CN103167807A - 增强益生菌的储存稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

本申请描述了提供储存稳定的含益生菌的食品或饮料的方法，包括：形成半渗透的微球体，所述微球体包括益生菌、高分子量聚合物、和有效量的抑菌剂。

Description

增强益生菌的储存稳定性的方法

技术领域

本发明总地涉及益生菌，更具体地涉及稳定食品和饮料中益生菌的方法。

背景技术

益生菌类是活的微生物，优选为细菌，当以适当量施用于对象时，会给予对象以健康益处。一些健康益处可能是菌株特异性的，即，通过属和类而变化，以给予益处（但是不管益处的类型），有效量的细菌在施用时必须是活着的(或活的)。由于本领域该最重要的考量，相当多的研究已经关于干燥储存稳定性的策略以及肠覆层进行以当益生菌穿过对象的胃时保护益生菌。稳定性通常作为活细菌的减少量测量，例如，菌落形成单位(cfu)减少量的对数值减少10倍。

涉及储存稳定性的考量，按照常规经验，本领域技术人员致力于冷冻干燥细菌然后保持它们干燥，通常通过使用疏水覆层进行。但是，活性似乎随时间降低，即使在干燥环境中也是如此。在其中湿度为约10%的水的环境中，活性急剧降低。例如，US2005/0266069，第[0025]段陈述，在10%水的环境中对于多种包封的益生菌，在37℃在14天中的4log减少量。食品通常描述为干燥的(理论上为0-15%的水)，半潮湿的(15-70%的水)，或潮湿的(70-90%)。饮料显然是大于90%的水。正如所知，如果限于干燥环境，大的市场区域将保持对益生菌关闭，或要求给料巨大过量的益生菌，以期待有效量可幸存。

因此，需要增强具有大于10%的水的食品中或饮料中益生菌的储存稳定性的方法。

具体实施方式

在一种实施方式中，本发明涉及提供储存稳定的含益生菌的食品或饮料的方法，该方法包括：形成半渗透的微球体，该微球体包括益生菌、高分子量聚合物、和有效量的抑菌剂；将所述微球体引入到相对高湿度的食品或饮料中，其中所述相对高湿度的食品具有大于10%的水的残留湿气水平；和在无冷藏下而在消费前储存所述食品或饮料至少6周。

在另一种实施方式中，本发明涉及提供储存稳定的含益生菌的食品或饮料的方法，该方法包括：提供半渗透的微球体，该微球体包括益生菌、高分子量聚合物、和有效量的抑菌剂；将所述微球体放进相对高湿度的食品或饮料中，其中所述相对高湿度的食品具有大于10%的水的残留湿气水平；和使水进入所述微球体，其中在无冷藏下储存所述食品或饮料至少6周以后，所述益生菌经历的菌群减少为1.5log cfu或更少。

"储存稳定的"表示益生菌保留足够的存活率以给予其健康益处。对于各益生菌的菌株，这样的量是本领域技术人员已知的。在优选的实施方式中，益生菌经历的菌群减少量为小于1.5log cfu，优选为小于1.3log cfu，更优选为小于1.1log cfu，更优选为小于1.0log cfu，更优选为小于0.9log cfu，更优选为小于0.8log cfu。

之前，本领域技术人员已经考虑到保持益生菌干燥以保持稳定性是关键的。申请人已经出乎意料地发现，良好的稳定性可以使用半渗透的微球体实现，条件是其中包含有效量的抑菌剂，如以下所述。"半渗透的"是指能渗透水。在一种实施方式中，渗透性根据高分子量聚合物变化。

微球体可以通过多种常规方式形成，例如通过流化床凝聚(fluid bedagglomeration)，凝胶珠成型(gel bead formation)，喷雾干燥，或泡沫制粒。在一种实施方式中，控制条件，使得微球体的平均粒度小于500微米。通常，将益生菌冻干，然后或涂覆、分散、或以其它方式夹带在微球体中。在一种实施方式中，微球体具有多层组分。在多层实施方式的一种实施方式中，微球体不包括蜡。

适宜的益生菌微生物的实例包括酵母，如酵母属(Saccharomyces)，德巴利酵母属(Debaromyces)，Candidaw Pichia和球拟酵母属(Torulopsis)；霉菌如曲霉属(Aspergillus)，根霉属(Rhizopus)，毛霉属(Mucor)，球拟酵母属(Torulopsis)，和青霉属(Penicillium)；和细菌，如属双岐杆菌属(Bifidobacterium)，类杆菌属(Bacteroides)，梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，梭形杆菌属(Fusobacterium)，Melissococcus，丙酸菌属(Propionibacterium)，链球菌属（Streptococcus），肠道球菌(Enterococcus)，乳球菌(Lactococcus)，Kocuriaw，葡萄球菌(Staphylococcus)，Peptostrepococcus，芽胞杆菌属(Bacillus)，片球菌属(Pediococcus)，细球菌属(Micrococcus)，明串珠菌属(Leuconostoc)，Weissella，气球菌属(Aerococcus)，Oenococcus和乳酸菌（Lactobacillus）。乳酸菌的非限制性实例包括嗜酸乳(酸)细菌（L.acidophilus)，食品乳杆菌(L.alimentarius)，L.amylovorus，卷曲乳杆菌(L.crispatus)，短乳杆菌(L.brevis)，L.case4，弯曲乳(酸)杆菌(L.curvatus)，纤维二糖乳(酸)杆菌(L.cellobiosus)，德氏乳杆菌(L.delbrueckii)，保加利亚乳(酸)杆菌(ss.Bulgaricus)，香肠乳杆菌(L farciminis)，发酵乳杆菌(L.fermentum)，加氏乳杆菌(L.gasseri)，瑞士乳(酸)杆菌(L.helveticus)，乳酸乳(酸)杆菌（L.lactis)，植物乳杆菌(L.plantarum)，约氏不动杆菌(L.johnsonii)，L.reuteri，干酪鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，L.sakei，和唾液乳(酸)杆菌(L.salivarius)。

适宜的益生菌可以获自Jarrow Formulas，例如，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)299v(Ideal Bowel Support^TM299v的活性成分；100亿活生物体)或通常的益生菌，例如胚芽乳(酸)杆菌(L.plantarum)，干酪鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，或嗜酸乳(酸)杆菌(L.acidophilus)。

"高分子量聚合物"大于50,000的重均分子量。可以使用多种合成、天然、或改性的聚合物，包括角蛋白，酪蛋白，清蛋白，胶原质，谷蛋白，胰高血糖素，麸质，玉米蛋白，凝胶及其衍生物，源自壳质或壳聚糖的聚合物，多糖聚合物例如基于纤维素的聚合物，例如乙基纤维素，羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，甲基纤维素，乙基羟基乙基纤维素，羧基甲基纤维素和季铵化的纤维素衍生物，淀粉及其衍生物，丙烯酸类聚合物或共聚物如聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯及其共聚物，聚乙烯基醇，天然来源的聚合物，它们是任选衍生的，例如阿拉伯树胶，瓜尔胶，黄原胶衍生物或刺梧桐树胶，藻酸盐，角叉胶，石莼聚糖(ulvanes)和其它藻类胶体，甘油氨基多糖，透明质酸及其衍生物，虫漆，香松树胶，达玛脂，榄香树脂和柯巴树脂，脱氧核糖核酸，粘多糖例如透明质酸，软骨素硫酸盐，己内酰胺，短醒霉多糖，胶质，甘露聚糖和半乳甘露聚糖，和葡甘露聚糖，及混合物和/或其衍生物。尽管列出了前述实例，但是应该理解可以使用多种食品等级的高分子量聚合物。

优选的高分子量聚合物的非限制性实例包括乙基纤维素和藻酸盐。任选地，两种或更多种高分子量聚合物可以共混。

不希望受理论限制，抑菌剂似乎是半渗透微球体的关键特征。正如所附实施例所示，过少或过多的抑菌剂都会导致存活率损失。抑菌剂可以选自尼生素，癸酸，月桂酸，壳聚糖，苯甲酸钠，富马酸，山梨酸钾，PABA，丙酸，TRICLOSAN，和亚油酸。

在一种实施方式中，抑菌剂是月桂酸。当抑菌剂是月桂酸时，其优选以下述wt.%范围(相对于微球体的总重量)存在：约0.3至约15，优选为约0.3至约12，优选为约0.4至约11，优选为约0.5至约10。也可以进一步使用该范围内的子组合。

本发明的微球体用于稳定益生菌以当结合进食品或饮料中时提供较长的保存限期。特别优选的是以下情形，其中微球体在相对高湿度的食品中，该食品的残留湿气水平为大于20%的水，优选为大于30%的水，优选为大于40%的水，更优选为大于50%的水。

水活性是指(在给定温度在产品表面的水蒸气的分压)除以(在相同温度高于纯水的水蒸气的分压的饱和压力)。在食品领域中，认为≥0.3至≤0.5的水活性是半干的，认为>0.5至≤0.7的水活性是半湿的，认为>0.7或以上的水活性是潮湿的。在过去认为，包含益生菌的半湿和潮湿的食品需要冷藏。

在一种实施方式中，微球体在相对高湿度的食品中，该食品的水活性大于0.6，优选为大于0.7，优选为大于0.8，更优选为大于0.9。

在一种实施方式中，相对高湿度的食品包括宠物食品，快餐食品，健康棒(health bars)，和未熟的预包装混合物，例如奶粉。

在一种实施方式中，微球体在饮料中。作为参照，大多数饮料的水活性为1.0。在一种实施方式中，饮料的pH小于5。这样的饮料的实例包括果汁和无醇饮料(苏打水)。

实施例

以下实施例仅针对说明的目的，并不意图限制本发明的范围。除非另有说明，否则所有的百分比均基于重量。

实施例1

本发明的示例性微球体如下形成：用包含3.33%ETHOCEL乙基纤维素和月桂酸的稳定化材料覆盖得自Custom Probiotics Inc的冻干的L.rhamnosus(100g起始重量)，所述3.33%ETHOCEL乙基纤维素购自The DowChemical Company Midland MI(乙氧基含量为48.0%-49.5%，在5%(80∶20甲苯∶乙醇)溶液中用Ubbelohde粘度计在25℃测得的溶液粘度为12.6-15.4cP)。将月桂酸和乙基纤维素分散在80%乙酸乙酯/20%乙醇的溶剂共混物中以形成稳定化溶液。

将稳定化溶液经流化床涂覆机使用Wurster法施用于细菌。Wurster法的特征在于使喷嘴定位在流化床的底部，该流化床是经氮气流悬浮在流化床涂覆机室的固体粒子的流化床。该粒子跟随在喷嘴顶部上的环状流。喷嘴将稳定化溶液的雾化流喷洒在该粒子上，这产生均匀的微球体。设定温度为80℃，这使得室内温度为约55℃。流速为0.6g/min。工艺压力为0.8巴。喷嘴压力为1.8巴。该方法得当均匀的球形粒子，其粒度平均在500微米范围内，经光学显微镜法测定。

包含在微球体中的月桂酸的所得量基于以下估算：在每次流化床涂覆试验结束时复原的细菌量，以及在每次试验过程中注射到室中的稳定化溶液的总量。计算微球体的组成并以wt.%范围(相对于微球体的总重量)给出在表1中：

表1

批料	益生菌	聚合物	月桂酸
				A	61.92	29.28	8.79
B	75.99	18.46	5.54

实施例2

本发明的示例性微球体如下形成：喷雾干燥含益生菌的粉末(批料D是5.4gL.Plantarum299v连同非活性成分，得自Jarrow Formulas，通过破坏IdealBowel Support^TM299v(活性成分L.Plantarum299v；100亿活生物体/胶囊)的打开胶囊获得，批料E是7.3gL.Plantarum，得自Custom Probiotics)与0.27g月桂酸和椰油(C=21.33g(39.5%)；D=19.43g(36%)。将月桂酸和油一起熔融并与益生菌在升高温度(40-45°C)混合。喷雾干燥制剂如下制备：使27g该混合物分散进100g SURELEASE(ETHOCEL乙基纤维素分散体(27%固体))中，添加另外的灭菌水以调节粘度。将分散体混合物泵送至装备在移动式副喷雾干燥器上的双流体喷嘴喷雾器。喷嘴的空气压力固定在1巴和50%的流，这相当于6kg/hr的气流。在氮气环境中进行喷雾干燥，其中入口温度固定在140℃，出口温度通过调节混合物的进料速率设定在50℃±1℃。使用旋风器收集微球体，然后施加真空以移除残留湿气。计算微球体的组成并以wt.%范围(相对于微球体的总重量)给出在表2：

表2

批料	益生菌	聚合物	月桂酸
				C	10.0	50.0	0.5
D	13.5	50.0	0.5

粉末的所得粒度具有的中值粒度直径为43微米，通过Coulter计算技术测定。

实施例3

本发明示例性的微球体通过凝胶珠形成。将椰油(按照批料分别为2.85g，1.5g，0.75g，和0)和月桂酸的混合物共混并在55℃熔融。将每次所得的熔体与细菌粉末(L.plantarum299v，得自Jarrow Formulas，通过破坏Ideal BowelSupport^TM299v(活性成分L.Plantarum299v；100亿活生物体/胶囊)(批料E和F使用0.25g的含量，批料G和H使用0.20g的含量)的打开胶囊获得)混合。

然后使熔体/细菌粉末各自分散在10.9375g的2%藻酸钠(KELTONE LV，FMC生物聚合物，Mw=50000-75000Da)溶液中。然后用移液管将每个批料的液滴移入单独的1M氯化钙溶液中从而使藻酸钠交联和形成基于藻酸盐的凝胶珠微球体，然后立即转移进去离子水。

计算微球体的组成并以wt.%范围(相对于微球体的总重量)给出在表3：

表3

批料	益生菌	聚合物	月桂酸	椰油
					E	1.76	1.54	1.06	20.09
F	1.76	1.55	10.57	10.57
					G	1.41	1.56	15.92	5.31
H	1.41	1.56	21.22	0

微球体和水的平衡(在形成后相对快速确定的百分比)。微球体的所得粒度为≥1000微米，通过光学显微镜法测定，但是通过微移液管或其它常规技术可以制成更小。

实施例4(对比)

对比微球体基本上通过实施例2的方法形成，所不同的是不使用月桂酸和使用21.6g椰油，下文称为对比批料1。

实施例5(对比)

对比微球体基本上通过实施例3的方法形成，所不同的是不使用月桂酸，和使用0.25g益生菌粉末含量和3.0g椰油，下文称为对比批料2。

实施例6

方法

初始细胞计数存活率如下评估：使100mg微球体悬浮在1ml水中并使用以下方法之一加工以释放细菌：1)使样品在37℃浸泡过夜并剧烈地涡动混合以释放细菌；2)在37℃浸泡过夜之后用消毒的剃刀切断粒子；3)使用研钵和杵研磨样品。正如所知，对于未涂覆的对照，样品未在水中浸泡过夜，因为无需释放细菌。类似地，针对稳定性测试，已经在水中浸泡的物质的存活率的测试也不需要另外浸泡过夜。在加工之后，将4ml的MRS肉汤基质添加到释放的细菌悬浮液中。然后进行连续稀释，将100μl放在MRS琼脂上并在37℃培养24-36小时。计算细菌菌落，报告每克微球体存活的细胞群落。

微球体基本上根据实施例1制备，并测试它们在蒸馏水中浸润指定时期之后的存活率，如表4A所描述：

表4A

微球体基本上根据实施例2和4制备，并测试它们在蒸馏水中浸润指定时期之后的存活率。结果给于表4B：

表4B

微球体基本上根据实施例3和5制备，并测试它们在蒸馏水中浸润指定时期之后的存活率。结果给于表4C：

表4C

**杀菌

实施例7(对比)

微球体基本上根据实施例4制备，并测试它们相对于未包封的L.rhamnosus益生菌的吸水性。两个样品都保持在~30%相对湿度的湿润室中直至样品达到平衡质量。%质量变化表示由样品获得的水的量。两个样品的质量都具有30.4%的变化。结果表明，即使是疏水包装也不能防止水吸收。

应该理解，本发明不限于特别公开的实施方式及其中的实例。本发明的各种修正对本领域技术人员而言是显而易见的。在不背离所附权利要求的范围的情况下可以进行这样的改变和修正。

而且，每个引用的范围包括该范围的所有组合和子范围，以及其中包含的具体数值。另外，本申请引用或描述的每篇专利、专利申请、和公开的公开内容全部通过参考引入本申请。

Claims (12)

1.一种提供储存稳定的含益生菌的食品或饮料的方法，包括：

形成半渗透的微球体，该微球体包括益生菌、高分子量聚合物、和有效量的抑菌剂，

将所述微球体引入到相对高湿度的食品或饮料中，其中所述相对高湿度的食品具有大于10%的水的残留湿气水平，和

在消费前在无冷藏下储存所述食品或饮料至少6周。

2.权利要求1的方法，其中所述益生菌经历的菌群减少量为1log cfu或更少。

3.权利要求1的方法，其中所述高分子量聚合物是乙基纤维素。

4.权利要求1的方法，其中所述高分子量聚合物是藻酸盐。

5.权利要求1的方法，其中所述微球体在饮料中。

6.权利要求5的方法，其中所述饮料的pH小于5。

7.权利要求1的方法，其中所述微球体在相对高湿度的食品中，所述食品的残留湿气水平为大于20%的水，优选为大于30%的水，优选为大于40%的水，更优选为大于50%的水。

8.权利要求1的方法，其中所述微球体在相对高湿度的食品中，所述食品的水活性为大于0.6，优选为大于0.7，优选为大于0.8，更优选为大于0.9。

9.权利要求1的方法，其中所述相对高湿度的食品包括宠物食品，快餐食品，健康棒，和未熟的预包装混合物。

10.权利要求1的方法，其中所述微球体具有多层组分，条件是所述微球体不包括蜡。

11.权利要求1的方法，其中所述微球体的粒度小于500微米。

12.提供储存稳定的含益生菌的食品或饮料的方法，包括：

提供半渗透的微球体，该微球体包括益生菌、高分子量聚合物、和有效量的抑菌剂，

将所述微球体放进相对高湿度的食品或饮料中，其中所述相对高湿度的食品具有大于10%的水的残留湿气水平，和

使水进入所述微球体，其中在无冷藏下储存所述食品或饮料至少6周以后，所述益生菌经历的菌群减少为1.5log cfu或更少。