CN103168239B - 跨膜的磁性纳米颗粒检测 - Google Patents

Abstract

跨薄膜检测磁性纳米颗粒，该膜把纳米颗粒与磁性传感器分开。该技术可被用于医疗环境中，其中感兴趣的分析物（存在于诸如血液的测试流体中）被附接到膜。其他化合物进而被结合到分析物，其中这些化合物中的一种包括磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒随后由传感器检测。以这种方式，通过检测磁性纳米颗粒而检测分析物。通过计数磁性纳米颗粒的数量，可确定测试流体中分析物的浓度。

Description

跨膜的磁性纳米颗粒检测

技术领域

本发明涉及检测磁性颗粒，更具体地，涉及检测用于医学和生物传感器应用的磁性纳米颗粒。

背景技术

一直存在这样的需求：准确、快速且以合理的成本分析生物分析物。确实，实现这点的程度是衡量保健系统提供满意的卫生保健能力一种方式。检测生物标志物能力的提高在大量的医学努力中是有益的，诸如检测癌症和其他疾病。

当前使用大量技术来检测分析物，其中使用分析化学方法来识别医生感兴趣的特定化合物。免疫测定法是用于检测或测量溶液中化合物浓度的生化测试；其依靠抗原和抗体用彼此之间高度特定结合的能力。可使用免疫测定法来检测抗原或其相应抗体。一种免疫测定法是磁性免疫测定法，其中抗原和抗体彼此结合，且磁性颗粒随后被附接到抗原/抗体对的抗原（或抗体）。通过给分析物加上磁性纳米颗粒的标签，生物检测的问题实际上被简化到一种磁场测量。

一种磁性免疫测定法涉及在生物测试样本上以几微米的相对大的距离扫描巨磁至电阻（GMR）传感器。（例如，参见J.Nordling等人的“GiantMagnetoresistance Sensors.1.Internally Calibrated Readout of ScannedMagnetic Arrays,”Anal.Chem.,80(21),pp.7930-7939,2008;以及R.L.Millen等人的“Giant Magnetoresistive Sensors.2.Detection ofBiorecognition Events at Self-Referencing and Magnetically TaggedArrays,”Anal.Chem.,80(21),pp.7940-7946,2008.）利用该方法，要求传感器和测试样本之间有相对大的距离，因为样本典型地是易碎的且可容易地被传感器损坏。结果，磁性颗粒必须是相应大以在该距离产生足够强大的磁场。因此，可达到的空间分辨率相对较差。而且，大磁性颗粒要求较大量的分析物以将其接合到功能化样本表面，由此降低检测敏感度。

在另一种磁性免疫分析法中，分析物和磁性颗粒直接位于GMR传感器的表面上（例如，参见G.Li等人的“Detection of single micron-sizedmagnetic bead and magnetic nanoparticles using spin valve sensors forbiological applications,”Journal of Applied Physics,vol.93(10),2003;以及Wang等人的美国专利7,682,838，名称是“Magnetic Nanoparticles,Magnetic Detector Arrays,and Methods for their Use in DetectingBiological Molecules”）。利用用于每个测试位置的专用传感器以及位于传感器表面的磁性颗粒，场灵敏度很高。在另一方面，这意味着为了处理大量不同的分析物，有必要具有非常复杂的测试芯片，其包括专用于各个测试位置和分析物的相对大量的GMR传感器。

发明内容

在此公开了方法，其中检查用于一种感兴趣的分析物（或多种分析物）的测试流体。薄而坚固的膜用作分析物的保护层，同时也限定磁性颗粒（其选择性地附接到分析物）和磁性传感器之间的间隔。磁性传感器和分析物位于该膜的相对侧上。

在一个示例性实施例中，与感兴趣的抗原匹配（即，特定结合于）的抗体被功能化且被附接到膜。其中具有感兴趣的抗原的测试流体，诸如来自病人的血液，随后被传递给已被附接了抗体的膜。结果是测试流体中感兴趣的抗原特定地结合到抗体（而测试流体中的其他类型抗原未结合到这些抗体）。此时膜可被清洗（例如可使用高纯水），留下功能化抗体和结合抗原。之前已被附接磁性纳米颗粒的抗体（与附接到膜的抗体是同样类型的）现在被传递给膜，以便结合抗原特定地附接到这些抗体/磁性纳米颗粒结构，随后是另一次清洗（例如使用高纯水）。现在的结果是夹心结构的收集，每个夹心结构包括被功能化到膜的抗体、附接到该抗体的抗原，以及在一端上附接到抗原而另一端上附接到磁性纳米颗粒的另一个相同种类的抗体。仅当感兴趣的抗原出现在测试流体中时才能捕获磁性纳米颗粒，且捕获的磁性纳米颗粒的数量指示测试流体中感兴趣的抗原浓度。利用磁性检测设备检测磁性纳米颗粒，其中跨膜的与磁性纳米颗粒接合到膜的一侧相对的侧而扫描所述磁性检测设备。

本发明的一方面是一种用于接合到膜的第一侧的磁性颗粒（或甚至仅是一个磁性颗粒）的方法，每个磁性颗粒结合到感兴趣的分析物。该方法包括使用位于膜的第二侧（与第一侧相对）上的磁性传感器检测磁性颗粒，其中磁性传感器相对于膜移动。该方法优选地包括计数磁性颗粒的数量。传感器可沿着膜的第二侧被扫描，由此确定磁性颗粒的位置。膜优选地具有少于100纳米的厚度，且更优选地是少于50纳米，而磁性颗粒优选地具有少于100nm的特征尺寸。磁性颗粒有利地是铁磁性或铁磁性的，且可被布置在任何阵列中。

本发明的另一方面是一种用于膜的方法，所述膜在其第一侧上具有区域阵列，每个区域具有多个反应位置。该方法包括功能化所述反应位置，以便不同区域中的反应位置具有不同的捕获抗体。该方法还包括施加测试流体到膜的第一侧，该测试流体包括不同的抗原，以便抗原特定结合到捕获抗原中的特定捕获抗原。该方法也包括将用对应于结合抗原的抗体功能化的磁性颗粒的溶液施加到结合抗体，以便至少一些结合抗原连接到用抗体功能化的各个磁性颗粒，导致磁性颗粒接合到各个反应位置。沿着膜的第二侧（与第一侧相对）扫描至少一个传感器，以确定接合到反应位置的每个区域中的磁性颗粒的数量。一旦知道该数量，可确定测试流体中抗原的浓度。而且也可在膜的第一侧之上施加密封剂，以便固定了磁性颗粒。

本发明的又一方面是一种用于膜的方法，所述膜在其第一侧上具有反应位置。该方法包括功能化反应位置，以便反应位置具有对于感兴趣的分析物的亲和性。该方法还包括将测试流体施加到膜的第一侧，其中测试流体包括感兴趣的分析物，而分析物结合到膜的第一侧上的反应位置。该方法还包括将用对于分析物具有亲和性的化合物功能化的磁性颗粒的溶液施加到具有结合分析物的膜的第一侧，以便磁性颗粒接合到膜的第一侧上的反应位置。随后沿着膜的第二侧（与第一侧相对）扫描至少一个传感器，以确定接合到膜的第一侧上的反应位置的磁性颗粒的数量。

附图说明

图1和2示出了用于测试流体（其包括将被检测的感兴趣的分析物）的装置。

图3，包括图3A、3B和3C，示出了一系列步骤，其中分析物被结合到装置的底层膜，且分子种（species）（其中一个包括磁性纳米颗粒）进而被附接到结合的分析物。

图4示出了作为这些步骤的结果而接合到装置的磁性纳米颗粒，以及用于检测磁性纳米颗粒的磁性传感器器件。

图5示出了磁性传感器器件的磁性传感器元件。

图6示出了由磁性传感器器件检测的磁性纳米颗粒。

图7示出了图1中示出的器件的阵列。

图8示出了在其上放置了磁性纳米颗粒的膜下扫描的结果。

具体实施方式

现在针对各个附图讨论优选方法。图1示出了附接了薄膜120的“芯片”110。芯片可例如用硅制成。另一方面，膜120可用例如碳、聚乙烯树脂（例如聚乙烯醇）、SiN、Si或SiO₂制成。膜相对薄，例如，其可以是5nm厚或者达到15nm厚，但优选地是不厚于100-200nm。芯片110具有位于中央的腔130，从其可看到膜120的一部分。芯片110/膜120结构可通过从硅块开始并在其上沉积SiN膜而形成。腔130可通过穿过芯片110蚀刻直到膜120而形成。腔130可具有100微米x100微米的面积尺寸，或甚至是1mm x1mm。图2是图1示出的结构的横截面图。图1和2示出的器件是商业可得的（例如来自SiMPore,Inc.或Ted Pella,Inc.），因为其可作为其上可放置物质的基板而被用于高分辨率显微镜行业。

图3是磁性夹心结构怎样被建立在膜120上的示意表示，这些结构的每个包括感兴趣的抗原和可被磁性传感器检测到的磁化纳米颗粒。感兴趣的抗原可以是大量分析物中的任一个，诸如生物标记（例如指示癌症出现的蛋白质）。使用本领域技术人员已知的方法，首先抗体被结合到膜120（例如参见Osterfeld等人的"Multiplex protein assays based on real-timemagnetic nanotag sensing",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,v.105,pp.20637-20640,2008）。特别地，制备这样的溶液，其包括特定结合到感兴趣的抗原的抗体。该溶液与膜120接触，使得抗体140将其自身附接到膜，如图3A所示。为清楚起见，仅在图3A中示出6个这样的抗体140，尽管实际中潜在地可能有几百万个或更多个这样的抗体将被附接到膜120。

在可选的清洗被施加到膜后，随后使测试流体（诸如来自病人的血液）与抗体140接触。在该讨论中，假设流体包括感兴趣的分析物（因为如果其不是，将不会形成以上讨论的磁化夹心结构）。当感兴趣的抗原与结合到膜120的一个抗体140接触时，其结合到该抗体，因为抗原和抗体彼此具有特定亲和性。图3B示出了产生的抗原/抗体对，其中感兴趣的抗原150被结合到一个抗体140。为清楚起见，在该图中仅示出了一个抗原/抗体对，尽管实际上可形成许多这样的对。确实，理想地抗体140（附接到膜120）比在测试流体中的抗原150要更多，这样流体中所有感兴趣的抗原可被捕获。（不期望由抗体140捕获测试流体中的其他抗原，因为其不具有所要求的对于彼此的亲和性）。这时可向膜施加另一次可选的清洗。

一旦捕获感兴趣的抗原，问题变成如何“标出（flag）”这些捕获的抗原，这样其可随后被识别。为此可采用额外的溶液，其包括已结合到各自的磁性纳米颗粒的抗体（与图3A和3B示出的那些具有相同的类型），由此形成抗体/纳米颗粒对。可使用本领域技术人员已知的方法来功能化磁性纳米颗粒（例如参见Srinivasan等人的"A Detection System Based onGiant Magnetoresistive Sensors and High-Moment Magnetic NanoparticlesDemonstrates Zeptomole Sensitivity:Potential for Personalized Medicine",Angew.Chem.Int.Ed.,v.48,pp.2764　2767,2009）。磁性颗粒优选地具有小于100nm的平均直径，例如10-30nm。具有这些抗体/纳米颗粒对的溶液与图3B示出的结构接触，以便该对的抗体部分与抗原150“搭配”以形成包括磁性纳米颗粒160的夹心结构（见图3C）。可使用磁场（未示出）通过向着抗原150加速磁性纳米颗粒160，并沿着优先轴（例如与膜120垂直）与纳米颗粒160的磁矩（未示出）对准，来促进该过程。现在可向膜施加另一次清洗。此外，通过将环氧树脂（例如可使用“5Epoxy”）引入到腔130中的空白空间（empty space），而在适当的位置“冻结”图3C示出的结构。这样做，将在扫描时给膜120提供支持，并将磁性纳米颗粒保持在固定位置。此外，可有利地以足以平滑膜中的任何波动的压力来施加密封剂。尽管已针对形成包括抗体/抗原/抗体/纳米颗粒结构的夹心描述了图3，也可使用类似方法来形成抗原/抗体/抗原/纳米颗粒结构。

在图4中示意性地示出刚才结合图3描述的处理的结果。与图1相反，图4示出了其中磁性纳米颗粒160所位于的大量反应位置210。也示出了对应于未结合到抗原150的抗体140的额外的反应位置220。任务现在变成计数磁性纳米颗粒160的数量，这最容易在磁性传感器器件230帮助下完成。（一旦确定磁性纳米颗粒160的数量，可通过用该数量除以引入到腔130的测试流体的体积而确定测试流体中的抗原浓度。）传感器器件230可包括例如巨磁至电阻（GMR）传感器元件240，其有利地位于从例如AlTiC的材料块一体形成的大量衬垫250中的一个内。（可使用其他的磁至电阻传感器元件，诸如隧道磁至电阻元件）。衬垫250优选地是平滑的（例如其甚至可以具有“气浮（air-bearing）”的品质），这样传感器器件230可在膜120之下被扫描并与其接触。

传感器元件240可以是传统的GMR元件，例如，诸如在名为“Magnetoresistive sensor based on the spin valve effect”的美国专利5,159,513描述的元件。图5示出了一个这样的传感器元件240及其相邻部件的平面图。传感器元件240被区域250（例如用Al₂O₃制成）电绝缘，其进而被坡莫合金（permalloy）区域S1和S2包围（bracket）。引线260连接到传感器元件240的两侧。范围在30-120nm的距离，例如，可分离S1和S2（屏蔽到屏蔽间隔）。传感器元件240可具有40-100nm（传感器宽度）X5-10nm（传感器厚度）的尺寸，以便可容易地分辨尺寸为100nm的磁性纳米颗粒。传感器宽度是确定一个维度中的空间分辨率的重要因素，而屏蔽到屏蔽间隔是确定正交维度中空间分辨率的重要因素。

图6示出了如何利用传感器元件240检测磁性纳米颗粒160。示出了夹心结构，其包括各个抗体140、抗原150和磁性颗粒160。也识别未接合到磁性纳米颗粒的反应位置220。优选地使传感器元件240与膜120接触（或尽可能靠近膜，例如，传感器元件240可具有固定在其上的薄保护涂层），以便其可检测位于膜另一侧上的磁性纳米颗粒160。通过沿膜120来回扫描，磁性传感器元件240检测每个磁性纳米颗粒160（且这样做，检测每个捕获的抗原150）。到达这样的程度，膜120是薄的，检测敏感度被增强，因为磁性传感器元件240将与磁性纳米颗粒160更接近。出于该原因，膜120的厚度优选地不大于5-15nm。

图1和2（也参见图3-4和6）示出的腔130表示其中存在大量反应位置的区域，其中一些被利用设计为捕获特定抗原的抗体功能化（或者，反应位置被利用设计为捕获特定抗体的抗原功能化）。如图7所示，大量这样的区域（130a、130b、130c等，例如，其具有矩形或正方形的形状，具有10⁴平方微米的面积）可形成矩阵310，其中每个区域用不同的抗体（或抗原）制备。以这种方式，可并行地针对各种抗原（或抗体）筛选（screen）测试流体。

可跨形成矩阵310的各种区域来回扫描磁性传感器320，利用连接到附接有磁性传感器的悬架330压电纳米定位台（未示出）的帮助。台330可将磁性传感器320从矩阵310的一端移动到矩阵的相对端，且随后在再次扫描矩阵长度前向一侧增量步进。或者，可使用多个磁性传感器（未示出）来扫描这些区域，例如，一个磁性传感器可被专用于每个区域130a、130b、130c等。

与图1的单腔器件如何制成类似，图7的矩阵310可从硅块开始形成，在该硅块上放置了SiN膜。Si块可被光刻构图，且随后可被蚀刻，在SiN膜处停止。结果是Si芯片312中的腔阵列，其每个在一侧被SiN膜314结合。与图1中示出的器件一样，可用环氧树脂来密封被附接到腔中的分析物的磁化纳米颗粒，由此允许病人的样本被存档和再次测试。各种区域130a、130b、130c，与其对应物130一样，可具有例如50-500微米x50-500微米的面积尺寸，对应于被暴露的膜314的该部分。

实例

具有大约18nm直径的亚铁磁CoFe₂O₄纳米颗粒被放置在具有15nm厚度的SiN膜上。磁性纳米实例已被涂敷以阻止纳米颗粒的积聚，如在Q.Dai等人中的“Self-Assembled Ferrimagnet-Polymer Composites forMagnetic Recording Media”,所描述的，NanoLetters,v.10,p.3216,2010（与现有技术的超顺磁性颗粒相反，该工艺允许使用铁磁和/或铁磁纳米颗粒。）。随后使用环氧树脂在合适的位置密封磁性纳米颗粒。在SiN膜的对侧上扫描GMR读取传感器。图8示出了磁性信号强度，作为从这样的扫描获取的位置函数，其中数据用灰度表示。图8中的放大部分示出了具有磁性纳米颗粒集群的区域，以及若干分离的单个磁性纳米颗粒，其中一个在插入部分中被调出（call out）。

集群中的磁性纳米颗粒的数量原理上可使用线性系统分析方法从磁场的二维图像确定。例如，可在控制实验中确定对单个磁性纳米颗粒的磁响应，例如使用高分辨率显微镜（诸如TEM），来识别其中单个磁性纳米颗粒所位于的区域。该信息随后可被用来确定任何集群中的颗粒数量。

本发明可被实施为其他特定形式，而不脱离其本质特征。描述的实施例应被认为在各方面都仅是说明性的而不是限制性的。本发明的范围因此是由所附权利要求书而不是前述描述限定的。权利要求书的等效意思和范围内的所有变化应被包含在该范围内。

Claims (14)

1.一种用于接合到膜的第一侧的磁性颗粒的方法，每个所述磁性颗粒被结合到感兴趣的分析物，所述方法包括：

使用位于所述膜的与所述第一侧相对的第二侧上的磁性传感器检测所述磁性颗粒，其中所述磁性传感器相对于所述膜移动。

2.如权利要求1所述的方法，包括计数所述磁性颗粒的数量。

3.如权利要求1所述的方法，所述检测包括：

沿着所述膜的所述第二侧扫描所述传感器，由此确定所述磁性颗粒的位置。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述磁性颗粒的阵列位于所述膜的所述第一侧上。

5.如权利要求4所述的方法，包括沿着所述膜的所述第二侧来回扫描所述传感器，由此确定所述磁性颗粒的位置。

6.如权利要求5所述的方法，包括计数所述磁性颗粒的数量。

7.一种用于膜的方法，所述膜在其第一侧上有区域阵列，每个区域具有多个反应位置，所述方法包括：

功能化所述反应位置，以便不同区域中的反应位置具有不同的捕获抗体；

将测试流体施加到所述膜的所述第一侧，所述测试流体包括不同的抗原，以便抗原特定地结合到所述捕获抗体中的特定捕获抗体；

将用对应于结合抗原的抗体功能化的磁性颗粒的溶液施加到所述结合抗原，以便至少一些所述结合抗原被接合到用抗体功能化的各个磁性颗粒，导致磁性颗粒被接合到各个反应位置；以及

沿着所述膜的与所述第一侧相对的第二侧扫描至少一个传感器，以确定接合到反应位置的每个区域中磁性颗粒的数量。

8.一种用于膜的方法，所述膜具有在其第一侧上的反应位置，所述方法包括：

功能化所述反应位置，以便所述反应位置对于感兴趣的分析物具有亲和性；

将测试流体施加到所述膜的所述第一侧，所述测试流体包括感兴趣的分析物，所述分析物结合到所述膜的所述第一侧上的反应位置；

将用对于所述分析物具有亲和性的化合物功能化的磁性颗粒的溶液施加到具有结合分析物的所述膜的所述第一侧，以便磁性颗粒被接合到所述膜的所述第一侧上的反应位置；以及

沿着所述膜的与所述第一侧相对的第二侧扫描至少一个传感器，以确定接合到所述膜的所述第一侧上的反应位置的磁性颗粒的数量。

9.如权利要求7或8所述的方法，包括在所述膜的第一侧之上施加密封剂。

10.如权利要求7或8所述的方法，包括确定所述测试流体中的所述分析物的浓度。

11.如权利要求1、7或8所述的方法，其中所述膜具有小于100纳米的厚度。

12.如权利要求1、7或8所述的方法，其中所述磁性颗粒具有小于100nm的特征尺寸。

13.一种方法，包括：

提供至少一个磁性颗粒，其接合到膜的第一侧，所述至少一个磁性颗粒被结合到感兴趣的分析物；以及

使用位于所述膜的与所述第一侧相对的第二侧上的磁性传感器来检测至少一个磁性颗粒，其中所述磁性传感器相对于所述膜移动。

14.如权利要求1、7、8或13所述的方法，所述至少一个磁性颗粒具有从由铁磁性和亚铁磁性组成的组中选择的磁性。