CN103175798A - 苏丹红iv酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测食品和饲料中苏丹红Ⅳ含量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒包括：96孔酶标板，苏丹红抗体浓缩液、酶标二抗、苏丹红6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、抗体稀释液、高浓度标准品、盖模板、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被耦联抗原，样本中含有苏丹红Ⅳ和微孔条上预包被的耦联抗原竞争抗苏丹红Ⅳ抗体，加入酶标二抗后，用底物显色，样本吸光度与标准曲线比较对应的值，反对数后再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中苏丹红Ⅳ的含量。

Description

苏丹红IV酶联免疫检测试剂盒

(一) 技术领域 : 本发明涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种苏丹红Ⅳ酶联免疫分析试剂盒。 

（二）背景技术: 苏丹红Ⅳ染料，颜色鲜艳，价格低廉，广泛应用于工业（油漆、化妆等）和科学研究（燃料染色剂，显微镜着色等）等领域。作为食品染色剂，颜色鲜亮持久，能增强食欲，被用作食品着色剂。但是，苏丹红Ⅳ使用具有偶氮结构，有致癌性，属于三类致癌物，对肝肾都有毒副作用，包括欧盟在内的很多国家都禁止在食品中应用。苏丹红Ⅳ染料因为其鲜艳的红色和低廉的价格，被非法用做食品添加剂，尤其是含有辣椒的食品中（含有红辣椒，咖喱粉，棕榈油的食品，冷冻肉，香料），在棕榈油等中也有应用。苏丹红Ⅳ浓度达100-1000mg/kg会影响辣椒副产品的颜色，一般报道称苏丹红Ⅳ的添加水平很低。因此,精确检测食品中低含量的苏丹红是非常重要的。在我国, 国家质检总局和国家标准委于2005年3月29日联合发布食品中苏丹红染料的检测方法一高效液相色谱法-国家标准, 该标准规定了苏丹红系列染料的测定方法, 最低检测限: Sudan I、Sudan II、Sudan III、Sudan Ⅳ均为10μ g /kg。 

苏丹红Ⅳ的检测方法主要有液相色谱和高效液相色谱-质谱法，也有不同的检测方法：紫外，电化学等。但是高效液相色谱仪器昂贵，样品前处理复杂，时间长，检测时间长，检测费用高，需要熟练的专业人员操作，缺乏自主知识产权，严重制约了在实际检测中的应用。研发一种简便快捷、灵敏、经济、特异性高的检测方法迫在眉睫。 

（三）发明内容：本发明所要提供的是一种发明的检测方便快捷、成本低、灵敏度高、特异性好的检测工具，此种检测工具不需要专业人员操作，可快速准确检测样品的SudanⅣ的含量，弥补了高效液相色谱检测的不足。 

本发明的技术方案是：苏丹红Ⅳ酶联免疫快速检测试剂盒，包括盒体、14个试剂瓶、1块酶标板，其中，塑料泡沫板设置在盒体内，塑料泡沫板上设有多 

个试剂瓶凹槽，多个试剂瓶下凹槽的高度是所对应的试剂瓶高度的1/3-3/4,各组试剂瓶放置在多个试剂瓶下的凹槽内。

上述一种苏丹红Ⅳ酶联免疫快速检测试剂盒，包括盒体，14瓶试剂瓶，一块酶标板，一块盖模板，一个自封袋，一个放试剂瓶的下凹槽，一份说明书，一份质检报告。 

其特征在于：96孔酶标板，上面包被有蛋白耦联苏丹红Ⅳ的抗原，可拆卸成12条酶标微孔条，可以一次测试多个样品，也可以拆开分次测试，剩余的酶标微孔条可以储存在自封袋内，下次使用；所述的试剂瓶分为七组：第一组试剂瓶是装有标准溶液的试剂瓶，共6瓶，第二组是装有高浓度标准品溶液的试剂瓶，1瓶；第三组试剂瓶是装有酶标二抗的试剂瓶，共1瓶；第四组试剂瓶为装有抗体浓缩液的试剂瓶，共1瓶，第五组试剂瓶是分别装有显色液A液和B液的试剂瓶，分别各1瓶，共2瓶；第六组试剂瓶是装有终止液的试剂瓶，共1瓶；第八组试剂瓶是装有抗体稀释液的试剂瓶，共1瓶；第八组是浓缩洗涤液试剂瓶，共1瓶。用不同颜色的瓶盖和瓶体对试剂进一步加以区分。 

上述的一种苏丹红Ⅳ酶联免疫快速检测试剂盒，其中八组试剂瓶分别为：标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体浓缩溶液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的黑色塑料瓶，显色液B用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止溶液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的白色PE塑料瓶。抗体稀释液，用红色帽的白色PE塑料瓶。下凹瓶位由白色塑料泡沫制成。 

根据权利要求1所述的一种苏丹红酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的盒体为硬质盒体。 

上述的苏丹红酶联免疫分析试剂盒，其中，所述的多个试剂瓶下凹槽的大小与所对应的试剂瓶大小相匹配。 

试剂瓶放在塑料泡沫凹槽内，和说明书、质检报告书、盖板模、酶标板、自封袋一其封装在硬纸盒内，便于携带和运输。 

测试时，采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被耦联抗原，样本中含有苏丹红Ⅳ和微孔条上预包被的耦联抗原竞争抗苏丹红Ⅳ抗体，加入酶标二抗后，用底物显色，样本吸光度与标准曲线比较对应的值，反对数后再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中苏丹红的含量。 

与现有的检测技术相比，本发明具有显著的优势：1）和高效液相色谱-质谱技术相比，本试剂盒成本低廉；2)与常规技术相比，本试剂盒不需专门的熟练的操作人员，操作简单，方便；可满足不同层次人员需要，包括专业检验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、加工企业和养殖场户等，便于推广应用。3）本试剂盒对样品的要求低，前处理简单，可广泛应用于各种食品、饲料药品等领域；4）本试剂盒的原理是酶联免疫反应，因此，灵敏度较其他方法高，最低检测限达到2 ng/g, 回收率达到87±17%。 

附图说明

下面结合附图和具体试试本发明的试剂盒做进一步的说明，但不构成本发明的任何限制。 

图1是本发明酶联板横切示意图 

图2是本发明酶联板纵切示意图

图3是本发明酶联板剖面示意图

图4是本发明的酶联板的盖板示意图

图5是本发明的试剂瓶的侧视示意图

图6是本发明的泡沫模板的俯视示意图

图7是本发明的试剂盒的打开示意图

实例

一、样品的前处理

1.配制溶液：

配制溶液1.0mol/L氢氧化钠溶液

称取4.0g的氢氧化钠，加蒸馏水溶解定容到100mL。

2. 洗涤溶液 

根据需要量，将25×浓缩洗涤溶液用蒸馏水按照1：24的体积比进行稀释，

用于酶标板的洗涤。

以苏丹红为食品添加剂的样本（粉末状、水溶液状和油状）处理步骤： 

称取1g样品至聚苯乙烯离心管中，加入10mL吡啶，漩涡震荡1分钟，室温，4000转离心10分钟，移取1ml上清，真空旋转抽干，用3mL正己烷涡旋溶解干燥的残留物；加入1mL的1.0mol/L氢氧化钠溶液，涡旋30秒，室温，4000转离心10分钟，移取1mL上清，真空干燥，加入1mLDMF溶解干燥的残留物，取100μL，用900μL的蒸馏水稀释混匀，得到待测样品液。

二、使用试剂盒操作步骤： 

1.将所需的试剂包括洗涤液从冷藏的环境中取出，放置在室温（20-25℃）30分钟以上，使其达到室温，在使用前将每种试剂摇匀。

2.取出酶标板架及需要数量的微孔，不需要的微孔放入自封袋，冷藏。 

3.浓缩抗体用抗体稀释液10倍稀释（一份浓缩抗体液用9份抗体稀释液稀释。 

4.编号：将样本溶液和标准品工作溶液对应的微孔编号，每个样品溶液和标准品工作溶液做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 

5.加标准品工作液/样本溶液：加标准品溶液/样本溶液50μL到各自的微孔中，然后每孔加抗体工作溶液50μL，盖上盖板膜在37℃中反应15分钟。 

6.取出微孔板，甩出孔内溶液，用洗涤液洗涤3-4次，每次洗涤后用吸水纸拍干。 

7.每孔加入酶标二抗工作液50μL，盖上盖板膜置于37℃30分钟，取出重复上述洗涤步骤。

8.将显色液A和B按体积1：1混合，每孔加50μL，，室温显色5分钟。 

9.每孔加入终止液50μL，用酶标仪于450nm处，测定每孔OD值（若无酶标液仪，则不加终止液用目测法可进行判定） 

(三)结果判定：

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。

注意样本吸光值与苏丹红Ⅳ含量的关系。

1.目测判断法：根据样品和标准品的颜色的深浅来判断样品的浓度范围。标准品的颜色是按照浓度（0μg/L,0.5μg/L,1.5μg/L,4.5μg/L,13.5μg/L,40.5μg/L）的升高颜色依次变浅至无色，假如样品的颜色处于4.5μg/L,13.5μg/L两孔颜色之间，那么样品的浓度就处于4.5μg/L,13.5μg/L之间再乘以稀释倍数。 

2.定量分析法： 

（1）制作标准曲线：

百分吸光率的计算，样品或者标准品的吸光值的百分率等于标准品或者样品的吸光值的平均值除以第一个标准品（标准品浓度为0的孔）的吸光值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%)=B/B₀×100%

B为标准品或者样品对应孔的吸光值的平均值

B₀为标准品浓度为0的孔的吸光值的平均值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度（0μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线。将样本的百分吸光率带入标准曲线中，从标准曲线读出样本所对应的样品浓度的对数值，再反对数，得到浓度再乘以稀释倍数，得到样本中苏丹红的含量。

四、测定时注意事项： 

1、测试前应将所用的试剂和样品回到常温（20-25℃），否则导致OD值偏低。

2、洗板过程中不可间断洗完拍完板应立即进行下一步试验。否则，出现半空干燥造成标准曲线不成线性，重复性差，测定结果不准确。 

3、试剂混合要均匀，显色液B要加入到显色液A，充分混匀，否则标准曲线不成线性，重复性不好，影响测定结果。 

4、终止液为2mol/L的硫酸溶液，避免接触皮肤。 

5、储存条件： 

保存试剂盒应在0-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新

密封，标准物质和无色发光剂对光敏感，因此避免直接暴露在光线下。显色液若有任何颜色表明变质，不应再使用。0标准的吸光度应在1左右，小于0.5时，

表示试剂可能变质。不要是用过了有效期的试剂盒，稀释与掺杂使用会引起试验结果不准确，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。

加A、B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30min。 

该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或者过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。 

Claims (9)

1.一种检测食品中苏丹红Ⅳ含量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜，14瓶试剂和放试剂的小凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被蛋白耦联苏丹红抗原制成检测板，14瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、1瓶酶标二抗、1瓶抗体浓缩溶液、1瓶显色液A溶液、1瓶显色液B溶液、1瓶终止溶液、1瓶抗体稀释溶液、1瓶浓缩洗涤溶液，下凹位共15个。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝铂袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体浓缩溶液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的黑色塑料瓶，显色液B用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止溶液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的白色PE塑料瓶。

3.抗体稀释液，用红色帽的白色PE塑料瓶。

4.下凹瓶位由白色塑料泡沫制成。

5.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅳ酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述酶联板（2）是可拆卸的96孔酶联板，可拆卸为12条酶标反应微孔条，每个酶标反应微孔条有8个反应孔，酶联板的微孔上包被有用蛋白耦联的苏丹红，制成固相抗原。

6.盖板膜大小与酶标板大小相一致。

7.标准品溶液共6瓶，1mL/瓶，浓度分别为0μg/L, 0.5μg/L, 1.5μg/L, 4.5μg/L, 13.5μg/L, 40.5μg/L; 高浓度标准品溶液（1mg/L），1瓶; 酶标二抗1瓶，8mL,抗体浓缩液1瓶，1mL; 显色液A液1瓶，8mL; 显色液B液1瓶，8 mL；终止液1瓶，8 mL；抗体稀释液1瓶，20 mL；浓缩洗涤液1瓶40 mL。

8.根据权利要求1所述的一种苏丹红Ⅳ酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的盒体为硬质盒体。

9.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅳ酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的多个试剂瓶下凹槽的大小与所对应的试剂瓶大小相匹配。

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