CN107308167B - 可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用，所述化合物为SGC‑CBP30，其特异靶向TbBDF5，特别是其第一个乙酰化赖氨酸结合结构域，并且与TbBDF5的第一个乙酰化赖氨酸结合结构域(BD1)的亲和力高，高效地杀伤布氏锥虫。

Description

可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及可杀伤布氏锥虫的化合物，包含所述化合物的药物组合物，及其在制备治疗锥虫病的药物方面的用途。本发明的的化合物可以作为治疗非洲锥虫病药物的前体分子进行开发或可直接用于锥虫病治疗。
背景技术
布氏锥虫是一种单细胞的真核寄生生物，包括布氏布氏锥虫、冈比亚布氏锥虫、罗德西亚布氏锥虫三个亚种，可以通过虫媒采采蝇感染人和其他动物，引起人的嗜睡病(sleeping sickness)和动物的拿干拿病(nagana disease)，统称非洲锥虫病。人感染布氏锥虫后如果缺乏及时治疗，在感染晚期具有很高的死亡率。目前用于治疗非洲锥虫病的药物容易产生耐药性，并且具有很强的副作用，因此迫切需要开发新的药物来克服这些困难。
对布氏锥虫等寄生生物表观遗传机制的研究显示多个与染色质有关的蛋白因子能够影响布氏锥虫的转录1，而包括组蛋白修饰在内的染色体标签可直接参与基因转录起始和终止的调控。先前的研究报道布氏锥虫基因表达调控主要是转录后水平上进行，但近年来布氏锥虫中各类转录因子的发现暗示了布氏锥虫具有较为复杂的转录水平的调节方式，表观遗传就是这样一个调节方式。研究布氏锥虫的表观遗传学调控将为本发明人了解布氏锥虫转录调控，致病机理以及寻找治疗锥虫病的策略提供重要线索。
乙酰化赖氨酸结合结构域(bromodomain)是表观遗传调控过程中的重要蛋白结构域元件，在真核细胞的转录过程以及DNA损伤修复等过程中具有重要作用，鉴于这个结构域的重要性，目前已有很多针对乙酰化赖氨酸结合结构域的特异性抑制剂被开发出来，已有一些已经在美国开展癌症方面的临床试验。TbBDF5在布氏锥虫表面糖蛋白的表达调控中占有重要作用的含有bromodomain的蛋白，能够作为治疗锥虫病的靶标2。
目前化合物I-BET151作为乙酰化赖氨酸结合结构域抑制剂已经被用于治疗非洲锥虫病的研究中2，但存在特异性差、亲和力低、机制不明确等缺点。因此急需寻找一种靶向特异性强，对哺乳动物等宿主低毒的小分子化合物。
发明内容
本发明通过计算机模拟筛选和实验验证的方法发现了化合物 SGC-CBP30是TbBDF5-BD1(TbBDF5的第一个乙酰化赖氨酸结合结构域) 的特异性抑制剂。化合物SGC-CBP30的分子式为：
Figure BDA0001359766930000021
本发明人发现化合物SGC-CBP30能在较低浓度杀伤布氏锥虫。
化合物SGC-CBP30在治疗非洲锥虫病中的应用机制在于：通过蛋白质结构分析和核磁化学微扰实验发现，SGC-CBP30能高效结合TbBDF5-BD1结合KAc的位点，从而抑制TbBDF5与H4K10Ac的结合；浓度为10～30μM的SGC-CBP30处理427细胞，24～72小时可引起427细胞生长抑制，并出现细胞死亡。
本发明人还发现化合物SGC-CBP30能够长效阻断TbBDF5-BD1与 H4K10Ac的结合，并且具有较强的阻断作用。
由此，本发明一方面提供化合物SGC-CBP30在制备药物中的用途，所述药物用于杀伤锥虫。
在优选的是实施方案中，所述锥虫是布氏锥虫。
本发明另一方面提供化合物SGC-CBP30在制备药物中的用途，所述药物用于治疗锥虫病。
在优选的实施方案中，所述锥虫病是非洲锥虫病。
在优选的实施方案中，所述锥虫病包括嗜睡病(sleeping sickness)和拿干拿病(nagana disease)。
本发明的另一方面提供化合物SGC-CBP30在制备药物中的用途，所述药物用于抑制TbBDF5的功能，特别是TbBDF5-BD1。
TbBDF5包含两个乙酰化赖氨酸结合结构域和一个无序的氮端， TbBDF5-BD1表示TbBDF5的第一个乙酰化赖氨酸结合结构域。
在本发明中，TbBDF5蛋白是本领域技术人员已知的蛋白，存在于非洲锥虫中，其蛋白数据库Uniprot编号为Q382J7。
在优选的实施方案中，所述化合物SGC-CBP30以低浓度施用。
在优选的实施方案中，所述化合物SGC-CBP30的浓度为10～30μM。
本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含化合物SGC-CBP30和药用载体，所述药物组合物用于治疗杀伤锥虫、治疗锥虫病或治疗锥虫病。
根据本发明，化合物SGC-CBP30特异靶向TbBDF5，特别是 TbBDF5-BD1，与TbBDF5-BD1亲和力高，抑制机制清楚，并且具有高效的杀伤布氏锥虫的能力，可作为制备治疗非洲锥虫病的药物。
附图说明
图1TbBDF5-BD1结合H4K4KAc和H4K10Ac
核磁化学微扰实验显示TbBDF5-BD1结合H4K4KAc(A)和H4K10Ac(B)。发生明显化学位移的氨基被标记到了右边，蛋白与小肽的浓度比分别为 1∶0；1∶5；1∶10，箭头表示谱峰漂移方向。
图2SGC-CBP30特异性结合TbBDF5-BD1
SGC-CBP30只结合TbBDF5-BD1(A)，不结合TbBDF5第二个 bromodomain(B)和TbBDF2(布氏锥虫中另外一个结合组蛋白乙酰化的蛋白)的bromodomain。B，C作为阴性对照。
图3SGC-CBP30抑制TbBDF5-BD1结合H4K10Ac
A核磁化学微扰实验显示H4K10Ac(上)和SGC-CBP30(下)都结合到 TbBDF5-BD1的KAc结合区域。
B等温滴定微量热实验。H4K10AC小肽分别滴定TbBDF5-BD1(上)和 TbBDF5-BD1-SGC-CBP30的混合物(下，混合物前后两者浓度比为1∶5)。结果证实了SGC-CBP30对TbBDF5-BD1的阻断作用。
图4SGC-CBP30对细胞生长的影响
A不同浓度的SGC-CBP30对细胞生长的影响。
B刃天青(Resazurin)染色法测量SGC-CBP30对细胞的影响。用不同浓度的SGC-CBP30处理细胞72小时后加入刃天青(终浓度22.88mg/ml) 孵育6小时，再用spectra MAXgemini EM检测。最后数据用OriginPro 8.0 处理。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从生工生物工程(上海)股份有限公司购得。
前循环型布氏锥虫427细胞系(下文也称为“427细胞”)来自University ofTexas-Houston李子银教授实验室。小分子抑制剂购自APExBIO Technology，Houston，USA，所有的乙酰化小肽均在吉尔生化(上海)有限公司合成。
实施例1化合物SGC-CBP30抑制TbBDF5-BD1与H4K10Ac的结合
(一)TbBDF5-BD1与H4K4Ac和H4K10Ac结合
根据文献介绍3，4，本发明人合成了布氏锥虫组蛋白乙酰化小肽库，通过核磁化学微扰实验5筛选发现，TbBDF5-BD1(把TbBDF5表达基因 1-369bp的表达框克隆到pET22载体中，用BL21表达得到目的蛋白)与 H4K4Ac和H4K10Ac小肽结合，如图1。具体的来说，不同浓度的小肽滴定浓度为0.3M的TbBDF5-BD1，得到不同浓度比条件下的1H，15N-HSQC，最终把不同浓度比的1H，15N-HSQC重叠就可以观察到发生化学位移的氨基酸。乙酰化小肽序列如下所示：其中乙酰化的K用下划线表示。
H2A-K4Ac：ATPKQAVKKAS(SEQ ID NO：1)
H2B-K4Ac：ATPKSTPAKTR(SEQ ID NO：2)
H2B-K12Ac：AKTRKEAKKTR(SEQ ID NO：3)
H2B-K16Ac：KEAKKTRRQRK(SEQ ID NO：4)
H3-K23Ac：SKKASKGSDAAS(SEQ ID NO：5)
H4-K2Ac：AKGKKSGEAK(SEQ ID NO：6)
H4-K4Ac：AKGKKSGEAK(SEQ ID NO：7)
H4-K10Ac：SGEAKGSQKR(SEQ ID NO：8)
H4-K14Ac：AKGSQKRQKK(SEQ ID NO：9)
(二)化合物SGC-CBP30特异性结合TbBDF5-BD1
本发明人解析了TbBDF5-BD的核磁溶液结构(蛋白数据库PBD的检索号：5wqz)，并利用软件PYRX对常用的bromodomian抑制剂进行模拟筛选，结合等温滴定微量热实验6，最后确定SGC-CBP30特异性结合 TbBDF5-BD1(Kd＝13.8μM)，见图2。PYRX软件使用见http：// pyrx.sourceforge.net/。等温滴定微量热实验：每隔120s滴定1.8μL 0.10mM的蛋白到0.05mM SGC-CBP30中，共滴定20次。
(三)化合物SGC-CBP30抑制TbBDF5-BD1与H4K10Ac的结合
H4K10Ac小肽和化合物SGC-CBP30分别对TbBDF5-BD进行核磁滴定，其中蛋白浓度为0.3mM，小肽和化合物对蛋白的浓度比分别为1∶10 和1∶5。最后通过公式
Figure BDA0001359766930000051
计算统计得到化学位移变化，发现H4K10Ac和化合物SGC-CBP30都可以结合到TbBDF-BD1 的KAc(乙酰化赖氨酸)结合区域，见图3A。
根据以上结果，本发明人利用等温滴定微量热仪实施了化合物 SGC-CBP30和H4K10Ac小肽的竞争性结合实验。在同样的DMSO浓度的条件下，分别进行了H4K10Ac滴定TbBDF5-BD1和 TbBDF5-BD1-SGC-CBP30混合物的实验，见图3B。结果显示化合物 SGC-CBP30抑制TbBDF5-BD1与H4K10Ac的结合。
实施例2化合物SGC-CBP30可有效杀伤布氏锥虫
在相同的DMSO浓度条件下，分别用0，10，20，30μM的SGC-CBP30 处理427细胞，并每天进行细胞计数。浓度为10～30μM的SGC-CBP30 处理427细胞24～72小时后可引起427细胞生长抑制，并出现大量细胞死亡，见图4A。
化合物SGC-CBP30按照浓度梯度稀释(35，30，25.6，12.8，6.4，3.2，1.6， 0.8，0.4，0.2，0.1，0微摩)并加入96孔板中，每个孔中再加入含有2×105个细胞的200μL培养基，继续培养72小时后，每个孔里加入20μL刃天青(22.88mg/ml)，孵育6小时后进行检测。监测数据根据Boltzmann函数用OriginPro 8.0软件进行计算。最终利用刃天青染色法得到SGC-CBP30 的半抑制浓度(IC50)为1.370μM，见图4B。
参考文献
以下参考文献均通过参考结合于本文。
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SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学技术大学
<120> 可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用
<130> IB178634
<160> 9
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Thr Pro Lys Gln Ala Val Lys Lys Ala Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Thr Pro Lys Ser Thr Pro Ala Lys Thr Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Lys Thr Arg Lys Glu Ala Lys Lys Thr Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Lys Glu Ala Lys Lys Thr Arg Arg Gln Arg Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Lys Lys Ala Ser Lys Gly Ser Asp Ala Ala Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala Lys Gly Lys Lys Ser Gly Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ala Lys Gly Lys Lys Ser Gly Glu Ala Lys
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ser Gly Glu Ala Lys Gly Ser Gln Lys Arg
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Lys Gly Ser Gln Lys Arg Gln Lys Lys
1 5 10

Claims (7)

1.以下结构式所述的化合物SGC-CBP30在制备药物中的用途，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述药物用于杀伤布氏锥虫。
2.根据权利要求1所述的用途，所述药物用于治疗非洲锥虫病。
3.根据权利要求2所述的用途，所述非洲锥虫病为拿干拿病。
4.根据权利要求1所述的用途，所述药物用于抑制TbBDF5 的乙酰化赖氨酸结合结构域。
5.根据权利要求4所述的用途，所述药物用于抑制 TbBDF5 的第一个乙酰化赖氨酸结合结构域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，所述化合物 SGC-CBP30以浓度 10~30 μM溶解于溶液中。
7.药物组合物在制备用于治疗非洲锥虫病的药物中的用途，其中，所述种药物组合物包含权利要求1所述的化合物SGC-CBP30和药用载体。
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