CN103191412B

CN103191412B - Pa200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解

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Publication number: CN103191412B
Application number: CN201310110391.8A
Authority: CN
Inventors: 邱小波; 钱民先; 逄也; 刘翠华; 王广菲; 朱倩倩; 张晓旭; 刘珊
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-04-01
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2033-04-01
Also published as: CN103191412A; WO2014161116A1

Abstract

本发明公开了PA200蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（1）至（4）中的至少一种：（1）结合乙酰化蛋白质；（2）促进乙酰化蛋白质降解；（3）参与体细胞DNA损伤修复；（4）参与精子形成。本发明在如下四个方面取得了突破：（1）发现乙酰化调控组蛋白降解、精子发生和DNA修复的机制。（2）揭示乙酰化，而非泛素化，介导组蛋白通过PA200/Blm10蛋白酶体降解。（3）发现新型含PA200，α4s的睾丸特异蛋白酶体，并揭示核心组蛋白作为这些蛋白酶体的第一类生理底物。（4）揭示组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进由DNA双链断裂诱导的、由乙酰化介导的组蛋白降解，增强细胞对DNA损伤的敏感性，容易引起细胞死亡。

Description

PA200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解

技术领域

本发明涉及PA200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解。

背景技术

蛋白酶体催化细胞内绝大部分蛋白质的ATP和多泛素化依赖性降解，而且在脊椎动物体内还催化组织相容性复合体I类分子抗原肽的生成。26S蛋白酶体由两亚复合体组成，即20S催化颗粒和结合其一端或两端的调节颗粒。目前在哺乳动物中已经确定的20S核心颗粒主要有两种形式：组成型蛋白酶体和诱导型免疫蛋白酶体。前者含有三种催化亚基（β1、β2和β5），而后者含三种与诱导紧密相关的亚基（β1i、β2i和β5i）。蛋白酶体主要的调节颗粒为19S复合体，它能够结合多泛素化的蛋白，使其去折叠后转移进入20S催化颗粒。另外还存在着其他的蛋白酶体活化因子，11S复合体-PA28α/PA28β能够加快多肽形成促使抗原递呈，PA28γ（为PA28α和PA28β的类似物）能促使某些核蛋白的不依赖于泛素化的降解。

最新发现的一种蛋白酶体活化因子为PA200，其酵母同源物为Blm10，在体外能够激活小分子多肽和结构不完整的Tau蛋白的降解。哺乳动物所有组织都含有PA200，但是在睾丸中高表达。PA200敲除导致雄性小鼠精子发生过程严重缺陷从而明显降低了其生殖能力，但其机理还不清楚。

核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成的八聚体由DNA包裹在核小体中，而连接组蛋白H1保护核小体间DNA。每一个八聚体都由两个H2A-H2B二聚体和一个H3-H4四聚体组成。核小体是染色质结构的组成单位，在许多细胞活动中起到重要作用，包括基因表达的表观遗传调控、细胞分裂、分化和DNA损伤应答等。

在精子发生过程中，减数分裂后细胞的大部分组蛋白先暂时性由转型蛋白(transition nuclear protein,TP蛋白)替换，最终被精蛋白取代。体细胞中的组蛋白在基因活性区或者启动子区域也会被替换。上述组蛋白替换的潜在机制还不清楚。

赖氨酸乙酰化广泛参与各项细胞活动，特别是染色质重塑、DNA修复和转录。它不仅通过阻碍或者促进某些底物的多泛素化来影响蛋白酶体降解通路，还影响特定蛋白质通过溶酶体通路的降解。组蛋白乙酰化转移酶（HAT）催化乙酰化赖氨酸的形成，蛋白质中这一修饰能够被溴区结构域（BRD）所识别，而组蛋白去乙酰化酶（HDAC）则起到了去除这一基团的作用。

在精子发生过程中组蛋白被清除之前是被高度乙酰化的。组蛋白乙酰化与打开和激活转录常染色质区域有关，并致使DNA双链断裂处染色质松散。尽管组蛋白乙酰化位点和乙酰化酶或去乙酰化酶受到广泛的研究，但乙酰化如何调控转录、精子发生和DNA修复仍不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供了新的组蛋白降解通路，即PA200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解。本发明还提供了一种新型组织特异性蛋白酶体，即生精蛋白酶体。

本发明提供了PA200蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（1）至（4）中的至少一种：（1）结合乙酰化蛋白质（可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac）；（2）促进乙酰化蛋白质（可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac）降解；（3）参与体细胞DNA损伤修复（具体为识别DNA损伤处的乙酰化组蛋白并促进乙酰化组蛋白被蛋白酶体降解，所述DNA损伤具体可为射线照射引起的DNA损伤和/或药物引起的DNA损伤；所述射线具体可为⁶⁰Coγ-射线；所述药物具体可为MMS）；（4）参与精子形成。

所述PA200蛋白具体可为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

本发明还提供了PA200蛋白的BRD类似域在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（5）和/或（6）：（5）结合乙酰化蛋白质（可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac）；（6）促进乙酰化蛋白质（可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac）降解；所述PA200蛋白的BRD类似域为所述PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽。

所述PA200蛋白的BRD类似域还可以被替换为PA200-BRD-GST融合蛋白（即PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。

本发明还保护PA200蛋白在促进精细胞中组蛋白（具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A）积累中的应用或PA200蛋白在抑制精细胞中组蛋白（具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A）降解中的应用。

本发明还保护α4s亚基，为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且在精细胞或精子中特异表达的由序列4衍生的蛋白质。

本发明还保护哺乳动物的生精蛋白酶体，由20S核心复合物、19S调节复合物和PA200调节颗粒组成；所述20S核心复合物中存在所述α4s亚基。所述哺乳动物可为牛、人、小鼠、大鼠或兔子。所述生精蛋白酶体为精子发生过程中主要的蛋白酶体形式。所述20S核心复合物中还存在免疫蛋白酶体的3个β催化亚基（β1i、β2i和β5i）。所述生精蛋白酶体存在两种形式：大的生精蛋白酶体和小的生精蛋白酶体。大的生精蛋白酶体由35种蛋白（包括α1-α7、α4s、β1-β7、Rpt1-Rpt6、Rpn1-3、Rpn5-13、UCH37和PA200）形成的48个亚基组成。小的生精蛋白酶体由19种蛋白（包括α1-α7、α4s、β1-β7、β1i、β2i、β5i和PA200）形成的29个亚基组成。

本发明还保护所述生精蛋白酶体在制备产品中的应用；所述产品的功能为降解乙酰化的蛋白质（所述蛋白质为组蛋白，具体可为核心组蛋白）。

本发明还保护抑制PA200蛋白的表达的物质，或抑制PA200蛋白的活性的物质，或抑制生精蛋白酶体和乙酰化蛋白质结合的物质，在制备产品中的应用；所述产品为如下①或②或③或④或⑤：①男性避孕药；②促进睾丸中细胞的凋亡的产品；③抗睾丸肿瘤的药物；④促进精细胞中组蛋白（具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A）积累的产品；⑤抑制精细胞中组蛋白（具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A）降解的产品。

本发明还保护一种男性避孕药，其活性成分为抑制PA200蛋白的表达的物质，或抑制PA200蛋白的活性的物质，或抑制生精蛋白酶体和乙酰化蛋白质结合的物质。所述乙酰化蛋白质可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac。

本发明还保护去乙酰化酶抑制剂在制备促进组蛋白降解的产品中的应用。所述去乙酰化酶抑制剂具体可为TSA。所述组蛋白可为核心组蛋白，具体可为H2B和/或H4。

本发明还保护去乙酰化酶抑制剂和发生引起DNA双链断裂的射线的仪器在制备抗肿瘤产品中的应用。所述去乙酰化酶抑制剂具体可为TSA。

本发明还保护去乙酰化酶抑制剂和引起DNA双链断裂的药物在制备抗肿瘤产品中的应用。所述去乙酰化酶抑制剂具体可为TSA。所述引起DNA双链断裂的药物具体可为MMS。

本发明发现了一种特异形式的蛋白酶体，它包含PA200/Blm10，能特异性催化核心组蛋白的多泛素非依赖性降解。在体细胞DNA损伤应答和精子发生过程中，PA200/Blm10通过其非典型性的BRD结构域结合核心组蛋白的乙酰化赖氨酸残基从而促使其降解。在哺乳动物睾丸中，大多数蛋白酶体均为以前未见报道的特殊蛋白酶体，将之命名为生精蛋白酶体（Spermatoproteasomes）。除了PA200外，生精蛋白酶体还含有精细胞和精子特异的α亚基，将其命名为α4s（Spermatid/sperm specificα4-like subunit）。同时生精蛋白酶体还含有免疫蛋白酶体中具催化活性的β亚基。

本发明发现去乙酰化酶抑制剂和可引起DNA双链断裂的放射或化学药物共同处理细胞，会诱导体细胞的核心组蛋白降解。进一步发现PA200基因的敲除能阻滞小鼠体细胞DNA双链断裂损伤过程中依赖于乙酰化的核心组蛋白降解，并延迟长形精细胞中核心组蛋白的适时清除。纯化的PA200明显地加快了乙酰化的核心组蛋白通过不依赖于ATP的体外蛋白酶体降解，而对多泛素化的蛋白质降解没有影响。PA200及其酵母同源物Blm10含有能特异识别赖氨酸乙酰化位点的类似于溴区结构域（Bromodomain）的新型结构域（溴区结构类似域，Bromodomain-like region）。可能在其它翻译后修饰的辅助下，PA200和Blm10通过该非典型溴区结构域结合乙酰化的核心组蛋白，并促进核心组蛋白降解。以上发现表明PA200/Blm10特异性识别并促使核心组蛋白通过乙酰化介导的蛋白酶体降解，从而揭示了乙酰化调控组蛋白降解、DNA修复和精子发生的作用机理。

根据本发明的一实施方案，发现PA200是精子发生过程中核心组蛋白程序性降解的关键。组蛋白的修饰模式被建议为“组蛋白密码”，用于基因表达的表观遗传调控，本发明阐述了在精子发生和体细胞DNA损伤应答过程中核心组蛋白降解的通路。哺乳动物中，大的睾丸特异性蛋白酶体（Lg）出人意料地拥有了免疫蛋白酶体特异的催化亚基β1i、β2i和/或β5i以及PA200。这些蛋白酶体在非变性胶中迁移的速率要慢于19S-20S和20S，但快于19S-20S-19S。因为免疫蛋白酶体特异的催化亚基是伴随着PA200一起迁移的，所以在spermatoproteasome中检测到的这些免疫蛋白酶体亚基不单单是因为有典型的免疫蛋白酶体存在。尽管少量的PA200-20S和PA200-20S-19S复合物也存在在肌肉中，但α4s和“免疫”亚基却没存在于肌肉中。所以蛋白酶体显示出的睾丸特异性是因其有一个或两个PA200在调节颗粒和β1i、β2i、β5i、α4s在20S颗粒中。在睾丸中这些变换的20S亚基的功能意义还不清楚。不同于其他可变换的20S亚基，α4s是处在外α-环上，所以缺乏催化活性，但可能优先与调节颗粒结合，如PA200。正是这种独一无二的特征可用于开发针对于某些睾丸肿瘤或甚至是男性避孕的药物，这些药物通过阻断对精子发生过程起关键作用的蛋白酶体活性来特异性靶定于精子发生。过剩的组蛋白会阻断转录，从而增强了DNA损伤的敏感性并导致染色体凝集或丢失。在PA200敲除小鼠中长形精细胞的核心组蛋白清除被延迟也导致了核心组蛋白的聚集而且诱导了其凋亡。所以，本发现可解释为什么小鼠PA200基因敲除会产生不正常的精细胞或精子从而导致雄性小鼠的生育能力急剧降低。

根据本发明的另一实施方案，发现乙酰化和PA200介导核心组蛋白通过不依赖于多泛素化的蛋白酶体通路降解。酵母中核心组蛋白在DNA双链断裂处附近会被去除，而在DNA修复时PA200会聚集在染色质上。本发明显示在酵母和哺乳动物体细胞DNA损伤应答中提升乙酰化水平（通过添加HDAC抑制剂）可促进核心组蛋白的去除。而且，这个进程是依赖于PA200/Blm10。本发明还描述了PA200/Blm10通过其非典型BRD结构域在DNA双链断裂处能特异性结合乙酰化的组蛋白，纯化的PA200能直接激活20S颗粒降解乙酰化的核心组蛋白。而在同样条件下对泛素化的蛋白质降解没有作用。许多HDAC的抑制剂作为抗癌药物正处在临床试验研究中，特别是与其它治疗方法，如化疗和放疗，一起使用。本发明描述了HDAC抑制剂促进了由辐射或DNA损伤药物MMS诱导的乙酰化介导的组蛋白降解，而这一降解途径能被蛋白酶体抑制剂（MG132）所阻断。HDAC抑制剂同时也增强了细胞对DNA损伤的敏感性，促进细胞死亡。这提供了其在临床中运用的机制。

根据本发明的另一实施方案，发现赖氨酸残基上的乙酰化也可作为蛋白酶体降解的信号。组蛋白乙酰化在基因表达的表观调控上起决定性作用。几乎所有已知的能识别赖氨酸乙酰化残基的BRDs，都有适度的序列同源性。尽管PA200/Blm10的非典型BRD结构域结构上像BRD，但是它们却与已知的BRDs基本上没有任何序列同源性。本发明对于鉴定其它新的、有非典型的BRDs、能结合乙酰化赖氨酸的蛋白很重要。由于PA200/Blm10能识别赖氨酸乙酰化修饰，其它乙酰化的非组蛋白的蛋白质也可能通过PA200介导降解。

根据本发明，总结精子发生和体细胞DNA修复过程中核心组蛋白降解模型。在精子发生过程中，减数分裂后的精细胞中核心组蛋白经历了1)乙酰化及其它仍待鉴定的翻译后修饰，2)后被PA200/Blm10的非典型BRD结构域识别，3)再由生精蛋白酶体降解，4)TP蛋白临时取代，而TP蛋白最终被精蛋白替换。当DNA双链断裂时，体细胞中DNA损伤位点附近的核心组蛋白也被乙酰化后由含PA200/Blm10的蛋白酶体降解，以至于DNA修复蛋白能够到达损伤区域。另外，在体内可能还需要其它或翻译后修饰与乙酰化一起促使组蛋白降解。

本发明开创了一个研究乙酰化介导的、通过PA200/Blm10蛋白酶体降解蛋白质及其调控DNA修复、基因调控和精子发生等众多细胞活动的全新领域，涉及组蛋白乙酰化修饰、蛋白质降解、基因表达的表观遗传调控及男性生殖领域,将有利于癌症和男性不育症等相关疾病的治疗及男性避孕药物的开发。

本发明在如下四个方面取得了突破：

（1）发现乙酰化调控组蛋白降解、精子发生和DNA修复的机制。组蛋白乙酰化是组蛋白修饰的一种主要类型，它可以调控许多极为重要的细胞活动，如基因表达的表观遗传调控、DNA修复和精子发生。然而，乙酰化调控这些重要过程的机理仍不清楚。该发明发现PA200/Blm10的非典型BRD结构域可以识别乙酰化核心组蛋白(其它的翻译后修饰可能辅助这种结合)并促使其通过蛋白酶体降解，揭示了乙酰化在组蛋白降解、精子发生和DNA修复中的作用机制。

（2）揭示乙酰化，而非泛素化，介导组蛋白通过PA200/Blm10蛋白酶体降解。蛋白酶体催化ATP和多聚泛素化依赖的细胞内多数蛋白的降解。为阐明组蛋白降解机制，人们一直试图通过寻找催化组蛋白多聚泛素化的酶，但是迄今为止并没有发现这样的酶。本发明发现PA200/Blm10蛋白酶体催化乙酰化而非多聚泛素化依赖的核心组蛋白降解。除组蛋白以外，其它蛋白质也可以被乙酰化修饰。因而，PA200/Blm10蛋白酶体也可能催化其它乙酰化蛋白质降解。已知典型的26S蛋白酶体抑制剂万珂(Velcade)已用于治疗多发性骨髓癌，PA200/Blm10蛋白酶体及乙酰化通路的调控也有可能成为相关疾病治疗的一种手段。

（3）发现新型含PA200的睾丸特异蛋白酶体（生精蛋白酶体），并揭示核心组蛋白作为这些蛋白酶体的第一类生理底物。发现多数哺乳动物睾丸中的蛋白酶体（“生精蛋白酶体”）除了包含PA200外，还包含一个精细胞/精子特异的α亚基α4s/PSMA8及免疫蛋白酶体的β催化亚基。作为蛋白酶体激活物的PA200/Blm10对体细胞DNA损伤和精子发生过程中核心组蛋白的及时清除是必不可少的。本发明发现了PA200/Blm10的非典型BRD结构域可识别核心组蛋白中乙酰化的赖氨酸残基。这些发现可能会对于开发特异的抗肿瘤药物甚至男性避孕药物起到重要作用。

（4）揭示组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂促进由DNA双链断裂诱导的、由乙酰化介导的组蛋白降解，增强细胞对DNA损伤的敏感性，容易引起细胞死亡。大量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为抗肿瘤药物正在临床实验中，尤其是将它们与化疗或放疗结合。本发明发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进辐射或DNA损伤试剂MMS诱导的、乙酰化介导的组蛋白降解，为它们的临床应用提供了机制。

附图说明

图1为PA200和H2BK5ac的共定位的结果。

图2为PA200和H4K16ac的共定位的结果。

图3为γ-电离辐射使PA200被招募至DNA损伤位点的结果。

图4为PA200/Blm10识别乙酰化的结构域的结果。

图5为各个融合蛋白与乙酰化组蛋白的结合能力的结果。

图6为PA200-BRD-GST融合蛋白与乙酰化组蛋白的结合能力的结果。

图7为哺乳动物睾丸中两种不同类型的蛋白酶体鉴定的结果。

图8为生精蛋白酶体中的特有亚基和活性的结果。

图9为小鼠PA200的敲除减缓了长形精细胞中核心组蛋白的降解的结果。

图10为含PA200/Blm10的蛋白酶体选择性降解乙酰化的核心组蛋白。

图11为体细胞DNA损伤时PA200/Blm10是核心组蛋白乙酰化相关降解必需的的结果。

图12为模式图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

PA200蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示，PA200基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示。谷胱甘肽S转移酶的氨基酸序列如序列表的序列3所示。His标签的氨基酸序列为“HHHHHH”。α4s蛋白的氨基酸序列如序列表的序列4所示。α4蛋白的氨基酸序列如序列表的序列5所示。Gcn5蛋白如GENBANK ACCESSION NO.NP_011768.1（linear PLN25-FEB-2013，GI:6321691）所示。组蛋白H4如GENBANK ACCESSION NO.NP_778224.1（linear PRI24-MAR-2013，GI:28173560）所示。TIP60蛋白如GENBANK ACCESSION NO.NP_874369（linearPRI10-FEB-2013，GI:36287069）所示。RNF5蛋白如ACCESSION NO.NP_008844.1（linearPRI18-MAR-2013，GI:5902054）所示。Flag标签的氨基酸序列为“DYKDDDDK”。

实施例中的大鼠均为Wistar大鼠，均购自中国医学科学院实验动物中心（中国北京）。C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠，均购自中国医学科学院实验动物中心（中国北京）。

实施例中所用的牛组织和兔组织均获自福成屠宰场（中国河北），动物屠宰后，立即剥离组织，浸没在液氮中，-80℃保存至使用。

COS-7细胞（非洲绿猴肾细胞）：ATCC，货号CRL-1651。大肠杆菌DH5α：Invitrogen，货号为4526。大肠杆菌BL21：Invitrogen，货号为57672。pcDNA-6B载体：Invitrogen，货号为52435。pGex-4T-2载体：Invitrogen，货号为345452。pET-28a(+)载体：Invitrogen，货号为235256。pET3a载体：Novagen,货号69418-3。p3×Flag载体：Sigma,货号E7908。293T细胞（又称HEK-293细胞）：ATCC，货号CRL-1573。

兔源PA200抗体：Boston Biochem，货号为AP124。小鼠源HA抗体：Santa Cruze,货号为SC-7392。兔源H4K16ac抗体（H4K16ac代表K16位点被乙酰化的组蛋白H4）：Millipore,货号为07-329。小鼠源γ-H2AX抗体（γ-H2AX代表磷酸化的组蛋白H2AX）：Millipore，货号为05-636。赖氨酸乙酰化抗体：Cell Signalling，货号为9441L。β1抗体、β1i抗体、β2抗体、β2i抗体、β5抗体、β5i抗体、PA28α抗体、PA200抗体、Rpt4抗体、Rpn7抗体均购自BioMol。GAPDH抗体购自Santa Cruz Biotechnologies。抗泛素抗体：Zymed，货号为13-1600。H1抗体：Abcam，货号为ab62884。H2A抗体：Abcam，货号为ab18255。H4抗体：Abcam，货号为ab05-858。H2B抗体：abcam，货号为ab1790。α2抗体：BioMol，货号PW8105。PA28β抗体：BioMol,货号PW8240。PA28γ抗体：BioMol,货号PW8190。H3抗体：Abcam，货号为ab1791。

蛋白酶体抑制剂MG132：Boston Biochem，货号为I-130。曲古抑菌素A（英文缩写为TSA，是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂）：sigma,货号为T1952。甲基磺酸甲酯（MMS，引起DNA双链断裂的药物）：sigma,货号为129925。GSH-珠子：GE,货号为17-0756-01。荧光多肽底物（succinyl LLVY-7-amino-4-methylcoumarin）：Boston Biochem,货号为S-280。

大鼠抗α4s抗体：用带His标签的α4s片段免疫大鼠并收集血清；带His标签的α4s片段为α4s片段的C端与His标签的N端融合得到的融合蛋白；α4s片段为α4s蛋白自N末端第221-250位氨基酸残基；表达融合蛋白采用的出发载体为pET-28a(+)载体，外源DNA插入出发载体的EcoRI和NotI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。

大鼠抗α4抗体：用带His标签的α4片段免疫大鼠并收集血清；带His标签的α4片段为α4片段的C端与His标签的N端融合得到的融合蛋白；α4片段为α4蛋白自N末端第219-248位氨基酸残基；表达融合蛋白采用的出发载体为pET-28a(+)载体，外源DNA插入出发载体的EcoRI和NotI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。

PA200敲除小鼠：Graduate School of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba,1-1-1Tennodai,Tsukuba,Ibaraki 305-8577,Japan；PA200敲除小鼠是以C57BL/6小鼠为出发动物，通过基因打靶技术构建的，PA200/PSME4基因的外显子25和26编码三种推定的PA200亚型的保守域，基因组上的这一区域基因被含链霉素抗性的基因盒所取代。

MEF细胞：Graduate School of Life and Environmental Sciences,Universityof Tsukuba,1-1-1Tennodai,Tsukuba,Ibaraki305-8577,Japan；MEF细胞是从C57BL/6小鼠胚胎中分离得到的胚胎纤维细胞。

Mut细胞（敲除PA200基因的MEF细胞）：Graduate School of Life andEnvironmental Sciences,University of Tsukuba,1-1-1Tennodai,Tsukuba,Ibaraki305-8577,Japan；MEF细胞是从PA200敲除小鼠胚胎中分离得到的胚胎纤维细胞。

从动物组织提取纯化蛋白酶体的方法参见：Xiao-Bo Qiu,Song-Ying Ouyang,Chao-Jun Li,Shiying Miao,Linfang Wang and Alfred L Goldberg.hRpn13/ADRM1/GP110is a novel proteasome subunit that binds the deubiquitinating enzyme,UCH37.Embo J,2006;25(24):5742-5753.。从动物组织提取纯化组蛋白的方法参见：DavidShechter et.al Nature protocol.2007。

实施例中涉及的各个蛋白、多肽或亚基的序列见表1。

表1实施例中涉及的各个蛋白、多肽或亚基的序列

实施例1、PA200识别并结合乙酰化组蛋白

一、PA200和H2BK5ac的共定位

小鼠源H2BK5ac抗体的制备方法：将由GenScript（中国，南京）合成的H2BK5ac(H2BK5ac代表K5位点被乙酰化的组蛋白H2B，具有生物素标记，具体为：PEPAKacSAPAPKKGSKKAVTKA-生物素)免疫BALB/C小鼠，收集血清。

取MEF细胞或Mut细胞，用小鼠源H2BK5ac抗体（相应的二抗为山羊抗小鼠-Dylight594，红色）和兔源PA200抗体（相应的二抗为山羊抗兔-FITC，绿色）进行免疫荧光染色，DAPI染核。

照片见图1（箭头指示为每一细胞的一处定位轨迹）。在MEF细胞中，PA200抗体识别细胞核中的点状结构，H2BK5ac也出现在该区域。Mut细胞中H2BK5ac的染色强度显著大于MEF细胞。结果表明，PA200与H2BK5ac共定位且促进H2BK5ac的降解。

二、PA200和H4K16ac的共定位

重组质粒HA-PA200：以pcDNA-6B载体为骨架载体，将编码HA标签的DNA分子（AGCG TAATCTGGAACATCGTATGGGTACATAAGCTTAACTAGCCAGCTTGGGTC）插入MulI和KpnI酶切位点之间，并将序列表的序列2所示的DNA分子（开放阅读框为第57至5588位）插入KpnI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒HA-PA200；重组质粒HA-PA200可以表达N端带有HA标签的PA200蛋白。

1、用重组质粒HA-PA200转染COS-7细胞。

2、取完成步骤1的细胞，用小鼠源HA抗体（相应的二抗为山羊抗小鼠-Dylight594，红色）和兔源H4K16ac抗体（相应的二抗为山羊抗兔-FITC，绿色）进行免疫荧光染色，DAPI染核。

结果见图2（箭头显示的为转染上HA-PA200的细胞）。结果表明，HA-PA200与H4K16ac共同定位。

三、γ-电离辐射使PA200被招募至DNA损伤位点

现有技术已证实，细胞中的DNA双链断裂处组蛋白发生乙酰化。

将MEF细胞用浓度为0.3μM的TSA处理2小时，然后用⁶⁰Coγ-射线照射15分钟（1Gy/min），照射结束开始计时，分别于0、20、60和120分钟取样，用兔源PA200抗体（相应的二抗为山羊抗兔-Dylight594，红色）、小鼠源γ-H2AX抗体（相应的二抗为山羊抗小鼠-FITC，绿色）进行免疫荧光染色。将进行射线照射前的细胞作为对照。

结果见图3（箭头指示细胞中PA200和γ-H2AX的共定位，黄色）。由辐射诱导的γ-H2AX在辐射后的20分钟和60分钟时与PA200在核内共定位。结果表明，γ-射线辐射后PA200会被招募到DNA损伤位点。该发现提示，在DNA双链断裂处乙酰化作为核心组蛋白降解的标志直接被PA200所识别。

四、PA200/Blm10识别乙酰化的结构域（Blm10为PA200的酵母同源物）

通过Net SurfP预测Blm10/PA200二级结构。酵母Blm10BRD类结构域和人源的CBP结构分别来自于Blm10的晶体结构（PDB code:3L5Q）和CBP晶体结构（PDB code:2RNY）。由于PA200晶体结构还没鉴定出来，所以其BRD类结构域是通过与Blm10同源比对后得到的模型图。

图4为PA200/Blm10含非典型的BRDs。图A为强疏水的氨基酸残基的序列比对，其中包含了PA200/Blm10的BRD类结构域，而酵母源的GCN5、T2D1和人源的CBP、BDF1、TF1A为已知的BRDs。有下划线的为α-螺旋，黄色阴影为高度保守残基，红色字体为潜在的赖氨酸乙酰化识别残基。图B为人源的PA200和酵母的Blm10的BRD类结构域与人源的CBP的BRD结构域的3维结构图。

赖氨酸乙酰化结合结构域BRD通常是由四个α螺旋形成的左手螺旋束和起中间连接的两个疏水环（ZA和BC环）组成，而赖氨酸乙酰化就是锚定在这两个环的天冬氨酸（Asn）残基上。基于已经发表的Blm10晶体结构，其在氨基酸1648到1732中也含有BRD-类似域，这一结构域同样有四个类似的α螺旋和连接环上核心疏水残基（Tyr¹⁶⁶³Asn¹⁶⁶⁴/Tyr¹⁷¹⁰）。通过预测，人源的PA200在第1650至1783位氨基酸残基也有相似的区域，其中含有Phe¹⁶⁷⁶/Asn¹⁷¹⁶Phe¹⁷¹⁷。不同于典型的BRDs拥有的其它许多保守残基，PA200和Blm10的BRD类似域并没有与已知的BRDs有明显的序列上同源性。

五、PA200/Blm10的BRD类似域是否能够结合乙酰化的组蛋白

1、制备融合蛋白

表达纯化PA200-BRD-GST融合蛋白（即PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。表达纯化Blm10-BRD-GST融合蛋白（即Blm10自N末端第1648-1732位氨基酸残基组成的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。表达纯化PA200-BRD（N1716T/F1717S）-GST融合蛋白（即PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽发生N1716T/F1717S双突变后得到的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。表达纯化Blm10-BRD（Y1663H/N1664D）-GST融合蛋白（即Blm10自N末端第1648-1732位氨基酸残基组成的多肽发生Y1663H/N1664D双突变后得到的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。表达纯化NC1对照蛋白（即PA200蛋白自N末端第1296-1377位氨基酸残基组成的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。表达纯化NC2对照蛋白（即Blm10自N末端第1980-2073位氨基酸残基组成的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白）。以上各个融合蛋白即为待测融合蛋白。以上表达纯化各个融合蛋白采用的出发载体均为pGex-4T-2载体，外源DNA插入出发载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，宿主菌均为大肠杆菌BL21。

带His标签的Gcn5HAT结构域（Gcn5HAT结构域的C端与His标签的N端融合得到的融合蛋白；Gcn5HAT结构域为Gcn5蛋白自N末端第98-262位氨基酸残基）。表达融合蛋白采用的出发载体为pET-28a(+)载体，外源DNA插入出发载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。

组蛋白的制备：从兔子胸腺组织中制备纯化组蛋白。

乙酰化组蛋白的制备：在缓冲液中（溶剂为pH8.0、50mM HEPES缓冲液；溶质及其浓度如下：10%glycerol、1mM DTT、10mM丁酸钠和0.3mM acetyl-CoA），将组蛋白和带His标签的Gcn5HAT结构域30℃共孵育30分钟（组蛋白在缓冲液中的初始浓度为0.3ug/ul，带His标签的Gcn5HAT结构域在缓冲液中的初始浓度为0.02ug/ul），得到乙酰化组蛋白。

2、分别检测步骤1得到的各个融合蛋白与乙酰化组蛋白的结合能力

体系（+）：在缓冲液中，将20ul完全吸附待测融合蛋白的GSH-珠子（GSH-珠子的浓度为50g/100mL）和3微克步骤1制备的乙酰化组蛋白共孵育（4摄氏度上下颠倒混匀2小时）；

体系（-）：在缓冲液中，将20ul完全吸附待测融合蛋白的GSH-珠子（GSH-珠子的浓度为50g/100mL）和3微克步骤1制备的组蛋白共孵育（4摄氏度上下颠倒混匀2小时）；

上述体系中采用的缓冲液：溶剂为pH7.5、10mM Na-Hepes缓冲液；溶质及其浓度如下：150mM NaCl、0.005%Tween-20和2mM DTT。

共孵育完成后，取体系中的GSH-珠子，用洗涤缓冲液（溶剂为pH7.5、10mM Na-Hepes缓冲液；溶质及其浓度如下：150mM KCl、0.05%Tween-20和2mM DTT）洗去不结合蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；分别用赖氨酸乙酰化抗体（用于检测赖氨酸乙酰化Ac-H）和H2B抗体免疫印迹分析（二抗均为辣根过氧化物标记的二抗），结果见图5的Pull-down；GST蛋白和GST融合蛋白用考马斯亮蓝染色。

共孵育完成后，取体系中的上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别用赖氨酸乙酰化抗体、H2B抗体和GST抗体进行免疫印迹分析（二抗均为辣根过氧化物标记的二抗），结果见图5的input。

图5中：图A中，自左至右，第1个泳道和第2个泳道对应PA200-BRD（N1716T/F1717S）-GST融合蛋白，第3个泳道和第4个泳道对应PA200-BRD-GST融合蛋白，第5个泳道和第6个泳道对应NC1对照蛋白；图B中，自左至右，第1个泳道和第2个泳道对应NC2对照蛋白，第3个泳道和第4个泳道对应Blm10-BRD-GST融合蛋白，第5个泳道和第6个泳道对应Blm10-BRD（Y1663H/N1664D）-GST,第7个泳道和第8个泳道对应谷胱甘肽S转移酶。

PA200-BRD-GST融合蛋白可以与乙酰化组蛋白特异结合，NC1对照蛋白不能与乙酰化组蛋白特异结合，PA200-BRD（N1716T/F1717S）-GST融合蛋白不能与乙酰化组蛋白特异结合。Blm10-BRD-GST融合蛋白可以与乙酰化组蛋白特异结合，NC2对照蛋白不能与乙酰化组蛋白特异结合，Blm10-BRD（Y1663H/N1664D）-GST融合蛋白不能与乙酰化组蛋白特异结合。H2B抗体识别的蛋白大小在14kDa左右，这表明组蛋白H2B的乙酰化是BRD类似域结合所必需的。

3、PA200-BRD-GST融合蛋白与乙酰化组蛋白的结合能力

（1）从HeLa细胞中提取乙酰化的组蛋白（Extraction,purification andanalysis of histones.David Shechter et.al Nature Protocol.2007）。

（2）表达纯化带His标签的TIP60蛋白（带His标签的TIP60蛋白为TIP60蛋白自N末端第1至513位氨基酸残基组成的多肽的C端与His标签的N端融合得到的融合蛋白），采用的出发载体为pET-28a(+)载体，外源DNA插入出发载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。

（3）乙酰化组蛋白的制备

在缓冲液中（溶剂为pH8.0、50mM HEPES缓冲液；溶质及其浓度如下：10%glycerol、1mM DTT、10mM丁酸钠和0.3mM acetyl-CoA），将组蛋白和带His标签的TIP60蛋白30℃共孵育30分钟（组蛋白在缓冲液中的初始浓度为0.3ug/ul，带His标签的TIP60蛋白在缓冲液中的初始浓度为0.05ug/ul），得到乙酰化组蛋白。

（4）表达纯化组蛋白H4和H4K16R（即组蛋白H4的K16位点突变为R）采用的出发载体均为pET3a载体，外源DNA插入出发载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。

（5）制备H4K16ac

合成的H4[aa1-21]短肽序列为:SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV。而H4K16ac为短肽H4[aa1-21]的K16位点被乙酰化。

（6）分组处理

第一组：在缓冲液中，将20ul完全吸附PA200-BRD-GST融合蛋白的GSH-珠子（GSH-珠子的浓度为50g/100mL）和3微克步骤（3）制备的乙酰化组蛋白共孵育（4摄氏度上下颠倒混匀2小时）；

第二组：在缓冲液中，将20ul完全吸附PA200-BRD（N1716T/F1717S）-GST融合蛋白的GSH-珠子（GSH-珠子的浓度为50g/100mL）和3微克步骤（3）制备的乙酰化组蛋白共孵育（4摄氏度上下颠倒混匀2小时）；

第三组：在缓冲液中，将20ul完全吸附PA200-BRD-GST融合蛋白的GSH-珠子（GSH-珠子的浓度为50g/100mL）、0.5微克步骤（4）制备的组蛋白H4和3微克步骤（3）制备的乙酰化组蛋白共孵育（4摄氏度上下颠倒混匀2小时）；

第四组：在缓冲液中，将20ul完全吸附PA200-BRD-GST融合蛋白的GSH-珠子（GSH-珠子的浓度为50g/100mL）、0.5微克步骤（5）制备的H4K16ac和3微克步骤（3）制备的乙酰化组蛋白共孵育（4摄氏度上下颠倒混匀2小时）。

上述体系中采用的缓冲液的配方见步骤2。

共孵育完成后，取体系中的GSH-珠子，用洗涤缓冲液（配方见步骤2）洗去不结合蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；用兔源H4K16ac抗体进行免疫印迹分析，见图6A中的Pull-down。共孵育完成后，取体系中的上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用兔源H4K16ac抗体、小鼠源HA抗体和GST抗体进行免疫印迹分析，见图6A中的input。图6A中，自左侧的第一个泳道为第一组的结果，第二个泳道为第二组的结果，第三个泳道为第三组的结果，第四个泳道为第四组的结果。

结果表明，H4K16ac可以与PA200-BRD结合，而无法与PA200-BRD（N1716T/F1717S）结合。200倍(摩尔比)的H4和H4K16ac[aa1-21]均不能竞争从HeLa细胞中提取的H4K16ac与BRDL区域的结合。采用同样的方法，发现H4K16ac可以与Blm10-BRD结合，而无法与Blm10-BRD（Y1663H/N1664D）结合。

由于细菌表达的组蛋白缺乏大部分哺乳动物细胞中的翻译后修饰过程，步骤（5）得到H4K16ac不能与PA200-BRD结合。与此相对应的是，PA200和Blm10的BRDL区域均不能与组蛋白H4N-端只有H4K16ac修饰的多肽（H4K16ac[aa1-21]）结合。也就是说，PA200和Blm10的BRDL区域可以在体外结合乙酰化的组蛋白，但是其它的翻译后修饰可能辅助这种结合。结果见图6B，细菌表达的组蛋白H4在其K16位点被乙酰化后不能与BRDL区域结合。

实施例2、哺乳动物睾丸中两种不同类型的蛋白酶体鉴定

组蛋白在生精细胞中会大量丢失，为了寻找组蛋白降解的潜在机理，本实施例检测哺乳动物生精细胞是否拥有独特的蛋白酶体形式。

1、提取牛骨骼肌肉（muscle）的总蛋白，即为肌肉总蛋白；提取牛睾丸曲细精管的总蛋白，即为生精总蛋白。

2、将肌肉总蛋白和生精总蛋白分别进行非变性凝胶电泳，与荧光多肽底物（succinyl LLVY-7-amino-4-methylcoumarin）共孵育（共孵育时，设置两种处理，一种孵育时加入终浓度为0.02%的SDS，另一种孵育时不加入SDS；室温摇15分钟后在UV灯下观察蛋白酶体条带。

结果见图7A。肌肉蛋白酶体的SDS处理组和非SDS处理组均显示两条带，分别为两端都有调节颗粒的（19S-20S-19S）蛋白酶体和只一端有的（19S-20S）蛋白酶体。睾丸蛋白酶体的非SDS处理组也显示为两条带，一条指示为19S-20S-19S，但另一条带却处在肌肉蛋白酶体两种颗粒之间，可能为中间大小的蛋白酶体（标记为Lg，即大的睾丸特异性蛋白酶体）。睾丸蛋白酶体的SDS处理组中，一条迁移更快的条带呈现出来了（标记为Sm），这可能是因为SDS激活了20S颗粒使其打开了能让底物进入的门通道。Lg对于多肽水解呈现得比19S-20S-19S更强，表明在牛睾丸生精细胞中Lg呈现为降解这一底物的主要活性。从大鼠睾丸中得到的生精蛋白酶体和从C57BL/6小鼠睾丸中得到的生精蛋白酶体的结果与图7A一致。

2、从肌肉总蛋白中通过甘油梯度法纯化26S颗粒。从生精总蛋白中通过甘油梯度法纯化Lg和Sm。纯化的各个颗粒分别进行非变性凝胶电泳，方法同步骤1。

结果见图7B。Sm形式的蛋白酶体迁移要比典型的20S颗粒慢。

3、分别从凝胶中回收肌肉总蛋白中的蛋白酶体（肌肉蛋白酶体）和生精总蛋白中的蛋白酶体（生精蛋白酶体），进行变性凝胶电泳，结果见图7C。生精蛋白酶体中的亚基的分布形式大体上与肌肉蛋白酶体中的亚基形式相似，但是所有的20S亚基水平呈现的明显比19S亚基的要高，另外生精蛋白酶体中存在一个200kDa左右的明显条带（标注为X）。

4、分别将肌肉蛋白酶体和生精蛋白酶体进行负染电镜（EM）扫描。

采用甲酸双氧铀对样品进行负染，在Tecnai T20电镜下观察，操作电压是120kV放大倍数是5千倍。通过1.5μm聚焦的Gatan4Kx4K UltraScan CCD照相机拍摄成像。所有图像二进制至像素最终大小是/pixel。通过WEB手动选择蛋白酶体调节颗粒，通过SPIDER进行图像处理（Frank et al.,1996）。蛋白酶体被窗口化至90x90像素图像中，通过多参数比对处理，规划等级方案为25个等级，之后将相同类型颗粒重新组合成最后的5个等级。选择只有20S颗粒与调节颗粒结合的侧视图进行图像处理，而游离的20S无任何调节颗粒结合的将不被选择做多参数比对和分级。绝大多数的蛋白酶体含任何一种调节颗粒基本看上去都是侧面图，所以，每一等级中蛋白酶体数量就代表着样品中该类型蛋白酶体的相应比率。

结果见图7D。在生精蛋白酶体和肌肉蛋白酶体中均有五种不同类型的蛋白酶体存在。前两种为典型的26S蛋白酶体，其20S颗粒的一末端或两末端拥有19S颗粒，另外三种在20S末端含有一个或两个比较小的结构，类似于PA200或其同源物Blm10，但不同于含PA28的复合物。生精蛋白酶体中大约90%为形似PA200的小结构类型。相比之下，这种形式在肌肉蛋白酶体中大概只有8%。因此，生精蛋白酶体中的Lg和Sm含有PA200。

5、分别将生精蛋白酶体和肌肉蛋白酶体采用甘油梯度纯化，收集各个组分并进行非变性凝胶电泳，将每条带逐一切出来，通过MALDI-TOF采用Applied BiosystemsVoyager-DE-STR系统对蛋白样品进行质谱分析，结果见表1。发现生精蛋白酶体除了具有肌肉20S颗粒中典型的亚基（α1-7和β1-7）外，其20S和Sm中分别检测到免疫蛋白酶体催化亚基(β1i,β2i和β5i)。生精蛋白酶体20S、Sm、26S和Lg中都能检测到PA200和一种新型亚基α4s，而肌肉蛋白酶体的20S和26S中都没检测到PA200和α4s。α4s与现有的α4/PSMA7有82%的相似性，特异存在于所有形式的生精蛋白酶体。

表1质谱分析结果

*表示不能被western blot实验证实。

哺乳动物26S蛋白酶体由20S核心复合物和19S调节复合物组成，具有19S-20S-19S和19S-20S两种存在形式。19S调节复合物包含有6个ATP酶亚基（Rpt）和13个非ATP酶亚基（Rpn及UCH37）。20S核心复合物是由两个α环（每个环由α1-α7共7个亚基组成）和两个β环（每个环由β1-β7共7个亚基组成）垒叠形成中空的桶状结构。

哺乳动物睾丸组织特异的生精蛋白酶体由20S核心复合物和19S调节复合物和PA200调节颗粒组成，具有19S-20S-PA200（大的生精蛋白酶体，Lg)和20S-PA200（小的生精蛋白酶体，Sm）两种存在形式。20S核心复合物的α环上除了含有通常的α4外，还含精细胞特有的α4s亚基。20S-PA200的β环上除了含有通常的催化亚基β1、β2和β5外，还含有免疫蛋白酶体催化亚基β1i、β2i和β5i。

哺乳动物蛋白酶体组成亚基几乎完全一致，本发明采用的材料有小鼠、大鼠、兔子、牛的组织，以及人的精子和精细胞。

大的生精蛋白酶体由35种蛋白（包括α1-α7、α4s、β1-β7、Rpt1-Rpt6、Rpn1-3、Rpn5-13、UCH37和PA200）形成的48个亚基组成。小的生精蛋白酶体由19种蛋白（包括α1-α7、α4s、β1-β7、β1i、β2i、β5i和PA200）形成的29个亚基组成。

6、分别将C57BL/6小鼠的睾丸和附睾的石蜡切片进行免疫组化分析，采用的一抗分别为大鼠抗α4s抗体或大鼠抗α4抗体，一抗孵育后用IHC试剂盒检测（北京，中杉金桥），阳性细胞通过3,4,3’,4’-四氨基联苯（DAB）可显色（棕色），接着用核苏木精（蓝色）复染，显微镜下拍摄图片。结果见图7F（抗原抗体复合物被染为棕色，细胞核为蓝色；实心箭头标注精母细胞，空心箭头标注圆形精细胞，空心三角标注长形精细胞，实心三角标注精子）。免疫组化分析显示α4s蛋白特异性存在精细胞和精子中。

实施例3、生精蛋白酶体中的特有亚基和活性

1、C2C12成肌细胞、TM3睾丸间质细胞、TM4睾丸支持细胞、小鼠GC-1spg B型精原细胞（简称GC1细胞）、小鼠GC-2spd（ts）型精母细胞（简称GC2细胞）、精子（sperm）、睾丸组织(testis)、脾脏组织(spleen)，分别提取总蛋白并进行SDS-PAGE电泳和免疫印记分析。以上各个细胞均购自美国模式培养物集存库。以上各个组织均为BALB/C小鼠的组织。免疫印迹采用的一抗分别为大鼠抗α4s抗体、大鼠抗α4抗体、β1i抗体、β1抗体、β2i抗体、β2抗体、β5i抗体、β5抗体、PA28α抗体、PA200抗体、Rpt4抗体、Rpn7抗体和GAPDH抗体。

结果见图8A。α4s和β2i只能在支持细胞和精母细胞中检测到，而β5i、PA200、19S亚基（如Rpt2、Rpt4和Rpn7）和PA28α在所有细胞系中都有表达。β1i、β2i和β5i大量存在于睾丸和脾脏中，但不存在于C2C12成肌细胞中。PA200、β1i和β5i（与Rpt4、β1、β2和β5一样）都能在精母细胞或者睾丸提取物的蛋白酶体中检测到。

2、取BALB/C小鼠的睾丸组织、肌肉组织、脾脏组织，分别提取总蛋白并进行SDS-PAGE电泳和免疫印记分析。免疫印迹采用的一抗分别为大鼠抗α4s抗体、大鼠抗α4抗体、α2抗体、β1i抗体、β1抗体、β2i抗体、β2抗体、β5i抗体、β5抗体、PA28α抗体、PA28β抗体、PA28γ抗体、PA200抗体、Rpt4抗体、Rpn7抗体、Rpt13抗体和GAPDH抗体。结果见图8B。α4s,β1i,β5i和PA200都能在纯化的睾丸蛋白酶体中检测到，但没有β2i。而11S蛋白酶体激活因子PA28α和PA28β也都存在，但蛋白水平很低。

3、从BALB/C小鼠睾丸（Te）、骨骼肌肉（Mu）和脾脏（Sp）中提取纯化蛋白酶体，分别进行非变性凝胶电泳，考马斯亮蓝染色和免疫印记分析，Lg和Sm分别指示大分子量和小分子量的睾丸特异性蛋白酶体。免疫印迹采用的一抗分别为β2i抗体、β2抗体、β5i抗体、β5抗体、PA200抗体、Rpt2抗体。结果见图8C。肌肉中的26S蛋白酶体主要是数量相当的19S-20S-19S和20S-19S，而从脾脏中得到的蛋白酶体（免疫蛋白酶体）主要为一端有调节颗粒的和少量的两端都有调节颗粒的蛋白酶体结构。相比之下，从睾丸中纯化的蛋白酶体大部分包含PA200和呈现在两个26S条带之间的条带（Lg）和少量19S-20S-19S颗粒。19S复合物的存在可通过Rpt2免疫印记来确定。β2i和β5i存在于睾丸和脾脏中的蛋白酶体，而不存在肌肉蛋白酶体中，肌肉蛋白酶体主要包含β2和β5。因此，睾丸特异性蛋白酶体很明显含有PA200，免疫蛋白酶体催化亚基和新型的α亚基（α4s）。

4、分别从牛的肌肉组织、睾丸组织和脾脏组织中提取总蛋白酶体，与[¹²⁵I]标记的小牛核心组蛋白（从sigma公司购买）共孵育[体系：20mM Heps(PH7.5）,0.5mM EDTA,5mMMgCl₂,2mM ATP,1mM DTT；孵育0、15、30或60分钟；小牛核心组蛋白与蛋白酶体的比例为3.75μM：0.4μg/ml]，定时取样，进行SDS-PAGE并通过磷屏成像分析。相对水平值显示在条带下面。至少重复3次独立实验得到相似的结果。结果见图8D。三种蛋白酶体形式降解该底物的速率都相似。

5、蛋白酶体降解多泛素化RNF5的能力

表达纯化Flag-RNF5融合蛋白（即将RNF5蛋白的C端与Flag标签的N端融合得到的融合蛋白），采用的出发载体为p3×Flag，外源DNA插入出发载体的NotI和KpnI酶切位点之间，宿主细胞为293T细胞。RNF5是一种泛素连接酶，能形成K48泛素化链从而催化其底物通过蛋白酶体降解。

将化Flag-RNF5融合蛋白进行体外泛素化，得到多泛素化形式的RNF5[RNF5-(Ub)_n]。泛素化采用的缓冲液：20mM Tris.HCl,pH7.5,20mM KCl,5mM MgCl2,1mM DTT,4mMATP,0.1ug/ul Ub。30℃孵育90分钟。

分别从牛的肌肉组织、睾丸组织和脾脏组织中提取总蛋白酶体。多泛素化形式的RNF5[RNF5-(Ub)_n]（0.6ug）与蛋白酶体(0.4μg/ml)孵育（孵育采用的缓冲液体系：溶剂为pH7.5、50mM的Tris缓冲液，含0.5mM EDTA、5mM MgCl₂、2mM ATP和1mM DTT）一定的时间点后采用抗泛素抗体进行免疫印记分析。结果见图8E。相比于肌肉和脾脏中的蛋白酶体，睾丸特异性蛋白酶体不能有效地降解多泛素化的RNF5。

为排除底物特异性，采用另一种多泛素化底物进行上述实验。Nrdp1也是一种泛素连接酶，其氨基酸序列如ACCESSION NO.NP_001229755.1（linear PRI10-FEB-2013，GI:338827618）所示。方法完全同上。结果与RNF5的结果一致。

实施例4、小鼠PA200的敲除减缓了长形精细胞中核心组蛋白的降解

一、PA200的敲除增加了睾丸中细胞凋亡速率

分别制作15周龄C57BL/6小鼠（WT）和PA200敲除小鼠(Mut)的睾丸石蜡切片（曲细精管切面），采用DeadEndTM TUNEL荧光法检测系统通过荧光素（绿色）检测凋亡的细胞，通过DAPI（蓝色）检测细胞核细胞核。睾丸中凋亡分析采用DeadEndTM TUNEL荧光法检测系统按照标准的石蜡包埋切片步骤操作（Promega）。结果见图9A。在C57BL/6小鼠的曲细精管中只有极少量的凋亡细胞（通常＜5），但在PA200敲除小鼠的曲细精管中存在相对较多的凋亡细胞（通常＞5）。与已有的报道一致，PA200敲除显著增加了睾丸中细胞凋亡而且降低了雄性小鼠的生育能力，但是并没有引起小鼠其它明显的表型变化。

二、PA200的敲除导致长形精细胞中核心组蛋白的积累

分别制作15周龄C57BL/6小鼠（WT）和PA200敲除小鼠(Mut)的睾丸石蜡切片，用苏木精（haematoxylin）染细胞核（蓝色），用针对各种组蛋白的抗体染组蛋白（棕色）。结果见图9B。实心箭头标注的为精母细胞，空心箭头标注的为圆形精细胞，空心三角标注的为长形精细胞。小鼠中精子分化进程包括16个时期。C57BL/6小鼠中核心组蛋白H2B和H3是在长形精细胞分化的早期（精子发生的第9期）消失。而在PA200敲除小鼠中，核心组蛋白H2B和H3却在精子延长的后期（11期）仍然能检测到。C57BL/6小鼠和PA200敲除小鼠中，核心组蛋白H2B和H3在长形精细胞中最后都会丢失而形成完全浓缩的染色质（如15-16期）。相比之下，PA200的敲除并没有阻碍长形精细胞中连接组蛋白H1的消失，也没有减少睾丸中大部分双倍体细胞其相应的水平。

三、PA200敲除增加了睾丸可溶提取物中核心组蛋白的水平

裂解缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为25mM Tris缓冲液（pH7.5）,溶质及其浓度如下：150mM NaCl、10%glycerol、5mM MgCl₂、1mM PMSF和5mM ATP。组蛋白通常是被包裹在染色质中，可以通过高盐或酸条件提取。

在裂解缓冲液中分别研磨C57BL/6小鼠和PA200敲除小鼠的睾丸组织，然后依次进行SDS凝胶电泳和免疫印记分析。结果见图9C，星号指示的是与20S颗粒形成复合物的多肽。PA200的敲除明显地增加了可溶性睾丸提取物中核心组蛋白H2A、H2B和H3的水平，而急剧地降低了H1的水平。

四、PA200的敲除明显地增加了可溶性睾丸提取物中核心组蛋白H2A、H2B和H3的水平，而急剧地降低了H1的水平。

已知在长形精细胞中核心组蛋白被移除之前组蛋白H4的K16位点被乙酰化。

分别制作15周龄C57BL/6小鼠（WT）和PA200敲除小鼠(Mut)的睾丸石蜡切片，用苏木精（haematoxylin）染细胞核（蓝色），用兔源H4K16ac抗体染组蛋白（棕色）。结果见图9D。实心箭头标注的为精母细胞，空心箭头标注的为圆形精细胞，空心三角标注的为长形精细胞。PA200的敲除提升了圆形精细胞和长形精细胞中H4K16ac的水平。因此，PA200能够促使长形精细胞中核心组蛋白的选择性清除（特别是乙酰化的形式）。S9、S11和S15-16均代表相应精子发生时期。

以上步骤一至步骤四的结果表明，在体内生精蛋白酶体能特异性地降解组蛋白，精子发生过程中PA200为组蛋白替换所必须。

实施例5、含PA200/Blm10的蛋白酶体选择性降解乙酰化的核心组蛋白

长形精细胞中延迟移除的组蛋白或者DSB位点释放的组蛋白就像是异常过表达的组蛋白，这在酵母中会引起过量组蛋白的积累，细胞中过量的组蛋白游离会导致基因组不稳定。所以在芽殖酵母中诱导过表达带FLAG标签的核心组蛋白，来研究Blm10/PA200调节核心组蛋白的降解机制。

Blm10通过其BRD类结构域介导过表达的H3降解。野生型菌株BY4741（WT）和突变体携带质粒pHHF1-Gal-10/1-FLAG-HHT1，编码半乳糖诱导的FLAG-H3用于组蛋白降解分析。Rpn13、Rpn4敲除菌株和HA-Blm10过表达（Blm10O/E）菌株作为对照，GAPDH作为上样量对照。组蛋白的相应水平是以上样量标准化后得到。不同于敲除19S亚基Rpn13、Rpn4、Blm10的敲除阻抑了过表达的组蛋白H3的降解（图10A）。过表达带HA标签的Blm10却没有加快FLAG-H3的降解（图9A），表明用于降解过量的组蛋白的正常内源的Blm10是足够的。进一步研究发现，Blm10的BRD类似域的点突变（Y1663H/N1664D）或截短（Blm10△C）都能稳定FLAG-H3蛋白水平（图10A）。

Blm10敲除稳定了过表达的H2B和H4。野生型菌株BY4741（WT）和突变体携带诱导表达的H2B和H4，其构建和分析同上。同样地，敲掉Blm10也阻抑了过表达的带FLAG标签组蛋白H2B和H4的降解（图10B）。

Blm10敲除对于Ub-R-GFP不影响。野生型和突变体携带半乳糖诱导表达的C端his标签的Ub-R-GFP质粒,用于降解分析同上。与敲除Rpn4和Rpn13不同，敲掉Blm10并不影响N-末端规则底物-ub-R-GFP(绿色荧光蛋白)的泛素化依赖性降解(图10C)。

从牛睾丸中纯化PA200蛋白的方法参见：Qiu et al.,2006;Ustrull et al.2005。

从牛肌肉中纯化得到20S颗粒的方法参见：Xiao-Bo Qiu,Song-Ying Ouyang,Chao-Jun Li,Shiying Miao,Linfang Wang and Alfred L Goldberg.hRpn13/ADRM1/GP110is a novel proteasome subunit that binds the deubiquitinating enzyme,UCH37.Embo J,2006;25(24):5742-5753。

组蛋白的制备：从兔子胸腺组织中提取纯化组蛋白。

乙酰化组蛋白的制备方法同实施例1的步骤五的1。

在缓冲液（pH7.5、20mM HEPES缓冲液,含0.5mM EDTA、5mM MgCl₂、2mM ATP和1mMDTT）中，进行如下两组孵育处理：

第一组：将底物和20S颗粒共孵育，其中20S颗粒的初始浓度为4ng/μl，底物的初始浓度为40ng/μl；

第二组：将底物、20S颗粒和PA200蛋白共孵育，其中20S颗粒的初始浓度为4ng/μl，PA200蛋白的初始浓度为15ng/μl，底物的初始浓度为40ng/μl；

底物为乙酰化组蛋白（Ac-H）、组蛋白（用H2B检测）或实施例3的步骤5制备得到的多泛素化形式的RNF5[RNF5-(Ub)_n]。底物为乙酰化组蛋白时，增设一个加入MG132(初始浓度为10μM)的组别。

分别于0min、10min、20min和30min后取样，进行免疫印记分析。

结果见图10D。PA200在没有ATP的情况下能够明显加快20S颗粒降解乙酰化的核心组蛋白（蛋白酶体抑制剂MG132能阻断这一降解过程，说明这一观察到的结果不是简单的去乙酰化过程）。相比之下，PA200对无修饰的H2B降解影响很小，而基本上没有对多泛素化的RNF5降解有作用。PA200特异性加快乙酰化核心组蛋白降解。

因此，PA200/Blm10能够直接靶定乙酰化的核心组蛋白进行无需ATP和多泛素化的蛋白酶体降解进程。

实施例6、体细胞DNA损伤时PA200/Blm10是核心组蛋白乙酰化相关降解必需的

在长形精细胞中DNA双链断裂（DSBs）处组蛋白乙酰化发生于组蛋白移除之前，故本实施例研究在DSBs处乙酰化是否促进了组蛋白的降解。

一、TSA和离子辐射一起处理减少了核心组蛋白的水平

实验组：小鼠GC-2spd（ts）型精母细胞用浓度为0.3μM的TSA处理2小时，然后用⁶⁰Coγ-射线照射15分钟（1Gy/min），照射结束开始计时，分别于0、20、60和120分钟取样；

对照组：小鼠GC-2spd（ts）型精母细胞用⁶⁰Coγ-射线照射15分钟（1Gy/min），照射结束开始计时，分别于0、20、60和120分钟取样；

将各次取样的细胞样本进行细胞裂解后进行免疫印迹分析。β-actin作为各个组蛋白的对照。H2B和H4水平用条带密度测定定量（用对照上样量标准化）。

结果见图11A。用γ-离子辐射诱导GC-2spd精母细胞株的DSBs，其标志物为组蛋白H2AX的磷酸化（γ-H2AX），基本上不影响核心组蛋白的水平。然而，加入TSA时，H4K16乙酰化水平明显增加，同时，γ-离子辐射致使在辐射释放后的20分钟和60分钟时非乙酰化的组蛋白H2B和H4水平急剧降低。而在释放后的120分钟，H2B和H4水平显著回升，这是因为细胞从DNA损伤中恢复。

二、TSA和MMS处理一起处理减少了核心组蛋白的水平

实验组：小鼠GC-2spd（ts）型精母细胞用不同浓度（0、0.1、0.3、0.5μM）的TSA和不同浓度（0、0.1、0.3、0.5μM）的MMS处理4小时后取样；

对照组：小鼠GC-2spd（ts）型精母细胞用不同浓度（0、0.1、0.3、0.5μM）的TSA处理4小时后取样；

结果见图11B，GC-2spd细胞用TSA和MMS同时处理，也使得组蛋白H2B和H4水平明显降低。

三、电离辐射和TSA处理降低了MEF细胞的核心组蛋白水平，但在PA200敲除细胞中不影响。

将MEF细胞和Mut细胞分别进行步骤一的实验，结果见图11C。在MEF细胞中，共同使用TSA和γ-离子辐射致使H2B和H4水平在辐射后的20分钟和60分钟时大量减少。相比而言，在PA200敲除的小鼠成纤维MEF细胞中，同样的处理却基本上不影响核心组蛋白的水平。既然在DNA复制时核心组蛋白是半保留复制，那么在辐射后的仅仅20分钟（相比于MEF细胞的大约24小时代时）内组蛋白大量丢失必然是由这些蛋白的快速降解造成的而不是因为在DNA复制时转录或翻译水平的降低。所以，在DNA双链断裂的应激中，PA200为核心组蛋白的乙酰化相关降解所必需。PA200抗体也显示了一条非特异的130kDa条带。

四、双倍体酵母细胞用MMS处理导致其核心组蛋白乙酰化和Blm10依赖性降解。

野生型（WT）和Blm10敲除的(Blm10△)双倍体芽殖酵母用MMS和/或VPA以及有或无MG132（10μM）处理一定的时间点。用SDS样品缓冲液裂解后，免疫印记分析H2B和GAPDH水平。

结果见图11D。进一步探测PA200酵母中的同源物Blm10在DSBs反应过程中对组蛋白降解起的作用。双倍体酵母菌株中，用MMS和HDAC抑制剂2-丙基戊酸（VPA）一起处理，也急剧减少了核心组蛋白H2B的水平。加上蛋白酶体抑制剂MG132处理，或者Blm10敲除都会阻断其减少。

五、Blm10为单倍体酵母DNA损伤过程中乙酰化介导的核心组蛋白降解所必需。

通过在含野生型或突变型Blm10的单倍体酵母(SY653)中用半乳糖(Gal)替换培养基中的葡萄糖诱导由半乳糖诱导的启动子控制的HO内切酶，然后western检测组蛋白H2B的水平。

结果见图11E。为证实DNA双链断裂在这一过程中的作用,由半乳糖诱导的启动子控制的可切割DNA的HO内切酶被导入单倍体酵母。随着HO内切酶的诱导，VPA大大减少了H2B的水平，并且这一效果可被MG132处理或Blm10基因敲除所阻断。

六、Blm10基因敲除可部分保护酵母免受HDAC抑制和DNA损伤的影响。

单倍体酵母按照一定的梯度比例稀释后接种在含葡萄糖（Control）或半乳糖(Gal)的完全平板培养基中，经VPA处理后，于30°C培养2天后观测细胞存活状况。

结果见图11F。同时，HO内切的诱导和VPA处理也导致了酵母生长的剧烈下降，但Blm10基因敲除可部分拯救这些酵母。这样，DNA双链断裂与HDAC抑制剂相结合各促进核心组蛋白乙酰化和降解，而在单倍体和双倍体酵母及哺乳动物体细胞中，PA200/Blm10为乙酰化介导的核心组蛋白降解所必需。

实施例7、模式图

综合实施例1至实施例6，发现了乙酰化调控核心组蛋白降解的模式图，分别为如下(A)和（B），参见图12：

（A）精子发生过程中，核心组蛋白由生精蛋白酶体（spermatoproteasomes）降解。在单倍体精细胞延长期，PA200非典型的BRD识别核小体中乙酰化的核心组蛋白，后从核小体中分开，导致了核心组蛋白降解成小肽。同时TP蛋白被招募到染色体上，最后由精蛋白取代。

（B）体细胞DNA修复和组蛋白降解的关联。DNA双链断裂激活了核心组蛋白的乙酰化。乙酰化的核心组蛋白被靶定和释放使得DNA修复蛋白固定到损伤的DNA上。同时乙酰化的核心组蛋白由含PA200/Blm10的蛋白酶体降解。随着损伤DNA的修复，新合成的核心蛋白结合DNA重新组成核小体。

Claims

1.哺乳动物的生精蛋白酶体，由20S核心复合物、19S调节复合物和PA200调节颗粒组成；所述20S核心复合物中存在免疫蛋白酶体的β亚基和α4s亚基；所述20S核心复合物中存在的免疫蛋白酶体的β亚基为β1i，β2i和β5i；

所述α4s亚基为由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.含有PA200/Blm10的蛋白酶体在制备产品中的应用；所述含有PA200/Blm10的蛋白酶体为权利要求1所述的生精蛋白酶体；所述产品的功能为如下(1)和(2)中的至少一种：

(1)结合乙酰化蛋白质；

(2)促进精子发生和体细胞DNA损伤修复过程中乙酰化蛋白质降解。

3.含有PA200/Blm10的蛋白酶体中的PA200/Blm10蛋白的BRD类似域在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(3)和/或(4)：

(3)结合乙酰化蛋白质；

(4)促进乙酰化蛋白质降解；

所述BRD类似域为PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽。

4.权利要求1所述的生精蛋白酶体在抑制精细胞或精子中组蛋白积累中的应用；所述应用为非疾病诊断治疗应用。

5.权利要求1所述的生精蛋白酶体在促进精细胞或精子中组蛋白降解中的应用；

所述应用为非疾病诊断治疗应用。

6.权利要求1所述的生精蛋白酶体在制备产品中的应用；所述产品的功能为降解乙酰化的蛋白质。

7.去乙酰化酶抑制剂和DNA双链断裂诱导剂在制备促进组蛋白通过含有PA200/Blm10的蛋白酶体降解的抗睾丸肿瘤产品中的应用；所述含有PA200/Blm10的蛋白酶体为权利要求1所述的生精蛋白酶体；

所述去乙酰化酶抑制剂为TSA；所述DNA双链断裂诱导剂为MMS或γ-射线；

所述组蛋白为H2B和/或H4。

8.去乙酰化酶抑制剂和产生γ-射线的仪器在制备促进组蛋白通过含有PA200/Blm10的蛋白酶体降解的抗睾丸肿瘤产品中的应用；

所述含有PA200/Blm10的蛋白酶体为权利要求1所述的生精蛋白酶体；

所述去乙酰化酶抑制剂为TSA；所述组蛋白为H2B和/或H4。