CN103175920A - 尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法 - Google Patents
尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法，包括（1）将混合标准溶液中的一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃分别转化为相应的三甲硅氧基多环芳烃，对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS分析；（2）将在室温下解冻后的尿液样品摇匀、前处理、衍生化，进而检测出尿样中八种一羟基多环芳烃的含量。本发明适用于各种常见样本的尿液中多环芳烃暴露的生物标志物检测研究，可以同时检测尿液中8种一羟基多环芳烃，具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确的优点。
Description
技术领域
本发明属于多环芳烃在尿液中的生物标志物理化检验技术领域，具体涉及尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法。
背景技术
多环芳烃是一类广泛分布于空气、食品和水甚至某些生物体等环境介质的可致癌化合物，因此各种特定环境中的多环芳烃含量一直受到政府的重视。在日常生活中，人们通过呼吸、饮食、饮水和吸烟甚至皮肤暴露均有可能不同程度地接触多环芳烃，由于人是不断在各种特定环境之间移动的，因此很难用特定环境中多环芳烃暴露量加和的方法来评估人体对多环芳烃的暴露情况，所以近年来人体对多环芳烃暴露的生物标志物研究一直是国内外的研究热点。例如我国在1996就颁布了高效液相色谱法测定生物尿中1-羟基芘的国家标准，目前国内所报道的多环芳烃暴露的生物标志物检测方法主要包括高效液相色谱－荧光检测器法、同步荧光检测法、酶联免疫吸收法和高效液相色谱－质谱联用法等，检测的生物标志物主要是尿液中的1-羟基芘，由于尿液中各种化合物多基质比较复杂，所以使用各种前处理技术与高效液相色谱法联用进行检测时，不可避免的受到明显的基质效应。因为人体各种代谢酶的多样性以及个人饮食的差异性等，有时这种基质效应表现为基质增强效应，有时表现为基质减衰效应，因而造成检测结果的偏差，同时这些检测方法在检测低暴露或非职业暴露人群时，由于尿液基质干扰大，检测限过高，常常出现测定结果不理想的情况。另外，高效液相色谱－质谱联用法等由于所涉及仪器昂贵，检测成本高。
PAHs是一类2个或2个以上苯环连接的碳氢化合物的总称，其具体组成非常复杂。大量研究证明，虽然在许多情况下尿样中的化合物与DNA不会有关联，但许多代谢产物确实能够反映个体内致癌物的活性程度和人体的解毒能力情况。由于尿样易获得，可以有效反映PAHs多途径的暴露情况，一直成为研究热点。PAHs暴露在人体尿液中的代谢物状态、浓度与细胞和组织代谢过程相关， 反映了单个或多个器官系统的代谢情况，因此PAHs暴露生物标志物是评估多环芳烃影响人体健康的重要依据，深入研究PAHs暴露生物标志物有助于我们更好的了解人体对PAHs的暴露浓度和代谢情况，促进人们更具体的了解个体对多环芳烃暴露情况与健康的关系。
大量研究证明，多环芳烃的代谢途径主要包括Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢，在Ⅰ相代谢中多环芳烃被细胞微粒体中的P450混合功能氧化组酶氧化为活性的环氧化物中间体，然后被水解衍生化为一羟基多环芳烃，一羟基多环芳烃可以再次被P450组酶环氧化然后水解生成更多结构更复杂的一羟基多环芳烃，在Ⅱ相代谢中，一羟基多环芳烃被葡糖苷酸酶和磺基转移酶分别转化为相应的葡糖苷酸和磺酸酯，然后排出体外。
目前，测定尿液中一羟基多环芳烃的检测方法中应用最多的是高效液相色谱－荧光检测器法，其中主要是对尿液中的1-羟基芘进行检测，一般是用β－葡糖苷酸酶、芳基磺酸酯酶、酸性水溶液、碱碱性水溶液等中的一种或两种对尿液中1-羟基芘葡糖苷酸和1-羟基芘磺酸酯进行酶解或水解后，用反相预柱富集，再用高效液相色谱－荧光检测器检测。虽然使用反相预柱可以对1-羟基芘等进行富集，但由于这一前处理方法固有的一些特点决定了一些极性与甲醇相近的物质与待测组分同时被洗脱，而1-羟基芘的极性比较小，所以也富集了相当一部分检测不需要且极性较大的物质，造成比较严重的基质效应。因而各种前处理技术与高效液相色谱联用的检测方法的检测限比较高，对部分低含量样本无法定性或定量。
发明内容
本发明的目的在于针对现有方法存在的样品前处理繁琐、检测限较高、灵敏度较低、检测成本较高等技术的不足，提供一种尿液中多环芳烃暴露的生物标志物气相色谱-质谱联用检测方法，为评估个体对多环芳烃暴露情况提供一种科学的判定方法，该方法具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点，适用于气相色谱-质谱联用法检测尿液中多环芳烃暴露的生物标志物。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种烟草料液中4-甲基咪唑的分析检测方法，包括以下步骤：
①配制8种一羟基多环芳烃标准品单标溶液，再配制含有一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃的8个混合标准溶液，然后通过三甲硅基衍生化反应，将混合标准溶液中的一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃分别转化为相应的三甲硅氧基多环芳烃，立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS分析，分别建立对应三甲硅氧基菲的标准溶液工作曲线、1-三甲硅氧基芘的标准溶液工作曲线和对应三甲硅氧基苯并[a]芘的标准溶液工作曲线；
②将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取尿样于试管中，并分别加入2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物溶液，再加入醋酸钠缓冲液和β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶，充分混匀后置入微波辅助萃取仪37℃恒温酶解。用正己烷对酶解后的尿样进行萃取，合并有机相，加入沸点较高的正十二烷，无水干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至近干，加入30μL甲苯并震荡，用微量注射器转移至气相色谱瓶中，加入N,O-双三甲硅基乙酰胺溶液，摇匀，静置，上GC-MS检测。
所述的尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法，其中分析检测尿样中1-羟基菲，2-羟基菲，3-羟基菲，4-羟基菲，9-羟基菲，1-羟基芘，3-羟基苯并[a]芘和7-羟基苯并[a]芘时进行三甲硅基衍生化，并使用2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物作为内标。
所述的尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法，其中使用微波辅助萃取仪在37℃对尿样进行恒温酶解。
具体实施方式
以下结合应用实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
实施例1：
一种尿液中一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法，包括以下步骤：
1、化学试剂
1-羟基菲，2-羟基菲，3-羟基菲，4-羟基菲，9-羟基菲，1-羟基芘，3-羟基苯并[a]芘，7-羟基苯并[a]芘，2-羟基菲-d9，1-羟基芘-d9，3-羟基苯并[a]芘-d11，含量25%的N,O-双三甲硅基乙酰胺的乙腈溶液。
2、标准曲线建立
8种一羟基多环芳烃标准溶液：以乙腈为溶剂，分别配制浓度为1μg／mL的1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、1-羟基芘、3-羟基苯并[a]芘和7-羟基苯并[a]芘共8种一羟基多环芳烃标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11共3种氘代一羟基多环芳烃的单标溶液；以乙腈为溶剂，按表1配制含有一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃的8个混合标准溶液；分别取0.5mL 8个混合标准溶液于8个GC-MS色谱瓶中，按照表2分别加入25%的N,O-双三甲硅基乙酰胺溶液，摇匀，50℃静置20分钟待其进行三甲硅基衍生化反应；然后立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS分析，分别以1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲对2-三甲硅氧基菲-d9的浓度之比为横坐标，以1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲对2-三甲硅氧基菲-d9的对应定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立对应三甲硅氧基菲的标准溶液工作曲线；以1-三甲硅氧基芘对1-三甲硅氧基芘-d9的浓度之比为横坐标，以1-三甲硅氧基芘对1-三甲硅氧基芘-d9的对应定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立1-三甲硅氧基芘的标准溶液工作曲线；分别以3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7-三甲硅氧基苯并[a]芘对3-三甲硅氧基苯并[a]芘-d11的浓度之比为横坐标，以3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7-三甲硅氧基苯并[a]芘对3-三甲硅氧基苯并[a]芘-d11的对应定量离子对峰面积之比建立对应三甲硅氧基苯并[a]芘的标准溶液工作曲线。
表1 一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃的混合标准溶液
表2 混合标准溶液的衍生化
3、样品处理
将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取5mL于25mL试管中，并分别加入2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物溶液（折算为1000pg/个氘代化合物），再加入2mL的醋酸钠缓冲液（pH5.5,1M）和10μL的β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶（364.25U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37℃恒温酶解60s。用2*5mL正己烷对酶解后的尿样进行萃取，合并有机相，加入10μL沸点较高的正十二烷，无水干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至近干，此时剩余的液体约为10μL，加入30μL甲苯并震荡1分钟，用微量注射器转移至气相色谱瓶中，加入20μL含量为25%的N,O-双三甲硅基乙酰胺溶液，摇匀，50℃静置20分钟，上GC-MS检测。
4、GC-MS检测条件
DB-5MS毛细管柱（30m*0.25 mm ID*0.25μm），以流速1mL/min的氦气作为载气，进样口温度270℃，进样量2μL，不分流。
柱温：初始温度100℃，保持2min，然后以15℃/min-1的速率升至160℃，再以10℃/min-1的速率升至230℃，保持5min，再以25℃/min-1的速率升至320℃，保持3min。离子源温度250℃，离子源轰击电压70eV。各组分GC-MS测定的监测参数见表3。
表3 各待测组分GC-MS测定参数
本发明涉及到的代表性羟基多环芳烃结构式为：
实施例2：
实际样品检测：
将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取5 mL于25 mL试管中，并分别加入10 μL的100 ng/mL的 2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物溶液（折算为1000pg/个氘代化合物），再加入2 mL的醋酸钠缓冲液（pH5.5,1M）和10 μL的β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶（364.25U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37 ℃恒温酶解60 s。用2*5 mL正己烷对酶解后的尿样进行萃取，合并有机相，加入10 μL沸点较高的正十二烷，无水干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至近干，此时剩余的液体约为10 μL，加入30μL甲苯并震荡1分钟，用微量注射器转移至气相色谱瓶中，加入20μL含量为25%的N,O-双三甲硅基乙酰胺溶液，摇匀，50℃静置20分钟， 在选定的GC-MS仪器参数下测定待测样品溶液中1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲和2-三甲硅氧基菲-d9的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲；测定待测样品溶液中1-三甲硅氧基芘和1-三甲硅氧基芘-d9的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的1-三甲硅氧基芘；测定待测样品溶液中3-三甲硅氧基苯并[a]芘、7-三甲硅氧基苯并[a]芘和3-三甲硅氧基苯并[a]芘-d11的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7-三甲硅氧基苯并[a]芘。进而换算出该尿液中1-羟基菲的浓度为382 pg/mL，2-羟基菲的浓度为679 pg/mL，3-羟基菲的浓度为518 pg/mL，4-羟基菲的浓度为513 pg/mL，9-羟基菲的浓度为185 pg/mL，1-羟基芘的浓度为551 pg/mL，3-羟基苯并[a]芘的浓度为38.2 pg/mL,7-羟基苯并[a]芘的浓度为40.7 pg/mL。
实施例3：
实际样品检测：
将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取5 mL于25 mL试管中，并分别加入10 μL的100 ng/mL的 2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物溶液（折算为1000pg/个氘代化合物），再加入2 mL的醋酸钠缓冲液（pH5.5,1M）和10 μL的β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶（364.25U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37 ℃恒温酶解60 s。用2*5 mL正己烷对酶解后的尿样进行萃取，合并有机相，加入10 μL沸点较高的正十一烷，无水干燥后过滤，在氦气氛围中浓缩至近干，此时剩余的液体约为10 μL，加入30μL甲苯并震荡1分钟，用微量注射器转移至气相色谱瓶中，加入30μL三甲基硅氯和30μL无水吡啶，摇匀，50℃静置20分钟，在选定的GC-MS仪器参数下测定待测样品溶液中的1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲和2-三甲硅氧基菲-d9的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲；测定待测样品溶液中1-三甲硅氧基芘和1-三甲硅氧基芘-d9的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的1-三甲硅氧基芘；测定待测样品溶液中3-三甲硅氧基苯并[a]芘、7-三甲硅氧基苯并[a]芘和3-三甲硅氧基苯并[a]芘-d11的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7-三甲硅氧基苯并[a]芘。进而换算出该尿液中1-羟基菲的浓度为581 pg/mL，2-羟基菲的浓度为773 pg/mL，3-羟基菲的浓度为618 pg/mL，4-羟基菲的浓度为607 pg/mL，9-羟基菲的浓度为283 pg/mL，1-羟基芘的浓度为681 pg/mL，3-羟基苯并[a]芘的浓度为58.5 pg/mL,7-羟基苯并[a]芘的浓度为52.7pg/mL。
实施例4：
实际样品检测：
将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取5mL于25mL试管中，并分别加入10μL的100ng/mL的2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物溶液（折算为1000pg/个氘代化合物），再加入2mL的醋酸钠缓冲液（pH5.5,1M）和20μL的β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶（364.25U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37℃恒温酶解60s。用2*5mL正己烷对酶解后的尿样进行萃取，合并有机相，加入10μL沸点较高的正十三烷，无水干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至近干，此时剩余的液体约为10μL，加入30μL乙苯并震荡1分钟，用微量注射器转移至气相色谱瓶中，加入20μL含量为25%的N,O-双三甲硅基乙酰胺溶液，摇匀，50℃静置20分钟，在选定的GC-MS仪器参数下测定待测样品溶液中1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲和2-三甲硅氧基菲-d9的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9-三甲硅氧基菲；测定待测样品溶液中1-三甲硅氧基芘和1-三甲硅氧基芘-d9的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的1-三甲硅氧基芘；测定待测样品溶液中3-三甲硅氧基苯并[a]芘、7-三甲硅氧基苯并[a]芘和3-三甲硅氧基苯并[a]芘-d11的对应定量离子对峰面积，使用混合标准溶液工作曲线计算待测样品中的3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7-三甲硅氧基苯并[a]芘。进而换算出该尿液中1-羟基菲的浓度为371 pg/mL，2-羟基菲的浓度为683 pg/mL，3-羟基菲的浓度为536 pg/mL，4-羟基菲的浓度为528 pg/mL，9-羟基菲的浓度为196 pg/mL，1-羟基芘的浓度为627 pg/mL，3-羟基苯并[a]芘的浓度为35.3 pg/mL,7-羟基苯并[a]芘的浓度为33.9pg/mL。
需要指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1、本发明使用衍生化-GC-MS法测定尿液中八种一羟基多环芳烃，具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点；
2、本发明方法的检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。
3、本发明的多环芳烃暴露的生物标志物气相色谱-质谱联用检测方法适用于各种常见样本的尿液中多环芳烃暴露的生物标志物检测研究，填补了这一技术领域的空白。
4、本发明提供的多环芳烃暴露生物标志物气相色谱-质谱联用检测方法，适用于各种常见样本的尿液中多环芳烃暴露的生物标志物检测研究，同时可以检测尿液中8种一羟基多环芳烃，因此该方法对于检测尿液中的一羟基多环芳烃具有重要意义。
Claims (3)
1.一种烟草料液中4-甲基咪唑的分析检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
①配制8种一羟基多环芳烃标准品单标溶液，再配制含有一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃的8个混合标准溶液，然后通过三甲硅基衍生化反应，将混合标准溶液中的一羟基多环芳烃和氘代一羟基多环芳烃分别转化为相应的三甲硅氧基多环芳烃，立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS分析，分别建立对应三甲硅氧基菲的标准溶液工作曲线、1-三甲硅氧基芘的标准溶液工作曲线和对应三甲硅氧基苯并[a]芘的标准溶液工作曲线；
②将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取尿样于试管中，并分别加入2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物溶液，再加入醋酸钠缓冲液和β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶，充分混匀后置入微波辅助萃取仪37℃恒温酶解。用正己烷对酶解后的尿样进行萃取，合并有机相，加入沸点较高的正十二烷，无水干燥后过滤，在氮气氛围中浓缩至近干，加入30μL甲苯并震荡，用微量注射器转移至气相色谱瓶中，加入N,O-双三甲硅基乙酰胺溶液，摇匀，静置，上GC-MS检测。
2.根据权利要求1所述的尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于分析检测尿样中1-羟基菲，2-羟基菲，3-羟基菲，4-羟基菲，9-羟基菲，1-羟基芘，3-羟基苯并[a]芘和7-羟基苯并[a]芘时进行三甲硅基衍生化，并使用2-羟基菲-d9、1-羟基芘-d9和3-羟基苯并[a]芘-d11三个氘代化合物作为内标。
3.根据权利要求1所述的尿液中八种一羟基多环芳烃的气相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于使用微波辅助萃取仪在37℃对尿样进行恒温酶解。
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