CN103189500B

CN103189500B - 用于调节整联蛋白CD11b/CD18的化合物和方法

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Publication number: CN103189500B
Application number: CN201180043382.0A
Authority: CN
Inventors: V.古普塔
Original assignee: Adhaere Pharmaceuticals Inc
Current assignee: GB006 Inc
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2011-05-02
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2031-05-02
Also published as: EP3243821B1; AU2016202918A1; WO2012005800A1; EP2591092A4; AU2016202918B2; AU2011276983B2; EP2591092A1; EP3243821B8; AU2011276983A1; CA2924494C; JP6310000B2; CN103189500A; US9023876B2; CN106038558A; JP2013536162A; CA2924494A1; JP5988970B2; JP2016183173A; CA2804387A1; US20120010255A1

Abstract

本发明公开了一种β2整联蛋白激动剂的药物制剂，其包括有效量的β2整联蛋白激动剂和药学上可接受的载体。本发明公开了一种通过使β2整联蛋白与β2整联蛋白激动剂相互作用而激活β2整联蛋白的方法。本发明公开了一种通过给予有效量的β2整联蛋白激动剂并激活β2整联蛋白而治疗患者的方法。本发明公开了一种通过将β2整联蛋白激动剂给予炎症患者，激活β2整联蛋白并减轻炎症而治疗炎症的方法。本发明公开了治疗和/或预防肾缺血再灌注(I/R)损伤、减少患者因支架插入所致的损伤、进行用于鉴定β2整联蛋白的小分子调节剂的测定、检测患者的疾病和改善患者的总体健康状态的方法。

Description

用于调节整联蛋白CD11b/CD18的化合物和方法

发明背景

1.技术领域

本发明涉及用不同的作用剂激活整联蛋白CD11b/CD18。本发明还涉及治疗炎性疾病。

2.背景技术

整联蛋白是介导细胞粘附、迁移和信号转导的非共价连接的α/β异二聚体受体。整联蛋白连同其配体在包括发育、止血、炎症和免疫在内的许多过程中，以及在癌症侵袭和心血管疾病等病理情况中起重要作用。白细胞迁移和募集在其对损伤和感染的正常免疫应答及在各种炎性病症和自身免疫性疾病中是必不可少的[1]。白细胞功能受β2整联蛋白(包括高表达的整联蛋白CD11b/CD18(亦称Mac-1、CR3和αMβ2))调节[2]。CD11b/CD18尤其识别作为配体的互补片段iC3b、血纤蛋白原和ICAM-1。许多炎性疾病和自身免疫性疾病，例如缺血再灌注损伤(包括急性肾衰竭和动脉粥样硬化)、组织损伤、中风、响应于血管损伤的新内膜增厚和炎症过程消退[3-7]，都涉及CD11b/CD18。

白细胞β2整联蛋白调节肿瘤浸润。在响应损伤或感染时，白细胞被募集到它们在其中参与免疫清除的组织中[2]。肿瘤还分泌募集CD11b+骨髓细胞的炎性细胞因子以利于新血管形成[8]。β2整联蛋白，一种具有共同的β-亚基(β2、CD18)但完全不同的α-亚基(CD11a、CD11b、CD11c和CD11d[9])的α/β异二聚体整联蛋白受体的亚家族，是白细胞特异性受体[10]。白细胞中两种主要β2整联蛋白之一的整联蛋白CD11b/CD18，介导白细胞与其多种配体(数目>30)结合，并介导白细胞迁移和募集进入发炎组织[1，11]。在癌症治疗期间，受照射治疗的肿瘤募集众多特定的白细胞、表达基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的骨髓衍生CD11b+骨髓细胞，所述基质金属蛋白酶-9恢复肿瘤血管系统，允许肿瘤再生长和复发[12]。最近的研究表明，在小鼠中，用CD11b拮抗剂(抗CD11b抗体)治疗降低CD11b+骨髓细胞浸润，提高肿瘤对放射的反应[12]。

炎性白细胞加重抗GBM肾炎。小鼠实验性抗GBM肾炎是急进性肾小球肾炎的模型，特征在于蛋白尿、白细胞浸润和肾小球新月体形成[13，14]。白细胞在抗GBM肾炎的发病机制中起决定性作用，其数目与新月形肾小球的百分比有关。CD11b-/-动物无蛋白尿(proteinurea)，对肾功能具有强大的保护[15]，表明了靶向这种整联蛋白的作用剂具有治疗这种疾病的潜力。

除了增加细胞粘附和调节迁移以外，CD11b/CD18活化介导许多胞内信号转导事件，包括骨髓细胞中活性氧类别的产生和许多促炎和抗炎基因的调节[16-21]。整联蛋白活化和配体结合导致其在细胞表面聚集，并启动由外到内的信号转导，包括PI3-K/Akt和MAPK/ERK1/2途径的活化[17，22]，从而在大多数细胞中模拟贴壁依赖性促存活信号。CD11b/CD18的连接和聚集还通过其它受体(例如Toll样受体(TLR)和细胞因子受体白介素-1受体(IL-1R)和TNFR)协同加强胞内信号转导，而且两者诱导促炎细胞因子(例如IL-1β、IL-6、TNF-α)的NF-κB依赖性表达以及其它因子(例如组织因子)的释放。CD11b/CD18缺乏提高TLR4触发的促炎细胞因子的产生，这就表明CD11b/CD18可能具有保护作用，并且可负调节白细胞的促炎途径(1-3)。

因此，调节CD11b/CD18功能的作用剂作为治疗各种炎性病况的治疗剂有重大潜力。CD11b/CD18在循环白细胞中和在许多其它细胞中以组成型无活性构象正常表达，但被快速激活以介导炎症部位的细胞进行细胞粘附、迁移和蓄积[23]。CD11b/CD18还在其它细胞类型和组织上表达，包括小胶质细胞(microgila)、肝细胞及T细胞和B细胞亚型。实际上，在许多实验模型中，用抗体和配体模拟物阻断CD11b/CD18及其配体(抗粘附疗法)[24-26]和CD11b或CD18的遗传消除在体内降低炎症反应的严重程度[27，28]。然而，这类阻滞剂在治疗人的炎性疾病/自身免疫性疾病时很少成功[28，29]，可能是因为由于大的可动员的胞内CD11b/CD18库的可得性所致，难以用抗体完全阻断CD11b/CD18[30，31]，或者因为用阻滞剂抑制白细胞募集需要占据活性整联蛋白受体的>90%[32]。抗整联蛋白β2抗体还具有意料不到的副作用[33]。此外，正如用活化剂治疗所预期的体内部分天然整联蛋白受体的短暂活化是否可在生理相关环境下具有任何重大的生物作用仍是个有争议的问题。

因此，需要选择性调节包括整联蛋白CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18在内的β2整联蛋白的配体结合和功能的新作用剂，例如抗体、蛋白质、肽、化合物和小分子。此外，需要通过靶向或结合整联蛋白上的变构调节部位(例如CD11b/CD18中的异亮氨酸疏水部位(SILEN)袋(hydrophobicsite-for-isoleucine(SILEN)pocket))而非配体结合部位，而激活整联蛋白的作用剂(激动剂)。因此，需要不阻断整联蛋白的配体结合功能的整联蛋白活化剂。此外，十分需要提高或促进整联蛋白介导的细胞粘附和细胞功能的作用剂和方法。然而，有关鉴定这类激动剂的进展缓慢，尤其选择性靶向和激活β2整联蛋白(包括CD11b/CD18)的激动剂，只有少数已报道的发现[34，35]。

本发明描述了包括整联蛋白CD11b/CD18活化而不是其阻断的新的方法，作为调节CD11b/CD18以及细胞(例如白细胞、小胶质细胞、肝细胞和淋巴细胞)的功能(包括其迁移、募集和其它生物功能)的策略。这类生物功能包括效应分子例如细胞因子的产生。制订了这样的策略：容易体内递送并且可容易优化以用于不同的哺乳动物的各种作用剂(例如小分子)，会是用于激活整联蛋白的最佳方法。本文表明，可通过用新的小分子激活CD11b/CD18而减少炎性疾病(但不限于此疾病)。这就表明了整联蛋白活化是治疗各种炎性疾病和自身免疫性疾病和病况(但不限于这些疾病)的新的有用的药理学上可命中目标的方法。本发明描述了新的策略，作为文献中目前已实践的抗粘附策略的备选方法，用于调节整联蛋白和表达整联蛋白的细胞的生物功能。许多不同类型的作用剂可激活整联蛋白，例如生物制剂、抗体、抗体片段、蛋白质、脂质、寡核苷酸和化合物。

对调节β2整联蛋白(包括CD11b/CD18)有用的激动剂和组合组的重要要求是，它们不会负面影响细胞、组织和动物存活力。描述这类激动剂、组合物和方法是本发明的一个目的。另外，本发明的一个目的是表明正如用本发明的激动剂和方法治疗所预期的一部分天然受体体内的短暂活化在生理学相关模型系统中具有生物作用。另外，本发明提供其它相关优势。

发明概述

本发明提供包括有效量的β2整联蛋白激动剂和药学上可接受的载体的β2整联蛋白激动剂的药物制剂。

本发明提供通过使β2整联蛋白与β2整联蛋白激动剂相互作用而激活β2整联蛋白的方法。

本发明还提供通过给予有效量的β2整联蛋白激动剂，并激活β2整联蛋白而治疗患者的方法。

本发明提供通过将β2整联蛋白激动剂给予炎症患者，激活β2整联蛋白并减轻炎症而治疗炎症的方法。

本发明还提供通过将β2整联蛋白激动剂给予患者，并激活β2整联蛋白而治疗和/或预防肾缺血再灌注(I/R)损伤的方法。

本发明提供通过在插入装置(例如支架)之前给予β2整联蛋白激动剂，并激活β2整联蛋白而减少患者的再狭窄的方法。

本发明提供通过给予用β2整联蛋白激动剂涂覆的装置(例如支架)，并激活β2整联蛋白而减少患者的再狭窄的方法。

本发明还提供通过鉴定β2整联蛋白中调节β2整联蛋白的活性的部位、确定结合袋的精确三维结构和鉴定可与结合袋相互作用的小分子而进行用于鉴定β2整联蛋白的小分子调节剂的测定的方法。

本发明提供通过给予β2整联蛋白激动剂、检测β2整联蛋白激动剂与β2整联蛋白的结合和证实疾病的存在而检测患者的疾病的方法。

本发明还提供通过给予有效量的β2整联蛋白激动剂，并激活β2整联蛋白而改善患者总体健康状态的方法。

附图描述

容易掌握本发明的其它优势，因为当结合附图考虑时，通过参考下面的详细描述，本发明的其它优势变得更好地理解，其中：

图1A-1I表示leukadherin增加CD11b/CD18依赖性细胞粘附，1A表示LA1、LA2、LA3和LA-C的化学结构；1B-1E显示剂量反应曲线，显示在递增量的LA1、LA2、LA3和LA-C存在下粘附至固定化Fg的输入K562CD11b/CD18(实心园)和K562(空心圆)细胞的百分比；1F显示直方图，显示在阻断抗体IB4和44a不存在或存在时LA1-3诱导的K562CD11b/CD18与Fg粘附，还显示了在生理Ca2+和Mg2+离子(Con)存在下和在有已知激动剂Mn2+时的粘附的参照水平。所示数据为平均值+SEM；1G显示了显示与粘附的基础水平(Con)相比，在LA1-3不存在(DMSO)或存在时WT(CD11b+/+)和CD11b-/-嗜中性粒细胞与固定化Fg粘附的直方图，所示数据为平均值+SEM；1H显示直方图，显示在阻断抗体(IB4，44a)不存在或存在时LA1-3诱导的K562E320A细胞与固定化Fg的结合，还显示了在有Ca2+和Mg2+离子(Con)和Mn2+的情况下K562E320A粘附的参照水平，所示数据为平均值+SEM；1I显示直方图，显示在LA1和LA2不存在(DMSO)或存在时重组GST-αA-结构域构建体与固定化Fg的结合，还显示了在任何蛋白质不存在时(-)或仅有GST构建体(GST)时所获得的背景信号，所示数据为平均值+SEM；

图2A-2I表示leukadherin影响细胞迁移。图2A.轨迹图显示在响应fMLP梯度时和在化合物LA1、LA2和LA3不存在(DMSO)或存在时，在Zigmond室中迁移性WT嗜中性粒细胞的分析(>50个细胞/条件，来自>3个独立实验/条件)。还显示了在不同时间点来自缩时视像显微术的代表性细胞图像。比例尺表示25微米(microm)；2B-2E表示显示leukadherin对细胞运动性的作用的平均位移(2B)、平均速度(2C)、方向持续性(2D)和平均位移平方图(2E)的定量分析。线条表示平均值±SEM。***p<0.0001；2F表示在响应fMLP时和在LA1、LA2和LA3不存在(DMSO)或存在下趋化性WT嗜中性粒细胞中的CD11b定位的荧光图像。显示了针对CD11b(绿色)和F-肌动蛋白(红色)染色的迁移性嗜中性粒细胞的代表性共焦相差图像。比例尺表示5微米；2G-2I表示THP-1细胞跨越HUVEC层的跨内皮迁移。2G.显示在LA1不存在(DMSO)或存在下在响应趋化因子MCP-1梯度时跨越TNFa刺激的HUVEC层(红色)迁移的THP-1细胞(绿色)的代表性共焦图像(10X)。2H.显示粘附至HUVEC的THP-1的定量测定的直方图。2I.显示迁移的THP-1细胞的定量测定的直方图。所示数据为平均值±SEM。***p<0.0001；

图3A-3L表示leukadherin体内降低白细胞的炎性募集，且体内保护器官功能。3A-3B是柱状图，显示在腹膜内注射巯基乙酸盐后4小时来自不同治疗组(仅巯基乙酸盐或在给予溶媒(C)、LA1、LA2或LA3后的巯基乙酸盐注射)的WT(A)或CD11b^-/-(B)小鼠腹膜液中嗜中性粒细胞的总数。盐水注射用作对照(n=4-9只/组)，所示数据为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，ns=不显著(单因素方差分析)。3C.显示在LA1不存在(黑色实心正方形)或存在(红色空心圆)下，在巯基乙酸盐注射后4小时、12小时和24小时WT动物腹膜液中嗜中性粒细胞数的曲线图。还显示了无巯基乙酸盐注射时的腹膜嗜中性粒细胞(黑色空心正方形)。**p<0.001，***p<0.0001，ns=不显著。3D.显示在没有(-Thio)或有巯基乙酸盐诱发性炎症(+Thio)的WT小鼠(n=3只/组)用DMSO或LA1治疗后4小时在不同器官中检出的嗜中性粒细胞比率的柱状图。BM表示骨髓；LI，肝；SP，脾；LU，肺；H，心脏；AM，腹肌；P，胰腺；BO，肠；K，肾。所示数据为平均值±SD。3E-F.用溶媒(DMSO)或LA1治疗的大鼠中球囊损伤后21天动脉的代表性显微照片。箭头表示新内膜增厚的位置。3G-H.用DMSO或LA1治疗的大鼠中球囊损伤后3天代表性动脉的显微照片。箭头表示CD68⁺巨噬细胞所处位置。I.显示通过对DMSO或LA1治疗的大鼠(n=7-9只/组)受损动脉的形态测量分析所确定的新内膜与中膜之比的柱状图。所示数据为平均值±SEM。*p<0.05。J.显示DMSO或LA1治疗的大鼠(n=12只/组)的受损动脉(损伤后3天)中巨噬细胞浸润物的定量测定的柱状图。所示数据为平均值±SEM。***p<0.0001。3K-L.显示与拮抗剂M1/70相比激动剂LA1更好地改善肾损伤的曲线图。3K.显示在不同时间点未治疗(盐水)、拮抗剂(M1/70)治疗和LA1治疗小鼠的肾小球嗜中性粒细胞数的曲线图(n=3-4只/组，第0天时间点除外，其中n=2)。所示数据为平均值±SEM。*p<0.05。3K.标绘在不同时间点在未治疗(盐水)、拮抗剂(M1/70)治疗和LA1治疗小鼠中测量的蛋白尿的曲线图(n=3-8只/组，第0天时间点除外，其中n=2)。所示数据为平均值±SEM。*p<0.05。

图4A-4F表示炎性嗜中性粒细胞募集的阻断可通过除去leukadherin而逆转，4A表示斑马鱼尾鳍损伤模型；4B-4C是在没有损伤(4B)和有损伤(4C)的情况下3dpf幼体尾的显微照片(左)和荧光图像(右)，用溶媒(DMSO)、LA1和LA2治疗的斑马鱼的代表性图像表示嗜中性粒细胞(绿色)在尾部蓄积；4D是柱状图，显示用溶媒(对照)、LA1和LA2治疗的斑马鱼幼体中尾鳍损伤部位附近的嗜中性粒细胞数的定量测定(n=12-16条斑马鱼幼体/组)，所示数据为平均值+SEM。***p<0.0001(单因素方差分析)；4E表示幼体尾的代表性显微照片(左)和荧光图像(右)，显示在除去化合物LA1和LA2后4小时嗜中性粒细胞(绿色)在尾部的蓄积；4F是柱状图，显示在除去LA1和LA2后4小时尾鳍损伤部位附近的嗜中性粒细胞数的定量测定(n=8-12条幼体/组)。所示数据为平均值+SEM。ns=不显著(单因素方差分析)；

图5表示leukadherin不影响表面CD11b/CD18表达，FACS分析使用mAbIB4和44a(黑色)和同种型IgG2a对照mAb(灰色)，显示在活的K562CD11b/CD18表面上CD11b/CD18表达的水平，所示数据为至少3个独立实验的代表性数据；

图6表示leukadherin不从内部贮库中动员CD11b/CD18，并且不影响人嗜中性粒细胞上的表面CD11b/CD18表达。FACS分析使用mAbIB4(黑色)和同种型IgG2a对照mAb(灰色)，显示在活的人嗜中性粒细胞表面上的CD11b/CD18表达的水平。将嗜中性粒细胞在溶媒(DMSO)、PMA、LPS或leukadherinLA1-3存在下与抗体一起温育，并按方法部分中的描述进行分析。所示数据是2-3个独立实验的代表性数据。实验表明，虽然嗜中性粒细胞用LPS和PMA活化导致CD11b/CD18的表面表达有预期的增加，但是leukadherin处理不会导致CD11b/CD18表面表达的任何增加；

图7A-7C表示leukadherin是真实的激动剂，并且在激动剂Mn²⁺离子存在下不抑制细胞粘附。A-C.显示在激动剂Mn²⁺离子(1mM)存在下且在增量的LA1(A)、LA2(B)和LA3(C)存在下粘附至固定化Fg的输入K562CD11b/CD18细胞的百分比的剂量反应曲线。所示数据为3个独立孔的平均值±SEM，并且是至少两个独立实验的代表性数据；

图8A-8C表示leukadherin依赖性CD11b/CD18活化不依赖于配体类型。A-C.Leukadherin以剂量依赖性方式提高CD11b/CD18与iC3b的结合。剂量反应曲线显示在增量的LA1(A)、LA2(B)和LA3(C)存在下，粘附至固定化iC3b的输入K562CD11b/CD18细胞的百分比。所示数据为6个独立孔的平均值±SEM，并且是至少3个独立实验的代表性数据；

图9表示leukadherin依赖性CD11b/CD18活化不依赖于配体类型。Leukadherin提高CD11b/CD18与ICAM-1的结合。直方图显示在仅缓冲液(含有Ca²⁺和Mg²⁺离子各1mM)或leukadherinLA1、LA2或LA3存在下粘附至固定化ICAM-1的K562CD11b/CD18细胞的相对结合(表示为输入细胞的百分比)。所示数据为6-9个独立孔的平均值±SEM，并且是至少3个独立实验的代表性数据。***p<0.0001；

图10A-10C表示leukadherin依赖性CD11b/CD18活化不依赖于细胞类型。A-C.Leukadherin以剂量依赖性方式提高THP-1细胞与Fg的结合。剂量反应曲线显示在增量的LA1(A)、LA2(B)和LA3(C)存在下输入THP-1细胞粘附至固定化Fg的百分比。所示数据为6个独立孔的平均值±SEM，并且是至少3个独立实验的代表性数据；

图11表示leukadherin增加K562细胞与iC3b调理的RBC的结合。直方图显示在EDTA(10mM)、对照(Ca²⁺和Mg²⁺离子各1mM)、激活Mn²⁺离子(1mM)或leukadherinLA1-3存在下iC3b调理的绵羊红细胞(RBC)(EiC3b)与表达CD11b/CD18的K562细胞的相对结合，其表示为显示玫瑰花结(rosette)的总细胞的百分比。各直方图表示代表性实验(所进行的三分之一)一式三份测定的平均值±SEM。***p<0.0001。由于CD11b/CD18也是已知的吞噬受体，因此这些结果表明LA1-3还增量调节CD11b/CD18的吞噬功能；

图12A-12E是显示CD11bA结构域的活化敏感区中LA1-3结合的计算模型的动画图，12A和12C表示呈其开放式构象(铜色带状物)的αA-结构域的模型，显示了活化敏感性F-α7区中LA1(绿色棒状模型)和LA2(蓝色棒状模型)的停靠，MIDAS部位的金属离子用灰色球体表示；12E表示呈其开放式构象(蓝色带状物)的αA-结构域的模型，显示了活化敏感性F-α7区中的LA3(黄色棒状模型)的停靠。与用LA3样化合物(12E)的研究一致，发现leukadherinLA1和LA2定向使得其大多数疏水部分与螺旋α7和α1与F链之间的疏水袋相互作用，形成结合袋的疏水残基(突出显示)包括α7Leu305、Ile308和Leu312、α1Phe156、V160、Leu164、F链Tyr267、Ile269以及包括Ile236、Val238、Ile135、Phe137、Phe171的其它疏水袋残基，leukadherin化合物的亲水羧酸部分远离可能与Lys166和/或Lys168形成离子相互作用的疏水袋定向；12B表示停靠结构(12A)αA-结构域(铜色带状物)的活化敏感性F-α7区的放大图，两张图相对彼此旋转90°，活化敏感性疏水区的相互作用残基表示为铜色棒状物并作标记，短划线突出显示LA1和αA结构域之间可能的氢键相互作用；12D表示停靠结构(12B)αA-结构域(铜色带状物)的活化敏感性F-α7区的放大图，两张图相对彼此旋转90°，活化敏感性疏水区的相互作用残基表示为铜色棒状物并作标记，短划线突出显示LA2和αA结构域之间可能的氢键相互作用；

图13表示leukadherin激活活的K562细胞中的全长整联蛋白CD11b/CD18。FACS分析显示在不存在(Ca，Mg，暗灰色直方图)或存在激动剂LA1(红色直方图)或Mn²⁺离子(蓝色直方图)时活化敏感性抗体mAb24与细胞表面表达的CD11b/CD18的反应性。在不存在(Ca，Mg)和存在LA1(黑色直方图)时使用mAbIB4对CD11b/CD18表面表达的水平进行分析，其表明总的CD11b/CD18表面表达无差异。还显示了被同种型对照mAb结合(浅灰色)。所示数据为至少3个独立实验的代表性数据。数据表明在LA1存在下mAb24与CD11b/CD18的反应性明显增加至之前用组成型活性CD11b/CD18观察到的水平；

图14表示与IMB-10相比leukadherin对CD11b/CD18显示较高亲和力。剂量反应曲线显示在增量的LA1和IMB-10(4)存在下粘附至固定化Fg的输入K562CD11b/CD18细胞的百分比，其中EC₅₀值对于LA1为4mM，对于IMB-10则>50mM。所示数据为6个独立孔的平均值±SEM，并且是至少3个独立实验的代表性数据；

图15A-15E表示体外leukadherin不影响3D凝胶中的嗜中性粒细胞迁移。A.来自对在leukadherinLA1不存在(DMSO)或存在下于3D胶原凝胶中向fMLP梯度迁移的WTB6嗜中性粒细胞成像的不同缩时系列的定格图像。还提供来自各影片的40个单个细胞在45分钟时间内的迁移轨迹。B-E.还提供了各种条件的至少40个嗜中性粒细胞的定量分析，但在45分钟录像期的细胞总位移(B)、迁移速度(C)和曲流指数(meandringindex)(D)未显示显著差异。此外，位移平方与时间的平方根的曲线图(E)显示两种条件下的定向细胞迁移；

图16A-16D表示体外leukadherin没有细胞毒性，在增量的LA1(16A)、LA2(16B)、LA3(16C)和LA-C(16D)存在下将K562CD11b/CD18细胞在37℃下温育，24小时后测定活细胞数，所示数据为一式三份进行的测定的平均值+SEM，并且是至少两个独立实验的代表性数据；

图17A-17C表示体外leukadherin对嗜中性粒细胞没有细胞毒性。在增量的LA1(A)、LA2(B)和LA3(C)存在下将WTB6嗜中性粒细胞在37℃下温育，在总共4小时温育后，用MTS试剂测定活细胞数。所示数据为一式三份进行的测定的平均值±SEM，并且是至少两个独立实验的代表性数据。结果清楚表明，这些化合物在高达50微摩的浓度下对原代嗜中性粒细胞都无毒性。

图18A-18B表示CD11b在K562CD11b/CD18细胞表面聚集的荧光图像，表明leukadherin不诱导整联蛋白聚集和由外到内的信号转导。整联蛋白活化和配体结合导致整联蛋白在细胞表面聚集，并启动由外到内的信号转导(5，6)。由于LA1-3结合并激活CD11b/CD18，所以可以想像仅这类结合便可引发整联蛋白介导的由外到内的信号转导，因此模拟细胞的配体结合的整联蛋白状态，这可能对白细胞寿命和功能具有重大意义。为了测试，我们使用共焦显微术用于对细胞表面的CD11b/CD18聚集进行成像(5)。A-B.在配体Fg不存在(A)或存在(B)时，将细胞悬液与DMSO、LA1、LA2或LA3温育。显示了针对CD11b(绿色)染色的细胞的代表性荧光和DIC图像。还显示了用ImageJ进行分析的选定细胞的CD11b荧光强度的3D图示。比例尺表示20mm。细胞在配体不存在时显示无可测出的CD11b/CD18大量聚集(macroclustering)(A，DMSO)，但在加入外源Fg时显示高度聚集(B，DMSO)。同样地，用LA1-3进行的处理只在加入外部Fg时显示整联蛋白大量聚集，这就表明LA1-3不是整联蛋白配体模拟物；

图19表示leukadherin不诱导CD11b/CD18介导的由外到内的信号转导。整联蛋白活化和配体结合还启动由外到内的信号转导(包括p38促分裂原活化蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径(5，6)的活化)，从而在大多数细胞中模拟贴壁依赖性促存活信号(7)。此外，其在加强促炎NF-kB信号转导中与炎性刺激物一起协同作用(8-10)。另外，虽然已知的CD11b/CD18激动剂Mn²⁺(11)和激活性mAb(12)及其配体(5)诱导ERK1/2磷酸化，但来自表达突变型组成型活性整联蛋白的敲入动物的细胞不诱导所述磷酸化(13)。为了检查LA1-3的作用，我们对LA1-3处理细胞中的ERK1/2磷酸化进行了分析。将K562CD11b/CD18细胞与DMSO(对照)、LA1、LA2、LA3或配体Fg一起温育，随后通过1DSDS-PAGE接着针对磷酸化ERK1/2(pERK)、总ERK1/2和GAPDH的蛋白质印迹法对细胞裂解物进行了分析。分析表明与配体Fg或佛波醇酯PMA一起温育不同，LA1-3处理不诱导所述磷酸化(pERK)(14)。因此，我们得出结论，在每种情况下在超过基础水平的配体不存在或存在时，leukadherin均不诱导导致ERK磷酸化的由外到内的信号转导；

图20A-20B表示在WT大鼠中的球囊损伤时对照化合物(LA-C)对新内膜增厚无作用，9A是用对照化合物LA-C治疗的动物在球囊损伤后21天的大鼠动脉的代表性显微照片。箭头表明动脉中新内膜增厚的位置；9B是柱状图，显示通过对来自DMSO和LA-C治疗动物(n=7-9只动物/组)的受损大鼠动脉的形态测量分析所确定的新内膜与中膜之比，所示数据为平均值+SEM。ns=不显著(单因素方差分析)；

图21A-21D表示在大鼠球囊损伤后leaukadherinLA3显著减少新内膜增厚。A.用溶媒(DMSO)或LA3治疗的动物在球囊损伤后21天的大鼠动脉的代表性显微照片。箭头表明新内膜增厚的位置。B.用DMSO或LA3治疗的大鼠在球囊损伤后3天的代表性动脉的显微照片。箭头表明CD68^-+巨噬细胞的位置。C.显示通过来自DMSO或LA3治疗的大鼠(n=7-9只/组)的受损动脉的形态测量分析所确定的新内膜与中膜之比的柱状图。所示数据为平均值±SEM。**p<0.001。D.显示DMSO或LA3治疗的大鼠(n=12只/组)的受损动脉(损伤后3天)中巨噬细胞浸润物的定量测定的柱状图。所示数据为平均值±SEM。***p<0.0001；

图22A-22D表示leukadherinLA2还防止嗜中性粒细胞募集到受损组织，且炎性嗜中性粒细胞募集的这种阻断还可通过除去LA2而逆转。A-B.与DMSO治疗的斑马鱼相比，在用LA2治疗的斑马鱼的无损伤(A)和有损伤(B)的3dpf幼体尾的代表性显微照片(左)和荧光图像(右)显示嗜中性粒细胞(绿色)在尾部蓄积减少(图4A-B，正文)。C.显示在除去LA2后4小时嗜中性粒细胞(绿色)在尾部蓄积的幼体尾的代表性显微照片(左)和荧光图像(右)。D.显示用溶媒(对照)和LA2治疗的斑马鱼幼体中尾鳍损伤部位附近嗜中性粒细胞数的定量测定和在除去LA2后4小时尾鳍损伤部位附近嗜中性粒细胞数的定量测定的柱状图(n=12-16条斑马鱼幼体/组)。所示数据为平均值±SEM。***p<0.0001，ns=不显著；

图23表示斑马鱼幼体中Leukadherin治疗不引起嗜中性粒细胞数损失，整个3dpf斑马鱼幼体的代表性荧光图像(上)和受损鱼尾部的显微照片(下)表示各斑马鱼幼体的嗜中性粒细胞(绿色)。(n=12-16条斑马鱼幼体/组)，LA1和LA2治疗的斑马鱼显示由于化合物自身荧光所致在荧光图像中略为较强的绿色背景；

图24表示显示动画图，其显示在CD11bA结构域的活化敏感区中不同leukadherin结合的计算模型的2D投影，leukadherin化合物的亲水羧酸部分远离可能与Lys166和/或Lys168形成离子相互作用的疏水袋定位；

图25A-25B表示由外到内的信号转导分析，将K562CD11b/CD18细胞与DMSO、LA1、LA2、LA3或配体Fg一起温育，随后针对磷酸化ERK1/2(pERK)、总的ERK1/2(12A)和磷酸化AKT(pAKT)、总的AKT和GAPDH(12B)对细胞裂解物进行分析；

图26A-26D是显示在LA1不存在和存在下在用LPS(10ng/mL)刺激时由WTB6巨噬细胞和嗜中性粒细胞分泌的促炎因子的直方图；

图27是显示在LA1不存在(灰色)或存在(红色线)下在基态(对照)和在TNFa-活化时人嗜中性粒细胞中的ROS水平的曲线图；

图28表示MyD88的分析，将人THP-1细胞与LPS、LPS和LA1或仅LA1一起温育一段时间，通过1D-SDSPAGE接着针对MyD88和GAPDH的蛋白质印迹法对细胞裂解物进行分析；

图29表示生存曲线，显示在CD11b/CD18激动剂LA1不存在或存在下在CLP时WT小鼠的生存；

图30是显示在进行性抗GBM肾炎开始后8天溶媒治疗(对照)和leukadherin治疗动物的血清suPAR水平的直方图；和

图31是显示在缺血诱导前30分钟用DMSO、LA1或LA2治疗的WT小鼠的肾功能的曲线图，再灌注24小时后进行sCr测量，***p<0.0001(n=5只小鼠/组)。

发明详述

本发明总的来说涉及各种作用剂(包括称为leukadherin的化合物)和用于激活β2整联蛋白，尤其是CD11b/CD18的方法。换句话说，本发明的作用剂起β2整联蛋白的激动剂而非拮抗剂的作用。所述激动剂和方法可用于治疗炎性疾病和自身免疫性疾病等疾病。

定义

术语“作用剂”是指化合物、肽、蛋白质、抗体、抗体片段、脂质、核酸或聚合物。

术语“烷氧基”是指具有与之连接的氧的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。

术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基，可用通式烷基-O-烷基表示。

术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环)基团、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链上具有30个或更少的碳原子(例如直链为C1-30、支链为C3-30)，更优选20或更少。

此外，贯穿整个说明书、实施例和权利要求中所用的术语“烷基”欲包括未取代和取代的烷基，后者是指具有取代基的烷基部分，所述取代基置换烃主链的一个或多个碳上的氢，包括卤代烷基例如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。

术语“Cx-y”当与酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基等化学部分联用时，意指包括在链中含有x-y个碳的基团。C0烷基在该基团位于末端位置时表示氢，如果位于内部则表示键。例如C1-6烷基在链中含有1-6个碳原子。

术语“胺”和“氨基”是本领域公知的，是指未取代和取代的胺两者及其盐，例如可由以下结构表示的部分：

其中R9、R10和R10’各自独立表示氢或烃基，或R9和R10与它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有4-8个原子的杂环。

本文所用术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。

本文所用术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。

本文所用术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子均为碳。优选环为5-7元环，更优选6元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个毗连环共用，其中至少一个环为芳族的，例如其它环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。

本文所用术语“碳环”、“碳环基”和“碳环的”是指非芳族饱和或不饱和的环，其中环的每个原子均为碳。优选碳环含有3-10个原子，更优选5-7个原子。

本文所用术语“碳环烷基”是指被碳环基取代的烷基。

本文所用术语“醚”是指通过氧与另一烃基连接的烃基。因此，烃基的醚取代基可以是烃基-O-。醚可为对称的或不对称的。醚的实例包括但不限于杂环-O-杂环和芳基-O-杂环。醚包括“烷氧基烷基”基团，其可用通式烷基-O-烷基表示。

本文所用术语“卤代”和“卤素”意指卤素，包括氯、氟、溴和碘。

本文所用术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。

术语“杂芳基”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选5-7元环，更优选5-6元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选1-4个杂原子，更优选1或2个杂原子。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个毗连环共用，其中至少一个环是杂芳族的，例如其它环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。

本文所用术语“杂原子”意指碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子为氮、氧和硫。

本文所用术语“杂环烷基”是指被杂环基取代的烷基。

术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，优选3-10元环，更优选3-7元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选1-4个杂原子，更优选1或2个杂原子。术语“杂环基”和“杂环”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个毗连环共用，其中至少一个环是杂环，例如其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。

本文所用术语“羟基烷基”是指被羟基取代的烷基。

本文所用术语“leukadherin”是指本文所述β2整联蛋白的激动剂化合物，其特征在于核心呋喃基噻唑烷酮、呋喃基咪唑烷酮、呋喃基噁唑烷酮或呋喃基异噁唑烷酮基序。

术语“低级”当与酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基等化学部分联用时意指包括在取代基中有10个以下原子、优选6个以下原子的基团。“低级烷基”是指例如含有10个以下碳原子、优选6个以下碳原子的烷基。在某些实施方案中，本文定义的酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别为低级酰基、低级酰氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基，不论它们单独出现还是与其它取代基组合出现，例如在叙述羟基烷基和芳烷基(例如在此情况下，当统计烷基取代基中的碳原子时，芳基内的原子不计算在内)中。

术语“多环基”、“多环”和“多环的”是指两个或更多个环(例如环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子为两个毗连环共用，例如环为“稠合环”。多环中的每个环可以是取代或未取代的。在某些实施方案中，多环中的每个环在环中含有3-10个原子，优选5-7个原子。

术语“取代的”是指具有置换主链的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。应理解的是，“取代”或“被……取代”包括以下隐含条件：这类取代符合取代原子和取代基所允许的化合价，且该取代产生稳定的化合物，例如所述化合物不会通过例如重排、环化、消除等而自发进行转化。预期本文所用术语“取代的”包括有机化合物的全部容许的取代基。从大的方面来看，容许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和无支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于合适的有机化合物，容许的取代基可为一个和多个，且可以是相同或不同的。对于本发明的目的，杂原子例如氮可具有氢取代基和/或本文所述有机化合物的任何容许的取代基，所述取代基满足杂原子的化合价。取代基可包括本文所述任何取代基，例如卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员应了解的是，适当时，烃链上被取代的部分自身可被取代。

本文所用术语“硫代烷基”是指被巯基取代的烷基。

本文所用术语“细胞”包括大量细胞。将化合物给予细胞包括体内、离体和体外给予。

“抑制”或“阻抑”或“降低”功能或活性(例如癌细胞增殖)，是当与除目标条件或目标参数外在其它方面相同的条件相比或者与另一条件相比时降低所述功能或活性。

本文所用术语“调节”包括抑制或阻抑功能或活性(例如细胞增殖)以及提高功能或活性。

表述“药学上可接受的”是本领域公认的。在某些实施方案中，该术语包括组合物、赋形剂、辅助剂、聚合物和其它物质和/或剂型，其是在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物组织接触而又无过量毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

本文所用表述“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的物质、组合物或溶媒，例如可用于配制用于医学或治疗用途的药物的固体或液体充填剂(filter)、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与制剂的其它成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。

可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于药物制剂的其它无毒相容物质。

术语“药学上可接受的盐”意指适于患者治疗或与患者治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。

本文所用术语“药学上可接受的酸加成盐”意指式I或式II所示任何碱化合物的任何无毒的有机盐或无机盐。形成合适的盐的示例性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及金属盐例如正磷酸氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的示例性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸例如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸以及磺酸类例如对甲苯磺酸和甲磺酸。可形成单酸盐或二酸盐，且这类盐可以水化、溶剂化或基本无水的形式存在。总的来说，与其游离碱形式相比，式I或式II化合物的酸加成盐更可溶于水和各种亲水有机溶剂，且通常具有更高的熔点。合适盐的选择是本领域技术人员已知的。可使用其它非药学上可接受的盐，例如草酸盐，例如用于实验室用途的式I或式II化合物的分离中，或用于随后转化成药学上可接受的酸加成盐。

本文所用术语“药学上可接受的碱加成盐”意指式I或式II所示任何酸性化合物或其中间体的任一种的任何无毒有机碱加成盐或无机碱加成盐。形成合适盐的示例性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成合适盐的示例性有机碱包括脂族、脂环或芳族有机胺，例如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。合适盐的选择是本领域技术人员已知的。

术语“预防”是本领域公认的，当关联病况例如局部复发(例如疼痛)、疾病(例如癌症)、综合征复征(例如心力衰竭)或任何其它医学病况使用时是本领域众所周知的，包括相对于未接受组合物的受试者降低受试者的医学病况的频率、或延迟医学病况的发作、减轻医学病况的症状的组合物给予。因此，癌症的预防包括例如相对于未治疗的对照群，在接受预防性治疗的患者群中减少可检测癌性生长的数目，和/或相对于未治疗的对照群，在受治群中延迟可检测癌性生长的出现，达例如统计显著量和/或临床显著量。感染的预防包括例如相对于未治疗的对照群，在受治群中减少感染诊断数目，和/或相对于未治疗的对照群，在受治群中延迟感染症状的发作。疼痛的预防包括例如相对于未治疗的对照群，在受治群中减轻受试者遭受的痛感的幅度，或者延迟受试者遭受的痛感。神经病症的预防包括例如相对于未治疗的对照群，在受治群中减轻受试者遭受的神经病症状的幅度，或者延迟受试者遭受的神经病症状。

本文所用术语“溶剂化物”意指其中合适溶剂的分子掺入晶格中的式I或式II化合物，或式I或式II化合物的药学上可接受的盐。在所给予的剂量下合适的溶剂是生理上可耐受的。合适溶剂的实例为乙醇、水等。当水是溶剂时，该分子称为“水合物”。

如本文使用且如本领域已知的一样，“治疗”是用于获得有益的或所需要的结果(包括临床结果)的方法。有益的或所需要的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况，减轻疾病的程度，稳定(即不恶化)疾病状况，防止疾病传播，延缓或减慢疾病进程，改善或减轻疾病状态并缓解(不论是部分还是完全)，不论可检测还是不可检测。“治疗”还可意指与如果不接受治疗的预期生存期相比延长生存期。

本发明的一个方面涉及下式(I)的化合物

其中

A不存在或选自烷基和烯基；

B不存在或选自烷基、烯基、O、S和NR4；

N选自氮和CR4；

X和Y独立选自O和S；

Z选自CR4、O、S和NR4；

U、V和W独立选自CR4、O、S和NR4；

R1和R3独立选自酰基、烷基、烯基、炔基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、芳基、芳烷基、羧基芳基、烷氧基烷基、烷氧基芳基、烷氧基羰基芳基(alcoxycarbonylaryl)、氨基芳基、酰氨基芳基、卤代芳基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、杂环基、杂环基烷基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、磺酸酯基、烷基磺酸酯基、芳基磺酸酯基、砜、烷基砜、芳基砜、亚砜、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基磺酰胺、芳基磺酰胺和磺酰胺、哌啶基、吗啉基、吡咯烷基、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、三唑基、吡唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、萘基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、苄基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吡啶并咪唑基、嘧啶并咪唑基、吡啶并吡唑基、吡唑并嘧啶基，且其任一个被1-6个独立的取代基任选取代；

R2选自氢、烷基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、烷氧基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基；和

R4不存在或选自氢和烷基。

在某些实施方案中，Z为S。

在某些实施方案中，X和Y为O。在某些其它实施方案中，X和Y为S。在某些其它实施方案中，X为S，Y为O。在某些其它实施方案中，X和Y为O，Z为S。在某些其它实施方案中，X、Y和Z为S。在某些其它实施方案中，X和Z为S，Y为O。

在某些实施方案中，U为O，V和W为CR4。在某些这类实施方案中，R4为氢。在某些其它实施方案中，U为S，V和W为CR4。在某些这类实施方案中，R4为氢。在某些其它实施方案中，U为CR4，V为N，W为O。在某些这类实施方案中，R4为氢。在某些其它实施方案中，U为CR4，V为O，W为N。在某些这类实施方案中，R4为氢。

在某些实施方案中，B为烷基，A不存在。在某些这类实施方案中，R1选自烷氧基羰基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和烷氧基羰基。在某些实施方案中，B为亚甲基，A不存在。在某些这类实施方案中，R1选自烷氧基羰基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和烷氧基羰基。在某些这类实施方案中，B为亚甲基，A不存在。

在某些实施方案中，在A为烷基，B不存在时，R1为烷氧基羰基。

在某些实施方案中，A和B两者均不存在。在某些这类实施方案中，R1选自烷氧基羰基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和烷氧基羰基。

在某些实施方案中，R1取代基被1-6个独立的取代基进一步取代。

在某些实施方案中，R1选自呋喃、苯基、苄基、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、四氢吡喃、四氢噻喃、哌啶、哌嗪和吗啉。在某些实施方案中，R1选自四氢呋喃、四氢噻吩和吡咯烷，优选四氢呋喃。

在某些实施方案中，R1为苯基，优选为取代苯基。在某些这类实施方案中，R1为被取代1-5次、优选1-3次、更优选1或2次的苯基。在某些这类实施方案中，R1为被独立选自以下的一个或两个、优选一个取代基取代的苯基：卤素、硝基、氰基、羟基、巯基、氨基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、硫代烷基和烷基，更优选烷基和卤素，例如甲基、氟和氯。

在某些实施方案中，R2选自氢、烷基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、烷氧基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基。

在某些实施方案中，R3选自烷基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、烷氧基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基。在某些实施方案中，R2为氢，R3选自芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基，优选芳基、杂芳基、碳环基和杂环基。

在某些实施方案中，R3为选自以下的杂芳基：吡咯、呋喃、嘧啶、噁唑、异噁唑和噻吩，优选呋喃。在某些实施方案中，R3为被取代1-3次、优选1-2次、更优选1次的呋喃。在某些这类实施方案中，R3为被选自以下的取代基取代1次的呋喃：芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基，优选芳基、杂芳基、碳环基和杂环基。在某些实施方案中，R3为被芳基取代1次的呋喃，所述芳基自身被以下基团任选取代优选1-2次：烷基、羧基、烷氧基羰基和卤素，例如氯苯基、二氯苯基、羧基苯基。

在某些实施方案中，R3为芳基，优选苯基。在某些这类实施方案中，R3为被独立选自以下的一个或两个、优选两个取代基取代的苯基：卤素、硝基、氰基、羟基、巯基、氨基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、硫代烷基和烷基。在某些这类实施方案中，R3为被卤素、优选溴取代一次的苯基。

本发明的一个方面涉及下式(II)的化合物

其中

A不存在或选自烷基和烯基；

B不存在或选自烷基、烯基、O、S和NR4；

N选自氮和CR4；

X和Y独立选自O和S；

Z选自CR4、O、S和NR4；

U、V和W独立选自CR4、O、S和NR4；

R1和R3独立选自酰基、烷基、烯基、炔基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、芳基、芳烷基、羧基芳基、烷氧基烷基、烷氧基芳基、烷氧基羰基芳基、氨基芳基、酰氨基芳基、卤代芳基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、杂环基、杂环基烷基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、磺酸酯基、烷基磺酸酯基、芳基磺酸酯基、砜、烷基砜、芳基砜、亚砜、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基磺酰胺、芳基磺酰胺和磺酰胺、哌啶基、吗啉基、吡咯烷基、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、三唑基、吡唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、萘基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、苄基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吡啶并咪唑基、嘧啶并咪唑基、吡啶并吡唑基、吡唑并嘧啶基，且其任一个被1-6个独立的取代基任选取代；

R4不存在或选自氢和烷基。

在某些实施方案中，Z为S。

在某些实施方案中，式II化合物选自

在某些实施方案中，较不优选选自下列化合物的式II化合物

本发明的一个方面涉及下式(III)化合物

其中

A不存在或选自烷基和烯基；

B不存在或选自烷基、烯基、O、S和NR4；

N选自氮和CR4；

X和Y独立选自O和S；

Z选自CR4、O、S和NR4；

U、V和W独立选自CR4、O、S和NR4；

R3为存在于芳基环1-6位的1-6个独立的取代基；

R4不存在或选自氢和烷基。

在某些实施方案中，Z为S。

在某些实施方案中，U为N，V和W为CR4。在某些这类实施方案中，R4为氢。在某些其它实施方案中，V为N，U和W为CR4。在某些这类实施方案中，R4为氢。在某些其它实施方案中，W为N，V和V为CR4。在某些这类实施方案中，R4为氢。

在某些实施方案中，R3为选自以下的杂芳基：吡咯、呋喃、嘧啶、噁唑、异噁唑和噻吩，优选呋喃。在某些实施方案中，R3为被取代1-3次、优选1-2次、更优选1次的呋喃。在某些这类实施方案中，R3为被选自以下的取代基取代1次的呋喃：芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基、优选芳基、杂芳基、碳环基和杂环基。在某些实施方案中，R3为被芳基取代1次的呋喃，所述芳基自身被以下基团任选取代优选1-2次：烷基、羧基、烷氧基羰基和卤素，例如氯苯基、二氯苯基、羧基苯基。

本发明的化合物可具有固有的端对端极性(end-to-endpolarity)，使得与分子的一端相比，化合物在分子另一端的极性更大，例如图示的顶端(噻唑烷环的N取代侧)或底端(噻唑烷环的取代呋喃基侧)。或者，具有两个极性末端的化合物可能是不利的。

本发明的化合物可呈纯的或基本纯的单一构型，例如Z构型。

本发明的β2整联蛋白激动剂化合物优选占据CD11b/CD18的αA-结构域的结合袋。本发明的化合物以类似于图12A-12-E和图24中所示方式占据αA-结构域的结合袋。更准确地说，如下面的实施例1中所述，所述化合物可与由整联蛋白的残基L312、I308、L305(α7螺旋)、L164、V160、F156(α1螺旋)和Y267、I269、I236、V238、I236、I135(中央β折叠)界定(line)的疏水袋相互作用。本发明的化合物可与αA结构域的氨基酸的极性残基或侧链相互作用。例如，所述化合物的较大极性端可与αA结构域的残基赖氨酸166或赖氨酸168相互作用。本发明的化合物的较大非极性端可占据αA结构域中结合部位的疏水袋，较大极性端可占据αA结构域中结合部位的袋，使得极性端更多暴露于溶剂中。

本发明的某些化合物可以特殊的几何形式或立体异构体形式存在。本发明考虑所有这类化合物，包括顺式异构体和反式异构体、R对映体和S对映体、非对映体、(d)-异构体、(l)-异构体、其外消旋混合物及其落入本发明范围的其它混合物。取代基(例如烷基)中可存在其它不对称碳原子。所有这类异构体及其混合物均欲包括在本发明中。

例如，如果需要本发明化合物的特定对映体，则其可通过不对称合成或通过用手性助剂衍化制备，其中所得非对映体的混合物经分离和辅助基团经裂解以提供纯的所需对映体。或者，如果分子含有碱性官能团(例如氨基)或酸性官能团(例如羧基)，则可用合适的旋光酸或碱形成非对映体的盐，接着通过本领域周知的分步结晶或层析方法拆分由此形成的非对映体，随后回收纯的对映体。

还可例如通过将3H或14C或放射性卤素(例如125I)掺入结构内而用放射性同位素标记，或通过借助于接头将激动剂结构与生物素或荧光团(fluorphore)连接而用标记，对本发明的激动剂进行标记。

本发明的一个方面涉及作为激动剂的非阻断的激活性抗整联蛋白抗体或其片段。这类抗体的非限制性实例包括抗CD11b抗体M18/2(4，5)、抗CD11b抗体ED7、抗CD118抗体ED8(6)、抗CD11b抗体VIM12(7)、抗CD11a抗体CBRLFA1/2(8)、抗CD11a抗体NKI-L16(9)、抗CD18抗体KIM185(10)、抗CD18抗体KIM127(11)、抗CD18抗体24(12)、抗CD18抗体NG2B12(6)、抗CD18抗体MEM48(13)。此外，可对这类抗体或其片段进行修饰以用于各种动物，例如制备本领域周知的人源化抗体。

药物制剂中可包括上述激动剂。该化合物可包括其衍生物、其药学上可接受的盐或其水合物。优选药物制剂包括可接受的稀释剂、载体、赋形剂或辅助剂以及活性化合物1-30。

药物制剂还可包括调节或治疗病况的其它活性化合物或作用剂。这些其它的活性化合物或作用剂可与本发明的激动剂协同作用。因此，可以比单独使用时低的剂量给予其它化合物/作用剂和本发明的激动剂两者。这允许在以较高剂量使用时可能有害的许多已知药物在较低剂量下有效地使用，同时对患者是安全的。

例如，本发明的激动剂可与TNF-α阻断剂联用，TNF-α阻断剂例如但不限于ENBREL?(依那西普，Amgen)、REMICADE?(英利昔单抗，CentocorOrthoBiotech，Inc.)或HUMIRA(阿达木单抗，AbbottLaboratories)。依那西普的剂量可为每周25-50mg，英利昔单抗的剂量可为每2-8周3mg/kg，阿达木单抗的剂量可为每2周40mg，并且与本发明的化合物组合时可降低。

本发明的激动剂可与抗炎药物联用，抗炎药物例如但不限于非甾体抗炎药物(NSAIDS)，例如水杨酸酯(阿司匹林)、乙酸衍生物(吲哚美辛)、丙酸衍生物(布洛芬或奈普生)或CoxII抑制剂例如塞来考昔(Celebrex?)或罗非考昔(Vioxx?)。抗炎药物剂量一般为10-3200mg/天，与本发明的激动剂组合时可降低。

本发明的激动剂可与抗癌化合物联用，抗癌化合物例如但不限于西仑吉肽、环(RGDfV)肽。剂量一般可为120-2400mg/m²，并且与本发明的化合物组合时可降低。

本发明的激动剂可与抗排斥药物联用，抗排斥药物例如但不限于他克莫司、环孢菌素和各种类固醇。他克莫司的剂量可为每天0.25mg-1mg，且与本发明的激动剂组合时可以降低。环孢菌素的剂量可为1-12mg/kg/天，与本发明的激动剂组合时可以降低。

本发明的激动剂可与抗凝血药物联用，抗凝血药物例如但不限于华法林(COUMADIN?，Bristol-MyersSquibb)、肝素、阿司匹林、噻氯匹定(TICLID?，RochePharmaceuticals，Inc.)、氯吡格雷(PLAVIX?，Bristol-MyersSquibb/SanofiPharmaceuticals)、双嘧达莫(PERSANTINE?，BoehringerIngelheimPharmaceuticals,Inc.)和糖蛋白IIb/IIIa受体激动剂。华法林的剂量可为例如每日1-10mg，阿司匹林的剂量可为每日50-6000mg，噻氯匹定的剂量可为250mg每日两次，氯吡格雷的剂量可为每日75-300mg，双嘧达莫的剂量可为75-100mg每日四次，与本发明的激动剂组合时可以降低。

本发明的激动剂可与类固醇类联用，类固醇类例如但不限于妥布霉素、地塞米松、新霉素、氢化可的松、泼尼松和红霉素。地塞米松的剂量可为每日0.75-9mg，新霉素的剂量可为每日3-12g，泼尼松的剂量可为每日5-60mg，红霉素的剂量可为每日30mg-4g，与本发明的激动剂组合时可以降低。

本发明的激动剂可与鞘氨醇-1-磷酸酯受体调节剂联用，例如芬戈莫德(GILENYA?，NovartisPharmaceuticalsCorporation)。剂量可为每日0.25mg-5mg，且与本发明的激动剂组合时可以降低。

本发明的激动剂还可与药物洗脱装置介质联用。这类装置包括支架和导管。本发明还提供减少因插入装置(例如支架或导管)所致的患者损伤的方法。更准确地说，可在将装置插入患者之前、插入期间及插入后给予激动剂。如下面的实施例1所述，激动剂起以下作用：减少具有装置的血管损伤部位中的白细胞蓄积，减少新内膜增厚。现有技术方法仅用β2整联蛋白拮抗剂提供这类结果。因此，预料不到的是，激动剂也可提供这种功能。

本发明的激动剂还可用作医疗装置(例如支架和导管)的涂覆材料。本发明还提供通过将用β2整联蛋白激动剂涂覆的装置给予患者而减少患者的损伤的方法。

本发明的激动剂还可用于减少患者的狭窄。本发明还提供通过将β2整联蛋白激动剂给予患者而减少患者的狭窄的方法。

本发明的激动剂还可用于改进患者血管通路的开放性。本发明还提供通过将β2整联蛋白激动剂给予患者而改进患者血管通路的开放性的方法。

本发明的激动剂还可用于减少患者的动静脉瘘(AVF)的狭窄以及动静脉移植物(AVG)的狭窄。本发明还提供通过将β2整联蛋白激动剂给予患者而减少患者的动静脉瘘(AVF)的狭窄以及动静脉移植物(AVG)的狭窄的方法。

最概括来说，本发明提供通过使β2整联蛋白与激动剂、优选本文所述化合物之一相互作用而激活β2整联蛋白的方法。现有技术方法只提供通过在细胞中表达突变型受体的β2整联蛋白活化，其中100%的整联蛋白受体含有激活性突变体。因此，预料不到的是，仅与全部野生型受体中的一部分结合的激动剂也可提供此功能。

此外，本发明提供通过给予β2整联蛋白激动剂、优选本文所述激动剂之一，并激活β2整联蛋白而治疗患者的方法。所述激活也可视为β2整联蛋白的过度激活。

相对于如下所述的其它β2整联蛋白，β2整联蛋白激动剂还可对CD11b/CD18具有选择性。或者，β2整联蛋白激动剂可激活任何所需的β2整联蛋白或整联蛋白。

对于激活β2整联蛋白、尤其是整联蛋白CD11b/CD18，有本发明的激动剂提供的许多不同功能。本发明的激动剂可调节β2整联蛋白的功能。这种调节可以是调节细胞中或细胞膜上的β2整联蛋白的构象或β2整联蛋白的组构，例如与自身或与其它蛋白质和物质的二聚化或多聚化。本发明的激动剂可通过调节β2整联蛋白而调节细胞功能。该激动剂可增加细胞粘附，并减少发炎组织中的细胞募集。细胞粘附性的增加可减少细胞的横向运动(包括细胞趋化性)。由于激动剂治疗而增加的细胞粘附性可减少细胞的跨内皮迁移(TEM)。本文所述组合物和方法影响白细胞募集。它们可例如通过提高白细胞慢滚动和与发炎内皮的粘附性来实现这一点，这可用阻断抗体来逆转。换句话说，增加细胞粘附使细胞更粘着，使得它们不能移动到血管之外进入到组织(例如受损或发炎组织)中。这是一种通过β2整联蛋白的活化而不是通过实际阻断而对β2整联蛋白介导的功能的功能性阻断。现有技术方法只用β2整联蛋白拮抗剂提供这类结果。因此，预料不到的是，激动剂也可提供这种功能。

本发明的激动剂可通过体外和体内调节β2整联蛋白而调节细胞的其它功能。例如，激动剂降低细胞分泌的化学因子水平。这类因子包括而不限于炎性因子，尤其例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、可溶性uPAR和微粒。本文所述激动剂和方法通过表达β2整联蛋白的细胞降低所分泌的因子的水平。本文所述激动剂和方法通过细胞(例如血管内皮细胞)降低所分泌的因子的水平，所述细胞自身不表达β2整联蛋白但与表达β2整联蛋白的细胞(例如白细胞或小胶质细胞)相互作用。本文所述组合物和方法提高所分泌的因子的水平。这类因子包括抗炎因子，尤其是例如IL-10。

本文所述组合物和方法还可改变细胞中的信号转导途径。激动剂可改变表达β2整联蛋白的细胞(尤其包括白细胞)的胞内信号转导途径。这类途径尤其包括而不限于NF-kB途径、AKT途径、MAPK途径、Toll样受体信号转导途径、细胞因子受体信号转导途径。本发明的化合物和方法激活β2整联蛋白，所述β2整联蛋白诱导与细胞中的其它的信号转导途径协同或对抗的胞内信号转导。本文所述组合物和方法改变与表达β2整联蛋白的细胞相互作用的细胞中的信号转导途径。这类细胞尤其包括其它白细胞亚型、淋巴细胞、内皮细胞、星形细胞和海马细胞。本文所述组合物和方法改变与由表达β2整联蛋白的细胞(尤其例如白细胞、淋巴细胞、内皮细胞)分泌的因子相互作用的细胞中的信号转导途径。

本发明的激动剂还可提高体外或体内β2整联蛋白、尤其整联蛋白CD11b/CD18与其配体的结合。这些配体可为ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、iC3b、血纤蛋白原、因子X、血纤蛋白、uPAR或GPIbα。激动剂与所述蛋白质的结合，调节通常与蛋白质的天然配体的结合有关的至少一种功能。这类功能包括细胞(例如白细胞)在血管内皮上的滚动，细胞与血管内皮结合，细胞在血管内皮上爬行，细胞通过血管内皮易位，细胞浸润入内膜组织，从细胞中释放一种或多种可溶性因子，从细胞释放趋化因子，从细胞中释放生长因子，趋化因子从组织中的细胞结合相关释放，生长因子从组织中的细胞结合相关释放，一种或多种可溶性因子从组织中的细胞结合相关释放，循环中的一种或多种可溶性因子水平的改变和一种或多种不溶解因子水平的改变。可溶性因子包括细胞因子，例如但不限于促炎细胞因子、抗炎细胞因子、IL-1β、IL-6和IL-10、TNF-α或IFN-γ。受激动剂影响的细胞包括白细胞、肝细胞、小胶质细胞、某些T细胞和B细胞、干细胞、多能细胞和白血病细胞等细胞，但不限于这些细胞。

激动剂还可纠正或减少表达β2整联蛋白的突变体形式的细胞的功能缺陷。例如已将CD11b的突变与狼疮和狼疮肾炎相关联。本发明的激动剂可减少或克服携带β2整联蛋白的突变体形式的细胞、生物体和动物的功能缺陷。

本发明的激动剂更通常还可体外或体内调节生物功能，例如但不限于基因表达、外遗传特征(epigeneticprofile)、蛋白质表达、蛋白质水平、蛋白质修饰、翻译后修饰和信号转导。优选本发明的激动剂调节白细胞、小胶质细胞和干细胞的生物功能。或者，本发明的激动剂可调节其它细胞或组织的生物功能。

本发明的激动剂还可体外或体内调节其它生物功能，例如干细胞的分化、多能细胞的分化、培养或长期保存中细胞的维持、细胞的动员，例如白细胞自骨髓进入循环或内皮祖细胞到炎症或损伤部位以及增加进入其合适部位的某些细胞(例如骨髓中的白血病细胞)的潴留。

有许多可被治疗或预防的与β2整联蛋白的活性有关的疾病或病况，例如但不限于炎症(包括但不限于急性和慢性炎症)、炎性皮肤疾病、免疫相关病症、自身免疫性疾病、烧伤、免疫缺陷、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、髓过氧化物酶缺乏症、威-奥综合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、慢性肾病、慢性肉芽肿病、高IgM综合征(hyper-IgMsyndrome)、白细胞粘附缺乏、铁缺乏症、切-东综合征(Chediak-Higashisyndrome)、重症联合免疫缺陷、糖尿病、肥胖症、高血压、HIV、伤口愈合、重建、瘢痕形成、纤维变性、干细胞疗法、恶病质、脑脊髓炎、多发性硬化、阿尔茨海默病(Alzheimers)、银屑病、狼疮、类风湿性关节炎、免疫相关病症、放射损伤、移植、细胞移植、细胞输入、器官移植、器官保存、细胞保存、哮喘、肠易激病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、结肠炎、肠病、癌症、白血病、缺血再灌注损伤、中风、与血管损伤相关的新内膜增厚、大疱性类天疱疮、新生期梗阻性肾病、家族性高胆固醇血症、动脉粥样硬化、血脂异常(dyslipidemia)、主动脉动脉瘤、动脉炎、血管闭塞包括脑动脉闭塞、冠状动脉旁路手术并发症、心肌炎包括慢性自身免疫心肌炎和病毒性心肌炎、心力衰竭包括慢性心力衰竭(CHF)、心力衰竭恶病质、心肌梗死、狭窄、心脏手术后再狭窄、无痛性心肌缺血、左心室辅助装置移植后并发症、血栓性静脉炎、血管炎包括川崎血管炎(Kawasaki'svasculitis)、巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、创伤性头部损伤、缺血后再灌注损伤、脑缺血后炎症、心肌梗死后缺血再灌注损伤、脑型疟和心血管疾病。可通过将呈药物制剂的本发明激动剂给予患者来治疗或预防这些疾病。激动剂可执行上述各种功能以治疗患者的疾病。

可通过检测β2整联蛋白的活化来证实对患者的治疗。这可通过从患者中提取样品并进行测定来实现，例如检测生物样品中在白细胞表面上的β2整联蛋白表达水平或在这类细胞上激活的β2整联蛋白的水平。证实治疗患者的另一种方法是评价患者中通常与所述疾病有关的其它已知标志物的水平(例如血样中的IL-6水平)或患者的疾病症状。

在治疗炎症的一种具体方法中，可将本文所述的β2整联蛋白激动剂给予炎症患者以激活β2整联蛋白并减轻炎症。在一个作用机制中，激动剂可通过使Akt磷酸化来抑制白细胞中的促炎细胞因子(例如IL-6)表达，如下面的实施例1所述。此外，激动剂可减少嗜中性粒细胞和巨噬细胞的可溶性因子分泌，这导致炎症减轻。激动剂还可通过增加炎症部位附近的嗜中性粒细胞粘附性并减少嗜中性粒细胞运动性来延迟嗜中性粒细胞募集。此外，激动剂激活的CD11b/CD18增加白细胞粘附，这减少白细胞爬行和跨内皮迁移，因此减少至发炎/受损组织中的募集。CD11b活化诱导对促炎信号和途径提供负反馈环的胞内信号转导。此外，虽然文献中存在激活CD11b/CD18的一些激活性抗体，但是这类“抗体”可能不是理想的。本发明提出这类激活性抗体需经修饰以用作本发明的激动剂，使得它们不诱导整联蛋白聚集或细胞中其它有害的信号转导途径，而是诱导类似于用leukadherin所诱导的途径。

本发明还提供通过将β2整联蛋白激动剂给予患者并激活β2整联蛋白而治疗和/或预防肾缺血再灌注(I/R)损伤的方法。肾I/R损伤是肾移植、大手术、创伤、脓毒性休克和出血性休克后的急性肾衰竭的主要原因。可在手术前给予β2整联蛋白激动剂。或者，可在肾移植、大手术、创伤、脓毒性休克和出血性休克之后给予激动剂。通过给予激动剂，sCr水平有显著降低，导致肾保护作用。

本发明还提供进行用于鉴定β2整联蛋白、尤其是CD11b/CD18的小分子调节剂的测定的方法。更准确地说，可鉴定在β2整联蛋白中，尤其在整联蛋白CD11b/CD18、整联蛋白CD11c/CD18、整联蛋白CD11d/CD18或整联蛋白CD11a/CD18中的调节β2整联蛋白活性的部位和结构域，并且可确定结合袋的确切三维结构，其可用来得到更有选择性和/或更有效的结合剂。例如，可制备CD11b/CD18与结合激动剂的复合物，并可通过例如x-射线晶体学、核磁共振或鉴定与激动剂相互作用的CD11b/CD18的结合部位的其它合适方法进行分析。所述测定法还可以是基于细胞粘附的高通量筛选测定法以鉴定抑制或提高细胞粘附的激动剂。例如，可针对特定的β2整联蛋白来筛选潜在的小分子激动剂的文库。可通过将测定板倒置籍重力除去未贴壁细胞。进行此步骤而不是洗涤测定板。可使细胞核染色，然后成像以定量测定贴壁细胞的数目，然后可鉴定出激动剂。所述测定法可以是体外或体内测定法。

可利用基于计算机的建模算法分析结合β2整联蛋白、尤其CD11b/CD18的激动剂的结构和构象，以鉴定有助于成功结合的结构特征。可结合有关CD11b/CD18或其结合袋的结构或构象的信息，例如通过采用x-射线晶体学或核磁共振等分析技术分析CD11b/CD18所获得的结构信息，对这类信息进行分析，以分析结合激动剂和它们与之相互作用的结合袋间的相互作用。这类分析可用来预测与激动剂相互作用的CD11b/CD18的部分，用来从试验激动剂文库中选择具有与所需结合活性有关的结构特征的激动剂，或用来设计预期显示与CD11b/CD18结合的结构用于采用本文所述测定法进行体内或体外测定。

还可利用本发明的化合物激动剂的结构特征，应用基于计算机的建模算法来鉴定结合β2整联蛋白、尤其CD11b/CD18的新的激动剂。可采用支架跳跃(Scaffoldhopping)、原子置换、残基置换和/或分子置换方法。可结合有关CD11b/CD18或其结合袋的结构或构象的信息，例如通过采用例如x-射线晶体学或核磁共振等分析技术分析CD11b/CD18获得的结构信息，对该信息进行分析以分析结合激动剂和它们与之相互作用的结合袋间的相互作用。这类分析可用来预测与激动剂相互作用的CD11b/CD18的部分，用来从试验激动剂文库中选择具有与所需结合活性有关的结构特征的激动剂，或用来设计预期显示与CD11b/CD18结合的结构用于采用本文所述测定法进行体内或体外测定。

提供通过给予本文所述的β2整联蛋白激动剂，检测β2整联蛋白激动剂与β2整联蛋白的结合，并证实疾病的存在而检测或诊断患者的病况或疾病的方法。优选β2整联蛋白是CD11b/CD18。换句话说，如果结合存在，则患者患有上述疾病。例如，所述疾病可以是炎性疾病或自身免疫性疾病，并且通过检测激动剂与CD11b/CD18的结合，可证实患者患有所述疾病。此外，可将本发明的激动剂给予获自患者的生物样品，以检测或诊断患者的病况或疾病。所给予的激动剂可按允许容易检测的方式衍生化、加标签、聚合、包封或植入。可使用接头，用示踪剂、放射性同位素标记或荧光标签给激动剂加标签。可采用磁共振成像(MRI)和本领域已知的其它这类诊断技术检测激动剂。另一种检测方法可如下。可从患者中采集生物样品，例如血液或血浆，可进行测定，例如以检测β2整联蛋白激动剂与β2整联蛋白的结合，或测量样品中的其它标志物(例如IL-6水平)。

本发明还提供通过给予有效量的β2整联蛋白激动剂并激活β2整联蛋白而改善患者总体健康状态的方法。换句话说，通过给予本发明的激动剂，患者的健康状况改善，因为激动剂治疗上述许多不同的疾病。

可通过用于制备可给予受试者的药学上可接受的组合物的已知方法，来制备含有本发明激动剂的组合物，使得将有效量的活性物质与药学上可接受的溶媒混合于混合物中。合适的溶媒描述于例如Remington'sPharmaceuticalSciences(Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，Pa.，USA1985)。据此，组合物包含(但并非唯一)与一种或多种药学上可接受的溶媒或稀释剂联合并包含在具有合适pH且与生理液体等渗的缓冲溶液中的物质的溶液。

可以游离碱的形式、以盐、溶剂化物的形式和作为水合物，使用本发明的激动剂。所有形式都属于本发明的范围。可形成酸加成盐中，并提供更方便的使用形式；在实践中，盐形式的使用固有地相当于碱形式的使用。可用来制备酸加成盐的酸优选包括这样的酸，其当与游离碱混合时产生药学上可接受的盐，即在盐的药用剂量下其阴离子对动物机体无毒的盐，使得游离碱固有的有益性质不被归因于阴离子的副作用消弱。虽然优选碱性激动剂的药学上可接受的盐，但是所有酸加成盐也可用作游离碱形式的来源，即使只需要特定的盐本身作为中间产物，如例如当形成盐仅用于纯化和鉴定的目的时，或当其用作中间体用于通过离子交换方法制备药学上可接受的盐时。

本发明范围内的药学上可接受的盐包括来源于下列酸的盐：无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸；有机酸例如乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、奎尼酸等。

按照本发明的方法，可以各种形式将所述激动剂或其盐或溶剂化物给予患者，这取决于选定的给药途径，正如本领域技术人员所了解的一样。可以口服或胃肠外给予本发明的组合物。胃肠外给药包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、跨上皮、经鼻、肺内、鞘内、直肠和局部给药方式。胃肠外给药可通过在选定时间内连续输注进行。

本发明的激动剂或其盐或溶剂化物可与例如惰性稀释剂一起或与可同化可食用的载体(carder)一起口服给予，或可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或可压制成片剂，或可直接掺入膳食食品中。对于经口治疗性给药，本发明的激动剂可掺入赋形剂，并以可摄食片剂、口含片剂、糖锭、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。

本发明的激动剂还可胃肠外或腹膜内给予。可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中，制备作为游离碱或药理上可接受的盐或溶剂化物的本发明激动剂的溶液。还可在含或不含醇的甘油、液体聚乙二醇、DMSO及其混合物中以及在油中制备分散剂。在保存和使用的正常条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物生长。本领域技术人员应了解如何制备合适的制剂。选择和制备合适制剂的常规方法和成分描述于例如Remington'sPharmaceuticalSciences(1990–第18版)和1999年出版的美国药典：国家处方集(USP24NF19)。

适于注射用的药物形式包括无菌含水溶液剂或分散剂和用于临用时配制无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉针剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须具有流动性至存在容易注射性的程度。

可将本发明的激动剂单独或与上述药学上可接受的载体组合给予动物，所述载体的比例取决于激动剂的溶解度和化学性质、所选的给药途径和标准药学实践。

本发明的激动剂和/或组合物的剂量可随许多因素而变化，例如激动剂的药效学性质、给药方式、接受者的年龄、健康状况和体重、症状的性质和程度、治疗的频率和同时治疗(如有的话)的类型和激动剂在受治动物中的清除率。本领域技术人员可根据上述因素确定合适的剂量。本发明的激动剂可最初以可根据临床反应按需调节的合适剂量给予。

参照下列实验实施例对本发明进行进一步的详细描述。仅以说明的目的提供这些实施例，而无意限制，除非另有说明。因此，本发明绝不应解释为限于下列实施例，而应解释为包括由于本文提供的教导而变得显明的任何和全部变化。

实施例1

材料与合成方法

本发明的激动剂可采用本领域技术人员已知技术容易地合成，这类技术描述于例如AdvancedOrganicChemistry.March,第4版,JohnWileyandSons,NewYork,NY,1992；AdvancedOrganicChemistry,Carey和Sundberg,第A和B卷,第3版,PlenumPress,Inc.,NewYork,NY,1990；ProtectivegroupsinOrganicSynthesis,Green和Wuts,第2版,JohnWileyandSons,NewYork,NY,1991；ComprehensiveOrganicTransformations,Larock,VCHPublishers,Inc.,NewYork,NY,1988和其中引用的参考文献。可采用易获自商业来源的化学前体的标准合成转化，来制备本发明中描述的激动剂的起始材料，所述商业来源例如AldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI)；SigmaChemicalCo.(St.Louis,MO)；LancasterSynthesis(Windham,N.H.)；RyanScientific(Columbia,S.C.)；Canbridge(Cornwall,UK)；MatrixScientific(Columbia,S.C.)；Arcos,(Pittsburgh,PA)和TransWorldChemicals(Rockville,MD)。

试剂与抗体。抗CD11b单克隆抗体(mAb)44a(IgG2a)[37]和异二聚体特异性抗CD18mAbIB4(IgG2a)[38，39]来自ATCC。mAb24(IgG1)[40]来自Abcam，同种型对照抗体MOPC-21(IgG1)和MOPC-173(IgG2a)、FITC缀合的mAbA85-1(大鼠抗小鼠IgG1)、R19-15(大鼠抗小鼠IgG2a)和FITC缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白来自BDPharmingen(SanDiego，CA)。大鼠抗小鼠GR1-FITC和Mac-1-PE来自BDPharmingen(SanDiego，CA)。人血纤蛋白原(耗尽纤溶酶原、冯维勒布兰德因子和纤连蛋白)来自EnzymeResearchLaboratories(SouthBend，IN)；牛血清白蛋白(BSA)来自Sigma(St.Louis,MI)；重组人ICAM1-Fc来自R&DSystems(Minneapolis，MN)和iC3b来自Calbiochem(SanDiego，CA)。384孔板来自商业来源(来自Nalgene(Rochester，NY)的MaxiSorp，来自Corning(Corning，NY)的Highbind)。脱脂奶获自BioRad(Hercules，CA)。细胞定量试剂MTS来自Promega(Madison，WI)，ATPLite来自PerkinElmer(Boston，MA)。PCR试剂及限制酶和修饰酶获自NewEnglandBiolabsInc.(Beverly，MA)。谷胱甘肽珠粒购自Sigma(St.Louis,MI)。所有细胞培养试剂来自InvitrogenCorp.(SanDiego，CA)和Mediatech(Manassas，VA)。胎牛血清购自AtlantaBiologicals，Inc(Lawrenceville，GA)。G418抗生素购自Invivogen(SanDiego，CA)。

小鼠。C57BL/6J(B6)野生型和B6CD11b-/-(Jax3991)[41]小鼠购自JacksonLaboratory(BarHarbour，ME)。野生型Fischer344大鼠购自HarlanLaboratories(Indianapolis，IN)。动物护理和程序经迈阿密大学公共机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee,IACUC)批准，并按照公共机构准则执行。

细胞系。之前已描述了用野生型整联蛋白CD11b/CD18稳定转染的K562细胞(ATCC)(K562CD11b/CD18)[42，43]。之前已描述了突变型CD11bE320A[44]。按照文献方案[42，43]产生用突变型整联蛋白CD11bE320A/CD18稳定转染的K562细胞(K562E320A)。所有细胞系在Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)中维持，培养基补充了10%热灭活胎牛血清、50IU/ml青霉素和链霉素及0.5mg/mlG418。

K562细胞贴壁测定法。按之前的描述进行用固定化配体的细胞贴壁测定法[42]。以相同的方式，用所有不同的K562细胞系(K562、K562CD11b/CD18和K562E320A)进行测定。简单地说，将384孔Highbind微量测定板用30μL含有Ca2+和Mg2+离子各1mM的含配体的磷酸缓冲盐水溶液(pH7.4)(PBS++)在4℃下包被过夜。配体Fg以5-15mg/mL的浓度，iC3b以1-5mg/mL包被。异二聚体特异性mAbIB4(腹水)以1:100稀释度包被。随后，孔中的非特异性位置通过用含1%脱脂奶的Tris缓冲盐水(TBS)(pH7.4)在室温下温育1小时来封闭，嗜中性粒细胞测定除外，其中各孔用含有1%明胶的TBS封闭。接下来，孔用TBS洗涤3次。将K562细胞悬浮于测定缓冲液(含有Ca2+和Mg2+离子各1mM的TBS(TBS++))中，并转移到配体包被的孔(30,000个细胞/孔)中。通过将激动剂以2-10mM的浓度溶于DMSO中，来制备小分子激动剂leukadherin家族的储液。测定中DMSO最终浓度约为1%。在递增浓度的leukadherin存在下，将K562细胞在37℃下温育30分钟。为了赶出未贴壁细胞，将测定板轻轻倒置，并在室温下保持倒置状态30分钟。如前所述[42]，将剩余的贴壁细胞使用甲醛固定，使用成像显微术定量测定。对于阻断测定，将细胞与mAb44a和IB4一起在室温下温育30分钟后，加到测定孔中。以3-6个重复孔进行测定。所报告的数据来自至少3个独立实验之一。如前所述[42，45]，使用>100,000个小分子的文库，进行高通量筛选(HTS)测定以鉴定新的激动剂。

嗜中性粒细胞贴壁测定法。按照文献方案[46]，自巯基乙酸盐刺激的腹膜中分离8-10周龄WT和CD11b-/-B6小鼠的嗜中性粒细胞。将细胞悬浮于无血清培养基(IMDM)中，在37℃下在配体包被的孔中用leukadherin温育细胞10分钟。接下来，将测定板轻轻倒置，并在室温下保持倒置状态30分钟以赶出未贴壁细胞。如前所述[42，47]，剩余的贴壁细胞采用成像显微术定量测定。测定按一式三孔进行。所报告的数据来自至少3个独立实验之一。

趋化性测定和缩时视像显微术。如[48，49]所述，在酸清洗的玻璃或Fg包被的玻璃盖玻片上使用Zigmond室(NeuroProbe)，在2D表面上进行嗜中性粒细胞趋化性测定。使细胞迁移在leukadherin(15mM)不存在或存在时，在10mM细菌肽甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸(fMLP，Sigma)的梯度中进行。使用NikonEclipse90i倒置显微镜，以每30秒钟间隔记录细胞迁移达25分钟时间。采用PLANAPO20X微分干涉相差(DIC)显微镜术物镜，用NikonDS照相机获取图像，并录入NikonImaging软件。应用ImageJ软件(NIH，USA)，用移动超过10μm的能动群[48]进行嗜中性粒细胞迁移的分析，手动细胞跟踪使用ImageJ的Ibidi趋化性和迁移工具插件进行。还对迁移速度和总位移(离起点的距离)进行了分析。使用来自至少3个独立实验的每种条件至少50个独立细胞进行定量测定。

免疫荧光。为了检查整联蛋白CD11b/CD18和F-肌动蛋白在迁移性嗜中性粒细胞中的定位，在leukadherin(15mM)不存在或存在时，将细胞(104)在玻璃盖玻片上的无血清培养基(RPMI1640)中用10μMfMLP在37℃下刺激15分钟。将细胞固定，用0.1%TritonX-100透化，用抗小鼠CD11b抗体(克隆M/170，BDBiosciences)接着用山羊抗大鼠Alexa488(Invitrogen)和罗丹明标记的鬼笔环肽(Invitrogen)染色。用LeicaTCSSP5共焦显微镜和HCXPLAPO63x/1.4NA物镜并应用LeicaLAS-AF软件记录荧光图像的z-系列。用LeicaLAS-AF软件套件对z-系列进行分析。所提供的图像来自基部至顶端细胞侧的15个共焦切片的z-堆栈投影(z-stackprojection)(堆栈z间距，0.29μm)。所提供的图像是来自至少2个独立实验的每种条件分析至少20个细胞的代表性图像。

为了检查CD11b/CD18在细胞表面上的聚集，将K562CD11b/CD18细胞(104)悬浮于无血清培养基(IMDM)中，并如所述[50]，在leukadherin(15mM)不存在或存在下，在37℃下不与或与配体Fg(100mg)温育3小时。将细胞保持悬浮，用抗CD11b/CD18mAbIB4接着用山羊抗小鼠Alexa488(SIGMA)染色。用LeicaDMI16000去卷积显微镜和HCXPLAPO63x/1.3NA物镜，并应用LeicaLAS-AF软件，用由LAS-AF软件驱动的DCF360FX照相机，记录荧光图像。在ImageJ中对CD11b/CD18聚簇进行分析，另在ImageJ中产生荧光强度的三维图像。所提供的图像是来自至少3个独立实验的每种条件分析至少20个细胞的代表性图像。

重组CD11bA-结构域(αA结构域)的纯化。按照已发表的方案[51]，构建并纯化重组人αA结构域。简单地说，使用正向引物5’-ggttccgcgtggatccgagaacctgtactttcaaggaggatccaacctacggcag-3’(SEQIDNO:1)和反向引物5’-gaattcccggggatccaccctcgatcgcaaagat-3’(SEQIDNO:2)，通过克隆和表达跨越残基Gly111-Gly321(321WT)的蛋白质片段，来产生呈其无活性构象的αA-结构域，并按照生产商的方案，使用InfusionCloningKit(Clontech，MountainView，CA)插入载体pGEX-2T的BamHI位点。使用正向引物5’-ggttccgcgtggatccgagaacctgtactttcaaggaggttttcaggaatgt-3’(SEQIDNO:3)和反向引物5’-atatccccgggattaaccctcgatcgcaaagcccttctc-3’(SEQIDNO:4)，通过用Gly置换Ile316(I316G[52])，来产生呈其活性构象的αA-结构域。插入序列用BamHI和SmaI消化，并连接入同样用BamHI和SmaI消化的pGEX-2T载体。所有构建体通过直接DNA测序而证实。使所有重组蛋白在大肠杆菌(Escherichiacoli)中作为谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达，并按照生产商的说明书，通过亲和层析法(谷胱甘肽-珠粒，Sigma)纯化。经纯化的蛋白质制备物针对20mmTris-HCl(pH7.5)、150mmNaCl(Tris缓冲盐水)进行透析，随后使用Amicon-10柱(Millipore)浓缩，并保存在-80℃下。纯度通过1DSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实。

αA-结构域配体结合测定。Maxisorp96孔板用含Fg(1μg/孔)的10mMPBS(pH7.4)包被过夜后，用含1%牛血清白蛋白的PBS封闭。经纯化的加GST标签的αA-结构域(50mL/孔，5mg/mL溶液)与固定化Fg的结合在TBS测定缓冲液(含有0.1%BSA、1mMMg2+、1mMCa2+和0.05%Tween20的TBS)中在室温下进行1小时。通过用TBS++洗涤测定孔两次，除去未结合的αA-结构域。随后，通过与辣根过氧化物酶缀合的抗GST抗体(GE，Piscataway，NJ)(1:2000稀释度)温育1小时，来测定结合的蛋白质的量。通过用TBS++洗涤测定孔两次，除去未结合的抗GST-HRP。按照生产商的方案，使用TMB底物试剂盒(VectorLabs，Burlingame，CA)进行结合蛋白质的检测。利用SpectromaxM5分光光度计(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)，读取吸光度。测定按一式三孔进行测定，所示数据来自至少3个独立实验之一。

流式细胞术。利用已发表的方案[53，54]，进行用于整联蛋白CD11b/CD18细胞表面表达的K562细胞的流式细胞术分析。简单地说，将细胞悬浮于测定缓冲液(含有Ca2+和Mg2离子各1mM(TBS++)和0.1%BSA的TBS)中。在含15mMleukadherin的100mlTBS++不存在或存在下，将细胞(5X105)与第一mAb(1:100稀释度的IB4或44a腹水)一起在37℃下温育30分钟。随后，细胞用测定缓冲液洗涤3次，与山羊抗小鼠-APC(1mg/ml，Invitrogen)一起在4℃下温育20分钟。细胞用测定缓冲液洗涤2次，采用FACSCaliber流式细胞仪(BDBiosciences，CA)进行分析，统计至少10,000个事件。应用CellQuest软件(BDBiosciences)对数据进行分析。一式三份进行测定，所示数据来自至少3个独立实验之一。

细胞存活力测定。如所述进行细胞存活力测定。简单地说，将K562CD11b/CD18细胞(10,000个/孔)在96孔板(Corning，Corning，NY)中与增量的规定激动剂一起温育24小时。24小时后通过按照生产商的方案(Promega，Madison，WI)，使用MTS试剂，并将SpectramaxM5分光光度计(MolecularDevices)用于读取测定板，而测定活细胞的数目。所提供的数据是至少两个独立实验的代表性数据。

蛋白质印迹。将K562CD11b/CD18细胞在无血清培养基中与LA1、LA2、LA3(15mM)或FG(200mg)一起在37℃下温育1小时。采用已确立的方案，使细胞裂解物在10%SDS-PAGE凝胶中电泳，并转印到PVDF膜(ThermoScientific，Waltham，MA)上。将膜用1:1000稀释度的抗磷酸ERK1/2抗体(Thr202/Tyr204，CellSignaling,Danvers,MA)探测，用Reblot温和剥离溶液(Millipore，Billerica，MA)剥离，先用抗ERK1/2抗体(CellSignal)，接着用抗GAPDH抗体(CellSignaling)再探测，并按照生产商的方案(ThermoScientific，Waltham，MA)显影。所提供的数据为至少3个独立实验的代表性数据。

血细胞计数。在小鼠病理核心实验室中，采用标准测定法定量测定来自不同小鼠的全外周血白细胞计数。

体内腹膜炎模型。如前所述[46]，使用8-10周龄WTB6和CD11b-/-B6小鼠，产生巯基乙酸盐诱发性腹膜炎。在巯基乙酸盐(3%)腹膜内(i.p.)注射前30分钟给予Leukadherin激动剂。静脉内(i.v.)给予LA1和LA2(200mL的在盐水中的20mM溶液)。i.p.给予LA3(1mL的在盐水中的20mM溶液)。为了评价腹膜嗜中性粒细胞募集，在巯基乙酸盐注射后4小时使小鼠安乐死，收集腹膜灌洗液，如所述[55]，使用GR-1和Mac-1染色的双阳性细胞，定量测定迁移嗜中性粒细胞的数目。

气球诱导的大鼠动脉损伤。所有手术在异氟烷麻醉(Baxter，IL，USA)下进行。用适宜常规血管造影术试剂盒(BostonScientific，Scimed)的2FFogarty导管(BaxterCorp.，Irvine，CA，USA)，在右髂动脉中产生球囊损伤[56]。在腹主动脉处进行主动脉切开术，将2FFogarty栓子清除术导管插入右髂动脉水平面。使气球充气到1.5-1.6个大气压并缩回到动脉切开术部位3次。主动脉切口用8.0缝线修复。采用间断缝合方式，沿平面将腹腔闭合。损伤后3-30天收集动脉样本，在4%福尔马林-PBS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中固定5分钟，通过组织学和免疫染色进行分析。

组织学和免疫染色。将ElasticavanGieson染色用于组织化学分析以评价新内膜形成。应用NIHImageJ，以盲法方式进行形态测量分析。用抗大鼠CD68(1:50，AbDSerotec)的免疫染色用于检测组织中的巨噬细胞。

斑马鱼尾鳍损伤测定法。按照标准方案[58]，保持转基因Tg(mpx::eGFP)[57]。如所述[57]，在受精后3天(dpf)幼体中进行尾鳍损伤。将幼体浸入含4.2%三卡因(tricane)的E3中麻醉，按照已批准的方案，用无菌显微切割解剖刀，将尾部完整切断，并在规定时间点上回收。如所述(参考文献)，将斑马鱼幼体(3dpf)用激动剂处理。简单地说，通过将幼体浸入含激动剂的E3溶液中，给予小分子激动剂。保持DMSO最终浓度<1%。为了评价炎性反应，在损伤后4小时，对受损幼体进行分析。对于洗涤后测定，将未受损幼体与激动剂在E3中温育4-8小时，洗入E3中，并致损。使用LeicaDMI6000B显微镜和使用Volocity的HamamatsuOrca-3CCD照相机，对幼体进行分析。使用488nm处的激光进行激发，使用Volocity分析图像。以盲法方式用肉眼统计炎症部位荧光嗜中性粒细胞的数目。

统计分析。当比较两个或更多个组时，使用单因素方差分析与事后分析比较数据。p值<0.05视为显著。

计算建模。为了建立leukadherin与αA结构域的有活性的开放构象结合的模型，如下进行了系列计算研究。首先，产生呈开放(有活性)构象的αA-结构域的模型。呈其闭合(无活性)和开放(有活性，有配体接受能力(ligand-competent))构象的αA的高分辨率三维结构可获自PDB[59，60]。然而，与αA的闭合形式的三维结构[59]相比，在开放形式的三维结构[60]中αA中的α7螺旋(其产生已知为CD11b中的异亮氨酸槽(SILEN)[60]或CD11a中的IDAS[61]的疏水袋的部分，并且在αA-活化时具有最大构象变化[62-64])短3个残基。由于预测αA激动剂在该区11中结合，通过自αA闭合(无活性)形式[59]的结构域手工延伸高分辨αA-结构域结构[60]中的α7螺旋达3个额外残基。通过氢键优化和约束极小化，对模型进行精修。

为了鉴定可能的配体结合方式，如前所述[36]，应用在Schrodinger软件套件中执行的诱导契合停靠(inducedfitdocking,IFD)方法。采用MMGB/SA，排列αA位姿(pose)；利用用疏水溶剂可及性表面积条件(hydrophobicsolventaccessiblesurfaceareaterm，GBSA)扩大的GeneralizedBorn溶剂化模型，采用该方法估算激动剂与αA结合的自由能。然后使用标准电势，将优化的αA结构用于激动剂再停靠[65]。进行若干IFD运行，对于大多数激动剂，它们产生高评分位姿[36]。然后使用SchrodingerGlide和SP评分功能，使用IFD后的优化受体结构以停靠新的激动剂。接下来，在分子动力学模拟中，使呈其Z构型的激动剂的最佳评分位姿进一步优化。按照具有先于产生分子动力学运行的若干最小化和模拟步骤的多步方案，进行分子动力学模拟。在IBME-服务器1350群集器(36节点的8Xeon2.3GHZ核和12GB的内存)上使用SPC水模型(受体周围10?的立方形盒)，用DEShawResearch[66]的分子动力学包Desmond在300K和325K(NPT系综)下进行模拟。最终的模拟时间为12ns，其中所报告的位姿保持稳定。图12A-12E表示LA1、LA2和LA3的位姿。

结果

整联蛋白激动剂相对于拮抗剂具有几个优势。前些年用拮抗剂的研究显示它们是亚最佳的。首先，已表明用拮抗剂阻抑白细胞募集需要占据>90%的活性整联蛋白受体[32]，通常需要体内高水平的阻断抗体。第二，由于大的可动员的胞内CD11b/CD18库的可及性所致，即使用抗体也难于完全阻断细胞表面表达的CD11b/CD18[30，31]。第三，若干其它的拮抗剂，例如配体模拟物嗜中性粒细胞抑制因子(NIF)[67]和重组αA-结构域[68]，在动物模型中是有效的，但它们大的尺寸和免疫原性妨碍其用作治疗剂。重组NIF(UK-279276)在临床试验中失败。同样地，衍生于抗CD11b/CD18抗体或CD11b/CD18配体的肽在阻断体外配体结合中不太有效[69]，可能因为它们在溶液中的不适当构象或因为它们相对于CD11b/CD18上的配体结合区的小尺寸。最后，许多拮抗性抗体(例如rhuMAbCD18、抗CD18LeukArrest(Hu23F2G)和抗ICAM1mAb恩莫单抗(R6.5))在几个临床试验中在治疗炎性疾病/自身免疫性疾病时不成功[28，29]，以及β2整联蛋白阻断剂还显示预料不到的副作用，不得不从市场撤出[33]。

用于鉴定CD11b/CD18激动剂的测定法：目前，无法获得CD11b/CD18的小分子激动剂，主要因为：a)依赖于吸附在微量滴定板上经纯化的CD11b/CD18的现有筛选测定法，无法担当高通量筛选(HTS)活动，因为难以从哺乳动物细胞中获得必需量的CD11b/CD18，并且因为大部分所吸附的蛋白质在吸附到塑料表面时不能保持其天然构象，和b)目前在文献中缺少针对CD11b/CD18的优化的基于细胞的测定法，因为这类测定法由于细胞表面表达的CD11b/CD18与其生理配体的结合亲和力低所致而难以自动化。申请人最近描述了新的基于细胞粘附的HTS测定法用于筛选针对CD11b/CD18的小分子文库[42]。该测定法使用固定化血纤蛋白原(Fg)作为在哺乳动物K562细胞上稳定表达的CD11b/CD18的配体。在使该构思适于用于HTS时遇到的主要问题是不论如何轻柔地洗涤板孔以除去未贴壁细胞，自动化洗涤步骤都引起贴壁细胞大量和不均匀地从孔中脱落这一事实。这导致巨大的测定可变性。预料不到的是，发现将测定板简单的倒置籍重力轻轻地除去未贴壁细胞而不是用自动化洗板器，消除了可变性，并且形成稳定且可再现的筛选测定法。随后，采用DAPI染色的细胞核的自动成像以量化贴壁细胞。新研发的基于384孔板的测定法对于HTS是快速、便宜的，一致地产生可接受的Z’值(>0.5)，并且易于在HTS环境中实现。

新的CD11b/CD18激动剂——leukadherin的发现。采用本公司研发的基于细胞的高通量筛选(HTS)测定法[42]以针对K562CD11b/CD18细胞的激动剂筛选>100,000种分子的化学文库。作为一种独特的策略，重点集中在增加细胞粘附(激动剂)的激动剂上，而不是抑制细胞粘附的分子上。鉴定出增加K562CD11b/CD18与其生理配体血纤蛋白原(Fg)粘附(激动剂)的含有核心呋喃基噻唑烷酮基序的一系列激动剂[42，45]。K562CD11b/CD18细胞显示当在只有测定缓冲液(含生理离子Ca2+和Mg2+各1mM的Tris缓冲盐水(TBS++))中温育时，几乎不与固定化血纤蛋白原(Fg)结合。预料不到的是，发现命中(hits)的大子集含有中心5元2,4-二氧代-噻唑烷[42]以及含有2,4-二氧代-噻唑烷基序的激动剂作为命中[45]。采用结合测定法，用纯化的重组αA结构域证实了含有2,4-二氧代-噻唑烷基序的激动剂靶定αA-结构域，其中这些激动剂增加αA-结构域与固定化Fg的结合[70]。此外，结合是选择性的，因为不表达CD11b/CD18的细胞不具有任何可观结合，且用已知的阻断性单克隆抗体(mAb)44a[37](抗CD11b)和IB4[38，39](抗CD18)，可阻断表达CD11b/CD18的细胞的结合。

对中心核心上的各种取代的结构-活性关系(SAR)进行了研究[36]，鉴定出几种被称为leukadherin的激动剂。这包括增加与Fg的CD11b/CD18依赖性细胞粘附的leukadherin-1(LA1)、leukadherin-2(LA2)和leukadherin-3(LA3)，其EC50(粘附增加50%的有效浓度)值分别为4μM、12μM和14μM(图1A-1D)。几种其它的激动剂提供相似的活性水平。还鉴定出结构上相关的化合物，leukadherin-对照(LA-C)，其对CD11b/CD18依赖性细胞粘附无影响(图1A和1E)。不表达CD11b/CD18的细胞未显示任何明显的结合(图1B-1E)。与最近描述的在基础条件下增加LFA-1介导的粘附但在激活条件下抑制LFA-1介导的粘附的LFA-1的逆激动剂(Yang,W.,C.V.Carman,M.Kim,A.Salas,M.Shimaoka和T.A.Springer.2006.Asmallmoleculeagonistofanintegrin,alphaLbeta2(整联蛋白αLβ2的小分子激动剂).JBiolChem)不一样，在激动剂Mn²⁺存在下，LA1-3不抑制细胞粘附(图7A-7C)，表明它们是真实的激动剂。由已知的激动剂Mn²⁺和LA1-3诱导的表达CD11b/CD18的细胞的粘附增加，被抗CD11b/CD18单克隆抗体(mAb)IB4和44a阻断(图1F)，进一步证实了这些化合物介导CD11b/CD18依赖性细胞粘附。嗜中性粒细胞含有大的可动员的胞内CD11b/CD18库，其除有助于CD11b/CD18自无活性到活性形式的构象转变以外，还有助于增加嗜中性粒细胞与胞外基质粘附。为了排除CD11b/CD18表面表达的增量调节是因LA1-3引起的细胞粘附增加的原因所致的可能性，测量了其在K562CD11b/CD18细胞(图5)和嗜中性粒细胞(图6)上的表面表达，未发现由LA1-3引起的增加。由LA1-3引起的CD11b/CD18依赖性细胞粘附的增加不依赖于配体的类型，因为它们还增加与CD11b/CD18配体iC3b(图8A-C)和ICAM-1(图9)的细胞粘附。人单核细胞THP-1细胞也显示类似的细胞粘附的leukadherin诱导的增加，这表明了leukadherin的作用不依赖于细胞类型(图10A-10C)。LA1-3还增加野生型(WT)嗜中性粒细胞与固定化Fg的结合，但不增加CD11b^-/-嗜中性粒细胞的结合(3)(图1G)，这进一步证实这些化合物靶向CD11b/CD18。为了确定leukadherin是否还影响CD11b/CD18介导的吞噬，将K562CD11b/CD18细胞与iC3b调理的RBC(EiC3b)一起温育。发现LA1-3显著增加EiC3b的俘获和玫瑰花结形成，表明了这些激动剂还可增量调节CD11b/CD18介导的吞噬功能(图11)。这首次可供测试CD11b/CD18活化是否是抗炎的，以及整联蛋白的小分子激动剂是否可体内激活整联蛋白，并产生如由敲入以激活其它整联蛋白的突变体的动物所预期的结果。

此外，对许多类似物进行了计算机检查。采用呈其低亲和力及其高亲和力构象的αA-结构域的高分辨率三维结构的计算机停靠研究[59，60，62]表明，LA1-3优先在活化敏感性α7-螺旋区附近与αA结构域的开放式高亲和力构象结合，经变构稳定呈其高亲和力构象的αA-结构域[36](图12A-12E)。

对于某些式(II)的激动剂，发现在呋喃环C-5位的取代(R3取代基)对激动剂功效具有最大作用(例如化合物1-30)[36]。破坏与平面呋喃基环的π-共轭的非芳族或非共轭的取代基极为不利。在某些方向上，优选平面芳族环，相对于苯基环的邻位或对位上的脂族基还优选未取代的苯基环。对于噻唑烷(thaizolidine)环N-3位的取代基，缩短取代酯的长度(自乙基至甲基)，并且缩短脂族链长度是十分不利的。同样地，脂族链被苯基环取代是不利的。N-3位的长链大个残基也是不利的。然而，含有亚甲基取代的小芳族环的化合物以类似于LA3的水平结合。相反地，N-3位上的苄基与R3上的高度吸电子的和大个的对位取代的芳族的共取代极为不利。某些化合物还显示通过增加与固定化Fg的结合而与纯化的重组αA-结构域选择性结合[70]以及相对于CD11a/CD18显示对整联蛋白CD11b/CD18的高选择性。

为了进一步评价所述化合物，应用SchrodingerQikProp程序计算各种物理化学描述符。在该系列(化合物1-14)中最有利的化合物具有良好的经预测Caco-2细胞通透性和人口服吸收。其中LA1-3具有略微更好的clogP和更好的预测溶解度并且在最高的配体功效中(BEI=14)[71]。

接下来，为了深入了解这个小分子子集在αA结构域中的潜在结合袋，在计算机上进行了停靠实验。呈其闭合(无活性)和开放(有活性，有配体接受能力)构象的CD11bA-结构域的高分辨率三维结构可获自PDB[59，60，62]。然而，与αA的闭合形式的三维结构[59，62]相比，αA中的α7螺旋(其产生CD11b中的称为异亮氨酸槽(SILEN)[60]或CD11a中的IDAS[61]的疏水袋的部分，且在αA-活化时显示最大构象变化[62-64])在开放形式的三维结构[59，60]中短3个残基。由于预测新发现的激动剂在此区内结合，并稳定αA的这种构象，因此通过自闭合形式的结构手工延长CD11bA-结构域的高分辨结构[59，60]中的α7螺旋达3个额外残基，接着通过在Maestro蛋白质制备设施(SchrodingerInc，Portland)中执行的氢键优化和约束(Impref)极小化，来构建CD11bA-结构域的开放(活性，有配体接受能力)构象的模型。

α7螺旋在活化时的构象重新排布(其在激动剂结合时似乎是稳定的)表明，激动剂在螺旋α7和α1与中央β折叠间的区域结合[11，62]。以前的报告中也表明了这一点[11]。因此，在开放构象中利用αA-结构域的上述优化结构以启动化合物停靠。在脱辅基(apo)结构中，衬在结合袋内的许多疏水残基在空间上充满了这种活化敏感性α7螺旋区。应用在Schrodinger软件套件执行的诱导契合停靠方法，其中具有变弱的电势(softenedpotential)以产生可能位姿的系综的初始停靠后面是受体优化和配体再停靠[65]。这个方案产生LA1-3(Z构型)的高评分位姿，其中2,4-二氧代-噻唑烷核心及其类似物的羰基氧被Ser133和Thr169固定，且LA3的例如疏水2,4-二氯苯基部分在疏水袋中相互作用。在升温下，在稳定的6ns全原子显溶剂分子动力学模拟中(使用DEShawResearch的Desmond)[66]，α7螺旋仅略微调整。应用SchrodingerGlide程序[72]，使用诱导契合停靠受体以停靠额外的结构。然后采用允许受体柔性的MM-GB/SA方法[73]，对获得的位姿再评分以获得相对结合自由能更精确的估算值。所获得的最佳化合物的结合假设见图12A-12E和图24。正如所预期的一样，疏水苯基呋喃基部分(噻唑烷环上的C5-取代基)埋在里面衬有残基L312、I308、L305(α7螺旋)、L164、V160、F156(α1螺旋)和Y267、I269、I236、V238、I236、I135(中央β折叠)的疏水袋中。这种结构模型还解释了化合物LA-C(在结构上与LA1-3相关)为什么无活性，因为在这种结合方式中，LA-C中央噻唑烷环N-3位上的乙基羧酸酯部分的αC碳与Ser133、Thr169和Asp132紧密靠近(小于2.5?)，这就造成紧密契合，不容许存在于一些化合物中但不存在于LA1-3中的αC处的较大甲基。总的来说，发现对于最类似的化合物，空间上要求较高的化合物的较低活性，可(至少部分)归因于受体和/或配体应变(strain)提高。

SAR和结合假设表明一种疏水相互作用是至关重要的。通常发现具有两个极性末端的化合物无活性。疏水袋中的相互作用似乎对空间要求和分子的总体尺寸相当敏感。例如，在较小乙酸乙酯N-3取代基的情况下，容许较大以及较小的苯基呋喃基取代基(但是最小的最有活性)，而对于具有较大N-3取代基的结构，仅未取代苯基呋喃基有活性。因此，计算机停靠研究表明对于整联蛋白CD11b/CD18的这些新的变构激动剂的结合的合理假设。此外，在各种诱导契合停靠研究中，获得其它位姿。例如，一种模型显示化合物沿其长的垂直轴“晃动”。然而，在所有情况下，疏水部分在图12A-12E所述和所示的同一区内相互作用。

接下来，测定化合物相对于高度同源的整联蛋白CD11a/CD18(亦称LFA-1)对整联蛋白CD11b/CD18的选择性。产生用野生型整联蛋白CD11a/CD18稳定转染的K562细胞(K562CD11a/CD18)。接着，测量LA3增加与固定化ICAM-1(一种整联蛋白CD11a/CD18的生理配体)的细胞粘附的能力。结果表明对整联蛋白CD11b/CD18的选择性为CD11a/CD18的2倍，用K562CD11b/CD18细胞的EC50值为13.6±5μM。这不同于之前描述的化合物[35]，其在测定中显示与两种整联蛋白的结合相等。

为了鉴定LA1-3的结合部位(经预测其结合CD11b/CD18中的配体结合αA(或αI)结构域[35，36，42])，产生稳定表达突变型整联蛋白CD11bE320A/CD18的K562细胞(K562E320A)。在CD11bA-结构域(αA结构域)中的活化敏感性α7-螺旋之后的接头的高度保守的残基E320作为CD18vWFA-结构域(βA结构域或I结构域)的内源配体起作用[44]。E320A突变破坏激动剂Mn2+-离子介导的经由CD11b/CD18的配体结合增加。然而，通过其它激活突变使呈高亲和力构象的αA稳定克服了这个缺点，并诱导E320A突变体中的配体结合[63]。LA1、LA2和LA3(但非Mn2+)选择性地增加K562E320A与Fg的结合(图1H)，表明了这些化合物也结合并稳定呈高亲和力构象的αA-结构域。为了进行验证，使用纯化的重组体αA[70]，正如所预期的一样[35，42]，发现LA1和LA2提高WTαA与固定化配体的结合(图1I)至用含有构成型激活突变(I316G)的突变型αA-结构域[52]所观察到的结合水平。这就表示leukadherin结合稳定呈其开放的高亲和力构象的αA。

流式细胞术分析表明在LA1存在下，活化敏感性mAb24与K562CD11b/CD18细胞的结合增加，证实了LA1激活在活细胞上表达的全长整联蛋白(图13)。Bj?rklund等人描述了也靶向CD11b/CD18aA的CD11b/CD18激动剂(IMB-10)。我们采用我们的基于细胞的粘附测定对LA1和IMB-10对CD11b/CD18的相对亲和力进行了比较，发现LA1具有较高的亲和力(图14)，可能是因为其在旋转上受更大约束的呋喃基-噻唑烷酮中央支架所致。

2D表面上的白细胞趋化性包括整联蛋白介导的相继的粘附和去粘附步骤[74]。表达组成型活性整联蛋白突变体的细胞显示粘附增加，并且通过将整联蛋白凝固在配体结合状态而显著降低趋化梯度中的细胞迁移[75，76]。为了测试通过leukaderin的细胞粘附增加是否影响细胞迁移，采用响应于趋化因子肽甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)[49]的梯度的鼠嗜中性粒细胞趋化迁移。活细胞成像显示嗜中性粒细胞在生理缓冲液中平稳迁移(图2A)。然而，用LA1、LA2或LA3处理导致这些细胞的横向迁移和迁移速度显著降低(图2A-2C)。虽然LA1-3处理的细胞显示某种朝向趋化因子的运动，但是它们显示方向持续性降低(图2D)，且平均平方位移(MSD，图2E)减小，表明了与对照(DMSO)细胞更加定向的运动性相比，运动性受约束。与在leukadherin不存在时的嗜中性粒细胞趋化移动(其中它们显示典型的平坦前沿和短窄尾部)不一样，在LA1-3存在下的细胞迁移显示尾足加长，表明了细胞去粘附中的缺点作为细胞迁移降低背后的关键机制，正如用激活性整联蛋白突变所观察的一样[55，77]。为了进行研究，使用共焦显微术，显示LA1-3处理的细胞延长尾足中聚集的CD11b/CD18(图2F)，这就表明尾足中不能解除整联蛋白-基质相互作用是造成有缺陷的迁移的原因。Leukadherin处理显示在3D胶原凝胶中嗜中性粒细胞迁移无变化(图15A-15E)，这就支持最新的研究结论，即3D中的白细胞迁移是不依赖于整联蛋白的。但是，leukadherin通过增加与HUVEC层的细胞粘附，而在体外降低THP-1细胞跨越TNFa激活的HUVEC层的透内皮迁移(TEM)的效率(图2G-I)。总之，这些数据表明，leukadherin提高细胞粘附性，并减少其横向运动性，从而影响TEM。

整联蛋白活化和配体结合导致整联蛋白在细胞表面聚集，并启动由外到内的信号转导(包括p38促分裂原活化蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MAPK/ERK1/2)途径的活化[17，22])，从而模拟大多数细胞中的贴壁依赖性促存活信号[50]。由于LA1-3结合并激活CD11b/CD18，所以可以想像仅这类结合便可触发整联蛋白介导的由外到内的信号转导，因此模拟细胞的配体结合的整联蛋白状态，这对白细胞寿命和功能可能具有重大意义。为了进行测试，使得共焦显微术用于对细胞表面上的CD11b/CD18聚集成像[17]。在配体不存在时，细胞不显示可检测的CD11b/CD18大量聚集(图18A，DMSO)，但在加入外源Fg时显示高度聚集(图18B，DMSO)。同样地，用LA1-3处理仅在加入外部Fg时显示整联蛋白大量聚集(图18A-18B)，这就表明LA1-3不是整联蛋白配体模拟物。此外，因为已知的CD11b/CD18激动剂Mn2+[78]和激活性mAb[79]及其配体[17]诱导ERK1/2磷酸化，因此在细胞中检查了ERK1/2磷酸化，发现LA1-3处理不诱导磷酸化(pERK，图19)，这不同于与配体Fg(图19)或佛波醇酯PMA(未显示)一起的温育。因此可以得出结论，leukadherin不模拟配体，并且在细胞中不诱导由外到内的信号转导。

预料不到的是，与仅用DMSO处理(未显示)相比，LA1-3处理导致稳健的Akt磷酸化，像用配体Fg一样。由于已知pAkt阻抑促炎细胞因子的炎症信号(例如LPS)依赖性表达，这就表明leukadherin还可阻抑促炎细胞因子在白细胞中的表达。

Leukadherin减少嗜中性粒细胞和巨噬细胞的可溶性因子分泌。在测试leukadherin处理对白细胞的促炎细胞因子分泌的作用的实验中，WT小鼠巨噬细胞和嗜中性粒细胞在两种不同浓度的激动剂LA1不存在或存在时用LPS刺激，并测量细胞上清液中促炎细胞因子的水平。与未刺激的细胞相比，在两种细胞类型中，LPS处理显著增加细胞因子分泌(未显示)，而加入LA1显著减少上清液中的细胞因子，这就表明用leukadherin的CD11b/CD18活化可具有抗炎作用。

为了测定LA1-3在体内对炎性反应的作用，在小鼠中在急性巯基乙酸盐诱发性腹膜炎时监测其对嗜中性粒细胞募集的作用[41]。LA1-3显示在高达50μM的浓度下对K562细胞(图16A-16D)或对鼠嗜中性粒细胞(图17A-17C)无体外细胞毒性。与仅用盐水相比，腹膜内注射巯基乙酸盐导致嗜中性粒细胞显著的腹膜蓄积(p<0.001)(图3A)。与仅给予溶媒相比，在巯基乙酸盐注射前30分钟给予LA1显著减少嗜中性粒细胞蓄积(达40%，p<0.05)，LA2减少嗜中性粒细胞蓄积达65%(p<0.0001)，LA3减少嗜中性粒细胞蓄积达55%(p<0.05)。与溶媒治疗的动物相比，对来自用leukadherin治疗小鼠的循环中白细胞的测定结果显示其细胞数未减少(表1)。

表1

这表明leukadherin在体内不引起对白细胞的细胞毒性，因此排除了它是在leukadherin治疗动物中所观察到的迁移嗜中性粒细胞减少的原因。还发现，给予LA1-3不显著减少CD11b-/-小鼠腹膜中所募集的嗜中性粒细胞的数目(图3B)，如之前[41]已发表的，CD11b-/-小鼠显示与WT相比增加的嗜中性粒细胞蓄积。这进一步表明LA1-3体内选择性靶向整联蛋白CD11b/CD18。

在TGC诱发性腹膜炎中，发现在溶媒治疗动物中，腹膜嗜中性粒细胞数在4小时后增加，12小时后达得峰值，之后下降(图3C)。在LA1治疗动物中，嗜中性粒细胞蓄积在4小时时显著减少，在12小时后保持减少。在两个动物组中，在24小时后观察到数目相当的腹膜嗜中性粒细胞，表明leukadherin显著延迟嗜中性粒细胞募集。

利用TGC诱发性腹膜炎动物的组织学以确定leukadherin治疗是否导致嗜中性粒细胞隔离在任何特定器官中。在leukadherin治疗动物中未发现嗜中性粒细胞隔离(图3D)，证实了leukadherin不引起嗜中性粒细胞隔离在小鼠中的任何特定器官中，leukadherin的作用实际上部分通过其炎症部位附近的嗜中性粒细胞粘附性增加和嗜中性粒细胞运动性减少而介导。

白细胞募集先于经皮腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)之后的新内膜增厚和再狭窄[3]。机械血管损伤部位的内皮细胞内衬的剥脱导致血纤蛋白和血小板沉积，在该处血小板细胞表面受体GPIbα和白细胞表面表达的整联蛋白CD11b/CD18之间的选择性结合介导白细胞募集[80]。实际上，在机械血管损伤实验模型中，在血管成形术或支架植入后，抗体介导的CD11b/CD18阻断或其缺乏(CD11b-/-)减少内膜增厚[25]。为了研究药理学激活性CD11b/CD18体内对这种损伤的作用，在大鼠动脉球囊损伤模型中对激动剂进行了测试[56]。在损伤前30分钟，将LeukadherinLA1、LA3或溶媒(DMSO)给予Fisher雄性大鼠，每隔一天继续注射达3周。LA2显示无作用，可能是因为大鼠和人αA间结合袋的差异(仅约70%同源性[68])。与溶媒治疗动物(比率为0.23±0.01)相比，LA1和LA3治疗动物的受损动脉显示新内膜增厚显著减少(新内膜与中膜之比分别为0.16±0.02和0.14±0.01，p<0.05)(图3E-3J和21A-21D)。对照化合物LA-C显示无作用(图20A-20B)。为了确定leukadherin治疗是否导致先于血管重建的白细胞蓄积减少，在损伤后3天，使用巨噬细胞特异性抗CD68抗体，对动脉进行免疫组织化学分析。相对于溶媒对照(42.2±6.7)，在LA1和LA3治疗动物的动脉中，观察到内侧的巨噬细胞数显著减少(分别为17.7±3.1和6.9±1.3，p<0.0001)(图3E-3J和21A-21D)。总之，这些结果表明，leukadherin治疗导致血管损伤部位的白细胞蓄积减少和随后的新内膜增厚减弱。

预料不到的是，采用以下实验，发现整联蛋白激动剂(leukadherin)在治疗炎症性损伤时具有优于整联蛋白拮抗剂的治疗优势。使用已确立的肾病抗肾小球基底膜(抗GBM)肾炎小鼠模型，在充分表征的CD11b/CD18拮抗剂(抗CD11b抗体M1/70)和LA1之间进行了头对头比较。该模型的特征在于介导尿蛋白质丢失(包括白蛋白)的嗜中性粒细胞浸润。与CD11b在该疾病中的重要作用一致，CD11b^-/-小鼠和抗CD11bmAb治疗的大鼠显示白细胞浸润减少，并免于蛋白尿。在此，小鼠中疾病的诱发导致在第3天嗜中性粒细胞的峰值流入和最高的蛋白尿(图3K-3L)。M1/70显著减少嗜中性粒细胞流入，并减少蛋白尿。然而，在受治小鼠中，在浸润性嗜中性粒细胞数和蛋白尿两方向，LA1都产生显著和最大的减少，证实了激动剂优于拮抗剂的明显治疗优势。

为了观察leukadherin治疗对活动物中白细胞蓄积的作用，使用表达在骨髓特异性过氧化物酶基因(mpx)启动子控制下的GFP的转基因Tg(mpx::eGFP)斑马鱼，以对嗜中性粒细胞进行特异性荧光标记用于白细胞募集的实时成像[57]。在受精后3天(dpf)的斑马鱼幼体中，横切尾鳍导致嗜中性粒细胞快速稳固地募集到组织损伤部位(图4A-4C和22A-22D)[57]。将LA1和LA2给予未受损幼体显示无可观察得到的作用(图4B和22B)。然而，与仅用溶媒治疗(34.6±4.5)相比，损伤后4小时LA1和LA2两者显著减少斑马鱼尾鳍中的嗜中性粒细胞蓄积(分别为15.6±1.7和13.3±2.1，p<0.0001)。受损的整个斑马鱼幼体的荧光成像显示，在leakadherin治疗和未治疗的动物中嗜中性粒细胞的总数无差异(图23)，这表明了leukadherin介导的嗜中性粒细胞在损伤部位的蓄积的减少不是因为嗜中性粒细胞数目的总体减少，还验证了在表明leukadherin不引起体内细胞毒性的小鼠实验的结果(表1)。最后，为了确定leukadherin治疗的体内作用是否是可逆的，将LA1和LA2给予未受损斑马鱼达4-8小时，冲洗斑马鱼，诱导尾鳍损伤，洗涤后4小时，定量测定嗜中性粒细胞蓄积。发现除去化合物导致在受损尾鳍处嗜中性粒细胞蓄积的水平与在未治疗的斑马鱼幼体中的类似。总的来说，这些数据表明，leukadherin下调嗜中性粒细胞在组织损伤部位的蓄积，且其体内作用可通过除去这些化合物而逆转。

此外，leukadherin治疗导致混合淋巴细胞反应(MLR)中T细胞增殖减弱，表明了在治疗各种炎性疾病和自身免疫性疾病中的额外用途。

Leukadherin体外增加嗜中性粒细胞粘附，并降低2D趋化性。为了测定leukadherin体内是否对嗜中性粒细胞具有类似作用，将活体显微镜检查法用于小鼠提睾肌，结果发现leukadherin增加毛细血管后微静脉中的嗜中性粒细胞粘附，并降低其滚动速度(未显示)，这就表明这些激动剂同样在体内起作用。更重要的是，发现阻断性抗CD11bmAbM1/70逆转leukadherin的作用，证实了leukadherin的作用是通过其对CD11b/CD18的激动作用而达到的。

超过15年前，首次提出整联蛋白活化作为调节炎性白细胞的组织侵袭的潜在治疗策略[81]。本文中，表明了CD11b/CD18激动剂可调节白细胞募集和炎症性损伤。leukadherin激活的CD11b/CD18增加白细胞粘附，所述白细胞粘附减少白细胞爬行和跨内皮迁移，因此，减少进入发炎/受损组织中的募集[82]。本文所提供的数据表明，整联蛋白特异性小分子介导的血管系统中白细胞粘附的增加减少白细胞浸润和炎症，并且可以是治疗多种炎性疾病和自身免疫性疾病的有效的药理上可命中目标的方法。

实施例2

1，肾损伤期间的初始非免疫损伤启动引起炎症和组织损伤的先天性免疫应答(43)。从受损组织释放的内源配体利用Toll样受体(TLR)，例如Toll样受体4(TLR4)，使得在肾细胞和白细胞上的TLR4活化进一步加重肾损伤。CD11b/CD18除增加细胞粘附和调节迁移以外，还调节白细胞中的TLR4介导的促炎信号转导(44-46)，表明了CD11b/CD18在调节白细胞活化和炎症中具有许多作用。2，CD11b/CD18活化还介导许多胞内信号转导事件，包括骨髓细胞中活性氧类别(ROS)的产生和许多促炎和抗炎基因的调节(47-52)。CD11b/CD18活化和配体结合启动由外到内的信号转导，包括PI3-K/Akt和MAPK/ERK1/2途径的活化(48，53)，从而模拟贴壁依赖性促存活信号。CD11b/CD18的连接和聚集还协同加强促炎细胞因子(例如IL1b、IL6、TNF-α)和其它因子(例如基质金属蛋白酶(MMP))的NF-kB依赖性表达。然而，CD11b/CD18缺乏提高TLR4触发的促炎细胞因子的产生，表明了CD11b/CD18活化可能是保护性的，并且可负调节白细胞的促炎途径(54-56)。Leukadherin是激活CD11b/CD18并减少体内白细胞募集的新的化合物。在本文中，推测leukadherin介导的CD11b/CD18的活化可降低TLR4介导的和TNFR介导的白细胞活化和促炎分子的产生，证实了CD11b/CD18活化可负调节白细胞的促炎途径。还推测CD11b/CD18的活化通过增加胞内衔接物MyD88降解、阻抑NF-kB途径从而降低白细胞产生的促炎细胞因子、趋化因子、ROS和MMP的水平，来限制白细胞的促炎反应。3，因为白细胞是循环suPAR(一种与FSGS有关的因子)的来源，因此推测白细胞在非炎症性肾小球病中起作用，而且还可用leukadherin降低这类白细胞活化。

数据

1.1Leukadherin增加pAKT但不模拟整联蛋白配体。尚不清楚整联蛋白活化对比整联蛋白连接和聚集是否与TLR和细胞因子受体信号转导差异性地协同作用。已经表明激活的(被Mn2+-离子或用激活性mAb激活)或配体结合的(48)CD11b/CD18作为聚簇存在于嗜中性粒细胞表面(48)。尚不清楚用leukadherin活化是否可导致亲合力提高。此外，已知CD11b/CD18激动剂Mn2+离子和激活性mAb像CD11b/CD18配体Fg那样(48)诱导pERK1/2和pAkt(57，58)，从而诱导促存活和促炎信号转导。同样地，激活性mAb与CD11b/CD18的结合足以诱导由外到内的信号转导，并模拟配体结合状态(57，58)，表明了通过外源作用剂稳定活性整联蛋白构象可能具有有害的免疫后果(58)。不清楚新发现的CD11b/CD18激动剂如何调节胞内事件。

因此，对经由leukadherin的整联蛋白活化对这类胞内信号转导事件的作用进行了研究。发现LA1-3处理的CD11b/CD18+细胞显示无pERK1/2(图25A)，与DMSO处理的细胞类似。然而，与配体Fg的温育显示这些细胞的pERK明显的预期增加，用佛波醇酯PMA处理亦是如此(未显示)。预料不到的是，与仅用DMSO处理相比，LA1-3处理导致稳固的Akt磷酸化(图25B)。由于已知pAkt阻抑促炎细胞因子的炎症信号(例如LPS)依赖性表达，因此这就表明leukadherin也可阻抑白细胞中的促炎细胞因子表达。为了测试激动剂介导的整联蛋白活化是否也改变亲合力，采用免疫荧光显微术用于成像，对细胞表面的整联蛋白聚集进行分析(48)。在配体不存在时，在LA1、LA2和LA3不存在(DMSO)或存在下细胞显示无可检测的CD11b/CD18的大量聚集(32)，这就表明了仅激动剂结合不诱导整联蛋白聚集。预期地，加入外部配体Fg在两种条件下产生明显的聚集。

1.2Leukadherin降低促炎因子的分泌。在测试leukadherin处理对白细胞的促炎因子分泌的作用的概念验证实验中，在激动剂LA1不存在或存在下，将WT小鼠嗜中性粒细胞或巨噬细胞用LPS刺激后，测量细胞培养上清液中各种因子的水平。图26A-26D表示与未刺激的细胞相比，LPS处理显著增加IL-6、TNF-α和MCP-1的水平，而且加入LA1显著减少上清液中所有3种因子的水平。同样地，在TNF-α激活的人嗜中性粒细胞中，LA1降低活性氧类别(ROS)的水平(图27)。这些数据表明，用leukadherin的CD11b/CD18活化可阻抑白细胞中的促炎信号转导，并具有抗炎作用。

1.3Leukadherin加快MyD88降解。TLR4介导的信号转导需要衔接物蛋白质MyD88的参与(43)，MyD88-/-小鼠免于IRI后的肾损伤。TLR4活化导致衔接物蛋白质MyD88的结合和稳定，所述衔接物蛋白质MyD88募集下游激酶以启动Nf-kB介导的促炎信号转导。随后，TLR4信号转导通过CD11b/CD18的内源活化诱导负反馈环，其激活Syk以使MyD88磷酰化，给其加标签用于遍在蛋白介导的破坏。这就表明CD11b/CD18激动剂可导致MyD88降解加快，从而诱导TLR4介导的促炎信号转导途径更快受阻。进行了预实验，以通过测定人单核细胞THP-1细胞中的MyD88水平来验证这种假设。发现TLR4激动剂LPS产生稳定达至少4小时的稳固的MyD88信号(图28)。然而，细胞用LA1共处理导致MyD88更快得多的降解。实际上，细胞与仅LA1一起温育(在LPS不存在时)导致在不到2小时内MyD88完全降解，这就表明了CD11b/CD18的活化可下调白细胞中的MyD88依赖性胞内信号转导。

1.4Leukadherin保护小鼠免于脓毒症。脓毒症的特征在于对感染的重度炎性反应，并且其并发症导致多器官衰竭，包括急性肾损伤，并且脓毒症可能是致命的(59)。已知通过leukadherin的CD11b/CD18活化显著降低TLR4介导的胞内信号转导，想了解这些化合物是否也可降低WT小鼠中的TLR4诱导性脓毒症，正如用MyD88-/-动物所观察的一样。在盲肠结扎穿孔(CLP)诱导脓毒症(59)后，在24小时内20%的未治疗小鼠死亡(图29)，所有小鼠在72小时内死亡，而80%的LA1治疗小鼠存活达36小时，40%的小鼠最终存活，这就强有力地表明了CD11b/CD18激动剂体内可减轻TLR4介导的炎症。一项更完整的动物分析目前正在进行中。

1.5用靶向白细胞的新的小分子降低血清中的循环suPAR水平。白细胞在胞内库中保留大量的uPAR，在活化时增加uPAR的表面表达以及将suPAR释放到循环中(22)。鉴于它们在suPAR产生中的重要作用，白细胞是用于降低血清中的suPAR水平的可行的靶细胞。发现leukadherin治疗在抗GBM肾炎小鼠模型中显著减少循环suPAR水平，并保护肾功能(图30)，这就表明这些化合物可作为用于减少白细胞依赖性循环系统疾病因素的作用剂在治疗上相关。

1.624小时时Leukadherin减轻肾IRI。为了评价leukadherin在IRI诱导的WT小鼠肾功能改变中的应用，进行了概念验证实验。将B6雄性小鼠(8-12周龄)麻醉，放在加热垫上以使之保持在37℃的恒温。接下来，进行剖腹术，用无创血管夹在两侧闭合肾蒂30分钟，然后松开血管夹，缝合手术切口。以相同方法但在不用血管夹的情况下进行假手术。缺血后24小时，通过测量血清肌酸酐水平，对肾IR损伤进行评价(图31)。使用手动试剂盒(StanbioLaboratory)，将来自尾部切口的小鼠血清用于sCr(和BUN水平(未显示))分析。与溶媒DMSO治疗的动物相比，在IR损伤前30分钟给予leukadherinLA1和LA2显示sCr水平显著降低，这就表明了这些化合物具有肾保护作用。

在整个本申请中，通过作者和年份及专利编号引用各种出版物，包括美国专利。下面列出出版物的完整引用。这些出版物和专利的公开内容通过引用以其整体特此结合到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术水平。

以示例性方式对本发明进行了描述，要理解的是所使用的术语旨在描述词语的性质而非限制。

显然，根据上述教导，本发明的许多修改和变化是可能的。因此要理解的是，可在随附权利要求的范围内以与明确描述不同的方式实施本发明。

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90.PetruzzelliL,MaduziaL,SpringerTA.Activationoflymphocytefunction-associatedmolecule-1(CD11a/CD18)andMac-1(CD11b/CD18)mimickedbyanantibodydirectedagainstCD18(由针对CD18的抗体模拟的淋巴细胞功能相关分子-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)的活化).JImmunol.1995;155(2):854-66。

91.KeizerGD,VisserW,VliemM,FigdorCG.Amonoclonalantibody(NKI-L16)directedagainstauniqueepitopeonthealpha-chainofhumanleukocytefunction-associatedantigen1induceshomotypiccell-cellinteractions(针对人白细胞功能相关抗原1α-链上的独特表位的单克隆抗体(NKI-L16)诱导同型细胞与细胞的相互作用).JImmunol.1988;140(5):1393-400。

92.AndrewD,ShockA,BallE,OrtleppS,BellJ,RobinsonM.KIM185,amonoclonalantibodytoCD18whichinducesachangeintheconformationofCD18andpromotesbothLFA-1-andCR3-dependentadhesion(诱导CD18构象改变并促进LFA-1依赖性粘附和CR3依赖性粘附两者的CD18的单克隆抗体KIM185).EurJImmunol.1993;23(9):2217-22。

93.RobinsonMK,AndrewD,RosenH,BrownD,OrtleppS,StephensP等,AntibodyagainsttheLeu-CAMbeta-chain(CD18)promotesbothLFA-1-andCR3-dependentadhesionevents(抗Leu-CAMβ-链(CD18)抗体促进LFA-1依赖性粘附和CR3依赖性粘附两个事件).JImmunol.1992;148(4):1080-5。

94.DransfieldI,HoggN.RegulatedexpressionofMg2+bindingepitopeonleukocyteintegrinalphasubunits(白细胞整联蛋白α亚基上的Mg2+结合表位的调节性表达).EMBOJ.1989;8(12):3759-65。

95.BazilV,StefanovaI,HilgertI,KristofovaH,VanekS,HorejsiV.Monoclonalantibodiesagainsthumanleucocyteantigens.IV.AntibodiesagainstsubunitsoftheLFA-1(CD11a/CD18)leucocyte-adhesionglycoprotein(抗人白细胞抗原的单克隆抗体。IV.抗LFA-1(CD11a/CD18)白细胞-粘附糖蛋白的亚基的抗体).FoliaBiol(Praha).1990;36(1):41-50。

Claims

1.化合物在制备治疗与β2整联蛋白活性相关的疾病的药物中的用途，所述化合物具有下式：

，

或其药学上可接受的盐，其中

B不存在且R¹为苯基，或

B为亚甲基且R¹为苯基或被一个氟取代的苯基；

X为O或S；和

R³选自4-羧基苯基和3-羧基-4氯苯基，和

其中

该疾病选自慢性肾病、与血管损伤相关的新内膜增厚、糖尿病、狼疮和腹膜炎。

2.权利要求1的用途，其中所述化合物选自下式及其药学上可接受的盐：

、、、。

3.权利要求2的用途，其中所述化合物选自下式及其药学上可接受的盐：

、、、、

。

4.权利要求1的用途，其中所述化合物为:

,

或其药学上可接受的盐。

5.权利要求1的用途，其中所述化合物为:

，

或其药学上可接受的盐。

6.权利要求1的用途，其中所述化合物为:

，

或其药学上可接受的盐。

7.权利要求1的用途，其中所述化合物为:

，

或其药学上可接受的盐。

8.权利要求1的用途，其中所述化合物为:

，

或其药学上可接受的盐。