式表示，包括一个外袋，两个内袋：

-第一个内袋包括如图2A,6A和10中所示的组装好的装置。

-第二个内袋包括针，真空管，培养井和圆形载玻片和/或离心管或者其它用于使用该装置的有用配件。

使用本发明的装置能够避免细胞采样的高风险，例如羊水细胞，同时能够进行细胞培养，例如羊膜腔穿刺术。此外，由于过滤器支撑108的形状类似于容器，免疫细胞化学反应和荧光原位杂交反应（“FISH”）能够直接在该支撑上进行。

Claims (5)

1.一种用于在过滤器(108，308)上分离固定细胞或者活细胞或者从所述活细胞中提取遗传物质的装置，其包括：

-隔室(102，302)，具有用于容纳含有所述细胞的液体的内部容积、下部开口和空气入口，

可移动装置，配置成能够相对于隔室单独移动，所述可移动装置还具有支腿；

-过滤器和过滤器支撑，由所述隔室开口和/或可移动装置实现支撑，被设计成当液体经过滤器时拦截所述细胞以及

-针(180)，至少暂时地与所述隔室开口一起形成单一防渗漏单元，过滤器被定位于针和隔室的内部容积之间，所述针被设计成刺穿具有相对于环境压力为负压的真空管(185)的塞子(186)以抽吸所述液体通过所述过滤器，

其特征在于其进一步包括：

位于隔室和围绕着针的保护筒(502)之间的连接装置(504，520)，所述连接装置适于在抽吸液体通过过滤器的过程中包围真空管的至少一部分；

其中保护筒(502)包括密封面对连接装置(504,520)的保护筒开口的可移动膜(510)以及一个开口，适用于在可移动膜被移除之后通过该开口将真空管(185)插入到保护筒中；

可移动装置和隔室分别被移动，以向过滤器施加力并且在液体被吸入到过滤器之后将过滤器释放；

其中，可移动装置的支腿如此配置，当操作者的手指移动可移动装置的支腿时，向过滤器支撑施加垂直向下的压力，并且将过滤器支撑从隔室的下端释放；

其中所述连接装置是临时的，并且其使至少一部分的连接装置、保护筒、针与真空管共同被移除。

2.根据权利要求1的装置，其至少临时地包括所述保护筒(502)。

3.根据权利要求1的装置，其中所述过滤器支撑(108，308)的厚度适于使过滤器支撑能够被扫描。

4.根据权利要求3的装置其中所述过滤器支撑(108,308)带有标识符。

5.一种用于在过滤器(108,308)上分离活细胞或从所述活细胞提出遗传物质的方法，其包括：

-至少暂时地将过滤器(108,308)和过滤器支撑连接到隔室(102,302)的下部开口上的步骤(202,402,602)，该隔室还具有空气入口，或者连接到可移动装置，其配置成能够相对于隔室单独移动，所述可移动装置还具有支腿，

-将含有所述细胞的液体加入到所述隔室中的步骤(208,405,604)，

-以防渗漏的方式将针(180)至少暂时地连接到所述隔室开口的步骤(202,402,602)，过滤器设置在针和隔室的内部容积之间，

其特征在于其进一步包括：

-至少暂时地将保护筒紧固到隔室的步骤(602)，所述保护筒随后包围针，以及

-借助所述针，刺穿相对于环境压力为负压的真空管(185)的塞子(186)的步骤(210,406,605,606)，真空管在刺穿步骤被插入到保护筒以及

-利用真空管的负压将液体抽吸通过所述过滤器的步骤(210,410,610)，所述过滤器拦截所述细胞；

使至少一部分的连接装置、保护筒、针与真空管共同被移除；

可移动装置和隔室分别被移动，以向过滤器施加力并且将过滤器释放；

其中，可移动装置的支腿如此配置，当操作者的手指移动可移动装置的支腿时，向过滤器支撑施加垂直向下的压力，并且将过滤器支撑从隔室的下端释放；

其中保护筒(502)包括密封面对连接装置(504,520)的保护筒开口的可移动膜(510)，该方法进一步包括在将真空管(185)插入到保护筒之前移除可移动膜的步骤。