CN1031637A - 大量生产无类病毒和病毒马铃薯繁殖材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过组织培养大量生产无病毒和类 病毒的马铃薯繁殖材料的方法。用一种方法，即分离 马铃薯的苗尖组织细胞，在营养剂中体外培养，然后 透导生根，或者诱导微块茎形成。培养生根的植株成 母本植物，或者进一步诱导微块茎，由微块茎进一步 培养成母本植株。由这些苗或小块茎得到繁殖材料， 或者用微块茎体为繁殖材料。

Description

本发明涉及通过植物组织培养，大量繁殖无类病毒、无病毒马铃薯的方法。

马铃薯（solanum    tuberosum）是一种基本食物。为了提高其繁殖力、抗病力以及对于环境的适应力，曾做过大量的实验和实际工作。尽管如此，但至今还没有获得抗各种重要病害，同时具有其它优良特性的栽培品种。

尽管也能产生双倍体和单倍体马铃薯品系（Houglas，R.W.，Ploquin，S.J.，Gabert    A.C.：Effect    of    seed    parent    and    pollinator    on    frequency    of    haploids    in    solanum    tuberosum.Crop.Sci.4.593-595.（1964）），但是大多数的马铃薯栽培品种都可分为四倍体马铃薯亚种（Howard，H.W.：Genetics    of    the    potato（Solanum    tuberosum），Logos    Press，London（1970）126.P.）。

一般认为，为了得到最大繁殖力和生长率，马铃薯一定是杂合体。然而，利用同系配合减少等位基因间的杂合体特性，马铃薯苗的生长率却明显降低。

由于一些国家的生态条件，不能长期保存无病害的不同马铃薯栽培品种。因此，改良的目标就是利用野生的抗性品种作杂交材料，培殖出抗逆境，抗病原体的栽培品种。

但是，抗性的提高有限，因为对于马铃薯来说，所谓的“一步”传统法不行（使用这种方法获得新的所希望的特性也可通过保存其它有利特性产生）。

已经研究出几种方法，体外营养繁殖马铃薯，如Roca，W.M.Esponoza，N.O.，Roca，M.R.、和Bryan，J.E.等的“迅速繁殖马铃薯的组织培养方法”（Am    Potato    J.55.691-701（1978））;Goodwin，P.B.，Kim，Y.C.、Adisarwanto.T等的“利用茎尖培养繁殖马铃薯”（Potato    Res.23，9-23（1980））;Roest.S.和Bokelmann的“用于马铃薯（Slanum    tuberosum）的营养繁殖和诱变育种的体外不定芽技术Ⅰ，通过形成不定枝在体外进行营养繁殖”（Potato.Res.23.167-181（1980）;Hussey.G和Stacey.N.J.的“马铃薯（Solanum    tuberosum    L.）的体外繁殖”（Ann.Bot.48.787-796（1981）;Henszky.L.E.、Enyingi.K和SzaboⅠ等的“马铃薯（Solanum    tuberosum    L.）种质的长期保藏和繁殖的组织培养技术”（Plant    Cell    Culture    in    Crop.Improvement    S.K.Sen，K.L.Giles    ad.，Plenum    Press，New    York，London，（1983）9～18）。

这些方法基本上被推荐用来繁殖无病毒马铃薯品系。除了筛选外，还有另一种可供选择的可能性，即分离病毒感染的植株的分生组织细胞，并进行体外培养，生产无病毒品系（Morel，G.，Muller    J.F.：La    culture    in    vitro    du    méristéme    apicale    de    la    pomme    de    terre;Compt.R    End.258.5250-5252（1964）;Mellor，R.C.Stace-Smith，R：Virus-free    potatoes    by    tissue    culture，“Applied    and    Fundamental    Aspects    of    Plant    Cell，Tissue    and    Organ    Culture”，edit.：Reinert    J.and    Bajaj    Y.P.S.，Springer-Verlag，Berlin-New    York，（1977）615-637;Faccioli，G.;Rubies-Autonell，C：PVX    and    PVY    distribution    in    Potato    meristem-tips    and    their    eradication    by    the    use    of    thermotherapy    and    meristem-tip    culture，Phytopeth.Z.103，66-76（1982））。其原因是，由于某些生化过程的结果至今可以部分解释植物的分生组织细胞无病毒感染。

通过分生组织培养除去病毒和在体外进行营养繁殖是广泛使用的保藏马铃薯种的普遍方法。体外生产小的马铃薯，即所谓马铃薯微块茎，也是一种已知方法（American    Potato    Journal    59.33-37.（1982））。

在体外产生的马铃薯小植株的进一步栽培，可在暖房进行。用繁殖无病毒的母株进行单芽扦插也被广泛使用（Sunarjono，H.，Krisnawati，Y.：Potato    seed    multiplication    by    stem    cutting    I.The    influence    of    the    mother    plant    age    on    the    growth    and    yield    of    the    cutting.Bull.Penel，Hort.8（2）39-47（1980）;Goodwin，P.B.，Brown，G.：Field    performance    of    potato    shoot-tips    proliferated    in    culture.Potato    Res.23，449-452（1980）;Goodwin，P.B.：Rapid    propagation    of    potato    by    single    node    cuttings，Field    crops，Res.4，165-173（1981））。

为了通过组织培养产生马铃薯无性繁殖材料尽管做了各种努力，但仍没有解决大量而又经济效益地的生产马铃薯的问题。虽然有些部分结果有价值，但至今还没有得到一种综合系统，能够成功地用于大规模生产一种适宜的马铃薯繁殖材料，能够提供一种解决办法，生产不同的繁殖材料（即生根插条、微块茎，或小块茎）的需要。

现已发现，也是本发明的目的，通过下列组织培养的方法可以大量地生产无类病毒（和病毒）的马铃薯繁殖材料（即生根插条，微块茎和/或小块茎）：

分离发芽的马铃薯分生组织细胞（苗端组织），将这种分离出来的无类病毒和病毒的部分分开，培养在营养剂上，直至长出6～8个芽，不久它就会在营养剂中生根，或在芽上诱导发出微茎块;将体外生根的植株转移到花房，在此，作为割离的分生组织株系，将成为母本植物，或者，再次在体外生根的植株上诱发出微块茎，再从这些微块茎，从这些母株苗，或小块茎获得母本植株作为繁殖材料。或者用微块茎作繁殖材料，用影响母本植株的块茎素（patatin）合成导至幼苗或块茎的形成。

本发明所列举的方法可以应用，大量生产有经济效益的马铃薯繁殖材料，并且适于常年稳定供应繁殖材料。

分离分生组织细胞、培养和繁殖幼苗、生根以及微块茎的形成都是在实验室条件下进行的。从生根植物培养母本植株在花房中进行。从母本植株培养籽苗或小块茎在无媒介环境条件下在花房或试验田中进行。

按照本发明的第一步就是选择无病毒和类病毒的马铃薯品系。

在同样的栽培品种的马铃薯块茎上，可用例如赤霉素来诱导芽形成，然后将它放置在一个无光照的气侯箱中，该块茎将会发芽。大约三周以后，从5～10厘米长的芽上消毒条件下分离0.2～0.3毫米的芽尖。将所分离的芽尖一个一个繁殖在无菌营养剂中。这样每一个分生细胞将被作为一个单独的品系被处理和繁殖。除去病毒和类病毒的每一繁殖品系可用病毒学试验方法，即酶免疫测定（EIA）检验（J.gen.Virol.33.165-167（1976）;Revue    Suisse    Agric.11.253-265（1979）;J.gen.Virol.34.475-483（1977）;Noevényvédelem    15（8），354-358（1979）;Phytopath.Z.90.364-368（1977）;Phytopath.67.145-150（1977）。

为了长期繁殖，只有那些无各种马铃薯病毒和类病毒的分生组织品系可被使用。在开始体外繁殖后，可以用此方法达到几次检验无病毒的株系。

将经过满意检定和选择的分生组织培养在有营养物的Wassermann试管中，直到长有6～8个芽。营养剂的组成如下：

MS大成分    二分之一浓度

MS小成分

Inozit    100毫克/升

盐酸硫胺素    0.5毫克/升

盐酸吡哆醇    0.5毫克/升

烟酸    5毫克/升

甘氨酸    2毫克/升

叶酸    0.5毫克/升

生物素    0.05毫克/升

水解酪蛋白    500毫克/升

Ca-泛酸    2毫克/升

萘乙酸（Naphtylacetic    acid）    0.001毫克/升

蔗糖    1.5%

琼脂    0.8%

至于大成分和小成分，见Hurashige和Skoog的文章：Physiol.Plant    15.473-497（1962）。

将所长出的带有6～8个芽的分生组织植株水平放置在固体营养剂中，与上述情况相似（大成分为原来的浓度，3%蔗糖），轻轻地挤放到培养基中。用这一方法，所有将有可能开始起动。在这一时期，植物就可在体外繁殖。

对于生根来说，同样的营养剂可用于繁殖，只是没有琼脂。对于微块茎的形成，Hungarican的专利说明书183，978和187，396中所给的营养培养基也可以使用。在液体培养中，该苗块的芽迅速生出芽、生出根组织。10～12天之后，根分枝成束，可以立即取出。该植株上只有极小的叶子，这对于在花房种植它们非常有利。不管是为了获得生根苗还是微块茎，都可用已知方法施加影响（Annals    of    Botany    53.565-578（1984））。

在花房中，可将体外生根的植株培养在固体土壤上。

将生根植株成束置于土壤表面。为了保持土壤适当湿度，用薄金属片覆盖植物，控制光照。每天要对薄金属片下的植物通气。到第二周时，逐步去掉覆盖物，使植物适应花房环境条件。植物移栽三周后，就可以无覆盖而生长，这样就可用它们进行扦插。

至于植物的生长则不均一，只要适于直接用它们繁殖产籽苗就可以了。因此，这些植物可用作母株提供苗。

为了生产均一的籽苗材料，可将顶部插条（具有3至4个芽）在栽培木箱中生根。

插条带有1～2厘米长的叶子的幼菌。因为较老的苗将发育成块茎，不适合用它们培养生根籽苗。在覆盖的条件下籽苗生根，将它们在栽培木箱中培养两周，直至长出5～6片叶子。然后就可以将籽苗移栽到花房中，或在无传染媒介环境的试验田中。

从苗繁殖诱出的微块茎所得到的植株也可以用作母本植株。

将在花房中培养的籽苗以一种方式移栽到无传染媒介的地里，正好使籽苗的上部叶子露出地面。所有这些水平座植的植物地下芽都将发育成苗，以后发育成块茎。为了能控制变种和生育力的真实性，最好是按分生组织系将植物分别种植在无传染媒介环境中。这样就可能除去不好的品系，选择好的特性。

在试验田中的这种繁殖材料的进一步繁殖就可采用传统的农业方法进行。

如上所述，从亲本植株得到的插条可被移栽，以获得块茎。假如我们不希望得到块茎，而是进一步获得能提供插条的亲本植株，那么就必须抑制块茎的形成，才能增加其插条形成的能力。一旦开始形成块茎之后，插条就不再能有效生根。

现已发现，马铃薯块茎形成的诱导是与马铃薯开始合成块茎形成素（papatin）紧密相联的。叶子中开始的合成块茎形成素也就意味着块茎形成诱导作用的预兆。合成块茎形成素以及因此而来的块茎形成的诱导或抑制可以用酶偶联的块茎形成素抗血清测定。

基于控制块茎形成素合成，可以通过改变环境条件或者化学处理影响块茎的形成。可以通过降温或者是除去无机氮源（氨，硝酸盐）而代之用有机氮源尿素来诱导。

按照本发明所公开的具体方法之一，可以诱导实验苗的块茎形成，从而在体外得到具有几个毫米直径的微块茎。这些微块茎非常便于作为繁殖材料。与季节苗的生产相反，该微块茎可以一年四季稳定生产，而且能够以小体积藏在冰箱。

然而，微块茎也有不利的一面，它们的密度疏松，极易萎缩和受到损伤。这些缺点可以通过用一种保护层，包被体外产生的块茎而消除，从而防止它们的萎缩，防止机械损伤。这些包被的块茎适合用插种机进行播种。

本方法如下：从培养瓶中取出微块茎后，一定要除去茎残余物，然后将块茎彻底冲洗后干燥。可以在一有1～2层的浅盘中，温度为20℃、湿度为40%的条件下干燥大约两周。干燥一直要进行到块茎的最初体积减少三分之一为止。然后用已知方式包裹块茎（0.5～0.6mm）形成颗粒化。可以采用包裹种子时所用的常规方法进行颗粒化。被包裹的块茎经干燥后，于2～5℃下保藏。在该方法的实践过程中，还没有发现自发的遗传变化。

下面的例子非限定性的说明了本发明。

实例1

无病毒培育原种的生产及栽培品种的体外保藏

用10%次氯酸钠和0.1%湿润剂的溶液洗涤10个“Somogy    gyongye”马铃薯块茎，用于洗擦。将它们浸泡在同样的溶液中30分钟。经消毒之后，用无菌蒸馏水将该块茎洗涤三次，干燥。为了促进发芽，将该块茎放在10毫克/升的GA-3（赤霉素）溶液中浸泡30分钟，然后再干燥。让它在温度为5℃、相对湿度为70～80%、无光照的气温箱中发芽18～22天，直至长出4～6厘米长的苗。用块茎和苗将培养物标记和记录。

将切下的苗在4%次氯酸钠溶液中灭菌，然后用无菌蒸馏水洗涤三次。再在显微镜下用锋利的柳叶刀切下苗尖，将它置于上面详述的营养培养基。将一个苗尖分生组织放在试管中，它在温度为20～22℃、光强度为500勒的条件下开始生长3～4周。在生长营养基上方的光照强度增加到2000勒，在6～8周发育成有5～7片叶子的小植株。

从试管中取出植株，放在上面提到过的一种营养基上，只是蔗糖的浓度必须增加至3%。含40毫升营养培养基的标准螺旋盖瓶（400毫升）非常合乎这一目的（1株/瓶）。在20～22℃以及3000勒光波度的条件下，所有的芽将在6～8周长出，在瓶中长成4～8厘米的苗。此时必须首先控制除去病毒。

被病毒感染的品系通过进一步培养而被消除，将合格的苗切成有1～2个芽的块，置于另外的培养瓶，按上述方法培养。在每一次的移植周期中，必须进一步控制至少三次，从而使无病毒的品系繁殖。使用上面详述的方法，就可以从每一品系大量地生产该植物。

实例2

生产微块茎

将按实例1生产的植株在上面所提到的不含营养剂（液体）中进一步培养（22℃，3000勒），培养植物的瓶按植株编号。大约三周之后，必须用另一种营养剂更换瓶中的营养剂，以促进块茎形成素合成。这种营养剂不同于其他营养剂，它含有10毫克/升的苯基-腺嘌呤，10毫克/升的香豆素和8%的蔗糖，但只有原量10%的无机氮源。在17℃，1000勒下培养10～12周。这时，可发育出40～60个直径为0.3～0.6厘米的微块茎。打开瓶子，干燥植物，取出块茎，在室温下放置一周，随后在黑暗和干燥的地方于+2～4℃保藏。

实例3

亲本植株和籽苗的生产

将按实例1所生产的植株以松散成束移栽到花房有泥炭和珍珠岩的混合物的土壤中（500～750个植物/米）。土壤保持在20℃，室温在24℃为了保证湿度，用薄金属片覆盖地面。培养物可能在2～4周内适应花房条件：植物越来越健壮，将发育出7～8片叶子。这就是亲本植物，通过喷洒0.2%Mikramid的人造肥料溶液阻止块茎素的合成，从而抑制块茎的形成。从这种亲本植株可以再次获得具有4～5片叶子的顶端苗，生根后就可进行培养，或者作为马铃薯籽苗投放市场。从每一个培养瓶中可以得到80～100个籽苗。

实例4

小块茎的生产

用实例2的微块基，或从实例3的籽苗在暖房或隔离器中，生产小块茎。播种或栽植在含有0.5千克/米³的尿素人造肥料的泥炭和珍珠岩的混合土中，（400个植株/米）。

必须在自然温度和光照条件下给植株浇水，以满足它们的需要。营养物的供给可以通过叶子进行。八周后，必须使用一种生长调节剂-氯-胆碱-氯化物阻止叶子的生长，并停止浇水。播种后85～90天可得到3～4个小块茎（原种）（直径0.5～2.0厘米）。

Claims (8)

1、通过组织培养大量生产无病毒和类病毒的马铃薯繁殖材料的方法，其特征在于分离马铃薯苗尖组织的发芽细胞，体外培养在营养剂中繁殖，得到的苗在营养剂中生根，或在苗上诱导块茎形成，将体外生根植株移载到花房，培养成亲本植株，或者将体外生根的植株诱导块茎形成，如果需要的话，从微块茎，培养成亲本植株，从亲本植株得到籽苗或小块茎的繁殖材料，或者用得到的微块茎作为繁殖材料，籽苗和块茎形成，可通过影响亲本植株块茎素合成进行控制。

2、如权利要求1所述的生产微块茎作为繁殖材料的方法，其特征在于直接或试管生根的体外繁殖所得的苗，可以诱导块茎形成。

3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于得到的微块茎繁殖材料用保护层包被。

4、如权利要求1所述的生产用作繁殖材料的马铃薯籽苗的方法，其特征在于体外繁殖得到的苗可在营养剂中体外生根，然后移栽到花房，因此得到亲本植株的繁殖材料，同时，亲本植株块茎素的合成受到阻止。

5、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于可通过环境条件，或者使用化学处理影响块茎素的合成。

6、如权利要求1所述的生产作为繁殖材料的马铃薯小块茎的方法，其特征在于在从体外生根所培养的亲本植株，或微块茎，可以诱导块茎形成。

7、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于从母本植株得到的苗，可以进一步培养母体植株。

8、如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于是在无病毒和类病毒的环境条件下生产马铃薯繁殖材料。