JP6310000B2 - インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を調節するための化合物及び方法 - Google Patents

インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を調節するための化合物及び方法 Download PDF

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Description

本発明は、様々な薬剤によるインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化に関する。本発明は、さらに、炎症性疾患を治療することに関する。
インテグリンは、細胞接着、遊走及びシグナル伝達を媒介する非共有結合型α／βヘテロ二量体受容体である。そのリガンドとともに、インテグリンは、発生、ホメオスタシス、炎症及び免疫を含む多くの過程において、並びに癌浸潤及び心血管疾患等の病理学的状態において中心的な役割を果たす。白血球の遊走及び動員は、損傷及び感染に対するその正常な免疫応答にとって、並びに様々な炎症性障害及び自己免疫障害において不可欠である［１］。白血球機能は、高度に発現されるインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１、ＣＲ３、及びαＭβ２としても知られる）を含む、β２インテグリンによって調節される［２］。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、特に、補体断片ｉＣ３ｂ、フィブリノーゲン、及びＩＣＡＭ−１をリガンドとして認識する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、多くの炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば虚血−再灌流傷害（急性腎不全及びアテローム性動脈硬化を含む）、組織傷害、卒中、血管損傷に応答した新生内膜肥厚、並びに炎症過程の消散に関係があるとされている［３−７］。
白血球β２インテグリンは、腫瘍浸潤を調節する。損傷又は感染に応答して、白血球は、それらが免疫クリアランスに関与する組織に動員される［２］。腫瘍は、また、炎症性サイトカインを分泌して、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞を動員し、血管新生を促進する［８］。共通のβ−サブユニット（β２、ＣＤ１８）を有するが、異なるα−サブユニット（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、及びＣＤ１１ｄ［９］）を有するα／βヘテロ二量体インテグリン受容体のサブファミリーであるβ２インテグリンは、白血球特異的受容体である［１０］。白血球における２つの主要なβ２インテグリンのうちの１つであるインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、白血球のその様々なリガンド（数は３０個を超える）への結合を媒介し、かつ炎症を起こした組織への白血球の遊走及び動員を媒介する［１，１１］。癌治療中に、放射線照射された腫瘍は、多数の特定の白血球、腫瘍血管系を回復させ、腫瘍の再増殖及び再発を可能にするマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）を発現する骨髄由来ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞を動員する［１２］。最近の研究は、ＣＤ１１ｂアンタゴニスト（抗ＣＤ１１ｂ抗体）による処理が、マウスにおけるＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞浸潤及び放射線に対する腫瘍応答の増強を低下させることを示した［１２］。
炎症性白血球は、抗ＧＢＭ腎炎を促進する。マウスにおける実験的抗ＧＢＭ腎炎は、急速進行性糸球体腎炎のモデルであり、タンパク尿、白血球浸潤、及び糸球体半月体形成を特徴とする［１３，１４］。白血球は、抗ＧＢＭ腎炎の発病において重要な役割を果たしており、その数は、半月体形成性糸球体のパーセンテージと相関する。ＣＤ１１ｂ−／−動物は、タンパク尿を示さず、腎機能の強い保護を示し［１５］、このインテグリンを標的とする薬剤が、この疾患を治療する潜在能力を有することを示している。
細胞接着を増加させ、遊走を調節することに加えて、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化は、活性酸素種の産生及び骨髄細胞におけるいくつかの炎症促進性遺伝子及び抗炎症性遺伝子の調節を含む、いくつかの細胞内シグナル伝達事象を媒介する［１６−２１］。インテグリン活性化及びリガンド結合は、細胞表面でのそのクラスタリングを生じさせ、ＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化を含む外側から内側へのシグナル伝達を開始し［１７，２２］、それにより大部分の細胞におけるアンカレッジ依存的な生存促進性シグナルを模倣する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のライゲーション及びクラスタリングは、また、他の受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びサイトカイン受容体インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）及びＴＮＦＲ）による細胞内シグナル伝達を相乗的に促進し、両方とも、ＮＦ−κＢ依存的な炎症促進性サイトカイン（例えば；ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）の発現及び他の因子（例えば；組織因子）の放出を誘導する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８欠損は、ＴＬＲ４によって誘発される炎症促進性サイトカインの産生を増強し、これは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８が、保護的役割を有することができ、白血球の炎症促進性経路を負に調節し得ることを示唆する（１−３）。
したがって、様々な炎症状態の治療のための治療剤としてのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の機能を調節する薬剤のかなりの潜在的な可能性がある。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、通常、循環白血球内及び多くの他の細胞内で構成的に不活性な立体構造で発現されているが、細胞接着、遊走及び炎症の部位での細胞の蓄積を媒介するように速やかに活性化される［２３］。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、ミクログリア、肝細胞、並びにＴ細胞及びＢ細胞のサブタイプを含む、他の細胞型及び組織でも発現されている。実際、抗体及びリガンド模倣体（抗接着療法）によるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８及びそのリガンドの遮断［２４−２６］、並びにＣＤ１１ｂ又はＣＤ１８の遺伝子除去は、多くの実験モデルにおいてインビボで炎症応答の重症度を低下させる［２７，２８］。しかし、そのような遮断薬は、ヒトの炎症性疾患／自己免疫疾患を治療するのにほとんど成功しておらず［２８，２９］、その理由はおそらく、抗体によるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の完全な遮断が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の大量の移動可能な細胞内プールの利用可能性のために困難であること［３０，３１］、又は遮断薬による白血球動員の抑制が、活性型インテグリン受容体の９０％超の占有を必要とすること［３２］である。抗インテグリンβ２抗体は、予想外の副作用も示している［３３］。さらに、活性化剤による処置から予想される、ごく一部のネイティブなインテグリン受容体のインビボでの一過性の活性化が、生理的に関連のある状況で何らかの顕著な生物学的効果を有するかどうかについては、未解決のままである。
そのため、インテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８及びＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８を含むβ２インテグリンのリガンド結合及び機能を選択的に調節する、抗体、タンパク質、ペプチド、化学的化合物及び小分子等の新規の薬剤が必要とされる。さらに、インテグリン上のリガンド結合部位ではなく、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８中のイソロイシンのための疎水性部位（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｉｔｅ−ｆｏｒ−ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）（ＳＩＬＥＮ）ポケット等のアロステリック調節部位を標的とするか又はそれに結合することによって、インテグリンを活性化する薬剤（アゴニスト）が必要とされる。したがって、インテグリンのリガンド結合機能を遮断しないインテグリン活性剤が必要とされる。さらに、インテグリン媒介性の細胞接着及び細胞機能を増強又は促進する薬剤及び方法が極めて望ましい。しかし、そのようなアゴニスト、特にＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を含むβ２インテグリンを選択的に標的とするか、又はそれを選択的に活性化するようなアゴニストの同定に向けた進展は遅く、ほんの数例しか発見が報告されてない［３４，３５］。
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、また、細胞の遊走、動員、及び他の生物学的機能を含む、細胞（例えば、白血球、ミクログリア、肝細胞及びリンパ球）の機能を調節するための戦略として、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の遮断ではなく、その活性化を伴う新規の手法を記載している。そのような生物学的機能には、サイトカイン等のエフェクター分子の生成が含まれる。インビボで容易に送達され、様々な哺乳動物での使用のために容易に最適化され得る、小分子等の様々な作用物質であれば、インテグリンを活性化するための最も優れた手法となるであろうという戦略を立てた。ここでは、限定するものではないが、炎症性疾患が新規の小分子によるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化によって軽減され得ることが示されている。これは、インテグリン活性化が、限定するものではないが、種々の炎症性及び自己免疫性の疾患及び状態を治療するための、新規の、有用な、薬理学的に標的とすることができる方法であることを示している。本発明は、インテグリン及びインテグリン発現細胞の生物学的機能を調節するための、現在文献中で実践されている抗接着戦略に代わるものとしての、新規の戦略を記載している。生物製剤、抗体、抗体断片、タンパク質、脂質、オリゴヌクレオチド、及び化学的化合物等の多くの異なる種類の薬剤が、インテグリンを活性化することができる。
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を含む、β２インテグリンを調節する有用なアゴニスト及び組成物の重要な要件は、それらが、細胞、組織、及び動物の生存に悪影響を及ぼさないことである。そのようなアゴニスト、組成物、及び方法を記載することが本発明の目的である。さらに、本発明のアゴニスト及び方法による処置から予想される、ごく一部のネイティブな受容体のインビボでの一過性の活性化が、生理的に関連のあるモデル系において生物学的効果を有することを示すことが本発明の目的である。さらに、本発明は、他の関連する利点を提供する。
本発明は、有効量のβ２インテグリンアゴニスト及び医薬として許容される担体を含むβ２インテグリンアゴニストの医薬製剤を提供する。
本発明は、β２インテグリンをβ２インテグリンアゴニストと相互作用させることによって、β２インテグリンを活性化する方法を提供する。
本発明はまた、有効量のβ２インテグリンアゴニストを投与し、β２インテグリンを活性化することによって、患者を治療する方法を提供する。
本発明は、β２インテグリンアゴニストを炎症を有する患者に投与し、β２インテグリンを活性化し、炎症を軽減することによって、炎症を治療する方法を提供する。
本発明はさらに、β２インテグリンアゴニストを患者に投与し、β２インテグリンを活性化することによって、腎虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を治療及び／又は予防する方法を提供する。
本発明は、ステント等の装置を挿入する前にβ２インテグリンアゴニストを投与し、β２インテグリンを活性化することによって、患者の再狭窄を低減させる方法を提供する。
本発明は、β２インテグリンアゴニストをコーティングしたステント等の装置を投与し、β２インテグリンを活性化することによって、患者の再狭窄を低減させる方法を提供する。
本発明はまた、β２インテグリンの活性を調節するβ２インテグリン内の部位を特定し、結合ポケットの正確な三次元構造を決定し、この結合ポケットと相互作用することができる小分子を同定することによって、β２インテグリンの小分子モジュレーターの同定のためのアッセイを行なう方法を提供する。
本発明は、β２インテグリンアゴニストを投与し、β２インテグリンアゴニストのβ２インテグリンへの結合を検出し、疾患の存在を確認することによって、患者の疾患を検出する方法を提供する。
本発明はまた、有効量のβ２インテグリンアゴニストを投与し、β２インテグリンを活性化することによって、患者の全般的な健康を改善する方法を提供する。
本発明の他の利点は、添付の図面と関連させて検討するときに、以下の詳細な説明を参照することによって、より良く理解されるようになるので、容易に理解される。
図１Ａ−１Ｉは、ロイカドヘリンがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８依存的な細胞接着を増加させることを示す。図１Ａは、ＬＡ１、ＬＡ２、ＬＡ３及びＬＡ−Ｃの化学構造を示し；図１Ｂ〜１Ｅは、増加量のＬＡ１、ＬＡ２、ＬＡ３、及びＬＡ−Ｃの存在下で固相化Ｆｇに接着しているインプットのＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞（黒塗りの丸）及びＫ５６２細胞（白塗りの丸）のパーセンテージを示す用量応答曲線を示し；図１Ｆは、ブロッキング抗体ＩＢ４及び４４ａの非存在下又は存在下での、ＬＡ１〜３によって誘導されるＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＦｇへの接着を示すヒストグラムを示し、また、生理的Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオン（Ｃｏｎ）の存在下での、並びに既知のアゴニストＭｎ２＋があるときの接着の参照レベルも示し（示したデータは平均＋ＳＥＭである）；図１Ｇは、基本レベルの接着（Ｃｏｎ）と比較したときの、ＬＡ１〜３の非存在下（ＤＭＳＯ）又はＬＡ１〜３の存在下での、ＷＴ（ＣＤ１１ｂ＋／＋）及びＣＤ１１ｂ−／−好中球の固相化Ｆｇへの接着を示すヒストグラムを示し（示したデータは、平均＋ＳＥＭである）；図１Ｈは、ブロッキング抗体（ＩＢ４、４４ａ）の非存在下又は存在下での、ＬＡ１〜３によって誘導されるＫ５６２ Ｅ３２０Ａ細胞の固相化Ｆｇへの結合を示すヒストグラムを示し、また、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオン（Ｃｏｎ）、並びにＭｎ２＋があるときのＫ５６２ Ｅ３２０Ａ接着の参照レベルも示し（示したデータは、平均＋ＳＥＭである）；図１Ｉは、ＬＡ１及びＬＡ２の非存在下（ＤＭＳＯ）又はＬＡ１及びＬＡ２の存在下での、組換えＧＳＴ−αＡ−ドメインコンストラクトの固相化Ｆｇへの結合を示すヒストグラムを示し、また、タンパク質の非存在下で（−）、又はＧＳＴコンストラクトのみ（ＧＳＴ）を用いて得られたバックグラウンドシグナルを示す（示したデータは、平均＋ＳＥＭである）。
図２Ａ−２Ｉは、ロイカドヘリンが細胞遊走に影響を及ぼすことを示す。図２Ａ．ｆＭＬＰ勾配に応答した、化合物ＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の非存在下（ＤＭＳＯ）又は化合物ＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の存在下での、Ｚｉｇｍｏｎｄチャンバー内での遊走するＷＴ好中球の解析を示す軌跡プロット（４回以上の独立した実験／条件からの＞５０細胞／条件）。タイムラプスビデオ顕微鏡観察による様々な時点での代表的な細胞画像も示されている。スケールバーは２５ミクロンを表し；図２Ｂ〜２Ｅは、平均変位（２Ｂ）、平均速度（２Ｃ）、方向持続（２Ｄ）、及び平均変位二乗プロット（２Ｅ）の定量的解析が、細胞運動性に対するロイカドヘリンの効果を示すことを示す。線は、平均＋ＳＥＭを示す。＊＊＊ｐ＜０．０００１；２Ｆは、ｆＭＬＰに応答した、ＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の非存在下（ＤＭＳＯ）又はＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の存在下での、化学遊走するＷＴ好中球におけるＣＤ１１ｂ局在の蛍光画像を示す。ＣＤ１１ｂ（緑）及びＦ−アクチン（赤）について染色された遊走好中球の代表的な共焦点及び位相差画像が示されている。スケールバーは５ミクロンを表し；図２Ｇ〜２Ｉは、ＨＵＶＥＣ層を横断するＴＨＰ−１細胞の経内皮遊走を示す。２Ｇ．ＬＡ１の非存在下（ＤＭＳＯ）又はＬＡ１の存在下で、ケモカインＭＣＰ−１勾配に応答して、ＴＮＦａで刺激されたＨＵＶＥＣ層（赤）を横断して経内皮遊走するＴＨＰ−１細胞（緑）を示す代表的な共焦点画像（１０×）。図２ＨはＨＵＶＥＣに接着したＴＨＰ−１の定量を示すヒストグラムである。図２Ｉは経内皮遊走したＴＨＰ−１細胞の定量を示すヒストグラムであ。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．０００１
図３Ａ−３Ｌは、ロイカドヘリンがインビボで炎症性白血球動員を減少させ、インビボで器官機能を保持することを示す。図３Ａ〜３Ｂは、様々な処置群（チオグリコレートのみ、又はビヒクル（Ｃ）、ＬＡ１、ＬＡ２、もしくはＬＡ３の投与後のチオグリコレート注射）に由来する、チオグリコレートの腹腔内注射４時間後のＷＴマウス（Ａ）又はＣＤ１１ｂ−／−マウス（Ｂ）の腹水中の好中球の総数を示す棒グラフである。生理食塩水注射を対照として用いた（ｎ＝４〜９匹／群）。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意ではない（一元ＡＮＯＶＡ）。図３ＣはＬＡ１の非存在下（塗りつぶされた黒の四角）又はＬＡ１の存在下（塗りつぶされていない赤の丸）での、チオグリコレート注射から４時間、１２時間、及び２４時間後のＷＴ動物の腹水中の好中球の数を示すグラフである。チオグリコレート注射の非存在下での腹膜好中球も示されている（塗りつぶされていない黒の四角）。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意ではない。図３Ｄはチオグリコレート誘導性炎症を有さない（−チオ）又はチオグリコレート誘導性炎症を有する（＋チオ）ＷＴマウス（ｎ＝３／群）のＤＭＳＯ又はＬＡ１処置の４時間後の様々な器官で検出された好中球の比を示す棒グラフである。ＢＭは骨髄を示し；ＬＩは肝臓を示し；ＳＰは脾臓を示し；ＬＵは肺を示し；Ｈは心臓を示し；ＡＭは腹筋を示し；Ｐは膵臓を示し；ＢＯは腸を示し；Ｋは腎臓を示す。示したデータは、平均＋ＳＤである。図３Ｅ〜Ｆはビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＬＡ１で処置したラットのバルーン障害の２１日後の動脈の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、新生内膜肥厚（ｎｅｏｉｎｉｔｍａｌ ｔｈｉｋｅｎｉｎｇ）を示す。図３Ｇ〜ＨはＤＭＳＯ又はＬＡ１で処置したラットのバルーン障害の３日後の代表的な動脈の顕微鏡写真である。矢印は、ＣＤ６８＋マクロファージを示す。図ＩはＤＭＳＯ又はＬＡ１で処置したラットの損傷動脈の形態計測解析によって決定された新生内膜対中膜比を示す棒グラフ（ｎ＝７〜９匹／群）である。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５。図ＪはＤＭＳＯ又はＬＡ１で処置したラットの（損傷３日後の）損傷動脈におけるマクロファージ浸潤の定量を示す棒グラフ（ｎ＝１２匹／群）である。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．０００１。図３Ｋ〜ＬはアゴニストＬＡ１がアンタゴニストＭ１／７０よりも良好に腎臓損傷を改善することを示すグラフである。図３Ｋは様々な時点での未処置マウス（生理食塩水）、アンタゴニスト処置マウス（Ｍ１／７０）、及びＬＡ１処置マウスにおける糸球体好中球の数を示すグラフ（ｎ＝３〜４匹／群、０ｄの時点（この場合、ｎ＝２）を除く）である。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５。図３Ｋは様々な時点での未処置マウス（生理食塩水）、アンタゴニスト処置マウス（Ｍ１／７０）、及びＬＡ１処置マウスにおける測定されたタンパク尿をプロットしたグラフ（ｎ＝３〜８匹／群、０ｄの時点（この場合、ｎ＝２）を除く）である。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５。
図４Ａ−４Ｆは、炎症性好中球動員の遮断がロイカドヘリンの除去によって覆られ得ることを示す。図４Ａは、ゼブラフィッシュ尾びれ損傷モデルを示し；図４Ｂ〜４Ｃは、損傷のない（４Ｂ）及び損傷のある（４Ｃ）３ｄｐｆ幼生の尾の顕微鏡写真（左）及び蛍光画像（右）であり、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＬＡ１、及びＬＡ２で処置したゼブラフィッシュの代表的な画像は、尾での好中球（緑）蓄積を示し；図４Ｄは、ビヒクル（対照）、ＬＡ１、及びＬＡ２で処置したゼブラフィッシュ幼生の尾びれ損傷部位付近の好中球の数の定量を示す棒グラフである（１群当たりｎ＝１２〜１６匹のゼブラフィッシュ幼生）。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．０００１（一元ＡＮＯＶＡ）；図４Ｅは、化合物ＬＡ１及びＬＡ２の除去４時間後の尾での好中球（緑）蓄積を示す幼生の尾の代表的な顕微鏡写真（左）及び蛍光画像（右）を示し；図４Ｆは、ＬＡ１及びＬＡ２の除去４時間後の尾びれ損傷部位付近の好中球の数の定量を示す棒グラフである（１群当たりｎ＝８〜１２匹の幼生）。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。ｎｓ＝有意ではない（一元ＡＮＯＶＡ）。
図５は、ロイカドヘリンが表面ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現に影響を及ぼさないことを示す。ｍＡｂ ＩＢ４及び４４ａ（黒）並びにアイソタイプＩｇＧ２ａ対照ｍＡｂ（灰色）を用いた、生きたＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の表面でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現のレベルを示すＦＡＣＳ解析。示したデータは、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
図６は、ロイカドヘリンがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を内部プールから動員せず、ヒト好中球での表面ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現に影響を及ぼさないことを示す。ｍＡｂ ＩＢ４（黒）及びアイソタイプＩｇＧ２ａ対照ｍＡｂ（灰色）を用いた、生きたヒト好中球の表面でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現のレベルを示すＦＡＣＳ解析。好中球を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＰＭＡ、ＬＰＳ、又はロイカドヘリンＬＡ１〜３の存在下で抗体とともにインキュベートし、方法の節に記載されているように解析した。示したデータは、２〜３回の独立した実験を代表するものである。それは、ＬＰＳ及びＰＭＡによる好中球活性化が、予想されるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の表面発現の増加をもたらすが、ロイカドヘリン処置は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８表面発現の増加を全くもたらさないことを示している。
図７Ａ−７Ｃは、ロイカドヘリンが真のアゴニストであり、アゴニストＭｎ２＋イオンの存在下で細胞接着を阻害しないことを示す。図７Ａ〜ＣはアゴニストＭｎ２＋イオン（１ｍＭ）の存在下及び増加量のＬＡ１（Ａ）、ＬＡ２（Ｂ）、及びＬＡ３（Ｃ）の存在下で固相化Ｆｇに接着しているインプットＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞のパーセンテージを示す用量応答曲線である。示したデータは、３個の独立したウェルの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。
図８Ａ−８Ｃは、ロイカドヘリン依存的なＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化がリガンドタイプに非依存的であることを示す。図８Ａ〜Ｃは、ロイカドヘリンが、用量依存的な様式で、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のｉＣ３ｂへの結合を増加させる。増加量のＬＡ１（Ａ）、ＬＡ２（Ｂ）、及びＬＡ３（Ｃ）の存在下で固相化ｉＣ３ｂに接着しているインプットＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞のパーセンテージを示す用量応答曲線である。示したデータは、６個の独立したウェルの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
図９は、ロイカドヘリン依存的なＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化がリガンドタイプに非依存的であることを示す。ロイカドヘリンは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のＩＣＡＭ−１への結合を増加させる。バッファーのみ（各１ｍＭのＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンを含む）又はロイカドヘリンＬＡ１、ＬＡ２、もしくはＬＡ３の存在下で固相化ＩＣＡＭ−１に接着するＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞の相対的な結合（インプット細胞のパーセンテージとして表されている）を示すヒストグラム。示したデータは、６〜９個の独立したウェルの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。＊＊＊ｐ＜０．０００１
図１０Ａ−１０Ｃは、ロイカドヘリン依存的なＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が細胞型に非依存的であることを示す。図１０Ａ〜Ｃは、ロイカドヘリンが、用量依存的な様式で、ＴＨＰ−１細胞のＦｇへの結合を増加させる。増加量のＬＡ１（Ａ）、ＬＡ２（Ｂ）、及びＬＡ３（Ｃ）の存在下で固相化Ｆｇに接着しているインプットＴＨＰ−１細胞のパーセンテージを示す用量応答曲線。示したデータは、６個の独立したウェルの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
図１１は、ロイカドヘリンがＫ５６２細胞によるｉＣ３ｂオプソニン化ＲＢＣの結合を増加させることを示す。ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、対照（各１ｍＭのＣａ２＋及びＭｇ２＋イオン）、活性化Ｍｎ２＋イオン（１ｍＭ）、又はロイカドヘリンＬＡ１〜３の存在下でのｉＣ３ｂオプソニン化ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）（ＥｉＣ３ｂ）のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現Ｋ５６２細胞への相対的な結合を示し、ロゼットを示す全細胞のパーセンテージとして表されているヒストグラム。各々のヒストグラムは、代表的な実験（実施された３回のうちの１回）の三連測定の平均＋ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は既知の貪食受容体でもあるので、これらの結果は、ＬＡ１〜３がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の貪食機能も上方調節することを示している。
図１２Ａ−１２Ｅは、ＣＤ１１ｂ Ａ−ドメインの活性化感受性領域内でのＬＡ１〜３の結合のコンピュータモデルを示す模式図である。図１２Ａ及び１２Ｃは、活性化感受性Ｆ−α７領域内でのＬＡ１（緑の棒モデル）及びＬＡ２（青の棒モデル）のドッキングを示す、その開いた立体構造のαＡ−ドメイン（赤銅色のリボン）のモデルを示す。ＭＩＤＡＳ部位の金属イオンは、灰色の球として示され；図１２Ｅは、活性化感受性Ｆ−α７領域内でのＬＡ３（黄色の棒モデル）のドッキングを示す、その開いた立体構造のαＡ−ドメイン（青のリボン）のモデルを示す。ＬＡ３様化合物（１２Ｅ）を用いた研究と一致して、ロイカドヘリンＬＡ１及びＬＡ２は、その最も疎水性の部分が、ヘリックスα７とヘリックスα１とＦ鎖の間の疎水性ポケットと相互作用するように配向していることが分かり、結合ポケットを形成する疎水性残基（強調されている）は、α７のＬｅｕ３０５、Ｉｌｅ３０８、及びＬｅｕ３１２、α１のＰｈｅ１５６、Ｖ１６０、Ｌｅｕ１６４、Ｆ鎖のＴｙｒ２６７、Ｉｌｅ２６９、並びにＩｌｅ２３６、Ｖａｌ２３８、Ｉｌｅ１３５、Ｐｈｅ１３７、Ｐｈｅ１７１を含む他の疎水性ポケット残基を含み、ロイカドヘリン化合物の親水性カルボン酸部分は、疎水性ポケットとは離れた方向を向き、Ｌｙｓ１６６及び／又はＬｙｓ１６８とのイオン相互作用を形成する可能性があり；図１２Ｂは、ドッキングした構造（１２Ａ）からのαＡ−ドメイン（赤銅色のリボン）の活性化感受性Ｆ−α７領域の拡大図を示す。この２つの図は互いに９０°回転したものであり、活性化感受性疎水性領域の相互作用している残基は、赤銅色の棒として示され、標識され、破線は、ＬＡ１とαＡ−ドメインの間の潜在的な水素結合相互作用を強調しており；図１２Ｄは、ドッキングした構造（１２Ｂ）からのαＡ−ドメイン（赤銅色のリボン）の活性化感受性Ｆ−α７領域の拡大図を示す。２つの図は互いに９０°回転したものであり、活性化感受性疎水性領域の相互作用している残基は、赤銅色の棒として示され、標識され、破線は、ＬＡ２とαＡ−ドメインの間の潜在的な水素結合相互作用を強調している。
図１３は、ロイカドヘリンが生きたＫ５６２細胞上の全長インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を活性化することを示す。アゴニストＬＡ１の非存在下（Ｃａ、Ｍｇ、濃灰色のヒストグラム）又はアゴニストＬＡ１の存在下（赤のヒストグラム）又はＭｎ２＋イオンの存在下（青ヒストグラム）での活性化感受性抗体ｍＡｂ ２４と細胞表面に発現したＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との反応性を示すＦＡＣＳ解析。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８表面発現のレベルを、ＬＡ１の非存在下（Ｃａ、Ｍｇ）及びＬＡ１の存在下（黒のヒストグラム）で、ｍＡｂ ＩＢ４を用いて解析した。これは、全ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８表面発現に差がないことを示している。アイソタイプ対照ｍＡｂ（薄灰色）による結合も示されている。示したデータは、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。データは、ＬＡ１の存在下でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのｍＡｂ２４反応性の、構成的活性型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で以前に観察されたレベルへの明らかな増加を示している。
図１４は、ロイカドヘリンが、ＩＭＢ−１０と比べて、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対するより大きい親和性を示すことを示す。ＬＡ１については４ｍＭ及びＩＭＢ−１０については＞５０ｍＭのＥＣ５０値で、増加量のＬＡ１及びＩＭＢ−１０（４）の存在下で固相化Ｆｇに接着しているインプットＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞のパーセンテージを示す用量応答曲線。示したデータは、６個の独立したウェルの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
図１５Ａ−１５Ｅは、ロイカドヘリンがインビトロで３Ｄゲル中の好中球遊走に影響を及ぼさないことを示す。図１５Ａは、ロイカドヘリンＬＡ１の非存在下（ＤＭＳＯ）又はロイカドヘリンＬＡ１の存在下で３Ｄコラーゲンゲル中のｆＭＬＰ勾配に向かって遊走するＷＴＢ６好中球を撮影した様々な一連のタイムラプス静止画像である。各々の動画からの４５分間にわたる４０個の個々の細胞の遊走トラックも提示されている。図１５Ｂ〜Ｅでは、各条件に由来する少なくとも４０個の好中球の定量解析も示され、これは、４５分間の記録期間での全細胞変位（Ｂ）、遊走速度（Ｃ）、及び蛇行（ｍｅａｎｄｒｉｎｇ）指数（Ｄ）の有意差を示さない。また、時間平方根に対する変位平方のプロット（Ｅ）は、両方の条件下での有向性細胞遊走を示している。
図１６Ａ−１６Ｄは、ロイカドヘリンがインビトロで細胞傷害性を示さないことを示す。Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞を、増加量のＬＡ１（１６Ａ）、ＬＡ２（１６Ｂ）、ＬＡ３（１６Ｃ）、及びＬＡ−Ｃ（１６Ｄ）の存在下、３７℃でインキュベートし、生細胞の数を２４時間後に測定した。示したデータは、三連で実施されたアッセイの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。
図１７Ａ−１７Ｃは、ロイカドヘリンがインビトロで好中球細胞傷害性を示さないことを示す。ＷＴ Ｂ６好中球を、増加量のＬＡ１（Ａ）、ＬＡ２（Ｂ）、及びＬＡ３（Ｃ）の存在下、３７℃でインキュベートし、生細胞の数を、４時間の全インキュベーションの後、ＭＴＳ試薬を用いて測定した。示したデータは、三連で実施されたアッセイの平均＋ＳＥＭであり、少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。結果は、これらの化合物が、５０μＭもの濃度で初代好中球に対して毒性がないことを明白に示している。
図１８Ａ−１８Ｂは、ロイカドヘリンがインテグリンクラスタリング及び外側から内側へのシグナル伝達を誘導しないことを示す、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞表面でのＣＤ１１ｂクラスタリングの蛍光画像を示す。インテグリン活性化及びリガンド結合は、細胞表面でのインテグリンのクラスタリングを生じさせ、外側から内側へのシグナル伝達を引き起こす（５，６）。ＬＡ１〜３はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に結合して、それを活性化するので、そのような結合だけでインテグリン媒介性の外側から内側へのシグナル伝達が誘発され、それにより細胞にとってリガンドがインテグリンに結合した状態とよく似た状況が生じ、これが白血球の寿命及び機能に対して深刻な結果をもたらし得ると考えられる。検討するために、本発明者らは、共焦点顕微鏡法を、細胞表面でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８クラスタリングのイメージングに用いた（５）。図１８Ａ〜Ｂでは、細胞懸濁液を、リガンドＦｇの非存在下（Ａ）又はリガンドＦｇの存在下（Ｂ）で、ＤＭＳＯ、ＬＡ１、ＬＡ２、又はＬＡ３とともにインキュベートした。ＣＤ１１ｂについて染色した細胞（緑）の代表的な蛍光画像及びＤＩＣ画像が示されている。ＩｍａｇｅＪで解析した、選択された細胞のＣＤ１１ｂ蛍光強度の３Ｄ表示も示されている。スケールバーは２０ｍｍを表す。細胞は、リガンドの非存在下での検出可能なＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８マクロクラスタリングを示さなかったが（Ａ、ＤＭＳＯ）、外部からＦｇを添加したときに、高度のクラスタリングを示した（Ｂ、ＤＭＳＯ）。同様に、ＬＡ１〜３による処理は、外部からＦｇを添加したときにのみインテグリンマクロクラスタリングを示し、これは、ＬＡ１〜３がインテグリンリガンド模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）でないことを示唆している。
図１９は、ロイカドヘリンがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８媒介性の外側から内側へのシグナル伝達を誘導しないことを示す。インテグリン活性化及びリガンド結合は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路の活性化を含む、外側から内側へのシグナル伝達も引き起こし（５，６）、それにより、大部分の細胞でアンカレッジ依存的な生存促進性シグナルを模倣する（７）。さらに、それは、炎症促進性ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増強する際に、炎症刺激と相乗作用する（８〜１０）。さらに、既知のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストＭｎ２＋（１１）並びに活性化ｍＡｂ（１２）及びそのリガンド（５）は、ＥＲＫ１／２リン酸化を誘導するが、突然変異体の構成的活性型インテグリンを発現するノックイン動物由来の細胞は誘導しない（１３）。ＬＡ１〜３の効果を調べるために、本発明者らは、ＬＡ１〜３で処理した細胞でＥＲＫ１／２リン酸化を解析した。Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞を、ＤＭＳＯ（対照）、ＬＡ１、ＬＡ２、ＬＡ３、又はリガンドＦｇとともにインキュベートし、その後、１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで、リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）、全ＥＲＫ１／２、及びＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットにより、細胞ライセートを解析した。それは、ＬＡ１〜３処理がリガンドＦｇ又はホルボールエステルＰＭＡによる処理とは対照的に（１４）、ＥＲＫ１／２リン酸化（ｐＥＲＫ）を誘導しなかったことを示している。それゆえ、本発明者らは、ロイカドヘリンが、いずれの場合にも、基礎レベルを超えるリガンドの非存在下又は存在下で、ＥＲＫリン酸化を引き起こす外側から内側へのシグナル伝達を誘導しないという結論を下している。
図２０Ａ−２０Ｂは、対照化合物（ＬＡ−Ｃ）がＷＴラットでのバルーン障害による新生内膜肥厚に対していかなる影響も及ぼさないことを示す。図９Ａは、対照化合物ＬＡ−Ｃで処置した動物由来のバルーン障害２１日後のラット動脈の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、動脈における新生内膜肥厚を示し；図９Ｂは、ＤＭＳＯ及びＬＡ−Ｃで処置した動物由来の損傷ラット動脈の形態計測解析によって測定された新生内膜対中膜比を示す棒グラフである（１群当たりｎ＝７〜９匹の動物）。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。ｎｓ＝有意ではない（一元ＡＮＯＶＡ）。
図２１Ａ−２１Ｄは、ロイカドヘリンＬＡ３がラットにおけるバルーン障害後の新生内膜肥厚を有意に低下させることを示す。図２１Ａはビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＬＡ３で処置した動物由来のバルーン障害２１日後のラット動脈の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、新生内膜肥厚を示す。図２１ＢはＤＭＳＯ又はＬＡ３で処置したラット由来のバルーン障害３日後の代表的な動脈の顕微鏡写真である。矢印は、ＣＤ６８＋マクロファージを示す。図２１ＣはＤＭＳＯ又はＬＡ３で処置したラット由来の損傷動脈の形態計測解析によって測定された新生内膜対中膜比を示す棒グラフである（１群当たりｎ＝７〜９匹の動物）。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．００１。Ｄ．ＤＭＳＯ又はＬＡ３で処置したラット由来の損傷動脈（損傷３日後）におけるマクロファージ浸潤の定量を示す棒グラフ（１群当たりｎ＝１２）。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．０００１
図２２Ａ−２２Ｄは、ロイカドヘリンＬＡ２が損傷組織への好中球動員も妨げ、この炎症性好中球動員の遮断がＬＡ２除去によって覆され得ることを示す。図２２Ａ〜ＢではＬＡ２で処置したゼブラフィッシュ由来の損傷のない（Ａ）及び（Ｂ）損傷のある３ｄｐｆ幼生の尾の代表的な顕微鏡写真（左）及び蛍光画像（右）は、ＤＭＳＯで処置したゼブラフィッシュと比べて、尾での好中球（緑）蓄積の減少を示す（図４Ａ〜Ｂ、本文）。図２２ＣはＬＡ２の除去４時間後の尾での好中球（緑）蓄積を示す幼生の尾の代表的な顕微鏡写真（左）及び蛍光画像（右）。Ｄ．ビヒクル（対照）、及びＬＡ２で処置したゼブラフィッシュ幼生の尾びれ損傷部位付近の好中球の数、並びにＬＡ２の除去４時間後の尾びれ損傷部位付近の好中球の数の定量を示す棒グラフ（１群当たりｎ＝１２〜１６匹のゼブラフィッシュ幼生）である。示したデータは、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意ではない。
図２３は、ロイカドヘリン処置がゼブラフィッシュ幼生における好中球細胞数の損失をもたらさないことを示す。３ｄｐｆゼブラフィッシュ幼生全体の代表的な蛍光画像（上）及び損傷を受けた魚の尾の顕微鏡写真（下）は、各ゼブラフィッシュ幼生における好中球（緑）を示す（１群当たりｎ＝１２〜１６匹のゼブラフィッシュ幼生）。ＬＡ１及びＬＡ２で処置したゼブラフィッシュは、化合物の自家蛍光のために、蛍光画像中でわずかにより高い緑色のバックグラウンドを示す。
図２４は、ＣＤ１１ｂ Ａ−ドメインの活性化感受性領域内の様々なロイカドヘリンの結合についてのコンピュータモデルによる２Ｄ投射を示す模式図を示す。ロイカドヘリン化合物の親水性カルボン酸部分は、疎水性ポケットとは離れた方向を向き、Ｌｙｓ１６６及び／又はＬｙｓ１６８とのイオン相互作用を形成する可能性がある。
図２５Ａ−２５Ｂは、外側から内側へのシグナル伝達の解析を示す。Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞を、ＤＭＳＯ、ＬＡ１、ＬＡ２、ＬＡ３、又はリガンドＦｇとともにインキュベートし、その後、細胞ライセートを、リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）、全ＥＲＫ１／２（１２Ａ）、及びリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、全ＡＫＴ、並びにＧＡＰＤＨ（１２Ｂ）について解析した。
図２６Ａ−２６Ｄは、ＬＡ１の非存在下及び存在下でのＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）による刺激時のＷＴ Ｂ６マクロファージ及び好中球による炎症促進性因子の分泌を示すヒストグラムである。
図２７は、基底状態（対照）での、及びＬＡ１の非存在下（灰色）又はＬＡ１の存在下（赤線）、ＴＮＦａで活性化したときの、ヒト好中球におけるＲＯＳのレベルを示すグラフである。
図２８は、ＭｙＤ８８の解析を示す。ヒトＴＨＰ−１細胞を、規定量の時間、ＬＰＳ、ＬＰＳ及びＬＡ１、又はＬＡ１のみとともにインキュベートし、その後、細胞ライセートを、１Ｄ−ＳＤＳ ＰＡＧＥ、次いで、ＭｙＤ８８及びＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットで解析した。
図２９は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストＬＡ１の非存在下又は存在下でのＣＬＰによるＷＴマウスの生存を示す生存曲線を示す。
図３０は、進行性抗ＧＢＭ腎炎の開始８日後のビヒクル処置動物（対照）及びロイカドヘリン処置動物の血清ｓｕＰＡＲレベルを示すヒストグラムである。
図３１は、虚血を誘導する３０分前にＤＭＳＯ、ＬＡ１、又はＬＡ２で処置したＷＴマウスの腎機能を示すグラフである。再灌流の２４時間後にｓＣｒ測定を実施した。＊＊＊ｐ＜０．０００１（ｎ＝５匹のマウス／群）
本発明は一般に、ロイカドヘリンと称される化学的化合物を含む、様々な薬剤、及びβ２インテグリン、特に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を活性化するための方法に関する。言い換えれば、本発明の薬剤は、アンタゴニストではなく、β２インテグリンのアゴニストとして作用する。このアゴニスト及び方法は、疾患の中でも特に、炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療するのに有用である。
定義
「薬剤」という用語は、化学的化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、脂質、核酸又はポリマーを指す。
「アルコキシ」という用語は、それに結合した酸素を有するアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を指し、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表すことができる。
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基の基を指す。好ましい実施形態では、直鎖又は分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０個以下（例えば、直鎖の場合はＣ１−Ｃ３０、分枝鎖の場合はＣ３−Ｃ３０）、より好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。
さらに、本明細書、実施例、及び特許請求の範囲を通して用いられる「アルキル」という用語は、非置換アルキル基と置換アルキル基の両方を含むことが意図され、そのうちの後者は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指し、これには、ハロアルキル基、例えば、トリフルオロメチル及び２，２，２−トリフルオロエチル等が含まれる。
アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシ等の化学部分に関連して用いられるときの「Ｃｘ−ｙ」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を鎖中に含む基を含むことを意味する。Ｃ０アルキルは、基が末端位置にある場合には水素を示し、内部の場合には結合を示す。Ｃ１−６アルキル基は、例えば１〜６個の炭素原子を鎖中に含む。
「アミン」及び「アミノ」という用語は、当技術分野で認識されており、非置換アミンと置換アミンの両方、及びそれらの塩、例えば、以下によって表すことができる部分を指す。
式中、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１０’は、各々独立に、水素もしくはヒドロカルビル基を表すか、又はＲ９及びＲ１０は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、４〜８個の原子を環構造中に有する複素環を完成させる。
本明細書で用いられる「アミノアルキル」という用語は、アミノ基で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で用いられる「アラルキル」という用語は、アリール基で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で用いられる「アリール」という用語は、環の各原子が炭素である置換又は非置換単環芳香族基を含む。好ましくは、環は、５〜７員環、より好ましくは、６員環である。「アリール」という用語はまた、２個以上の炭素が２個の隣接する環に共通する２個以上の環式環を有する多環式環系を含み、ここで、これらの環の少なくとも１つは芳香族であり、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／又はヘテロシクリルであることができる。アリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリン等が挙げられる。
本明細書で用いられる「炭素環」、「カルボシクリル」及び「炭素環式」という用語は、環の各原子が炭素である非芳香族飽和又は不飽和環を指す。好ましくは、炭素環は、３〜１０個の原子、より好ましくは５〜７個の原子を含む。
本明細書で用いられる「カルボシクロアルキル」という用語は、炭素環基で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で用いられる「エーテル」という用語は、酸素を介して別のヒドロカルビル基に連結されたヒドロカルビル基を指す。したがって、ヒドロカルビル基のエーテル置換基は、ヒドロカルビル−Ｏ−であることができる。エーテルは、対称又は非対称であることができる。エーテルの例としては、複素環−Ｏ−複素環及びアリール−Ｏ−複素環が挙げられるが、これらに限定されない。エーテルは、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表すことができる「アルコキシアルキル」基を含む。
本明細書で用いられる「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含む。
本明細書で用いられる「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘタリール基で置換されたアルキル基を指す。
「ヘテロアリール」という用語は、その環構造が、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、より好ましくは１又は２個のヘテロ原子を含む、置換又は非置換芳香族単環構造、好ましくは５〜７員環、より好ましくは５〜６員環を指す。「ヘテロアリール」という用語はまた、２個以上の炭素が２個の隣接する環に共通する２個以上の環式環を有する多環式環構造を含み、ここで、これらの環の少なくとも１つは複素環式芳香族であり、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／又はヘテロシクリルであることができる。ヘテロアリール基としては、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、及びピリミジン等が挙げられる。
本明細書で用いられる「ヘテロ原子」という用語は、炭素又は水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄である。
本明細書で用いられる「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、複素環基で置換されたアルキル基を指す。
「ヘテロシクリル」、「複素環」及び「複素環式」という用語は、その環構造が、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、より好ましくは１又は２個のヘテロ原子を含む、置換又は非置換非芳香環構造、好ましくは３〜１０員環、より好ましくは３〜７員環を指す。「ヘテロシクリル」及び「複素環式」という用語はまた、２個以上の炭素が２個の隣接する環に共通する２個以上の環式環を有する多環式環構造を含み、ここで、これらの環の少なくとも１つは複素環式であり、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／又はヘテロシクリルであることができる。ヘテロシクリル基としては、例えば、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタム等が挙げられる。
本明細書で用いられる「ヒドロキシアルキル」という用語は、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で用いられる「ロイカドヘリン」という用語は、コアフラニルチアゾリジノン、フラニルイミダゾリジノン、フラニルオキサゾリジノン、又はフラニルイソオキサゾリジノンモチーフを特徴とする本明細書に記載のβ２インテグリンのアゴニスト化合物を指す。
アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシ等の化学部分に関連して用いられるときの「低級」という用語は、置換基中に１０個以下の原子、好ましくは６個以下の原子が存在する基を含むことを意味する。「低級アルキル」は、例えば、１０個以下、好ましくは６個以下の炭素原子を含むアルキル基を指す。特定の実施形態では、本明細書で定義されるアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシ置換基は、それらが、単独で現れるものであれ、ヒドロキシアルキル及びアラルキル（この場合、例えば、アルキル置換基中の炭素原子を数えるとき、アリール基内の原子は数えない）という記述中にあるように、他の置換基との組合せで現れるものであれ、それぞれ、低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、又は低級アルコキシである。
「ポリシクリル」、「多環」及び「多環式」という用語は、２個以上の原子が２個の隣接する環に共通する２個以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール及び／又はヘテロシクリル）を指し、例えば、これらの環は「縮合環」である。多環の環の各々は、置換又は非置換であることができる。特定の実施形態では、多環の各々の環は、環中に３〜１０個、好ましくは５〜７個の原子を含む。
「置換された」という用語は、骨格の１個以上の炭素上の水素に代わる置換基を有する部分を指す。「置換」又は「で置換された」は、そのような置換が置換原子及び置換基の許容される原子価と一致し、かつ置換が、例えば、再配置、環化、脱離等によって自発的に変化しない、安定な化合物を生じさせるという絶対的条件を含むことが理解されるであろう。本明細書で用いられる場合、「置換された」という用語は、有機化合物の全ての許容可能な置換基を含むことが企図される。広範な態様では、許容可能な置換基としては、有機化合物の非環式及び環式、分枝状及び非分枝状、炭素環式及び複素環式、芳香族及び非芳香族の置換基が挙げられる。許容可能な置換基は、適切な有機化合物の場合は、１個以上であることができ、同じもの又異なるものであることができる。本発明のために、窒素等のヘテロ原子は、水素置換基、及び／又はヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載の有機化合物の任意の許容可能な置換基を有することができる。置換基としては、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、又はアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、又はチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族もしくは複素環式芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖上で置換された部分を、それ自体、必要に応じて置換することができることが当業者に理解されるであろう。
本明細書で用いられる「チオアルキル」という用語は、チオール基で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で用いられる「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、複数の細胞を含む。細胞への化合物の投与は、インビボ、エクスビボ、及びインビトロでの投与を含む。
機能又は活性、例えば、癌細胞増殖を「阻害する」又は「抑制する」又は「低下させる」ことは、関心対象の条件もしくはパラメータを除く他の同じ条件と比較したとき、又は別の条件と比較したときに、この機能又は活性を低下させることである。
本明細書で用いられる「調節する」という用語は、機能又は活性（例えば、細胞増殖）の阻害又は抑制、及び機能又は活性の増強を含む。
「医薬として許容される」という語句は、当技術分野で認識されている。特定の実施形態では、この用語は、組成物、賦形剤、アジュバント、ポリマー、及び他の材料、並びに／又は健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題もしくは合併症を伴わずに人間及び動物の組織と接触させて用いるのに好適である、妥当な利益／リスク比に見合った、剤形を含む。
本明細書で用いられる「医薬として許容される担体」という語句は、医薬として許容される材料、組成物、又はビヒクル、例えば、医薬用途又は治療用途の薬物を製剤化するのに有用な液体又は固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、又はカプセル化材料を意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ患者にとって有害でないという意味において、「許容される」ものでなければならない。
医薬として許容される担体の役割を果たすことができる材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテート；（４）粉末化トラガカント；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバター及び座薬用ワックス；（９）油、例えば、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；並びに（２１）医薬製剤中で利用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。
「医薬として許容される塩」という用語は、患者の治療に好適であるか又は患者の治療と適合する酸付加塩又は塩基付加塩を意味する。
本明細書で用いられる「医薬として許容される酸付加塩」という用語は、式Ｉ又はＩＩによって表される任意の塩基化合物の任意の非毒性の有機塩又は無機塩を意味する。好適な塩を形成する実例となる無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸、並びにオルトリン酸水素ナトリウム及び硫酸水素カリウム等の金属塩が挙げられる。好適な塩を形成する実例となる有機酸としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸、例えば、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、及びサリチル酸、並びにｐ−トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。一酸塩又は二酸塩のいずれかを形成することができ、そのような塩は、水和した形態、溶媒和した形態、又は実質的に無水の形態のいずれかで存在することができる。一般に、式Ｉ又はＩＩの化合物の酸付加塩は、水及び様々な親水性有機溶媒中で、より溶解性であり、通常、その遊離塩基の形態と比較して、より高い融点を示す。適切な塩の選択は、当業者に公知である。他の医薬として許容されない塩、例えば、シュウ酸塩は、例えば、実験的使用のための式Ｉ又はＩＩの化合物の単離において、又はその後の医薬として許容される酸付加塩への変換のために使用することができる。
本明細書で用いられる「医薬として許容される塩基付加塩」という用語は、式ＩもしくはＩＩ又はその中間体のいずれかによって表される任意の酸性化合物の任意の非毒性の有機又は無機塩基付加塩を意味する。好適な塩を形成する実例となる無機塩基としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、又は水酸化バリウムが挙げられる。好適な塩を形成する実例となる有機塩基としては、脂肪族、脂環式、もしくは芳香族有機アミン、例えば、メチルアミン、トリメチルアミン、及びピコリン、又はアンモニアが挙げられる。適切な塩の選択は、当業者に公知である。
「予防する」という用語は、当技術分野で認識されており、局所再発（例えば、疼痛）等の状態、癌等の疾患、心不全等の複合性症候群、又は任意の他の医学的状態との関連で用いられるとき、当技術分野で十分に理解されており、かつ組成物を投与されていない対象と比べて、対象の医学的状態の症状の頻度を低下させるか、又は該症状の開始を遅延させる組成物の投与を含む。したがって、癌の予防は、例えば、治療されていない対照集団と比べて、予防的治療を受けている患者集団における検出可能な癌性増殖の数を低下させること、並びに／又は治療されていない対照集団と比べて、例えば、統計的に及び／もしくは臨床的に有意な量だけ、治療された集団における検出可能な癌性増殖の出現を遅延させることを含む。感染の予防は、例えば、治療されていない対照集団と比べて、治療された集団における感染の診断の数を低下させること、及び／又は治療されていない対照集団と比べて、治療された集団における感染の症状の開始を遅延させることを含む。疼痛の予防は、例えば、治療されていない対照集団と比べて、治療された集団の対象によって経験される疼痛の感覚の程度を軽減するか、又は代わりに、該疼痛の感覚を遅延させることを含む。神経学的障害の予防は、例えば、治療されていない対照集団と比べて、治療された集団の対象によって経験される神経学的症状の程度を軽減するか、又は代わりに該症状を遅延させることを含む。
本明細書で用いられる「溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている、式ＩもしくはＩＩの化合物、又は式ＩもしくはＩＩの化合物の医薬として許容される塩を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理的に許容し得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水等である。水が溶媒である場合、分子は、「水和物」と呼ばれる。
本明細書で用いられるように、及び当技術分野で十分に理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む、有益な又は望ましい結果を得るための手法である。有益な又は望ましい臨床結果としては、検出可能なものであれ、検出不可能なものであれ、１以上の症状又は状態の軽減又は改善、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち、非悪化）、疾患の拡大の予防、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分寛解又は完全寛解を問わない）を挙げることができるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けていない場合の予想される生存と比べた、生存の延長を意味することもできる。
本発明の一態様は、式（Ｉ）の化合物に関する。
式中、
Ａは存在しないか、又はアルキル及びアルケニルから選択され；
Ｂは存在しないか、又はアルキル、アルケニル、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｎは、窒素及びＣＲ４から選択され；
Ｘ及びＹは、独立に、Ｏ及びＳから選択され；
Ｚは、ＣＲ４、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｕ、Ｖ、及びＷは、独立に、ＣＲ４、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｒ１及びＲ３は、独立に、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアリール、アルコキシアルキル、アルコキシアリール、アルコキシカルボニルアリール、アミノアリール、アミドアリール、ハロアリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、スルホネート、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、スルホン、アルキルスルホン、アリールスルホン、スルホキシド、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、スルホンアミド、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ベンジル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリドイミダゾリル、ピリミドイミダゾリル、ピリドピラゾリル、ピラゾロピリミジニル、並びに１〜６個の独立した置換基で任意に置換されているそのいずれかから選択され；
Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され；かつ
Ｒ４は存在しないか、又は水素及びアルキルから選択される。
特定の実施形態では、ＺはＳである。
特定の実施形態では、Ｘ及びＹはＯである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＹはＳである。特定の他の実施形態では、ＸはＳであり、ＹはＯである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、ＺはＳである。特定の他の実施形態では、Ｘ、Ｙ、及びＺは、Ｓである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＺはＳであり、ＹはＯである。
特定の実施形態では、ＵはＯであり、Ｖ及びＷはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＵはＳであり、Ｖ及びＷはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＵはＣＲ４であり、ＶはＮであり、ＷはＯである。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＵはＣＲ４であり、ＶはＯであり、ＷはＮである。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。
特定の実施形態では、Ｂはアルキルであり、Ａは存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。特定の実施形態では、Ｂはメチレンであり、Ａは存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。特定のそのような実施形態では、Ｂはメチレンであり、Ａは存在しない。
特定の実施形態では、Ａがアルキルであり、かつＢが存在しない場合、Ｒ１はアルコキシカルボニルである。
特定の実施形態では、ＡとＢは両方とも存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ１置換基は、１〜６個の独立した置換基でさらに置換されている。
特定の実施形態では、Ｒ１は、フラン、フェニル、ベンジル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ピペリジン、ピペラジン、及びモルホリンから選択される。特定の実施形態では、Ｒ１は、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、及びピロリジン、好ましくは、テトラヒドロフランから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ１はフェニル、好ましくは置換フェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、１〜５回、好ましくは１〜３回、より好ましくは１又は２回置換されたフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、及びアルキルから、より好ましくはアルキル及びハロゲンから、例えば、メチル、フルオロ、及びクロロから独立に選択される１又は２個、好ましくは１個の置換基で置換されたフェニルである。
特定の実施形態では、Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ３は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル、好ましくはアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ３は、ピロール、フラン、ピリミジン、オキサゾール、イソオキサゾール、及びチオフェンから選択されるヘテロアリール、好ましくはフランである。特定の実施形態では、Ｒ３は、１〜３回、好ましくは１〜２回、より好ましくは１回置換されたフランである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル、好ましくはアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択される置換基で１回置換されたフランである。特定の実施形態では、Ｒ３は、それ自体、任意に、アルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、及びハロゲンで、好ましくは１〜２回置換されているアリール基で１回置換されたフラン、例えば、クロロフェニル、ジクロロフェニル、カルボキシフェニルである。
特定の実施形態では、Ｒ３はアリール、好ましくはフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、及びアルキルから独立に選択される１又は２個、好ましくは２個の置換基で置換されたフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、ハロゲン、好ましくはブロモで１回置換されたフェニルである。
本発明の一態様は、式（ＩＩ）の化合物に関する。
式中、
Ａは存在しないか、又はアルキル及びアルケニルから選択され；
Ｂは存在しないか、又はアルキル、アルケニル、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｎは、窒素及びＣＲ４から選択され；
Ｘ及びＹは、独立に、Ｏ及びＳから選択され；
Ｚは、ＣＲ４、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｕ、Ｖ、及びＷは、独立に、ＣＲ４、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｒ１及びＲ３は、独立に、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアリール、アルコキシアルキル、アルコキシアリール、アルコキシカルボニルアリール、アミノアリール、アミドアリール、ハロアリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、スルホネート、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、スルホン、アルキルスルホン、アリールスルホン、スルホキシド、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、スルホンアミド、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ベンジル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリドイミダゾリル、ピリミドイミダゾリル、ピリドピラゾリル、ピラゾロピリミジニル、並びに１〜６個の独立した置換基で任意に置換されているそのいずれかから選択され；
Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され；かつ
Ｒ４は存在しないか、又は水素及びアルキルから選択される。
特定の実施形態では、ＺはＳである。
特定の実施形態では、Ｘ及びＹはＯである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＹはＳである。特定の他の実施形態では、ＸはＳであり、ＹはＯである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、ＺはＳである。特定の他の実施形態では、Ｘ、Ｙ、及びＺは、Ｓである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＺはＳであり、ＹはＯである。
特定の実施形態では、ＵはＯであり、Ｖ及びＷはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＵはＳであり、Ｖ及びＷはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＵはＣＲ４であり、ＶはＮであり、ＷはＯである。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＵはＣＲ４であり、ＶはＯであり、ＷはＮである。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。
特定の実施形態では、Ｂはアルキルであり、Ａは存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。特定の実施形態では、Ｂはメチレンであり、Ａは存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。特定のそのような実施形態では、Ｂはメチレンであり、Ａは存在しない。
特定の実施形態では、Ａがアルキルであり、かつＢが存在しない場合、Ｒ１はアルコキシカルボニルである。
特定の実施形態では、ＡとＢは両方とも存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ１置換基は、１〜６個の独立した置換基でさらに置換されている。
特定の実施形態では、Ｒ１は、フラン、フェニル、ベンジル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ピペリジン、ピペラジン、及びモルホリンから選択される。特定の実施形態では、Ｒ１は、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、及びピロリジン、好ましくは、テトラヒドロフランから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ１はフェニル、好ましくは置換フェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、１〜５回、好ましくは１〜３回、より好ましくは１又は２回置換されたフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、及びアルキルから、より好ましくはアルキル及びハロゲンから、例えば、メチル、フルオロ、及びクロロから独立に選択される１又は２個、好ましくは１個の置換基で置換されたフェニルである。
特定の実施形態では、Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ３は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル、好ましくはアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ３は、ピロール、フラン、ピリミジン、オキサゾール、イソオキサゾール、及びチオフェンから選択されるヘテロアリール、好ましくはフランである。特定の実施形態では、Ｒ３は、１〜３回、好ましくは１〜２回、より好ましくは１回置換されたフランである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル、好ましくはアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択される置換基で１回置換されたフランである。特定の実施形態では、Ｒ３は、それ自体、任意に、アルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、及びハロゲンで、好ましくは１〜２回置換されているアリール基で１回置換されたフラン、例えば、クロロフェニル、ジクロロフェニル、カルボキシフェニルである。
特定の実施形態では、Ｒ３はアリール、好ましくはフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、及びアルキルから独立に選択される１又は２個、好ましくは２個の置換基で置換されたフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、ハロゲン、好ましくはブロモで１回置換されたフェニルである。
特定の実施形態では、式ＩＩの化合物は、以下から選択される。
特定の実施形態では、以下の化合物から選択される式ＩＩの化合物は、あまり好ましくない。


本発明の一態様は、式（ＩＩＩ）の化合物に関する。
式中、
Ａは存在しないか、又はアルキル及びアルケニルから選択され；
Ｂは存在しないか、又はアルキル、アルケニル、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｎは、窒素及びＣＲ４から選択され；
Ｘ及びＹは、独立に、Ｏ及びＳから選択され；
Ｚは、ＣＲ４、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｕ、Ｖ、及びＷは、独立に、ＣＲ４、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ４から選択され；
Ｒ３は、アリール環の位置１〜６（複数可）に存在する１〜６個の独立した置換基であり；
Ｒ１及びＲ３は、独立に、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアリール、アルコキシアルキル、アルコキシアリール、アルコキシカルボニルアリール、アミノアリール、アミドアリール、ハロアリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、スルホネート、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、スルホン、アルキルスルホン、アリールスルホン、スルホキシド、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、スルホンアミド、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ベンジル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリドイミダゾリル、ピリミドイミダゾリル、ピリドピラゾリル、ピラゾロピリミジニル、並びに１〜６個の独立した置換基で任意に置換されているそのいずれかから選択され；
Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され；かつ
Ｒ４は存在しないか、又は水素及びアルキルから選択される。
特定の実施形態では、ＺはＳである。
特定の実施形態では、Ｘ及びＹはＯである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＹはＳである。特定の他の実施形態では、ＸはＳであり、ＹはＯである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、ＺはＳである。特定の他の実施形態では、Ｘ、Ｙ、及びＺは、Ｓである。特定の他の実施形態では、Ｘ及びＺはＳであり、ＹはＯである。
特定の実施形態では、ＵはＮであり、Ｖ及びＷはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＶはＮであり、Ｕ及びＷはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。特定の他の実施形態では、ＷはＮであり、Ｖ及びＶはＣＲ４である。特定のそのような実施形態では、Ｒ４は水素である。
特定の実施形態では、Ｂはアルキルであり、Ａは存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。特定の実施形態では、Ｂはメチレンであり、Ａは存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。特定のそのような実施形態では、Ｂはメチレンであり、Ａは存在しない。
特定の実施形態では、Ａがアルキルであり、かつＢが存在しない場合、Ｒ１はアルコキシカルボニルである。
特定の実施形態では、ＡとＢは両方とも存在しない。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、及びアルコキシカルボニルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ１置換基は、１〜６個の独立した置換基でさらに置換されている。
特定の実施形態では、Ｒ１は、フラン、フェニル、ベンジル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ピペリジン、ピペラジン、及びモルホリンから選択される。特定の実施形態では、Ｒ１は、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、及びピロリジン、好ましくは、テトラヒドロフランから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ１はフェニル、好ましくは置換フェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、１〜５回、好ましくは１〜３回、より好ましくは１又は２回置換されたフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ１は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、及びアルキルから、より好ましくはアルキル及びハロゲンから、例えば、メチル、フルオロ、及びクロロから独立に選択される１又は２個、好ましくは１個の置換基で置換されたフェニルである。
特定の実施形態では、Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ３は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキルから選択される。特定の実施形態では、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル、好ましくはアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択される。
特定の実施形態では、Ｒ３は、ピロール、フラン、ピリミジン、オキサゾール、イソオキサゾール、及びチオフェンから選択されるヘテロアリール、好ましくはフランである。特定の実施形態では、Ｒ３は、１〜３回、好ましくは１〜２回、より好ましくは１回置換されたフランである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル、好ましくはアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択される置換基で１回置換されたフランである。特定の実施形態では、Ｒ３は、それ自体、任意に、アルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、及びハロゲンで、好ましくは１〜２回置換されているアリール基で１回置換されたフラン、例えば、クロロフェニル、ジクロロフェニル、カルボキシフェニルである。
特定の実施形態では、Ｒ３はアリール、好ましくはフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、チオアルキル、及びアルキルから独立に選択される１又は２個、好ましくは２個の置換基で置換されたフェニルである。特定のそのような実施形態では、Ｒ３は、ハロゲン、好ましくはブロモで１回置換されたフェニルである。
本発明の化合物は、化合物が、分子のもう一方の末端と比較したときに、分子の一方の末端で、例えば、図示したような上部末端（チアゾリジン環のＮ置換側）又は下部末端（チアゾリジン環の置換フラニル側）でより極性を持つように、固有の末端間極性（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有することができる。或いは、極性のある２つの末端を有する化合物を避けることができる。
本発明の化合物は、純粋な又は実質的に純粋な単一配置、例えば、Ｚ配置にあることができる。
本発明のβ２インテグリンアゴニスト化合物は、好ましくは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のαＡ−ドメイン中の結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）を占める。本発明の化合物は、図１２Ａ〜１２Ｅ及び図２４に記載されているのと同様の様式でαＡ−ドメイン中の結合ポケットを占める。より具体的には、本化合物は、下の実施例１に記載されているように、インテグリンの残基Ｌ３１２、Ｉ３０８、Ｌ３０５（α７ヘリックス）、Ｌ１６４、Ｖ１６０、Ｆ１５６（α１ヘリックス）、及びＹ２６７、Ｉ２６９、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｉ２３６、Ｉ１３５（中心βシート）によって裏打ちされた（ｌｉｎｅｄ）疎水性ポケットと相互作用することができる。本発明の化合物は、αＡ−ドメインのアミノ酸の極性のある残基又は側鎖と相互作用することができる。例えば、本化合物のより極性のある末端は、αＡ−ドメインの残基リジン１６６又はリジン１６８と相互作用することができる。極性のある末端が溶媒により曝露されるように、本発明の化合物のより極性のない末端は、αＡ−ドメイン中の結合部位の疎水性ポケットを占めることができ、より極性のある末端は、αＡ−ドメイン中の結合部位のポケットを占めることができる。
本発明のある化合物は、特定の幾何形態又は立体異性形態で存在することができる。本発明は、本発明の範囲内に含まれるような、シス−及びトランス異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（ｄ）−異性体、（ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、及びそれらの他の混合物を含む、全てのそのような化合物を包含する。さらなる不斉炭素原子が、アルキル基等の置換基中に存在することができる。全てのそのような異性体、及びその混合物が本発明に含まれることが意図される。
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが望ましい場合、それを、不斉合成によるか、又はキラル補助基による誘導体化によって調製することができ、その場合、得られるジアステレオマー混合物を分離し、補助基を切断して、純粋な所望のエナンチオマーを提供する。或いは、分子が、アミノ等の塩基性官能基、又はカルボキシル等の酸性官能基を含有する場合、光学活性のある適切な酸又は塩基を用いて、ジアステレオマー塩を形成させ、その後、このように形成されたジアステレオマーを当技術分野で周知の分別結晶又はクロマトグラフィー手段によって分割し、その後、純粋なエナンチオマーを回収することができる。
本発明のアゴニストはまた、例えば、その構造内への３Ｈもしくは１４Ｃもしくは放射性ハロゲン、例えば１２５Ｉの組込みによって放射性標識で標識することができるか、又はリンカーを援用して、アゴニスト構造体をビオチンもしくはフルオロフォアと連結させることによって標識で標識することができる。
本発明の一態様は、アゴニストとしての非遮断性、活性化抗インテグリン抗体又はその断片に関する。そのような抗体の非限定的な例としては、抗ＣＤ１１ｂ抗体 Ｍ１８／２（４，５）、抗ＣＤ１１ｂ抗体ＥＤ７、抗ＣＤ１１８抗体ＥＤ８（６）、抗ＣＤ１１ｂ抗体ＶＩＭ１２（７）、抗ＣＤ１１ａ抗体ＣＢＲ ＬＦＡ１／２（８）、抗ＣＤ１１ａ抗体ＮＫＩ−Ｌ１６（９）、抗ＣＤ１８抗体ＫＩＭ１８５（１０）、抗ＣＤ１８抗体ＫＩＭ１２７（１１）、抗ＣＤ１８抗体２４（１２）、抗ＣＤ１８抗体ＮＧ２Ｂ１２（６）、抗ＣＤ１８抗体ＭＥＭ４８（１３）が挙げられる。さらに、そのような抗体又はその断片は、様々な動物で使用するために修飾することができ、例えば、当技術分野で周知であるように、ヒト化抗体を作製することができる。
上記のアゴニストを医薬製剤中に含めることができる。本化合物は、その誘導体、医薬として許容されるその塩、又はその水和物を含むことができる。好ましくは、医薬製剤は、活性化合物１〜３０とともに、許容される希釈剤、担体、賦形剤、又はアジュバントを含む。
医薬製剤は、疾患を調節又は治療する他の活性化合物又は活性剤をさらに含むことができる。これらの他の活性化合物又は活性剤は、本発明のアゴニストと相乗的に作用することができる。したがって、他の化合物／薬剤と本発明のアゴニストの両方を、個々に使用する場合よりも低い用量で投与することができる。これにより、より高い用量で使用する場合に有害である可能性がある多くの既知の薬物を、患者にとって安全であると同時に、より低い用量で効果的に使用することが可能になる。
例えば、本発明のアゴニストを、ＴＮＦ−α遮断薬、例えば、限定するものではないが、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト、Ａｍｇｅｎ）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、又はＨＵＭＩＲＡ（アダリムマブ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と組み合わせて使用することができる。エタネルセプトの投与量は、１週間に１回２５〜５０ｍｇであることができ、インフリキシマブの投与量は、２〜８週間に１回、３ｍｇ／ｋｇであることができ、アダリムマブの投与量は、２週間に１回、４０ｍｇであることができ、また、本発明の化合物と組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、抗炎症薬、例えば、限定するものではないが、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、例えば、サリチレート（アスピリン）、酢酸誘導体（インドメタシン）、プロピオン酸誘導体（イブプロフェンもしくはナプロキセン）、又はＣｏｘＩＩ阻害剤、例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））もしくはロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））と組み合わせて使用することができる。投与量は、通常、抗炎症薬の場合、１日当たり１０〜３２００ｍｇであり、これを、本発明のアゴニストと組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、抗癌化合物、例えば、限定するものではないが、シクロ（ＲＧＤｆＶ）ペプチドのシレンジタイドと組み合わせて使用することができる。投与量は、通常、１２０〜２４００ｍｇ／ｍ２であることができ、これを、本発明の化合物と組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、拒絶反応抑制剤、例えば、限定するものではないが、タクロリムス、サイクロスポリン、及び様々なステロイドと組み合わせて使用することができる。タクロリムスの投与量は、１日当たり０．２５ｍｇ〜１ｍｇであることができ、これを、本発明のアゴニストと組み合わせて低減させることができる。サイクロスポリンの投与量は、１日当たり１〜１２ｍｇ／ｋｇであり、これを、本発明のアゴニストと組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、抗凝固薬、例えば、限定するものではないが、ワルファリン（ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ヘパリン、アスピリン、チクロピジン（ＴＩＣＬＩＤ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、クロピドグレル（ＰＬＡＶＩＸ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ／Ｓａｎｏｆｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ジピリダモール（ＰＥＲＳＡＮＴＩＮＥ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、及び糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アゴニストと組み合わせて使用することができる。ワルファリンの投与量は、例えば、１日当たり１〜１０ｍｇであることができ、アスピリンは、１日１回、５０〜６０００ｍｇであることができ、チクロピジンは、１日２回、２５０ｍｇであることができ、クロピドグレルは、１日１回、７５〜３００ｍｇであることができ、ジピリダモールは、１日４回、７５〜１００ｍｇであることができ、これらを、本発明のアゴニストと組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、ステロイド、例えば、限定するものではないが、トブラマイシン、デキサメタゾン、ネオマイシン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、及びエリスロマイシンと組み合わせて使用することができる。デキサメタゾンの投与量は、１日１回、０．７５〜９ｍｇであることができ、ネオマイシンの投与量は、１日１回、３〜１２ｇであることができ、プレドニゾンの投与量は、１日１回、５〜６０ｍｇであることができ、エリスロマイシンの投与量は、１日１回、３０ｍｇ〜４ｇであることができ、これらを、本発明のアゴニストと組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体モジュレーター、例えば、フィンゴリモド（ＧＩＬＥＮＹＡ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と組み合わせて使用することができる。投与量は、１日１回、０．２５ｍｇ〜５ｍｇであることができ、これを、本発明のアゴニストと組み合わせて低減させることができる。
本発明のアゴニストは、さらに、薬剤溶出装置媒体（ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔ ｍｅｄｉａ）と組み合わせて使用することができる。そのような装置としては、ステント及びカテーテルが挙げられる。本発明はまた、ステント又はカテーテル等の装置の挿入による患者の損傷を軽減する方法を提供する。より具体的には、アゴニストを、患者への装置の挿入前に、挿入中に、及び挿入後に投与することができる。下の実施例１に記載されているように、アゴニストは、装置による血管損傷の部位での白血球の蓄積を低下させ、新生内膜肥厚を減少させるように作用する。従来技術の方法は、β２インテグリンアンタゴニストでのみ、そのような結果を提供した。したがって、アゴニストによってもこの機能が提供されることは予想外である。
本発明のアゴニストはさらに、ステント及びカテーテル等の医療装置のコーティングとして使用することができる。本発明はまた、β２インテグリンアゴニストをコーティングした装置を患者に投与することによって、患者の損傷を軽減する方法を提供する。
本発明のアゴニストは、さらに、患者の狭窄を低減させるために使用することができる。本発明はまた、β２インテグリンアゴニストを患者に投与することによって、患者の狭窄を低減させる方法を提供する。
本発明のアゴニストは、さらに、患者の血管アクセスの開通性を改善するために使用することができる。本発明はまた、β２インテグリンアゴニストを患者に投与することによって、患者の血管アクセスの開通性を改善する方法を提供する。
本発明のアゴニストは、さらに、患者の動静脈フィステル（ＡＶＦ）及び動静脈グラフト（ＡＶＧ）の狭窄を低減させるために使用することができる。本発明はまた、β２インテグリンアゴニストを患者に投与することによって、患者の動静脈フィステル（ＡＶＦ）及び動静脈グラフト（ＡＶＧ）の狭窄を低減させる方法を提供する。
最も一般的には、本発明は、β２インテグリンとアゴニスト、好ましくは、本明細書に記載の化合物のうちの１つと相互作用させることによって、β２インテグリンを活性化する方法を提供する。従来技術の方法は、１００パーセントのインテグリン受容体が活性化変異体を含む、細胞内での突然変異体受容体の発現を介したβ２インテグリン活性化を提供するだけであった。したがって、全ての野生型受容体のごく一部にしか結合しないアゴニストによってもこの機能が提供されることは予想外である。
また、本発明は、β２インテグリンアゴニスト、好ましくは、本明細書に記載のアゴニストのうちの１つを投与し、β２インテグリンを活性化することによって、患者を治療する方法を提供する。活性化は、β２インテグリンの過剰活性化と考えることもできる。
β２インテグリンアゴニストは、さらに、下記のような他のβ２インテグリンと比べて、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に選択的であることができる。或いは、β２インテグリンアゴニストは、任意の所望のβ２インテグリン（単数又は複数）を活性化することができる。
本発明のアゴニストが、β２インテグリン、特にインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化に関して提供する多くの異なる機能がある。本発明のアゴニストは、β２インテグリンの機能を調節することができる。この調節は、β２インテグリンの立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）若しくは細胞内又は細胞膜上でのβ２インテグリンの組織化、例えば、それ自体又は他のタンパク質及び物質との二量体化又は多量体化に関するものであることができる。本発明のアゴニストは、β２インテグリンを調節することによって、細胞の機能を調節することができる。アゴニストは、細胞接着を増加させ、炎症を起こした組織への細胞動員を低下させることができる。細胞接着力の増加は、細胞の側方移動（細胞走化性を含む）を低下させることができる。アゴニスト処理による細胞接着力の増加は、細胞の経内皮遊走（ＴＥＭ）を低下させることができる。本明細書に記載の組成物及び方法は、白血球動員に影響を及ぼす。これらの組成物及び方法は、例えば、白血球の遅いローリング及び炎症を起こした内皮への接着力を増加させることによって、これを達成することができ、それは、ブロッキング抗体を用いて覆すことができる。言い換えれば、細胞接着の増加によって細胞がより粘着性になり、そのため、それらは、血管の外側に移動して、組織、例えば、損傷又は炎症を起こした組織に侵入することができない。これは、実際の遮断の代わりに、β２インテグリンの活性化によるβ２インテグリン媒介性機能の機能的遮断である。従来技術の方法は、β２インテグリンアンタゴニストでのみ、そのような結果を提供した。したがって、アゴニストによってもこの機能が提供されることは予想外である。
本発明のアゴニストは、インビトロ及びインビボでβ２インテグリンを調節することによって、細胞の他の機能を調節することができる。例えば、アゴニストは、細胞によって分泌される化学的因子のレベルを低下させる。そのような因子としては、限定するものではないが、炎症因子、例えば、とりわけ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、可溶性ｕＰＡＲ、及びマイクロ粒子が挙げられる。本明細書に記載のアゴニスト及び方法は、β２インテグリン発現細胞による分泌因子のレベルを低下させる。本明細書に記載のアゴニスト及び方法は、それ自体はβ２インテグリンを発現しないが、白血球又はミクログリア等のβ２インテグリン発現細胞と相互作用する、血管内皮細胞等の細胞による分泌因子のレベルを低下させる。本明細書に記載の組成物及び方法は、分泌因子のレベルを増加させる。そのような因子としては、抗炎症因子、例えば、とりわけＩＬ−１０が挙げられる。
本明細書に記載の組成物及び方法は、細胞内のシグナル伝達経路を修飾することもできる。アゴニストは、β２インテグリン発現細胞（とりわけ、白血球を含む）の細胞内シグナル伝達経路を修飾することができる。そのような経路としては、限定するものではないが、とりわけ、ＮＦ−ｋＢ経路、ＡＫＴ経路、ＭＡＰＫ経路、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路、サイトカイン受容体シグナル伝達経路が挙げられる。本発明の化合物及び方法は、β２インテグリンを活性化し、それにより、細胞内の他のシグナル伝達経路と相乗作用するか又は拮抗する細胞内シグナル伝達が誘導される。本明細書に記載の組成物及び方法は、β２−インテグリン発現細胞と相互作用する細胞内のシグナル伝達経路を修飾する。そのような細胞としては、とりわけ、他の白血球サブセット、リンパ球、内皮細胞、星状細胞、及び海馬細胞が挙げられる。本明細書に記載の組成物及び方法は、β２−インテグリン発現細胞（例えば、とりわけ、白血球、リンパ球、内皮細胞）によって分泌される因子と相互作用する細胞内のシグナル伝達経路を修飾する。
本発明のアゴニストは、β２インテグリン、特にインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のそのリガンドへの、インビトロ又はインビボのいずれかでの結合も増加させる。これらのリガンドは、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ｉＣ３ｂ、フィブリノーゲン、第Ｘ因子、フィブリン、ｕＰＡＲ、又はＧＰ Ｉｂαであることができる。アゴニストとタンパク質との結合は、通常、タンパク質の天然のリガンドの結合と関連する少なくとも１つの機能を調節する。そのような機能としては、血管内皮表面での白血球等の細胞のローリング、細胞と血管内皮との結合、血管内皮上での細胞のクローリング、血管内皮を通した細胞の転位、細胞の血管内膜組織への浸潤、細胞からの１以上の可溶性因子の放出、細胞からの走化性因子の放出、細胞からの成長因子の放出、細胞結合に関連する組織からの走化性因子の放出、細胞結合に関連する組織からの成長因子の放出、細胞結合に関連する組織からの１以上の可溶性因子の放出、循環中の１以上の可溶性因子のレベルの変化、及び１以上の非可溶性因子のレベルの変化が挙げられる。可溶性因子としては、サイトカイン、例えば、限定するものではないが、炎症促進性サイトカイン、抗炎症サイトカイン、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、又はＩＦＮ−γが挙げられる。アゴニストによって影響を受ける細胞としては、限定するものではないが、白血球、肝細胞、ミクログリア、特定のＴ細胞及びＢ細胞、幹細胞、多能性細胞、並びに白血病細胞等の細胞が挙げられる。
アゴニストは、突然変異体形態のβ２インテグリンを発現する細胞の機能欠損を矯正又は軽減することもできる。例えば、ＣＤ１１ｂの突然変異は、ループス及びループス腎炎と関連付けられている。本発明のアゴニストは、突然変異体形態のβ２インテグリンを担持する細胞、生物体、及び動物の機能欠損を軽減又は克服することができる。
本発明のアゴニストは、インビトロ及びインビボで、生物学的機能、例えば、限定するものではないが、遺伝子発現、エピジェネティックプロファイル、タンパク質発現、タンパク質レベル、タンパク質修飾、翻訳後修飾、及びシグナル伝達をより全般的に調節することもできる。好ましくは、本発明のアゴニストは、白血球、ミクログリア、及び幹細胞の生物学的機能を調節する。或いは、本発明のアゴニストは、他の細胞又は組織の生物学的機能を調節することができる。
本発明のアゴニストは、インビトロ及びインビボで、他の生物学的機能、例えば、幹細胞の分化、多能性細胞の分化、培養中又は長期保存中の細胞の維持、細胞の移動、例えば、白血球の骨髄から循環中への移動又は内皮前駆細胞の炎症もしくは損傷部位への移動、及び特定の細胞のそのニッチへの保持の増加、例えば、骨髄中の白血病細胞の増加を調節することもできる。
治療又は予防することができる、β２インテグリンの活性と関連する多くの疾患又は状態があり、それには、例えば、炎症（急性及び慢性炎症を含むが、これらに限定されない）、炎症性皮膚疾患、免疫関連障害、自己免疫疾患、火傷、免疫不全、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ミエロペルオキシダーゼ欠損、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性腎疾患、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、白血球接着不全、鉄分不足、セディアック−東症候群、重症複合免疫不全、糖尿病、肥満、高血圧、ＨＩＶ、創傷治癒、リモデリング、瘢痕化、線維化、幹細胞療法、悪液質、脳脊髄炎、多発性硬化症、アルツハイマー病、乾癬、ループス、関節リウマチ、免疫関連障害、放射線障害、移植、細胞移植、細胞輸血、臓器移植、臓器保存、細胞保存、喘息、過敏性腸疾患、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、大腸炎、腸疾患、癌、白血病、虚血−再灌流傷害、卒中、血管損傷と関連する新生内膜肥厚、水疱性類天疱瘡、新生児閉塞性腎症、家族性高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、脂質異常症、大動脈動脈瘤、動脈炎、脳動脈閉塞を含む血管閉塞、冠状動脈バイパス手術の合併症、慢性自己免疫性心筋炎及びウイルス性心筋炎を含む心筋炎、慢性心不全（ＣＨＦ）を含む心不全、心不全の悪液質、心筋梗塞、狭窄、心臓手術後の再狭窄、無症候性心筋虚血、左室補助装置の移植後合併症、血栓性静脈炎、川崎血管炎を含む血管炎、巨細胞性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫、外傷性頭部損傷、虚血後の再灌流傷害、虚血後の脳の炎症、心筋梗塞後の虚血−再灌流傷害、脳マラリア、並びに心血管疾患があるが、これらに限定されない。これらの疾患は、医薬製剤中の本発明のアゴニストを患者に投与することによって、治療又は予防することができる。アゴニストは、上記のような様々な機能を果たして、患者の疾患を治療することができる。
患者の治療は、β２インテグリンの活性化を検出することによって確認することができる。これは、患者から試料を採取し、生物学的試料中の白血球の表面でのβ２インテグリン発現のレベル又はそのような細胞上の活性化β２インテグリンのレベルの検出等のアッセイを行なうことによって達成することができる。患者の治療を確認するための別の手法は、通常、該疾患と関連する患者の他の既知のマーカーのレベル、例えば、血液試料中のＩＬ−６のレベル、又は患者の疾患症状を評価することである。
炎症を治療する具体的な方法では、本明細書に記載のβ２インテグリンアゴニストを、炎症を有する患者に投与して、β２インテグリンを活性化し、炎症を軽減することができる。１つの作用機序では、アゴニストは、下の実施例１に記載されるように、Ａｋｔをリン酸化することによって、白血球における炎症促進性サイトカイン発現、例えば、ＩＬ−６を抑制することができる。さらに、アゴニストは、炎症の減少をもたらす好中球及びマクロファージによる可溶性因子の分泌を減少させることができる。アゴニストは、炎症部位付近での好中球接着力を増加させ、そして好中球運動性を減少させることによって、好中球動員を遅延させることもできる。また、アゴニストが活性化されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、白血球接着を増加させ、それにより、白血球のクローリング及び経内皮遊走が減少し、その結果、炎症／損傷を起こした組織への動員が低下する。ＣＤ１１ｂ活性化は、炎症促進性シグナル及び経路に対するネガティブフィードバックループを提供する細胞内シグナル伝達を誘導する。さらに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を活性化するいくつかの活性化抗体が文献中に存在するが、そのような「抗体」は理想的でない場合がある。本発明は、そのような活性化抗体が、細胞内でインテグリンクラスタリング又は他の有害なシグナル伝達経路を誘導するのではなく、代わりに、ロイカドヘリンによって誘導されるものと同様の経路を誘導するように、それらを本発明のアゴニストとして使用するために修飾する必要があることを提供する。
本発明はまた、β２インテグリンアゴニストを患者に投与し、β２インテグリンを活性化することによって、腎虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を治療及び／又は予防する方法を提供する。腎臓Ｉ／Ｒ傷害は、腎移植、大手術、外傷、敗血症性ショック、及び出血性ショックの後の急性腎不全の主な原因である。β２インテグリンアゴニストは、手術前に投与することができる。或いは、アゴニストは、腎移植、大手術、外傷、敗血症性ショック、及び出血性ショックの後に投与することができる。アゴニストを投与することによって、ｓＣｒレベルが顕著に低下し、腎臓保護効果がもたらされる。
本発明はまた、β２インテグリン、特に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の小分子モジュレーターの同定のためのアッセイを行なう方法を提供する。より具体的には、β２インテグリンの活性を調節する部位及びドメインを、β２インテグリン中に、特に、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８中に、インテグリンＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８中に、インテグリンＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８中に、又はインテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８中に同定することができ、かつ結合ポケットの正確な三次元構造を決定することができ、これを用いて、より選択的かつ／又は強力なバインダーを得ることができる。例えば、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合アゴニストとの複合体を調製し、例えば、ｘ線結晶学、核磁気共鳴、又は他の好適な手段で解析して、このアゴニストと相互作用するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の結合部位を同定することができる。本アッセイは、細胞接着を阻害又は増強するアゴニストを同定するための細胞接着に基づくハイスループットスクリーニングアッセイであることもできる。例えば、小分子アゴニスト候補のライブラリーを特定のβ２インテグリンに対してスクリーニングすることができる。接着していない細胞は、アッセイプレートをひっくり返して重力によって除去することができる。この工程は、アッセイプレートを洗浄する代わりに実施される。細胞核を染色し、その後、イメージングして接着細胞の数を定量することができ、その後、アゴニストを同定することができる。本アッセイは、インビトロ又はインビボアッセイであることができる。
コンピュータに基づくモデリングアルゴリズムを用いて、β２インテグリン、特に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に結合するアゴニストの構造及び立体構造を解析し、結合の成功に寄与する構造的特徴を同定することができる。そのような情報を、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８又はその結合ポケットの構造又は立体構造、例えば、ｘ線結晶学又は核磁気共鳴等の解析技術を用いるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の解析によって得られる構造情報に関する情報と併せて解析し、結合するアゴニストとそれらが相互作用する結合ポケットとの相互作用を解析することができる。そのような解析を用いて、アゴニストと相互作用するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の部分を予測し、所望の結合活性と相関する構造的特徴を有するアゴニストを試験アゴニストのライブラリーから選択するか、又は本明細書に記載されているようなアッセイを用いてインビボもしくはインビトロで試験するために、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との結合を示すことが予想される構造を設計することができる。
コンピュータに基づくモデリングアルゴリズムを用いて、本発明の化学的化合物アゴニストの構造的特徴を用いて、β２インテグリン、特に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に結合する新規のアゴニストを同定することもできる。スキャフォールドホッピング法、原子置換法、残基置換法、及び／又は分子置換法を用いることができる。この情報を、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８又はその結合ポケットの構造又は立体構造、例えば、ｘ線結晶学又は核磁気共鳴等の解析技術を用いるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の解析によって得られる構造情報に関する情報と併せて解析し、結合するアゴニストとそれらが相互作用する結合ポケットとの相互作用を解析することができる。そのような解析を用いて、アゴニストと相互作用するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の部分を予測し、所望の結合活性と相関する構造的特徴を有するアゴニストを試験アゴニストのライブラリーから選択するか、又は本明細書に記載されているようなアッセイを用いてインビボもしくはインビトロで試験するために、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との結合を示すことが予想される構造を設計することができる。
本明細書に記載されるようなβ２インテグリンアゴニストを投与し、β２インテグリンアゴニストのβ２インテグリンへの結合を検出し、疾患の存在を確認することによって、患者の状態又は疾患を検出又は診断する方法を提供する。好ましくは、β２インテグリンは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８である。言い換えれば、結合が存在する場合、患者は、上記のような疾患を有する。例えば、疾患は、炎症性疾患又は自己免疫疾患であることができ、アゴニストのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合を検出することによって、患者がそれらの疾患を有することを確認することができる。また、患者の状態又は疾患を検出又は診断するために、本発明のアゴニストを患者から得られた生物学的試料に投与することができる。投与されるアゴニストは、簡便な検出を可能にするようなやり方で、誘導体化するか、タグ化するか、ポリマー化するか、カプセル化するか、又は封入することができる。アゴニストは、リンカーを用いて、トレーサー、放射性標識、又は蛍光タグでタグ化することができる。アゴニストは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）及び当技術分野で公知の他のそのような診断技術を用いて検出することができる。別の検出方法は以下の通りであることができる。血液又は血漿等の生物学的試料を患者から採取することができ、例えば、β２インテグリンアゴニストのβ２インテグリンへの結合を検出するか、又は試料中の他のマーカー（例えば、ＩＬ−６レベル）を測定するための、アッセイを行なうことができる。
本発明はまた、有効量のβ２インテグリンアゴニストを投与し、β２インテグリンを活性化することによって、患者の全般的な健康を改善する方法を提供する。言い換えれば、本発明のアゴニストは、上記のような多くの異なる疾患を治療するので、このアゴニストを投与することによって、患者の健康状態（ｈｅａｌｔｈ）及び健康（ｗｅｌｌｎｅｓｓ）が改善する。
本発明のアゴニストを含む組成物は、有効量の活性物質が医薬として許容されるビヒクルとの混合物中で組み合わされるように、対象に投与することができる医薬として許容される組成物の調製のための公知の方法によって調製することができる。好適なビヒクルは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ １９８５）に記載されている。これに基づいて、組成物は、限定されるものではないが、１以上の医薬として許容されるビヒクル又は希釈剤と関連した、かつ好適なｐＨを有し、生理液と等張な緩衝溶液中に含まれる、物質の溶液を含む。
本発明のアゴニストは、遊離塩基の形態で、塩、溶媒和物の形態で、及び水和物として用いることができる。全ての形態が本発明の範囲内である。酸付加塩が形成され、使用のためのより好都合な形態を提供することができ；実際、塩形態の使用は、本質的に塩基形態の使用に等しい。酸付加塩を調製するために用いることができる酸は、好ましくは、遊離塩基と組み合わせたときに、医薬として許容される塩、すなわち、そのアニオンが、塩の薬学的用量で動物にとって非毒性である塩を生じさせ、その結果、遊離塩基に固有の有益な特性がアニオンに起因する副作用によって損なわれない酸を含む。塩基性アゴニストの医薬として許容される塩が好ましいが、たとえ、特定の塩それ自体が、例えば、塩が、精製及び同定のみを目的として形成される場合、又はそれが、医薬として許容される塩をイオン交換手順で調製する際の中間体として用いられる場合のように、中間産物としてのみ望ましいとしても、全ての酸付加塩が遊離塩基形態の供給源として有用である。
本発明の範囲内の医薬として許容される塩としては、以下の酸に由来するものが挙げられる；鉱酸、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、及びスルファミン酸；及び有機酸、例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐトルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸等。
本発明の方法に従って、記載されたアゴニスト又はその塩もしくは溶媒和物を、当業者によって理解されるように、選択された投与経路に応じて種々の形態で患者に投与することができる。本発明の組成物は、経口的に又は非経口的に投与することができる。非経口投与としては、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻腔内、肺内、髄腔内、経直腸、及び局所の投与様式が挙げられる。非経口投与は、選択された期間にわたる連続注入であることができる。
本発明のアゴニスト又はその塩もしくは溶媒和物は、例えば、不活性希釈剤とともにもしく同化可能な食用担体（ｃａｒｄｅｒ）とともに経口投与することができるか、又はそれは、ハードシェルゼラチンカプセルもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができるか、又はそれは、圧縮して錠剤にすることができるか、又はそれは、食事の食物とともに直接取り込むことができる。経口治療投与のために、本発明のアゴニストは、賦形剤とともに組み込み、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で用いることができる。
本発明のアゴニストは、非経口的に又は腹腔内に投与することもできる。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩もしくは溶媒和物としての本発明のアゴニストの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に組み合わせた水の中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、及びアルコールを含む又はアルコールを含まないそれらの混合物中、並びに油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止する防腐剤を含む。当業者であれば、好適な製剤の調製の仕方を知っているであろう。好適な製剤の選択及び調製のための従来の手順及び成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０−第１８版）、及び１９９９年に刊行された米国薬局方：国民医薬品集（ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に記載されている。
注射使用に好適な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌性でなければならず、また、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。
本発明のアゴニストは、単独で又は上記のような医薬として許容される担体と組み合わせて動物に投与することができ、その割合は、アゴニストの溶解度及び化学的性質、選ばれる投与経路、並びに標準的な薬学的慣習によって決定される。
本発明のアゴニスト及び／又は組成物の投薬量は、アゴニストの薬力学的特性、投与様式、レシピエントの年齢、健康状態、及び体重、症状の性質及び程度、治療の頻度及びもしあれば、併用療法の種類、並びに治療されるべき動物におけるアゴニストのクリアランス速度等の多くの因子によって様々であり得る。当業者は、上記の因子に基づいて、適切な投薬量を決定することができる。本発明のアゴニストは、最初は、好適な投薬量で投与することができ、これは、臨床的応答に応じて、適宜調整することができる。
本発明をさらに、以下の実験実施例を参照して詳細に記載する。これらの実施例は、単に説明目的で提供されるのであって、特に明記しない限り、限定を意図するものではない。したがって、本発明は、決して、以下の実施例に限定されるものとみなされるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明確になるありとあらゆる変化形を包含するものとみなされるべきである。
実施例１
合成の材料及び方法
本発明のアゴニストは、例えばＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍａｒｃｈ，第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａ巻及びＢ巻，第３版，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９０；Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９１；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｌａｒｏｃｋ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８、及びこれらの文献に引用されている参考文献に記載されるような当業者に公知の技術を用いて容易に合成できる。本発明に記載のアゴニストの出発材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ，Ｎ．Ｈ．）；Ｒｙａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｓ．Ｃ．）；Ｃａｎｂｒｉｄｇｅ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）；Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｓ．Ｃ．）；Ａｒｃｏｓ，（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、及びＴｒａｎｓ Ｗｏｒｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）等の市販供給源から容易に入手可能である化学的前駆体の標準的な合成変換を用いて調製することができる。
試薬及び抗体。抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（ｍＡｂ）４４ａ（ＩｇＧ２ａ）［３７］及びヘテロ二量体特異的抗ＣＤ１８ ｍＡｂ ＩＢ４（ＩｇＧ２ａ）［３８，３９］は、ＡＴＣＣ製であった。ｍＡｂ ２４（ＩｇＧ１）［４０］は、Ａｂｃａｍ製であり、アイソタイプ対照抗体ＭＯＰＣ−２１（ＩｇＧ１）及びＭＯＰＣ−１７３（ＩｇＧ２ａ）、ＦＩＴＣコンジュゲートｍＡｂ Ａ８５−１（ラット抗マウスＩｇＧ１）、Ｒ１９−１５（ラット抗マウスＩｇＧ２ａ）、及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリンは、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。ラット抗マウスＧＲ１−ＦＩＴＣ及びＭａｃ−１−ＰＥは、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。ヒトフィブリノーゲン（プラスミノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子、及びフィブロネクチン除去型）は、ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＳｏｕｔｈＢｅｎｄ，ＩＮ）製であり、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）製であり、組換えヒトＩＣＡＭ１−Ｆｃは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製であり、ｉＣ３ｂは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。３８４ウェルプレートは、市販供給源からのもの（Ｎａｌｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）製のＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製のＨｉｇｈｂｉｎｄ）であった。無脂肪乳は、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から入手した。細胞定量試薬ＭＴＳは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であり、ＡＴＰＬｉｔｅは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）製であった。ＰＣＲ試薬、並びに制限酵素及び修飾酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。グルタチオンビーズは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）から購入した。細胞培養試薬は全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＭｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）製であった。胎仔ウシ血清は、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ（Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）から購入した。Ｇ４１８抗生物質は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）野生型及びＢ６ ＣＤ１１ｂ−／−（Ｊａｘ ３９９１）［４１］マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＭＥ）から購入した。野生型フィッシャー３４４ラットは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。動物の世話及び処置は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉａｍｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、施設のガイドラインに従って実施された。
細胞株。野生型インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ）（Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）は、以前に記載されている［４２，４３］。突然変異体ＣＤ１１ｂＥ３２０Ａは、以前に記載されている［４４］。突然変異体インテグリンＣＤ１１ｂＥ３２０Ａ／ＣＤ１８を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞（Ｋ５６２ Ｅ３２０Ａ）は、文献プロトコルに従って作製された［４２，４３］。細胞株は全て、１０％非働化胎仔ウシ血清、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン、並びに０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されたイスコフの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で維持された。
Ｋ５６２細胞接着アッセイ。固相化リガンドを用いる細胞接着アッセイを以前に記載されている通りに実施した［４２］。全て異なるＫ５６２細胞株（Ｋ５６２、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、及びＫ５６２ Ｅ３２０Ａ）を用いるアッセイを同一のやり方で実施した。簡潔に述べると、３８４ウェルＨｉｇｈｂｉｎｄマイクロタイタープレートを、各１ｍＭのＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンを含むリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ＋＋）中の３０μＬのリガンド溶液で、４℃で一晩コーティングした。リガンドＦｇを５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｉＣ３ｂを１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。ヘテロ二量体特異的ｍＡｂ ＩＢ４（腹水）を１：１００希釈でコーティングした。その後、ウェルを１％ゼラチンを含むＴＢＳでブロッキングする好中球アッセイを除き、ウェル中の非特異的部位を、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４中の１％無脂肪乳とともに室温で１時間インキュベートすることによってブロッキングした。次に、ウェルをＴＢＳで３回洗浄した。Ｋ５６２細胞をアッセイバッファー（各１ｍＭのＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンを含むＴＢＳ（ＴＢＳ＋＋））に懸濁し、リガンドをコーティングしたウェルに移した（３０，０００細胞／ウェル）。ロイカドヘリンファミリーの小分子アゴニストのストック溶液は、アゴニストを２〜１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解させることによって調製した。アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、約１％であった。Ｋ５６２細胞を、増加濃度のロイカドヘリンの存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。接着していない細胞を除去するために、アッセイプレートをゆっくりとひっくり返し、ひっくり返した位置に室温で３０分間保った。接着し続けている細胞をホルムアルデヒドを用いて固定し、以前に記載されているように、イメージング顕微鏡法を用いて定量した［４２］。ブロッキングアッセイのために、細胞をｍＡｂ ４４ａ及びＩＢ４とともにＲＴで３０分間インキュベートし、その後、それらをアッセイウェルに添加した。３〜６個の複製ウェル中でアッセイを実施した。報告されたデータは、少なくとも３回の独立した実験のうちの１回からのものである。１００，０００を超える小分子のライブラリーを用いて新規アゴニストを同定するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを以前に記載されているように実施した［４２，４５］。
好中球接着アッセイ。８〜１０週齢のＷＴ及びＣＤ１１ｂ−／−Ｂ６マウス由来の好中球を、文献プロトコルに従って、チオグリコレートで刺激した腹膜から単離した［４６］。細胞を無血清培地（ＩＭＤＭ）に懸濁し、リガンドをコーティングしたウェルの中で、ロイカドヘリンとともに、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、接着していない細胞を除去するために、アッセイプレートをゆっくりとひっくり返し、ひっくり返した位置に室温で３０分間保った。接着し続けている細胞を、以前に記載されているように、イメージング顕微鏡法を用いて定量した［４２，４７］。アッセイを三連ウェルで実施した。報告されたデータは、少なくとも３回の独立した実験のうちの１回からのものである。
走化性アッセイ及びタイムラプスビデオ顕微鏡観察。２Ｄ表面での好中球走化性を、記載されているように［４８，４９］、Ｚｉｇｍｏｎｄチャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）を用いて、酸洗浄されたガラス又はＦｇコーティングされたガラスカバースリップ上で実施した。ロイカドヘリン（１５ｍＭ）の非存在下又は存在下、１０ｍＭの細菌ペプチドホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ、Ｓｉｇｍａ）の勾配中で細胞遊走を生じさせた。細胞遊走を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ９０ｉ倒立顕微鏡を用いて、３０秒毎の間隔で２５分間記録した。ＰＬＡＮ ＡＰＯ ２０Ｘ微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡対物レンズを用いてＮｉｋｏｎ ＤＳカメラで画像を取得し、Ｎｉｋｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアに取り込んだ。ＩｍａｇｅＪ用のＩｂｉｄｉの走化性及び遊走ツールプラグインを用いる手動の細胞トラッキングとともに、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を用いて、１０μｍを超えて移動していた運動性集団について、好中球遊走の解析を行なった［４８］。遊走速度及び全変位（起点からの距離）も解析した。少なくとも３回の独立した実験から１条件当たり少なくとも５０個の細胞を用いて、定量を行なった。
免疫蛍光。遊走好中球におけるインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８及びＦ−アクチンの局在を調べるために、細胞（１０４）を、ガラスカバースリップ上で、ロイカドヘリン（１５ｍＭ）の非存在下又は存在下、無血清培地（ＲＰＭＩ １６４０）中の１０μＭのｆＭＬＰで、３７℃で１５分間刺激した。細胞を固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理し、抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（クローンＭ／１７０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いで、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びローダミン標識ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ｚシリーズの蛍光画像を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡及びＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ６３ｘ／１．４ ＮＡ対物レンズで、並びにＬｅｉｃａ ＬＡＳ−ＡＦソフトウェアを用いて記録した。ｚ−シリーズをＬｅｉｃａ ＬＡＳ−ＡＦソフトウェア一式で解析した。提示された画像は、基底細胞側から頂端細胞側への１５枚の共焦点切片のｚ−スタック投影（スタックｚ−間隔、０．２９μｍ）に由来するものである。提示された画像は、少なくとも２回の独立した実験からの条件１つ毎に解析された少なくとも２０個の細胞を代表するものである。
細胞表面でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のクラスタリングを調べるために、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞（１０４）を無血清培地（ＩＭＤＭ）に懸濁し、ロイカドヘリン（１５ｍＭ）の非存在下又は存在下、記載されているように［５０］、リガンドＦｇ（１００ｍｇ）あり又はなしで、３７℃で３時間インキュベートした。細胞を懸濁液中で固定し、抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ ｍＡｂ ＩＢ４、次いで、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８（ＳＩＧＭＡ）で染色した。蛍光画像を、ＬＡＳ−ＡＦソフトウェアにより駆動されるＤＣＦ３６０ＦＸカメラを用いて、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ１６０００デコンボリューション顕微鏡及びＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ６３ｘ／１．３ ＮＡ対物レンズで、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ−ＡＦソフトウェアを用いて記録した。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８クラスターをＩｍａｇｅＪで解析し、蛍光強度の三次元表示もＩｍａｇｅＪで作成した。提示された画像は、少なくとも３回の独立した実験からの条件１つ毎に解析された少なくとも２０個の細胞を代表するものである。
組換えＣＤ１１ｂ Ａ−ドメイン（αＡ−ドメイン）の精製。組換えヒトαＡ−ドメインを公表されているプロトコルに従って構築し、精製した［５１］。簡潔に述べると、残基Ｇｌｙ１１１からＧｌｙ３２１に及ぶタンパク質断片（３２１ＷＴ）を、フォワードプライマー５’−ｇｇｔｔｃｃｇｃｇｔｇｇａｔｃｃｇａｇａａｃｃｔｇｔａｃｔｔｔｃａａｇｇａｇｇａｔｃｃａａｃｃｔａｃｇｇｃａｇ−３’（配列番号：１）及びリバースプライマー５’−ｇａａｔｔｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃａｃｃｃｔｃｇａｔｃｇｃａａａｇａｔ−３’（配列番号：２）を用いて、かつ製造業者のプロトコルに従って、Ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩ部位にクローニングし、発現させることによって、その不活性型立体構造のαＡ−ドメインを作製した。フォワードプライマー５’−ｇｇｔｔｃｃｇｃｇｔｇｇａｔｃｃｇａｇａａｃｃｔｇｔａｃｔｔｔｃａａｇｇａｇｇｔｔｔｔｃａｇｇａａｔｇｔ−３’（配列番号：３）及びリバースプライマー５’−ａｔａｔｃｃｃｃｇｇｇａｔｔａａｃｃｃｔｃｇａｔｃｇｃａａａｇｃｃｃｔｔｃｔｃ−３’（配列番号：４）を用いて、Ｉｌｅ３１６をＧｌｙに置換する（Ｉ３１６Ｇ［５２］）ことによって、その活性型立体構造のαＡ−ドメインを作製した。挿入物をＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで同様に消化したｐＧＥＸ−２Ｔベクターに連結した。全てのコンストラクトを直接的なＤＮＡシークエンシングで確認した。全ての組換えタンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現させ、製造業者の指示に従って、親和性クロマトグラフィー（グルタチオン−ビーズ、Ｓｉｇｍａ）で精製した。精製タンパク質調製物を、２０ｍｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍM ＮａＣｌ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）に対して透析し、その後、Ａｍｉｃｏｎ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、−８０℃で保存した。純度を１Ｄ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析で確認した。
αＡ−ドメインリガンド結合アッセイ。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＦｇ（１μｇ／ウェル）で一晩コーティングし、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。精製した、ＧＳＴタグ化αＡ−ドメイン（５ｍｇ／ｍＬ溶液の５０ｍＬ／ウェル）の固相化Ｆｇへの結合を、室温で１時間、ＴＢＳアッセイバッファー（０．１％ＢＳＡ、１ｍＭ Ｍｇ２＋、１ｍＭ Ｃａ２＋、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）中で行なった。未結合のαＡ−ドメインを、アッセイウェルをＴＢＳ＋＋で２回洗浄することによって除去した。その後、結合したタンパク質の量を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（１：２０００希釈）にコンジュゲートされた抗ＧＳＴ抗体とともに１時間インキュベートすることによって決定した。未結合の抗ＧＳＴ−ＨＲＰを、アッセイウェルをＴＢＳ＋＋で２回洗浄することによって除去した。結合したタンパク質の検出を、製造業者のプロトコルに従って、ＴＭＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて行なった。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ Ｍ５分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて読み取った。アッセイを三連ウェルで行なった。示したデータは、少なくとも３回の独立した実験のうちの１回からのものである。
フローサイトメトリー。インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の細胞表面発現についてのＫ５６２細胞のフローサイトメトリー解析を、公表されているプロトコルを用いて行なった［５３，５４］。簡潔に述べると、細胞をアッセイバッファー（各１ｍＭのＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンを含むＴＢＳ（ＴＢＳ＋＋）、並びに０．１％ＢＳＡ）に懸濁した。細胞（５×１０５）を、１００ｍｌ ＴＢＳ＋＋中の１５ｍＭロイカドヘリンの非存在下又は存在下、一次ｍＡｂ（１：１００希釈のＩＢ４又は４４ａ腹水）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をアッセイバッファーで３回洗浄し、ヤギ抗マウス−ＡＰＣ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに４℃で２０分間インキュベートした。細胞をアッセイバッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）を用いて解析し、少なくとも１０，０００事象をカウントした。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。アッセイを三連で行なった。示したデータは、少なくとも３回の独立した実験のうちの１回からのものである。
細胞生存率アッセイ。細胞生存率アッセイを記載されているように実施した。簡潔に述べると、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞（１０，０００／ウェル）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、増加量の表示されたアゴニストとともに２４時間インキュベートした。２４時間後の生細胞の数を、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従ってＭＴＳ試薬を用い、かつアッセイプレートの読取りにＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることによって決定した。示したデータは、少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。
ウェスタンブロット。Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞を、無血清培地中、ＬＡ１、ＬＡ２、ＬＡ３（１５ｍＭ）又はＦＧ（２００ｍｇ）とともに、３７℃で１時間インキュベートした。細胞ライセートを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、確立されたプロトコルを用いて、ＰＶＤＦ膜（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に転写した。膜を１：１０００希釈の抗ホスホＥＲＫ１／２抗体（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）でプロービングし、再ブロット用の弱いストリッピング溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）でストリッピングし、まず、抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ）で、次に、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で再プロービングし、製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に従って発色させた。提示したデータは、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
血球数。様々なマウス由来の全末梢血白血球数を、標準的なアッセイを用いてマウス病理検査コアで定量した。
インビボ腹膜炎モデル。チオグリコレート誘導性腹膜炎を、８〜１０週齢のＷＴＢ６及びＣＤ１１ｂ−／−Ｂ６マウスを用いて、以前に記載されているように実施した［４６］。ロイカドヘリンアゴニストを腹腔内（ｉ．ｐ．）チオグリコレート（３％）注射の３０分前に投与した。ＬＡ１及びＬＡ２（２００ｍＬの２０ｍＭ生理食塩水溶液）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＬＡ３をｉ．ｐ．投与した（１ｍＬの２０ｍＭ生理食塩水溶液）。腹膜への好中球動員を評価するために、チオグリコレート注射４時間後に、マウスに麻酔をかけ、腹腔洗浄液を回収し、記載されているように、ＧＲ−１及びＭａｃ−１染色について二重陽性の細胞を用いて、移入してきた好中球の数を定量した［５５］。
ラットにおけるバルーン誘導性動脈損傷。手術は全て、イソフルラン麻酔（Ｂａｘｔｅｒ，ＩＬ，ＵＳＡ）下で行なわれた。特注の血管造影キット（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｃｉｍｅｄ）に適合させた２Ｆ Ｆｏｇａｒｔｙカテーテル（Ｂａｘｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、右腸骨動脈のバルーン損傷を負わせた［５６］。腹部大動脈での大動脈切開を行なって、２Ｆ Ｆｏｇａｒｔｙ塞栓除去カテーテルを右腸骨動脈のレベルにまで挿入した。バルーンを１．５〜１．６気圧まで膨張させ、動脈切開部位まで３回引き戻した。大動脈切除を８．０縫合糸で修復した。腹腔を結節縫合パターンを用いて平面で閉じた。損傷の３〜３０日後に動脈標本を回収し、４％ホルマリン−ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で５分間固定し、組織検査及び免疫染色によって解析した。
組織検査及び免疫染色。エラスチカ・ワンギーソン染色を組織化学的解析に用いて、新生内膜形成を評価した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪを用いて盲検様式で形態学的解析を行なった。組織中のマクロファージの検出のための抗ラットＣＤ６８（１：５０、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）による免疫染色である。
ゼブラフィッシュ尾びれの損傷アッセイ。トランスジェニックＴｇ（ｍｐｘ：：ｅＧＦＰ）［５７］を標準的なプロトコルに従って維持した［５８］。受精後（ｄｐｆ）３日の幼生の尾びれ損傷を記載されているように行なった［５７］。４．２％トリカイン（ｔｒｉｃａｎｅ）を含むＥ３への浸漬によって幼生に麻酔をかけ、承認されたプロトコルに従って滅菌顕微解剖用メスを用いて尾を完全に切断し、示された時点の間、回復させた。ゼブラフィッシュ幼生（３ｄｐｆ）を記載されているようにアゴニストで処理した（Ｒｅｆ）。簡潔に述べると、幼生をアゴニストのＥ３溶液に浸漬させることによって、小分子アゴニストを投与した。ＤＭＳＯの最終濃度は、１％未満で維持した。炎症応答の評価のために、損傷を受けた幼生を損傷４時間後に解析した。洗浄後アッセイのために、損傷を受けていない幼生をＥ３中のアゴニストとともに４〜８時間インキュベートし、洗浄してＥ３に入れ、損傷を与えた。Ｖｏｌｏｃｉｔｙを用いて、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ６０００Ｂ顕微鏡及びＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ−３ＣＣＤカメラを用いて、幼生を解析した。４８８ｎｍのレーザーを用いて励起を行ない、Ｖｏｌｏｃｉｔｙを用いて画像を解析した。炎症部位での蛍光好中球の数を盲検様式で目視によりカウントした。
統計解析。２以上の群を比較する場合、事後解析を伴う一元ＡＮＯＶＡを用いて、データを比較した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
コンピュータモデリング。αＡ−ドメインの活性型の、開いた立体構造へのロイカドヘリンの結合をモデリングするために、コンピュータによる一連の研究を以下のように行なった。まず、開いた（活性型の）立体構造のαＡ−ドメインのモデルを作成した。その閉じた（不活性型の）立体構造と開いた（活性型の、リガンド結合可能な）立体構造の両方のαＡの高分解能三次元構造は、ＰＤＢから入手可能である［５９，６０］。しかし、αＡ中のα７ヘリックス（これは、ＣＤ１１ｂ中のイソロイシンの受入口として知られる疎水性ポケット（ＳＩＬＥＮ）［６０］又はＣＤ１１ａ中のＩＤＡＳ［６１］の一部を生成させ、αＡ活性化によって最も大きい立体構造変化を示す［６２〜６４］）は、閉じた形態のαＡの三次元構造［５９］と比較して、開いた形態の三次元構造［６０］において３残基短い。αＡアゴニストは、この領域１１中で結合すると予測されているので、α７ヘリックスを、αＡ−ドメインの高分解能構造［６０］において、閉じた（不活性型）形態のαＡ［５９］のドメイン由来の３つの追加の残基だけ手作業で延長させた。このモデルを水素結合最適化及び制約付き最小化によって洗練した。
考えられるリガンド結合様式を特定するために、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェア一式に実装されている誘導適合ドッキング（ＩＦＤ）手順を以前に記載されているように適用した［３６］。ＭＭ ＧＢ／ＳＡを用いて、αＡ孔に順位を付け；このアプローチを用いて、疎水性溶媒露出表面積条件に関して補強された一般化ボルン溶媒和モデル（ＧＢＳＡ）を用いて、アゴニストのαＡに対する結合の自由エネルギーを推定した。その後、最適化されたαＡ構造を、標準電位を用いるアゴニスト再ドッキングに用いた［６５］。数回のＩＦＤの実行を行ない、それらにより、大部分のアゴニストについての高得点の形状が得られた［３６］。その後、ＩＦＤ後の最適化された受容体構造を用いて、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｇｌｉｄｅ及びＳＰ得点化関数を用いて、新規のアゴニストをドッキングさせた。次に、そのＺ配置のアゴニストについての最も得点が高い形状を分子動態シミュレーションでさらに最適化した。分子動態シミュレーションは、分子動態実行の作成（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｕｎ）前にいくつかの最小化及びシミュレーション工程がある多工程プロトコルとして行なわれる。３００Ｋ及び３２５Ｋ（ＮＰＴ ｅｎｓｅｍｂｌｅ）でＤＥＳｈａｗ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製の分子動態パッケージＤｅｓｍｏｎｄ［６６］を用いて、ＩＢＭ Ｅ−サーバー１３５０クラスター（３６ノードの８Ｘｅｏｎ ２．３ＧＨＺコア及び１２ＧＢのメモリ）上でＳＰＣ水モデル（受容体周辺の１０Åの立方体）を用いて、シミュレーションを行なった。最終的なシミュレーション時間は１２ｎｓであり、この間、報告された形状は安定なままであった。図１２Ａ〜１２Ｅは、ＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の形状を示す。
結果
インテグリンアゴニストは、アンタゴニストに優るいくつかの利点を有する。ここ数年にわたるアンタゴニストを用いた研究によって、それらが準最適であることが示されている。第一に、アンタゴニストで白血球動員を抑制することは、通常、高レベルのブロッキング抗体をインビボで必要とする、活性型インテグリン受容体の９０％超の占有を必要とする［３２］ことが示されている。第二に、細胞表面に発現されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の完全な遮断は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の大量の移動可能な細胞内プールの利用可能性のために、抗体を用いても難しい［３０，３１］。第三に、リガンド模倣性の好中球阻害因子（ＮＩＦ）［６７］及び組換えαＡ−ドメイン［６８］等の、いくつかの他のアンタゴニストは、動物モデルで効果的であったが、そのサイズの大きさ及び免疫原性のために、治療剤としてのその使用は避けられる。組換えＮＩＦ（ＵＫ−２７９２７６）は、臨床試験で失敗に終わった。同様に、抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗体又はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８リガンドのいずれかに由来するペプチドは、おそらくは、溶液中でのその不適切な立体構造又はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８上のリガンド結合領域と比べたその小さいサイズのために、インビトロでリガンド結合を遮断するのにそれほど有効ではない［６９］。最後に、多くのアンタゴニスト性抗体（例えば、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８、抗ＣＤ１８ ＬｅｕｋＡｒｒｅｓｔ（Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ）、及び抗ＩＣＡＭ１ ｍＡｂ Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ（Ｒ６．５））は、いくつかの臨床試験で炎症性疾患／自己免疫疾患を治療するのに失敗し［２８，２９］、また、β２インテグリン遮断薬は予期しない副作用も示し、市場から回収されなければならなかった［３３］。
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストの同定のためのアッセイ：現在、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の小分子アゴニストは利用可能ではなく、その理由は、主に：ａ）必要量のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を哺乳動物細胞から得ることが難しいため、及び吸着したタンパク質の大部分がプラスチック表面への吸着によってその天然の立体構造を保持しないために、マイクロタイタープレートに吸着した精製ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に依存する現在のスクリーニングアッセイがハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）キャンペーンに耐えられないこと、並びにｂ）そのようなアッセイが、細胞表面に発現したＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のその生理的リガンドに対する低い結合親和性のせいで自動化するのが難しいために、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８についての最適化された細胞ベースのアッセイは、現在、文献が不足していることである。出願人は最近、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する小分子のライブラリーをスクリーニングするための新規の細胞接着ベースのＨＴＳアッセイを記載した［４２］。このアッセイは、固相化フィブリノーゲン（Ｆｇ）を、哺乳動物Ｋ５６２細胞上に安定に発現されるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のリガンドとして用いる。この考えをＨＴＳでの使用に適合させる際に直面する主な問題は、接着していない細胞を除去するためにどれだけ穏やかにプレートのウェルを洗浄しても、自動洗浄工程では、接着細胞のウェルからの大幅かつ不均一な剥離が生じるという事実であった。これにより、アッセイの大きなばらつきが生じた。驚くことに、自動プレート洗浄機を用いるよりもむしろ、アッセイプレートを単にひっくり返して、接着していない細胞を重力で穏やかに除去することによって、ばらつきがなくなり、頑健でかつ再現性のあるスクリーニングアッセイになることが分かった。その後、ＤＡＰＩ染色した細胞核の自動イメージングを用いて、接着細胞を定量した。新たに開発された３８４ウェルプレートベースのアッセイは、迅速で、費用がかからず、ＨＴＳの許容されるＺ’値（＞０．５）を一貫して生じ、かつＨＴＳ環境で実行しやすい。
新規のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニスト−ロイカドヘリンの発見。自家開発した細胞ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを用いて［４２］、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞に対するアゴニストについて、１００，０００を超える分子の化学的ライブラリーをスクリーニングした。独特な戦略として、細胞接着を阻害するアゴニストではなく、細胞接着を増加させる（アゴニスト）アゴニストに的を絞った。Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のその生理的リガンドのフィブリノーゲン（Ｆｇ）への接着を増加させる（アゴニスト）コアフラニルチアゾリジノンモチーフを含有する一連のアゴニストが同定された［４２，４５］。Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞は、アッセイバッファー（各１ｍＭの生理的イオンＣａ２＋及びＭｇ２＋を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ＋＋））だけの中でインキュベートしたとき、固相化フィブリノーゲン（Ｆｇ）への結合をほとんど示さなかった。驚くことに、ヒットの大きなサブセットは、中心の５員２，４−ジ−オキソ−チアゾリジン［４２］及び２，４−ジ−オキソ−チアゾリジンモチーフ含有アゴニスト［４５］をヒットとして含むことが分かった。２，４−ジ−オキソ−チアゾリジンモチーフ含有アゴニストによるαＡ−ドメインのターゲッティングは、精製組換えαＡ−ドメインを用いる結合アッセイを用いて確認され、その場合、これらのアゴニストは、αＡ−ドメインの固相化Ｆｇへの結合を増加させた［７０］。さらに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現していない細胞は、感知できるほどの結合を示さず、また、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現細胞の結合は、既知の遮断モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４４ａ［３７］（抗ＣＤ１１ｂ）及びＩＢ４［３８，３９］（抗ＣＤ１８）で遮断することができたので、結合は選択的であった。
中心コアに対する様々な置換の構造−活性関係（ＳＡＲ）を調べ［３６］、ロイカドヘリンと命名されているいくつかのアゴニストを同定した。これには、ロイカドヘリン−１（ＬＡ１）、ロイカドヘリン−２（ＬＡ２）、及びロイカドヘリン−３（ＬＡ３）が含まれ、これらは、それぞれ、４μＭ、１２μＭ、及び１４μＭのＥＣ５０（接着の５０％増加を表す有効濃度）値で、Ｆｇに対するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８依存的細胞接着を増加させた（図１Ａ〜１Ｄ）。いくつかの他のアゴニストは、同様のレベルの活性を提供した。構造的に関連する化合物のロイカドヘリン−対照（ＬＡ−Ｃ）も同定され、これは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８依存的細胞接着に対していかなる影響も及ぼさなかった（図１Ａ及び１Ｅ）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現していない細胞は、有意な結合を示さなかった（図１Ｂ〜１Ｅ）。基底状態ではＬＦＡ−１媒介性接着を増加させるが、活性化状態ではそれを阻害する、最近記載されたＬＦＡ−１のインバースアゴニストとは異なり（Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｃ．Ｖ．Ｃａｒｍａｎ，Ｍ．Ｋｉｍ，Ａ．Ｓａｌａｓ，Ｍ．Ｓｈｉｍａｏｋａ，ａｎｄ Ｔ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．２００６．Ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｇｌｉｎ，ａｌｐｈａ Ｌ ｂｅｔａ ２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）、ＬＡ１〜３は、アゴニストＭｎ２＋の存在下で細胞接着を阻害せず（図７Ａ〜７Ｃ）、それらが真のアゴニストであることを示した。既知のアゴニストＭｎ２＋及びＬＡ１〜３によって誘導されるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８発現細胞の接着の増加は、抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＩＢ４及び４４ａによって阻止され（図１Ｆ）、これらの化合物が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８依存的細胞接着を媒介することがさらに確認された。好中球は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の大量の移動可能な細胞内プールを含み、これは、不活性型形態から活性型形態へのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の立体構造スイッチに加えて、好中球が細胞外マトリックスに接着するのを助ける。ＬＡ１〜３による細胞接着の増加の理由としてＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８表面発現の上方調節を除外するために、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞（図５）及び好中球（図６）でのその表面発現を測定し、ＬＡ１〜３による増加は見られなかった。ＬＡ１〜３は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８リガンドｉＣ３ｂ（図８Ａ〜Ｃ）及びＩＣＡＭ−１（図９）に対する細胞接着も増加させたので、ＬＡ１〜３によるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８依存的細胞接着の増加は、リガンドの種類に非依存的であった。ヒト単球ＴＨＰ−１細胞もロイカドヘリンによって誘導される同様の細胞接着の増加を示し、ロイカドヘリンの効果が細胞型に非依存的であることが示された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＬＡ１〜３は野生型（ＷＴ）好中球の固相化Ｆｇへの結合も増加させたが、ＣＤ１１ｂ−／−好中球の固相化Ｆｇへの結合を増加させず（３）（図１Ｇ）、これらの化合物が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を標的とすることがさらに示された。ロイカドヘリンがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８媒介性貪食にも影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞を、ｉＣ３ｂオプソニン化ＲＢＣ（ＥｉＣ３ｂ）とともにインキュベートした。ＬＡ１〜３は、ＥｉＣ３ｂの捕捉及びロゼッティングを有意に増加させることが分かり、これらのアゴニストは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８媒介性貪食機能を上方調節することもできることが示された（図１１）。これにより、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が抗炎症性であるかどうか、及びインテグリンの小分子アゴニストが、インビボでインテグリンを活性化し、他のインテグリンの活性化突然変異体がノックインされた動物によって予測されるような結果をもたらすことができるかどうかについての試験が初めて可能になる。
また、いくつかの類似体のコンピュータによる検討を行なった。その低親和性及びその高親和性の立体構造のαＡ−ドメインの高分解能三次元構造を用いたコンピュータによるドッキング研究［５９，６０，６２］は、ＬＡ１〜３が、活性化感受性α７−ヘリックス領域付近で、αＡ−ドメインの開いた、高親和性立体構造に優先的に結合し、その高親和性立体構造のαＡ−ドメインをアロステリックに安定化することを示した［３６］（図１２Ａ〜１２Ｅ）。
式（ＩＩ）の特定のアゴニストについて、フラン環（Ｒ３置換基）のＣ−５位での置換が、アゴニスト効力に対して最も大きい効果を有することが分かった（例えば、化合物１〜３０）［３６］。平面フラニル環とのパイ共役を破壊する非芳香族又は非共役置換基は、非常に不利であった。特定の配向では、平面芳香環が好ましく、非置換フェニル環も、フェニル環のオルト位又はパラ位の脂肪族基と比べて好ましかった。チアゾリジン環のＮ−３位の置換基については、（エチルからメチルへの）置換エステルの長さの短縮、及び脂肪族鎖長の短縮が極めて不利であった。同様に、脂肪族鎖とフェニル環との置換は不利であった。長鎖の嵩高い残基もＮ−３位では不利であった。しかし、メチレン置換された小さい芳香族環を含有する化合物は、ＬＡ３と同様のレベルまで結合した。逆に、Ｒ３におけるＮ−３位のベンジルと、電子求引性が高くかつ嵩高いパラ−置換芳香族化合物との共置換は、極めて不利であった。特定の化合物は、固相化Ｆｇへの結合［７０］及びＣＤ１１ａ／ＣＤ１８と比べたインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する高い選択性を増加させることによって、精製組換えαＡ−ドメインに対する選択的結合も示した。
さらにこれらの化合物を評価するために、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＱｉｋＰｒｏｐプログラムを用いて、様々な物理化学的記述子を計算した。そのシリーズ（化合物１〜１４）中で最も望ましい化合物は、予測された良好なＣａｃｏ−２細胞透過性及びヒト経口吸収を有する。それらの中で、ＬＡ１〜３は、わずかにより良好なｃｌｏｇＰ及び予測されたより良好な溶解性を有し、かつそれらの中で最も高いリガンド効率（ＢＥＩ＝１４）を有する［７１］。
次に、αＡ−ドメイン中のこの小分子サブセットの潜在的結合ポケットについての洞察を得るために、コンピュータによるドッキング実験を行なった。その閉じた（不活性型の）立体構造と開いた（活性型の、リガンド結合可能な）立体構造の両方のＣＤ１１ｂ Ａ−ドメインの高分解能三次元構造がＰＤＢから入手可能である［５９，６０，６２］。しかし、αＡ中のα７ヘリックス（これは、ＣＤ１１ｂ中のイソロイシンの受入口として知られる疎水性ポケット（ＳＩＬＥＮ）［６０］又はＣＤ１１ａ中のＩＤＡＳ［６１］の一部を生成させ、かつαＡ活性化によって最も大きい立体構造変化を示す［６２〜６４］）は、閉じた形態のαＡの三次元構造［５９，６２］と比較して、開いた形態の三次元構造［５９，６０］において３残基短い。新たに発見されたアゴニストは、この領域中で結合し、αＡのこの立体構造を安定化すると予測されているので、α７ヘリックスを、ＣＤ１１ｂ Ａ−ドメインの高分解能構造［５９，６０］において、閉じた形態の構造由来の３つの追加の残基だけ手作業で延長させ、次いで、Ｍａｅｓｔｒｏタンパク質調製設備（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｉｎｃ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ）に実装されているような水素結合最適化及び制約付き（Ｉｍｐｒｅｆ）最小化を行なうことによって、ＣＤ１１ｂ Ａ−ドメインの開いた（活性型の、リガンド結合可能な）立体構造のモデルを構築した。
アゴニスト結合によって安定化されるように見える、活性化によるα７ヘリックスの立体構造の再ポジショニングは、アゴニストが、ヘリックスα７とヘリックスα１と中心βシートの間の領域中で結合することを示している［１１，６２］。これは、以前の報告によっても示されている［１１］。それゆえ、αＡ−ドメインの上記の最適化された構造を、開いた立体構造において利用し、化合物ドッキングを引き起こした。アポ構造では、この活性化感受性α７ヘリックス領域には、ポケットを裏打ちする多くの疎水性残基が空間的に密集していた。Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェア一式に実装されている誘導適合ドッキング手順を適用した。この手順では、あり得る孔の組合せを生成させる軟化ポテンシャルによる初期ドッキングに続いて、受容体最適化及びリガンド再ドッキングが行なわれる［６５］。このプロトコルによって、２，４−ジ−オキソ−チアゾリジンコア及びその類似体のカルボニル酸素がＳｅｒ１３３及びＴｈｒ１６９によって固定されている、例えば、ＬＡ３の疎水性２，４−ジクロロフェニル部分が疎水性ポケット中で相互作用している、ＬＡ１〜３の高得点の形状（Ｚ配置）が得られた。高温での安定な６ｎｓ全原子の明示的溶媒分子動態シミュレーション（ＤＥＳｈａｗ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＤｅｓｍｏｎｄを用いる）［６６］では、α７ヘリックスは、ごくわずかにしか適応しない。誘導適合ドッキング受容体を用いて、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｇｌｉｄｅ Ｐｒｏｇｒａｍ［７２］を用いて、さらなる構造をドッキングさせた。その後、受容体の柔軟性によって相対的な結合自由エネルギーのより正確な推定が得られるのを可能にするＭＭ−ＧＢ／ＳＡ法［７３］を用いて、得られた孔を再得点化した。最良の化合物に関する結果として得られた結合仮説を図１２Ａ〜１２Ｅ及び図２４に示す。予想されたように、疎水性フェニルフラニル部分（チアゾリジン環上のＣ５−置換基）は、残基Ｌ３１２、Ｉ３０８、Ｌ３０５（α７ヘリックス）、Ｌ１６４、Ｖ１６０、Ｆ１５６（α１ヘリックス）、及びＹ２６７、Ｉ２６９、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｉ２３６、Ｉ１３５（中心βシート）によって裏打ちされた疎水性ポケットに埋没している。この構造モデルによって、（ＬＡ１〜３と構造的に関連する）化合物ＬＡ−Ｃが不活性である理由も説明される。というのは、この結合様式では、ＬＡ−Ｃの中心チアゾリジン環のＮ−３位にあるエチルカルボキシレート部分のαＣ炭素が、Ｓｅｒ１３３、Ｔｈｒ１６９、及びＡｓｐ１３２と近接し（２．５Å未満）、これにより、密接な嵌合が生じ、いくつかの化合物中に存在するが、ＬＡ１〜３には存在しない、αＣのより大きなメチル基が許容されないからである。一般に、最も類似した化合物について、立体的により要求の多い化合物のより低い活性は、（少なくとも部分的には）受容体及び／又はリガンドの歪みの増加に起因し得ることが分かった。
ＳＡＲ及び結合仮説は、１つの疎水性相互作用が重要であることを示している。２つの極性末端を有する化合物は一般に、不活性であることが分かっている。疎水性ポケットにおける相互作用は、立体的要求及び全体的な分子サイズに対して極めて感受性が高いように思われる。例えば、より小さい酢酸エチルＮ−３置換基の場合、より大きいフェニルフラニル置換基及びより小さいフェニルフラニル置換基が許容されるが（とはいえ、最も小さいものが最も活性がある）、より大きいＮ−３置換基を有する構造の場合、非置換フェニルフラニルにしか活性がない。したがって、コンピュータによるドッキング研究は、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のこれらの新規のアロステリックアゴニストの結合についての妥当な仮説を示している。さらに、様々な誘導適合ドッキング研究において、他の形状が得られた。例えば、１つのモデルは、化合物が、その長い、縦軸に沿って「素速く動く」ことを示した。しかし、全ての場合において、疎水性部分は、図１２Ａ〜１２Ｅに記載及び図示されている同じ領域中で相互作用する。
次に、極めて相同なインテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１としても知られる）と比べた、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する化合物の選択性を明らかにした。野生型インテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞（Ｋ５６２ ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）を作製した。次に、固相化された、インテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８の生理的リガンドのＩＣＡＭ−１に対する細胞接着を増加させるＬＡ３の能力を測定した。それは、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８と比べて、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する２倍高い選択性を示し、Ｋ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞について１３．６±５μＭのＥＣ５０値であった。これは、これらのアッセイにおいて両方のインテグリンに対する等しい結合を示した、以前に記載された化合物と対照的である［３５］。
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８中のリガンド結合αＡ（又はαＩ）ドメイン［３５，３６，４２］に結合すると予測されるＬＡ１〜３の結合部位を同定するために、突然変異体インテグリンＣＤ１１ｂＥ３２０Ａ／ＣＤ１８を安定に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２ Ｅ３２０Ａ）を作製した。ＣＤ１１ｂ Ａ−ドメイン（αＡ−ドメイン）中の活性化感受性α７−ヘリックスの後ろのリンカー中の高度に保存された残基Ｅ３２０は、ＣＤ１８ ｖＷＦＡ−ドメイン（βＡ−又はＩ−ドメイン）の内在性リガンドとして働く［４４］。Ｅ３２０Ａ突然変異は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８によるアゴニストＭｎ２＋−イオン媒介性リガンド結合の増加を消失させる。しかし、さらなる活性化突然変異による高親和性立体構造のαＡの安定化は、この欠点を克服し、Ｅ３２０Ａ突然変異体でのリガンド結合を誘導する［６３］。（Ｍｎ２＋ではなく）ＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３は、Ｋ５６２ Ｅ３２０ＡのＦｇへの結合を選択的に増加させ（図１Ｈ）、これらの化合物も高親和性立体構造のαＡ−ドメインに結合し、それを安定化することを示している。確認するために、精製組換えαＡ［７０］を用い、予想されたように［３５，４２］、ＬＡ１及びＬＡ２が、構成的活性化突然変異（Ｉ３１６Ｇ）を含む突然変異体αＡ−ドメインの場合に認められる結合レベル［５２］まで、ＷＴ αＡの固相化リガンドへの結合を増加させることが分かった（図１Ｉ）。これは、ロイカドヘリン結合が、その開いた、高親和性立体構造のαＡを安定化することを示している。
フローサイトメトリー解析は、ＬＡ１の存在下での、活性化感受性ｍＡｂ２４のＫ５６２ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞への結合の増加を示し、ＬＡ１が生細胞で発現された全長インテグリンを活性化することを裏付けた（図１３）。Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄらは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ ａＡも標的とするＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニスト（ＩＭＢ−１０）を記載した。本発明者らは、本発明者らの細胞ベースの接着アッセイを用いて、ＬＡ１及びＩＭＢ−１０のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する相対的親和性を比較し、ＬＡ１が、おそらくは、そのより回転が制約されたフラニル−チアゾリジノン中心スキャフォールドのために、より高い親和性を示すことを見出した（図１４）。
２Ｄ表面での白血球走化性は、インテグリン媒介性の連続的な接着及び脱接着工程を伴う［７４］。構成的活性型インテグリン突然変異体を発現する細胞は、インテグリンをリガンド結合状態に留めることによって、接着の増加及び走化性勾配における細胞遊走の劇的な低下を示した［７５，７６］。ロイカドヘリンによる細胞接着の増加が細胞遊走に影響を及ぼすかどうかを検討するために、ケモカインペプチドホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）［４９］の勾配に応答して化学遊走するマウス好中球を用いた。生細胞イメージングは、生理的バッファー中での好中球の円滑な遊走を示した（図２Ａ）。しかし、ＬＡ１、ＬＡ２、又はＬＡ３による処理は、これらの細胞の側方遊走及び遊走速度の有意な減少をもたらす（図２Ａ〜２Ｃ）。ＬＡ１〜３で処理した細胞は、ケモカイン方向への若干の移動を示したが、それらは、方向持続の低下（図２Ｄ）及び平均二乗変位の低下（ＭＳＤ、図２Ｅ）を示し、対照（ＤＭＳＯ）細胞のより方向性のある運動性と比較して、制約された運動性を示した。ロイカドヘリンの非存在下で化学遊走する好中球とは異なり（この場合、好中球は、典型的な扁平な先端及び短くて細い尾を示す）、ＬＡ１〜３の存在下で遊走する細胞は、伸張した尾肢を示し、活性化インテグリン突然変異で見られるような、細胞遊走の減少の背後にある重要なメカニズムとしての、細胞脱接着の欠損を示した［５５，７７］。検討するために、共焦点顕微鏡法を用い、それにより、ＬＡ１〜３で処理した細胞の伸張した尾肢におけるクラスター化したＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８が示され（図２Ｆ）、尾肢におけるインテグリン−基質相互作用の解除の失敗が、欠陥のある遊走の一因であることが示された。ロイカドヘリン処理は、３Ｄコラーゲンゲル中での好中球遊走の変化を示さず（図１５Ａ〜１５Ｅ）、３Ｄでの白血球遊走がインテグリン非依存的であるという最近の知見を裏付けた。しかし、ロイカドヘリンは、ＨＵＶＥＣ層への細胞接着を増加させることによって、インビトロでのＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦａ活性化ＨＵＶＥＣ層を介した経内皮遊走（ＴＥＭ）の効率を低下させた（図２Ｇ〜Ｉ）。まとめると、これらのデータは、ロイカドヘリンが細胞接着力を増加させ、その側方運動性を低下させ、それによりＴＥＭに影響を及ぼすことを示している。
インテグリン活性化及びリガンド結合は、細胞表面でのインテグリンのクラスタリングを生じさせ、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２）経路の活性化を含む、外側から内側へのシグナル伝達を引き起こし［１７，２２］、それにより、大部分の細胞でのアンカレッジ依存的な生存促進性シグナルを模倣する［５０］。ＬＡ１〜３は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に結合し、それを活性化するので、そのような結合だけで、インテグリン媒介性の外側から内側へのシグナル伝達が誘発され、それにより、細胞にとってリガンドがインテグリンに結合した状態とよく似た状況が生じ、これが、白血球の寿命及び機能に対して深刻な結果をもたらし得ると考えられる。検討するために、共焦点顕微鏡法を用いて、細胞表面でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８クラスタリングをイメージングした［１７］。細胞は、リガンドの非存在下で、検出可能なＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８マクロクラスタリングを示さなかったが（図１８Ａ、ＤＭＳＯ）、外部からＦｇを添加したときに、高度のクラスタリングを示した（図１８Ｂ、ＤＭＳＯ）。同様に、ＬＡ１〜３による処理は、外部からＦｇを添加したときにのみインテグリンマクロクラスタリングを示し（図１８Ａ〜１８Ｂ）、これは、ＬＡ１〜３がインテグリンリガンド模倣体でないことを示唆している。さらに、既知のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストＭｎ２＋［７８］並びに活性化ｍＡｂ［７９］及びそのリガンド［１７］は、ＥＲＫ１／２リン酸化を誘導するので、ＥＲＫ１／２リン酸化を細胞で検討し、ＬＡ１〜３処理が、リガンドＦｇ（図１９）又はホルボールエステルＰＭＡ（図示せず）とのインキュベーションとは対照的に、ＥＲＫ１／２リン酸化（ｐＥＲＫ、図１９）を誘導しないことが分かった。したがって、ロイカドヘリンが、リガンドを模倣せず、また、細胞において外側から内側へのシグナル伝達を誘導しないという結論を下すことができる。
驚くことに、ＬＡ１〜３処理は、ＤＭＳＯのみによる処理と比較したとき、リガンドＦｇの場合と同様の、強力なＡｋｔリン酸化を引き起こした（図示せず）。ｐＡｋｔは、炎症促進性サイトカインの炎症シグナル（例えば、ＬＰＳ）依存的な発現を抑制することが知られているので、これは、ロイカドヘリンが白血球における炎症促進性サイトカイン発現を抑制することもできることを示している。
ロイカドヘリンは、好中球及びマクロファージによる可溶性因子の分泌を減少させる。白血球による炎症促進性サイトカインの分泌に対するロイカドヘリン処理の効果を検討するための実験において、ＷＴマウスのマクロファージ及び好中球を、２つの異なる濃度のアゴニストＬＡ１の非存在下又は存在下、ＬＰＳで刺激し、細胞上清中の炎症促進性サイトカインのレベルを測定した。ＬＰＳ処理は、刺激していない細胞と比較して、両方の細胞型でサイトカイン分泌を有意に増加させ（図示せず）、また、ＬＡ１の添加は、上清中のそれを有意に減少させ、これにより、ロイカドヘリンによるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が抗炎症効果を有し得ることが示された
インビボでの炎症応答に対するＬＡ１〜３の効果を明らかにするために、マウスでの急性チオグリコレート誘導性腹膜炎による好中球動員に対するその効果をモニタリングした［４１］。ＬＡ１〜３は、５０μＭもの濃度で、Ｋ５６２細胞（図１６Ａ〜１６Ｄ）に対しても、マウス好中球に対してもインビトロでの細胞傷害性を示さなかった（図１７Ａ〜１７Ｃ）。チオグリコレートの腹腔内注射は、生理食塩水のみと比較して、腹膜への好中球の有意な蓄積をもたらした（ｐ＜０．０１）（図３Ａ）。ビヒクルのみの投与と比較して、チオグリコレート注射３０分前のＬＡ１の投与は、好中球蓄積を有意に低下させ（４０％、ｐ＜０．０５）、ＬＡ２はそれを６５％低下させ（ｐ＜０．０００１）、ＬＡ３はそれを５５％低下させた（ｐ＜０．０５）。ロイカドヘリンで処置したマウスの循環中での白血球の測定は、ビヒクル処置動物と比較して、その細胞数の低下を示さなかった（表１）。
これは、ロイカドヘリンが、インビボで白血球細胞傷害性を引き起こさないことを示し、それゆえ、白血球細胞傷害性は、ロイカドヘリン処置動物で遊走好中球の低下が観察された理由から除外される。ＬＡ１〜３投与が、以前に公表されたように［４１］、ＷＴと比較して好中球蓄積の増加を示す、ＣＤ１１ｂ−／−マウスの腹膜内の動員された好中球の数を有意に低下させるものではないことも分かった（図３Ｂ）。これはさらに、ＬＡ１〜３が、インビボでインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を選択的に標的とすることを示している。
ＴＧＣ誘導性腹膜炎では、腹膜好中球の数が、ビヒクル処置動物で４時間後に増加し、１２時間後にピークに達し、その後、減少することが分かった（図３Ｃ）。ＬＡ１処置動物では、好中球蓄積は、４時間で有意に低下し、１２時間後に低下した状態のままであった。同程度の数の腹膜好中球が両方の動物群で２４時間後に観察され、ロイカドヘリンが好中球動員を有意に遅延させることが示された。
ロイカドヘリン処置が、任意の特定の器官における好中球の隔離を引き起こすかどうかを明らかにするために、ＴＧＣ誘導性腹膜炎動物由来の組織の組織学検査を用いた。好中球の隔離はロイカドヘリン処置動物で見出されず（図３Ｄ）、ロイカドヘリンが、マウスの任意の特定の器官における好中球の隔離を引き起こさないこと、並びにロイカドヘリンの効果が、実際、その炎症部位付近での好中球接着力の増加及び好中球運動性の減少によって部分的に媒介されることが確認された。
白血球動員は、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の新生内膜肥厚及び再狭窄よりも前に起こる［３］。機械的血管損傷部位での内皮細胞内層の露出は、フィブリン及び血小板の沈着を引き起こし、その場合、血小板細胞表面受容体ＧＰ Ｉｂαと白血球の表面に発現したインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の間の選択的結合によって、白血球の動員が媒介される［８０］。実際、機械的血管損傷の実験モデルでは、抗体によって媒介されるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８遮断又はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の不在（ＣＤ１１ｂ−／−）は、血管形成術又はステント移植後の内膜肥厚を減少させる［２５］。この損傷に対するインビボでの薬理学的活性化ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の効果を調べるために、アゴニストをラットの動脈バルーン障害モデルで試験した［５６］。ロイカドヘリンＬＡ１、ＬＡ３、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を損傷の３０分前にフィッシャー系の雄ラットに投与し、１日おきに３週間、注射し続けた。ＬＡ２は、おそらくは、ラットαＡとヒトαＡの結合ポケットの違い（わずか約７０％の相同性［６８］）のために、効果を示さなかった。ＬＡ１処置動物及びＬＡ３処置動物の損傷動脈は、ビヒクル処置動物（０．２３±０．０１の比）と比較して、有意に低下した新生内膜肥厚（それぞれ、０．１６±０．０２及び０．１４±０．０１の新生内膜対中膜比、ｐ＜０．０５）を生じさせた（図３Ｅ〜３Ｊ及び図２１Ａ〜２１Ｄ）。対照化合物ＬＡ−Ｃは、効果を示さなかった（図２０Ａ〜２０Ｂ）。ロイカドヘリン処置が、血管リモデリングよりも前に起こる白血球蓄積の低下をもたらすかどうかを明らかにするために、マクロファージ特異的抗ＣＤ６８抗体を用いて、損傷３日後の動脈の免疫組織化学的解析を行なった。ビヒクル対照（４２．２±６．７）と比べて、ＬＡ１処置動物及びＬＡ３処置動物の動脈の中膜マクロファージの数の有意な低下（それぞれ、１７．７±３．１及び６．９±１．３、ｐ＜０．０１）が観察された（図３Ｅ〜３Ｊ及び図２１Ａ〜２１Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ロイカドヘリン処置が、血管損傷部位での白血球の蓄積の低下、及びその後の新生内膜肥厚の減少をもたらすことを示している。
驚くことに、以下の実験を用いて、インテグリンアゴニスト（ロイカドヘリン）が、炎症性損傷の治療において、インテグリンアンタゴニストに優る治療的利益を有することが分かった。腎疾患の確立されたマウスモデルである、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）腎炎を用いて、十分に特徴付けられているＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アンタゴニスト（抗ＣＤ１１ｂ抗体Ｍ１／７０）とＬＡ１の直接の比較を行なった。このモデルは、アルブミンを含む、尿タンパク質の損失を媒介する好中球浸潤を特徴とする。この疾患におけるＣＤ１１ｂの重要な役割と一致して、ＣＤ１１ｂ−／−マウス及び抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂ処置ラットは、白血球浸潤の減少及びタンパク尿からの保護を示した。この場合、マウスにおける疾患の誘導は、３日目での好中球の最大流入及び最大タンパク尿をもたらした（図３Ｋ〜３Ｌ）。Ｍ１／７０は、好中球流入を有意に減少させ、かつタンパク尿を低下させた。しかし、ＬＡ１は、処置マウスにおける浸潤好中球の数とタンパク尿の両方の有意なかつ最大限の減少をもたらし、アンタゴニストに優るアゴニストの明白な治療的利益を示した。
生きた動物における白血球蓄積に対するロイカドヘリン処置の効果を可視化するために、骨髄特異的ペルオキシダーゼ遺伝子（ｍｐｘ）プロモーター下でＧＦＰを発現するトランスジェニックＴｇ（ｍｐｘ：：ｅＧＦＰ）ゼブラフィッシュを用いて、白血球動員のライブイメージング用に好中球を特異的に蛍光タグ化した［５７］。受精後（ｄｐｆ）３日のゼブラフィッシュ幼生の尾びれ切断は、組織損傷部位への迅速かつ強力な好中球動員（図４Ａ〜４Ｃ及び図２２Ａ〜２２Ｄ）を引き起こす［５７］。損傷を受けていない幼生へのＬＡ１及びＬＡ２の投与は、観察可能な効果を示さなかった（図４Ｂ及び２２Ｂ）。しかし、ＬＡ１とＬＡ２は両方とも、ビヒクルのみによる処理（３４．６±４．５）と比較して、損傷４時間後のゼブラフィッシュ尾びれでの好中球蓄積を有意に低下させた（それぞれ、１５．６±１．７及び１３．３±２．１、ｐ＜０．０００１）。損傷を受けた全ゼブラフィッシュ幼生の蛍光イメージングは、ロイカドヘリン処置動物及び未処置動物における好中球の総数に差がないことを示し（図２３）、これは、ロイカドヘリンによって媒介される損傷部位での好中球蓄積の低下が、好中球細胞数の全体的な減少によるものではないことを示し、ロイカドヘリンがインビボで細胞傷害性を引き起こさないことを示すマウスでの実験結果をさらに裏付けた（表１）。最後に、ロイカドヘリン処置のインビボ効果が可逆的であるかどうかを明らかにするために、ＬＡ１及びＬＡ２を、損傷を受けていないゼブラフィッシュに４〜８時間投与し、ゼブラフィッシュをすすぎ、尾びれ損傷を誘導し、洗浄４時間後に、好中球蓄積を定量した。化合物の除去は、処置を受けていないゼブラフィッシュ幼生で見られるのと同様のレベルの、損傷を受けた尾びれでの好中球蓄積を引き起こすことが分かった。まとめると、これらのデータは、ロイカドヘリンが組織損傷部位での好中球蓄積を下方調節すること、及びそのインビボ効果が、これらの化合物の除去によって覆され得ることを示している。
さらに、ロイカドヘリン処置は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖の低下をもたらし、様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療におけるさらなる用途を示した。
ロイカドヘリンは、インビトロで好中球接着を増加させ、２Ｄ走化性を減少させる。ロイカドヘリンが、インビボで好中球に対する同様の効果を有するかどうかを明らかにするために、マウス精巣挙筋に対して生体顕微鏡検査を用い、ロイカドヘリンが、後毛細血管細静脈における好中球接着を増加させ、そのローリング速度を低下させることが分かり（図示せず）、これらのアゴニストがインビボでも同様に作用することが示された。より重要なことに、遮断抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂ Ｍ１／７０が、ロイカドヘリンの効果を覆すことが分かり、ロイカドヘリンの効果が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のその受容体活性化作用（ａｇｏｎｉｓｍ）を介するものであることが裏付けられた。
インテグリン活性化は、１５年以上前に初めて、炎症白血球による組織浸潤を調節するための潜在的な治療戦略として提案された［８１］。ここでは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストが、白血球動員及び炎症性損傷を調節することができることが示されている。ロイカドヘリンによって活性化されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、白血球接着を増加させ、それにより、白血球のクローリング及び経内皮遊走が減少し、その結果、炎症／損傷を起こした組織への動員が低下する［８２］。ここに提示したデータは、インテグリン特異的小分子によって媒介される血管系での白血球接着の増加が、白血球浸潤及び炎症を低下させ、種々の炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療するための薬理学的にターゲッティング可能な有効な方法となり得ることを示している。
実施例２
第一に、腎損傷時の初期の非免疫性損傷は、炎症及び組織損傷を引き起こす自然免疫応答を引き起こす（４３）。損傷した組織から放出される内在性リガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を利用するため、腎臓細胞及び白血球に対するＴＬＲ４活性化によって、腎損傷がさらに悪化する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、細胞接着の増加及び遊走の調節に加えて、白血球におけるＴＬＲ４媒介性の炎症促進性シグナル伝達を調節し（４４〜４６）、これは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８が白血球活性化及び炎症の調節において多くの役割を有することを示している。第二に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化は、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を含む、いくつかの細胞内シグナル伝達事象、並びに骨髄細胞におけるいくつかの炎症促進性遺伝子及び抗炎症性遺伝子の調節も媒介する（４７〜５２）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化及びリガンド結合は、ＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化を含む、外側から内側へのシグナル伝達を引き起こし（４８，５３）、それにより、アンカレッジ依存的な生存促進性シグナルを模倣する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のライゲーション及びクラスタリングはまた、炎症促進性サイトカイン（例えば；ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＴＮＦ−α）及び他の因子（例えば；マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））のＮＦ−ｋＢ依存的発現を相乗的に促進する。しかし、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８欠損は、ＴＬＲ４によって誘発される炎症促進性サイトカインの産生を増強し、これは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が保護的であることができ、また、白血球の炎症促進性経路を負に調節することができることを示している（５４〜５６）。ロイカドヘリンは、インビボでＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を活性化し、白血球動員を低下させる新規の化合物である。ここでは、ロイカドヘリンによって媒介されるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化がＴＬＲ４及びＴＮＦＲによって媒介される白血球活性化及び炎症促進性分子の生成を低下させるという仮説が立てられ、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が白血球の炎症促進性経路を負に調節することができることが証明されている。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化が、細胞内アダプターＭｙＤ８８の分解を増加させ、ＮＦ−ｋＢ経路を抑制し、それにより、白血球によって生成される炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、ＲＯＳ、及びＭＭＰのレベルを低下させることによって、白血球の炎症促進性応答を制限するという仮説も立てられている。第三に、白血球は、ＦＳＧＳと関連する因子である循環ｓｕＰＡＲの供給源であるので、白血球が、非炎症性糸球体症において役割を果たしており、また、そのような白血球活性化は、ロイカドヘリンで低下させることもできるという仮説が立てられている。
データ
１．１ ロイカドヘリンは、ｐＡＫＴを増加させるが、インテグリンリガンドを模倣しない。インテグリン活性化が、インテグリンのライゲーション及びクラスタリングと比べて、ＴＬＲ及びサイトカイン受容体シグナル伝達と示差的に相乗作用するかどうかは明らかでない。活性化型（Ｍｎ２＋イオンによるかもしくは活性化ｍＡｂを用いて活性化されたもの）又はリガンド結合型（４８）のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、好中球表面にクラスターとして存在することが示されている（４８）。ロイカドヘリンによる活性化が結合力の増加をもたらすかどうかは依然として不明である。さらに、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストＭｎ２＋イオン及び活性化ｍＡｂは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８リガンドＦｇがそうであるように（４８）、ｐＥＲＫ１／２及びｐＡｋｔを誘導し（５７，５８）、それにより、生存促進性及び炎症促進性シグナル伝達を誘導することが知られている。同様に、活性化ｍＡｂのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８への結合は、外側から内側へのシグナル伝達を誘導し、リガンド結合状態を模倣するのに十分であり（５７，５８）、外因性薬剤による活性型インテグリン立体構造の安定化が、有害な免疫学的効果を有し得ることを示している（５８）。新たに発見されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストがどのようにして細胞内事象を調節するのかは不明であった。
したがって、そのような細胞内シグナル伝達事象に対するロイカドヘリンによるインテグリン活性化の効果を調べた。ＬＡ１〜３で処理したＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８＋細胞は、ＤＭＳＯで処理した細胞と同様に、ｐＥＲＫ１／２を示さないことが分かった（図２５Ａ）。しかし、リガンドＦｇとのインキュベーションは、ホルボールエステルＰＭＡによる処理で示されるような（図示せず）、これらの細胞内での予想された明確なｐＥＲＫの増加を示した。驚くことに、ＬＡ１〜３処理は、ＤＭＳＯのみによる処理と比較して、強力なＡｋｔリン酸化を生じさせた（図２５Ｂ）。ｐＡｋｔは、炎症促進性サイトカインの炎症シグナル（例えば、ＬＰＳ）依存的な発現を抑制することが知られているので、これは、ロイカドヘリンが白血球での炎症促進性サイトカイン発現も抑制し得ることを示している。アゴニスト媒介性のインテグリン活性化が結合力も変化させるかどうかを検討するために、免疫蛍光顕微鏡法をイメージングに用い、細胞表面でのインテグリンクラスタリングを解析した（４８）。リガンドの非存在下では、細胞は、ＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の非存在下（ＤＭＳＯ）又はＬＡ１、ＬＡ２、及びＬＡ３の存在下（３２）での、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の検出可能なマクロクラスタリングを示さず、これにより、アゴニスト結合だけでは、インテグリンクラスタリングが誘導されないことが示された。予想された通り、外部からのリガンドＦｇの添加は、両方の条件での顕著なクラスタリングを生じさせた。
１．２ ロイカドヘリンは炎症促進性因子の分泌を減少させる。白血球による炎症促進性因子の分泌に対するロイカドヘリン処置の効果を検討する概念実証実験において、ＷＴマウスの好中球又はマクロファージを、アゴニストＬＡ１の非存在下又は存在下、ＬＰＳで刺激し、様々な因子のレベルを細胞培養上清中で測定した。図２６Ａ〜２６Ｄは、ＬＰＳ処置が、刺激していない細胞と比較して、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１のレベルを有意に増加させたこと、並びにＬＡ１の添加が、上清中の３つ全ての因子のレベルを有意に減少させたことを示している。同様に、ＬＡ１は、ＴＮＦ−α活性化ヒト好中球における活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを減少させた（図２７）。これらのデータは、ロイカドヘリンによるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が、白血球における炎症促進性シグナル伝達を抑制し、抗炎症効果を有することができることを示している。
１．３ ロイカドヘリンはＭｙＤ８８分解を加速する。ＴＬＲ４媒介性シグナル伝達は、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８の関与を必要とし（４３）、ＭｙＤ８８−／−マウスは、ＩＲＩ後の腎損傷から保護される。ＴＬＲ４活性化は、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８の結合及び安定化をもたらし、これにより、下流のキナーゼが動員され、Ｎｆ−ｋＢ媒介性の炎症促進性シグナル伝達を引き起こす。その後、ＴＬＲ４シグナル伝達が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の内在性の活性化によるネガティブフィードバックループを誘導し、これにより、Ｓｙｋが活性化されて、ＭｙＤ８８をリン酸化し、それにユビキチン媒介性分解のためのタグを付ける。これは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストが、ＭｙＤ８８の分解の加速をもたらし、それにより、ＴＬＲ４媒介性の炎症促進性シグナル伝達経路のより速い鈍化を誘導することを示している。予備実験を行ない、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞におけるＭｙＤ８８のレベルを測定することによって、この仮説を検証した。ＴＬＲ４アゴニストのＬＰＳが、少なくとも４時間は安定である強力なＭｙＤ８８シグナルを産生することが分かった（図２８）。しかし、ＬＡ１による細胞の同時処理は、はるかにより早いＭｙＤ８８の分解を生じさせる。実際、（ＬＰＳの非存在下の）ＬＡ１のみとの細胞のインキュベーションは、２時間未満のうちにＭｙＤ８８の完全分解を生じさせ、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の活性化が、白血球におけるＭｙＤ８８依存的な細胞内シグナル伝達を下方調節することができることを示した。
１．４ ロイカドヘリンは、マウスを敗血症から保護する。敗血症は、感染に対する重度の炎症応答と特徴とし、その合併症は、急性腎損傷を含む多臓器不全を引き起こし、致死的であることもある（５９）。ロイカドヘリンを介するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８活性化が、ＴＬＲ４媒介性の細胞内シグナル伝達を劇的に低下させることを考慮して、これらの化合物が、ＭｙＤ８８−／−動物で観察されるように、ＷＴマウスでＴＬＲ４誘導性敗血症も低下させるのかどうかということが疑問に思われた。盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）による敗血症の誘導（５９）の後、未処置マウスの２０％は２４時間以内に死亡し（図２９）、また、それらの全てが、７２時間以内に死亡したのに対し、ＬＡ１処置マウスの８０％は３６時間生存し、また、それらの４０％が最終的に生き残り、これにより、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８アゴニストが、ＴＬＲ４媒介性炎症をインビボで低下させることができることが強く示された。これらの動物のより完全な解析は現在進行中である。
１．５ 白血球を標的とする新規の小分子による血清中の循環ｓｕＰＡＲレベルの減少。白血球は、細胞内プールに大量のｕＰＡＲを保持し、活性化によって、ｕＰＡＲの表面発現を増加させるだけでなく、ｓｕＰＡＲを循環中に放出する（２２）。ｓｕＰＡＲの産生におけるその中心的な役割を考慮すると、白血球は、血清中のｓｕＰＡＲレベルを低下させるための有望な標的細胞である。ロイカドヘリン処置は、抗ＧＢＭ腎炎のマウスモデルにおいて、循環ｓｕＰＡＲレベルを有意に低下させ、腎機能を保持することが分かり（図３０）、これらの化合物が、白血球依存的な循環疾患因子を緩和するための薬剤として治療的に意義があり得ることが示された。
１．６ ロイカドヘリンは、２４時間で腎臓ＩＲＩを低下させた。ＩＲＩによって誘導されるＷＴマウスの腎機能の変化におけるロイカドヘリンの使用を評価するために、概念実証実験を行なった。Ｂ６雄マウス（８〜１２週齢）に麻酔をかけ、加温パッドの上で保持し、それらを一定の３７℃の温度に保持した。次に、腹部を切開し、腎茎を、非外傷性血管クランプで３０分間、両側性に閉塞させ、その後、クランプを取り除き、外科的切開を閉じた。同一ではあるが、クランプを適用しない手順でシャム手術を行なった。血清クレアチニンレベルを測定することによって、腎臓ＩＲ損傷を虚血２４時間後に評価した（図３１）。尾切開からのマウス血清を、手製のキット（Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いるｓＣｒ（及びＢＵＮレベル（図示せず））の解析に用いた。ＩＲ損傷の３０分前のロイカドヘリンＬＡ１及びＬＡ２の投与は、ビヒクルＤＭＳＯで処置した動物と比較して、ｓＣｒレベルの有意な低下を示し、これらの化合物に腎臓保護効果があることを示した。
本明細書の全体を通じて、米国特許を含む、様々な刊行物が、著者及び年号及び特許番号によって参照されている。これらの刊行物の完全な引用が以下に列挙されている。これらの刊行物及び特許のその全体としての開示は、本発明が関連する技術の水準をより完全に記載するために、参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、例示的な形で記載されているが、使用されている術語は、限定ではなく説明の言葉の性質を帯びていることが意図されることが理解されるべきである。
上記の教示に照らして、本発明の多数の修正及び変形が可能であることが明白である。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲内で、具体的に記載されている以外のものを実施することができることが理解されるべきである。

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１３． Ｏｐｈａｓｃｈａｒｏｅｎｓｕｋ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， １ ９９８． ５４（２）： ｐ． ４１６−２５．

１４． Ｌｅ Ｈｉｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｄｏｃｙｔｅ ｂｒｉｄｇｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｕｆｔ ａｎｄ Ｂｏｗｍａｎ’ｓ ｃａｐｓｕｌｅ： ａｎ ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ， ２００１ ． １２（１０）： ｐ． ２０６０−７１．

１５． Ｔａｎｇ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｍａｃ− １ （ＣＤＩＩｂ／ＣＤ１８） ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ： Ｍａｃ− １ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｂｒｏｇａｔｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ− ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， １ ９９７． １８６（１ １ ）： ｐ． １８５３−６３．

１６． Ｆａｎ， ＳＴ． ａｎｄ Ｔ．Ｓ． Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ， Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １９９１ ． ８７（１ ）： ｐ． ５０−７．

１７． Ｗｈｉｔｌｏｃｋ， Ｂ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ａｌｐｈａ（Ｍ）ｂｅｔａ（２） ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｋｔ ａｎｄ ＥＲＫ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２０００． １５１ （６）： ｐ． １３０５−２０．

１８． Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ １ｂ ａｎｄ ＣＤ１ １ｃ ｂｅｔａ（２） ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ２３ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｌｐｈａ （Ｍｌ Ｐ− １ ａｌｐｈａ） ａｎｄ ＭＩＰ− １ｂｅｔａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐａｔｈｗａｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ． Ｂｌｏｏｄ， ２００１ ． ９７（１ ０）： ｐ． ２９３２−４０．

１９． Ｇｕｈａ， Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｍａｃｋｍａｎ， Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ ｐａｔｈｗａｙ ｌｉｍｉｔｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００２． ２７７（３５）： ｐ． ３２１ ２４−３２．

２０． Ｒｕｂｅｌ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｄｅｌａｙｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００３． ３３（５）： ｐ． １４２９−３８．

２１． Ｋｅｔｔｒｉｔｚ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００４． ２７９（４）： ｐ． ２６５７−６５．

２２． Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ， Ｆ．Ｇ． ａｎｄ Ｅ． Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９． ２８５（５４３０）： ｐ． １０２８−３２．

２３． Ｓｈｅｉｋｈ， Ｓ． ａｎｄ Ｇ．Ｂ． Ｎａｓｈ， Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅ ｎｏｖｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｒｏｌｌｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｔｏ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｏｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ． Ｂｌｏｏｄ， １９９６． ８７（１２）： ｐ． ５０４０−５０．

２４． Ｊａｅｓｃｈｋｅ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｃ− １ （ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８） ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １９９３． １７（５）： ｐ． ９１５−２３．

２５． Ｒｏｇｅｒｓ， Ｃ， Ｅ．Ｒ． Ｅｄｅｌｍａｎ， ａｎｄ Ｄ．Ｉ． Ｓｉｍｏｎ， Ａ ｍＡｂ ｔｏ ｔｈｅ ｂｅｔａ２−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍａｃ−１ （ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８） ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ ｏｒ ｓｔｅｎｔ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９８． ９５（１ ７）： ｐ． １０１３４−９．

２６． Ｗｉｌｓｏｎ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｅａｒｔ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １ ９９３． ８８（５ Ｐｔ ２）： ｐ． ＩＩ３７２−９．

２７． Ｐｌｏｗ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｌ． Ｚｈａｎｇ， Ａ ＭＡＣ− １ ａｔｔａｃｋ： ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｉｎ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １ ９９７． ９９（６）： ｐ． １１４５−６．

２８． Ｙｏｎｅｋａｗａ， Ｋ． ａｎｄ Ｊ．Ｍ． Ｈａｒｌａｎ， Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ， ２００５． ７７（２）： ｐ． １２９−４０．

２９． Ｄｏｖｅ， Ａ．， ＣＤ１８ ｔｒｉａｌｓ ｄｉｓａｐｐｏｉｎｔ ａｇａｉｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０００． １８（８）： ｐ． ８１７−８．

３０． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍａｃ−１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｕｔｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００８． １１７（１５）： ｐ． １９９７−２００８．

３１． Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， ＣＤ１８ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｅ． ｃｏｌｉ， ｂｕｔ ｎｏｔ ａｆｔｅｒ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ， １９９７． ６１ （２）： ｐ． １６７−７２．

３２． Ｌｕｍ， Ａ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＦＡ− １ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｒｒｅｓｔ ｏｎ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ （ＩＣＡＭ− １） ｉｎ ｓｈｅａｒ ｆｌｏｗ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００２． ２７７（２３）： ｐ． ２０６６０−７０．

３３． Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｍ．， ＰＭＬ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｌｏｏｍ ｆｏｒ Ｒｉｔｕｘａｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１０． ２８（２）： ｐ． １０５−６．

３４． Ｂａｎｓａｌ， Ｖ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ３ ｂｌｏｃｋ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ， ２００３． ３０４（３）： ｐ． １０１６−２４．

３５． Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｌｐｈａＭｂｅｔａ２ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｙ ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００６． ４５（９）： ｐ． ２８６２−７１ ．

３６． Ｆａｒｉｄｉ， Ｍ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８． Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ， ２００９．

３７． Ａｒｎａｏｕｔ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３− ｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ−ｃｏａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｏｆ Ｃ３ｂｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ （Ｍｏｌ）． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １９８３． ７２（１ ）： ｐ． １７１−９．

３８． Ｗｒｉｇｈｔ， Ｓ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ３ｂｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９８３． ８０（１８）： ｐ． ５６９９−７０３．

３９． Ｈｏｇｇ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｕｔ ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅｔａ２ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ Ｍａｃ− １ ａｎｄ ＬＦＡ−１． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １９９９． １０３（１ ）： ｐ． ９７−１０６．

４０． Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ， Ｉ． ａｎｄ Ｎ． Ｈｏｇｇ， Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｇ２＋ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔｓ． ＥＭＢＯ Ｊ， １ ９８９． ８（１２）： ｐ． ３７５９−６５．

４１． Ｃｏｘｏｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｅｔａ ２ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８ ｉｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ａ ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９６． ５（６）： ｐ． ６５３−６６．

４２． Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｙ．， Ｍ．Ａ． Ａｒｎａｏｕｔ， ａｎｄ Ｖ． Ｇｕｐｔａ， Ａ ｓｉｍｐｌｅ， ｎｏ−ｗａｓｈ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８． Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ， ２００７． １２（３）： ｐ． ４０６−１７．

４３． Ｇｕｐｔａ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｂｅｔａ−ｔａｉｌ ｄｏｍａｉｎ （ｂｅｔａＴＤ） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８． Ｂｌｏｏｄ， ２００７． １０９（８）： ｐ． ３５１３−２０．

４４． Ａｌｏｎｓｏ， Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａＡ ｄｏｍａｉｎ ａｃｔ ａｓ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｅｔａＡ ｄｏｍａｉｎ？ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ， ２００２． １２（１０）： ｐ． Ｒ３４０−２．

４５． Ｇｕｐｔａ， Ｖ．， ＨＴＳ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８ ｔｏ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｖｉａ ａ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ． Ｐｕｂｃｈｅｍ Ａｓｓａｙ ＩＤ １４９９， ２００９．

４６． Ｃｈｅｎ， Ｌ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ， ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ， ２００３． １２（１９）： ｐ． ２５４７−５８．

４７． Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｙｐｅ ＩＩＩ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２００７． １１７（６）： ｐ． １ ６９９−７０７．

４８． Ｓｚｃｚｕｒ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ ＣＤＣ４２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｖｉａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ． Ｂｌｏｏｄ， ２００６． １０８（１ ３）： ｐ． ４２０５−１３．

４９． Ｚｉｇｍｏｎｄ， Ｓ．Ｈ．， Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９８８． １６２： ｐ． ６５−７２．

５０． Ｐｌｕｓｋｏｔａ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａＭｂｅｔａ２． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００８． １８１ （５）： ｐ． ３６０９−１９．

５１． Ｌｉ， Ｒ． ａｎｄ Ｍ．Ａ． Ａｒｎａｏｕｔ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ ２ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９９． １２９： ｐ． １０５−２４．

５２．Ｘｉｏｎｇ， Ｊ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｓｗｉｔｃｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ １ １ｂ Ａ−ｄｏｍａｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２０００． ２７５（４９）： ｐ． ３８７６２−７．

５３． Ｌｕ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｇｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｂｅｃｏｍｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｕｐｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００１ ． １６６（９）： ｐ． ５６２９−３７．

５４． Ｘｉｏｎｇ， Ｊ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ， ２００３． １０２（４）： ｐ． １１５５−９．

５５． Ｓｅｍｍｒｉｃｈ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＬＦＡ−１ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２００５． ２０１ （１２）： ｐ． １９８７−９８．

５６． Ｇａｂｅｌｅｒ， Ｅ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂａｌｌｏｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔ ａｒｔｅｒｉｅｓ． ＢＭＣ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓｏｒｄ， ２００２． ２： ｐ． １６．

５７． Ｒｅｎｓｈａｗ， Ｓ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ， ２００６． １０８（１３）： ｐ． ３９７６−８．

５８． Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ， Ｃ， Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ． ２００２： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．

５９． Ｌｅｅ， Ｊ．Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＲ３ （ＣＤ１ １ｂ／ＣＤ１８）． Ｃｅｌｌ， １ ９９５． ８０（４）： ｐ． ６３１−８．

６０． Ｘｉｏｎｇ， Ｊ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｓｗｉｔｃｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ １ １ｂ Ａ−ｄｏｍａｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２０００． ２７５（４９）： ｐ． ３８７６２−７．

６１． Ｗｅｉｔｚ−Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｔｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ− １ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｔｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２００１ ． ７（６）： ｐ． ６８７−９２．

６２． Ｌｅｅ， Ｊ．Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｗｏ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａ−ｄｏｍａｉｎ （ｌ−ｄｏｍａｉｎ）： ａ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ？ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １９９５． ３（１２）： ｐ． １３３３−４０．

６３． Ｓｈｉｍａｏｋａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｍ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ２００２． ９９（２６）： ｐ． １６７３７−４１ ．

６４． ＭｃＣｌｅｖｅｒｔｙ， Ｃ．Ｊ． ａｎｄ Ｒ．Ｃ． Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａＭｂｅｔａ２ Ｉ ｄｏｍａｉｎ： ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ， ２００３． ３７２（Ｐｔ １ ）： ｐ． １２１−７．

６５． Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｔ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ２００６． ４９（２）： ｐ． ５３４−５３．

６６． Ｋｅｖｉｎ， Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｌａｂｌｅ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＭ／ＩＥＥＥ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ （ＳＣ０６）， Ｔａｍｐａ， Ｆｌｏｒｉｄａ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １ １ −１ ７， ２００６．

６７． Ｂａｒｎａｒｄ， Ｊ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９５． １５５（１０）： ｐ． ４８７６−８１ ．

６８． Ｚｅｒｒｉａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ｂ Ａ−ｄｏｍａｉｎ ｂｌｏｃｋｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００６． １１９（４）： ｐ． ４３１−４０．

６９． Ｆｅｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉ−Ｍａｃ− １ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｌｏｃｋ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ− １ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｍａｃ−１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９８． ２７３（１０）： ｐ． ５６２５−３０．

７０． Ｌｉ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｗｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ１ １ｂ Ａ−ｄｏｍａｉｎ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｋｅｙ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｗｏ Ｍｎ２＋−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １ ９９８． １４３（６）： ｐ． １ ５２３−３４．

７１． Ａｂａｄ−Ｚａｐａｔｅｒｏ， Ｃ． ａｎｄ Ｊ．Ｔ． Ｍｅｔｚ， Ｌｉｇａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎｄｉｃｅｓ ａｓ ｇｕｉｄｅｐｏｓｔｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ， ２００５． １０（７）： ｐ． ４６４−９．

７２． Ｆｒｉｅｓｎｅｒ， Ｒ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉｄｅ： ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ， ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ． １． Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｃｃｕｒａｃｙ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ２００４． ４７（７）： ｐ． １ ７３９−４９．

７３． Ｇｕｉｍａｒａｅｓ， Ｃ．Ｒ． ａｎｄ Ｍ． Ｃａｒｄｏｚｏ， ＭＭ−ＧＢ／ＳＡ ｒｅｓｃｏｒｉｎｇ ｏｆ ｄｏｃｋｉｎｇ ｐｏｓｅｓ ｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｌｅａｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｍｏｄｅｌ， ２００８． ４８（５）： ｐ． ９５８−７０．

７４． Ｌｉｕ， Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ＲｈｏＡ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｄｅ− ａｄｈｅｓｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００２． １６９（５）： ｐ． ２３３０−６．

７５． Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ， Ａ．， Ｍ．Ｈ． Ｇｉｎｓｂｅｒｇ， ａｎｄ Ａ．Ｆ． Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｌｉｎｋａｇｅｓ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １９９６． １３４（６）： ｐ． １５５１−６２．

７６． Ｐａｌｅｃｅｋ， Ｓ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｇｏｖｅｒｎ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ ａｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９７． ３８５（６６１ ６）： ｐ． ５３７−４０．

７７． Ｐａｒｋ， Ｅ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｂｅｒｒａｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｇｕｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２００７． １１７（９）： ｐ． ２５２６−３８．

７８． ｄｅ Ｂｒｕｙｎ， Ｋ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅ Ｒａｐ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｍｎ（２＋）− ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＬＦＡ−１− ａｎｄ ＶＬＡ−４− ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００２． ２７７（３３）： ｐ． ２９４６８−７６．

７９． Ｌｅｆｏｒｔ， Ｃ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍａｃ−１． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００９． １８３（１０）： ｐ． ６４６０−８．

８０． Ｗａｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｂａｌｐｈａ ｖｉａ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍａｃ−１ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００５． １１２（１９）： ｐ． ２９９３−３０００．

８１． Ｋｕｉｊｐｅｒｓ， Ｔ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ａ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｈｉｇｈ− ａｖｉｄｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， １９９３． １７８（１ ）： ｐ． ２７９−８４．

８２． Ｐａｒｋ， Ｅ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ＬＦＡ−１ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ， ｄｉａｐｅｄｅｓｉｓ， ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ． Ｂｌｏｏｄ， ２０１０． １１５（８）： ｐ． １ ５７２−８１．

８３． Ｈａｎ Ｃ， Ｊｉｎ Ｊ， Ｘｕ Ｓ， Ｌｉｕ Ｈ， Ｌｉ Ｎ， Ｃａｏ Ｘ． Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ ｂ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＴＬＲ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｓｙｋ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｙＤ８８ ａｎｄ ＴＲＩＦ ｖｉａ Ｃｂｌ−ｂ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（８）７３４−４２．

８４． Ｃａｏ Ｃ， Ｇａｏ Ｙ， Ｌｉ Ｙ， Ａｎｔａｌｉｓ ＴＭ， Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ ＦＪ， Ｚｈａｎｇ Ｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１ １ ｂ． Ｊ Ｃｌｉｎ ｌｎｖｅｓｔ．１２０（６）：１９７１−８０．

８５． Ｍｅａｎｓ ＴＫ， Ｌｕｓｔｅｒ ＡＤ． Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｌｉｍｉｔ ｔｈｅ Ｔｏｌｌ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ １ （８）：６９１−３．

８６． Ｄｒｉｅｓｓｅｎｓ ＭＨ， ｖａｎ Ｈｕｌｔｅｎ Ｐ， Ｚｕｕｒｂｉｅｒ Ａ， Ｌａ Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｇ， Ｒｏｏｓ Ｅ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＦＡ−１ ａｎｄ Ｍａｃ−１ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ１８． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＬＦＡ−１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ＩＣＡＭ−１ ， −２， ａｎｄ − ３ ａｒｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． １９９６；６０（６）：７５８−６５．

８７． Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｆ， Ｓｌｏｂｏｄｏｖ Ｕ， Ｍａｋｒａｎｚ Ｃ， Ｒｏｔｓｈｅｎｋｅｒ Ｓ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ （ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ） ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｉｎ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ． ２００１ ；８（３）：５０４−１２．

８８． Ｐａｖｌｏｖｉｃ ＭＤ， Ｃｏｌｉｃ Ｍ， Ｐｅｊｎｏｖｉｃ Ｎ， Ｔａｍａｔａｎｉ Ｔ， Ｍｉｙａｓａｋａ Ｍ， Ｄｕｊｉｃ Ａ． Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＣＤ１８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｐｌａｓｔｉｃ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｒｅｓｔｉｎｇ ｖｅｒｓｕｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９４；２４（７）：１６４０−８．

８９． Ｓｔｏｃｋｌ Ｊ， Ｍａｊｄｉｃ Ｏ， Ｐｉｃｋｌ ＷＦ， Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ Ａ， Ｐｒａｇｅｒ Ｅ， Ｇｓｃｈｗａｎｔｌｅｒ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｎｅａｒ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ３ ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎ （ＣＤ１ １ ｂ） ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ− ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩ ＩＢ （ＣＤ１ ６） ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ ９９５；１５４（１ ０）：５４５２−６３．

９０． Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ Ｌ， Ｍａｄｕｚｉａ Ｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＴＡ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ− ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ （ＣＤ１ １ ａ／ＣＤ１ ８） ａｎｄ Ｍａｃ−１ （ＣＤ１ １ ｂ／ＣＤ１ ８） ｍｉｍｉｃｋｅｄ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＣＤ１８． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ ９９５；１５５（２）：８５４−６６．

９１． Ｋｅｉｚｅｒ ＧＤ， Ｖｉｓｓｅｒ Ｗ， Ｖｌｉｅｍ Ｍ， Ｆｉｇｄｏｒ ＣＧ． Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＮＫＩ− Ｌ１６） ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ １ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ ９８８；１４０（５）：１３９３−４００．

９２． Ａｎｄｒｅｗ Ｄ， Ｓｈｏｃｋ Ａ， Ｂａｌｌ Ｅ， Ｏｒｔｌｅｐｐ Ｓ， Ｂｅｌｌ Ｊ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｍ． ＫＩＭ１ ８５， ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＣＤ１８ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１８ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｏｔｈ ＬＦＡ−１ − ａｎｄ ＣＲ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ ９９３；２３（９）：２２１７−２２．

９３． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＭＫ， Ａｎｄｒｅｗ Ｄ， Ｒｏｓｅｎ Ｈ， Ｂｒｏｗｎ Ｄ， Ｏｒｔｌｅｐｐ Ｓ， Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｌｅｕ−ＣＡＭ ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ （ＣＤ１８） ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｏｔｈ ＬＦＡ−１ − ａｎｄ ＣＲ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｅｖｅｎｔｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９２；１４８（４）：１０８０−５．

９４． Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ Ｉ， Ｈｏｇｇ Ｎ． Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｇ２＋ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔｓ． ＥＭＢＯ Ｊ． １９８９；８（１ ２）：３７５９−６５．

９５． Ｂａｚｉｌ Ｖ， Ｓｔｅｆａｎｏｖａ Ｉ， Ｈｉｌｇｅｒｔ Ｉ， Ｋｒｉｓｔｏｆｏｖａ Ｈ， Ｖａｎｅｋ Ｓ， Ｈｏｒｅｊｓｉ Ｖ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ． ＩＶ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＬＦＡ−１ （ＣＤ１ １ ａ／ＣＤ１８） ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ−ａｄｈｅｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｆｏｌｉａ Ｂｉｏｌ （Ｐｒａｈａ）． １９９０；３６（１）：４１−５０．

Claims (11)

  1. β２インテグリンの活性と関連する疾患を治療するための医薬であって、
    有効成分として、
    式：
    〔式中、
    Ｂは存在せず、かつＲ１はフェニル、若しくは
    Ｂはメチレン、かつＲ１はフェニル又は１個のフッ素で置換されたフェニルであり；
    ＸはＯ又はＳであり；そして
    Ｒ３は４−カルボキシフェニル及び３−カルボキシ−４−クロロフェニルから選ばれる〕
    を有する化合物又はその医薬として許容される塩を含み、
    前記β２インテグリンの活性と関連する疾患は、急性炎症及び慢性炎症からなる群から選ばれる、前記医薬。
  2. 前記化合物は、
    並びにその医薬として許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬。
  3. 前記化合物は、
    並びにその医薬として許容される塩からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬。
  4. 前記化合物は、
    又はその医薬として許容される塩である、請求項１に記載の医薬。
  5. 前記化合物は、
    又はその医薬として許容される塩である、請求項１に記載の医薬。
  6. 前記化合物は、
    又はその医薬として許容される塩である、請求項１に記載の医薬。
  7. 前記化合物は、
    又はその医薬として許容される塩である、請求項１に記載の医薬。
  8. 前記化合物は、
    又はその医薬として許容される塩である、請求項１に記載の医薬。
  9. β２インテグリンの活性と関連する疾患を治療するための医薬であって、
    有効成分として、式：
    〔式中、
    Ｂは存在せず、かつＲ１はフェニル、若しくは
    Ｂはメチレン、かつＲ１はフェニル又は１個のフッ素で置換されたフェニルであり；
    ＸはＯ又はＳであり；そして
    Ｒ３は４−カルボキシフェニル及び３−カルボキシ−４−クロロフェニルから選ばれる〕
    を有する化合物（ただし、以下の化合物：

    を除く）又はその医薬として許容される塩を含み、
    前記疾患は、白血球β２インテグリンによる腫瘍浸潤と関連する、前記医薬。
  10. 前記化合物は、
    （ただし、以下の化合物：

    を除く）並びにその医薬として許容される塩からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬。
  11. 前記化合物は、

    並びにその医薬として許容される塩からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬。
JP2016095454A 2010-07-08 2016-05-11 インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を調節するための化合物及び方法 Active JP6310000B2 (ja)

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