CN103163114B - 一种血清蛋白浓度测定荧光传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于传感器制备技术领域，特别涉及一种血清蛋白浓度测定荧光传感器及其制备方法。本发明采用超分子层层组装的方法，利用静电引力将带正电的纳米水滑石层板和带负电的赤藓红客体分子复合成为薄膜，将其用于血清蛋白浓度测定，其检测范围为5-90μg/ml，检测限为2.51μg/ml，检测时间为10-20s。与传统的检测方法相比，本发明制备的传感器在血清物质中对血清蛋白的选择性高，并在一定范围内呈现出线性关系，检测时间短，检测范围宽，适用范围广，成本低廉，简捷实用，易实现量产。检测过程中该传感器不污染待测体系，且无试剂损耗；检测完成后，通过油酸钠竞争结合大分子蛋白，实现传感器对大分子蛋白的解吸附，从而实现传感器的再生和重复使用。
Description
技术领域
本发明属于传感器制备技术领域，特别涉及一种血清蛋白浓度测定荧光传感器及其制备方法。
背景技术
在生物检测领域，血清蛋白含量变化与血液稀释、营养不良、慢性消耗性疾病、肝蛋白合成功能障碍等各种病因引起的蛋白丢失相关，因此，高效快捷检测血清蛋白浓度的手段是生物化学领域研究的热门课题。目前应用于蛋白检测的常规方法主要包括以下三种：基于蛋白质元素组成特点的凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、胶体金法；基于蛋白质化学显色反应的考马氏亮蓝法、银染法；基于蛋白质的光吸收特性紫外分光光度法、荧光法。这些常规方法当中，检测速度最快的需要5-10分钟（紫外吸收法），检测灵敏度最高为2μg（考马斯亮蓝法），而且几种方法对血清蛋白的检测的选择性均不高。根据医疗事业的发展需要，更为快速、高效、操作便捷的检测蛋白浓度的方法是近年来医疗、分析领域研究的方向。
荧光传感器因其灵敏度高、可采集信号丰富及使用方便等优点而倍受关注，近年来得到了迅速的发展。荧光传感器主要分为两类，一类是在溶液中使用的均相荧光传感器，另一类是薄膜荧光传感器。后者可以重复使用且能进行气相传感，因而成为近年来的研究焦点。
双金属复合氢氧化物又称为水滑石(LayeredDoubleHydroxides,简写为LDHs)，是一种新型多功能无机层状材料，有较强的抗热性能，且化学稳定性良好，在药物的缓释、催化、阻燃、光化学等领域有广泛的应用。LDHs层板带有正电荷，可作为超分子组装的材料，应用于荧光传感器领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用超分子自组装的方法制备荧光传感器，并实现了对血清蛋白浓度很好的荧光响应。
本发明利用水滑石剥层后层板带正电荷，客体分子赤藓红带有负电荷，水滑石层板与客体分子赤藓红通过静电引力层层自组装形成超分子结构体系后制备成膜，最后考察薄膜传感器对不同浓度血清蛋白的快速（10-20s）荧光响应。
本发明所述的血清蛋白浓度测定荧光传感器的制备方法为：
1).制备水滑石前体，所述水滑石前体的化学式为Mg1-xAlx(OH)2(NO3)x·mH2O，其中0.2≤x≤0.33，m为结晶水数量，取值范围为0.5-9；
2).取步骤1)中制备的水滑石前体0.10-0.13g，加入装有100-130ml甲酰胺的烧瓶中，在N2保护下搅拌反应40-50h，离心后得到剥层后的水滑石层板胶体溶液；
3).配制浓度为1×10-5-3×10-5mol/L的赤藓红B钠盐的水溶液，用NaOH调节pH值为7-7.5后，避光保存在容量瓶中；
4).将石英片用体积比为7:3的浓H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超声2-4次，每次15-25min，得到表面富含羟基的石英片，然后将其置于步骤2)制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡18-22min进行预组装，取出后用去离子水冲洗并在室温下吹干；
5).将步骤4)得到的石英片放入步骤3)配置的赤藓红B钠盐的水溶液中浸泡8-12min，取出后用去离子水清洗并在室温下吹干；然后置于步骤2)制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡8-12min，取出后去离子水清洗并在室温下吹干；
6).重复步骤5)，25-27次，得到组装26-28层的复合薄膜，即为血清蛋白浓度测定荧光传感器。
所述的水滑石前体采用共沉淀法、成核/晶化隔离法、非平衡晶化法、离子交换法或水热合成法制备。
将上述制备的血清蛋白浓度测定荧光传感器应用于血清蛋白浓度的测定，检测范围为5-90μg/ml，检测限为2.51μg/ml，检测时间为10-20s；检测完成后，将其静置在浓度为250-320μg/ml的油酸钠的水溶液中80-100s，实现血清蛋白浓度测定荧光传感器的再生，可重复用于血清蛋白浓度的检测。
上述血清蛋白浓度测定荧光传感器可重复使用6-10次。
本发明的优点在于：本发明所制备的血清蛋白浓度测定荧光传感器检测范围为5-90μg/ml，检测限为2.51μg/ml，检测时间为10-20s；与传统的检测方法相比，该传感器在血清物质中对血清蛋白的选择性高，并在一定范围内呈现出线性关系，检测时间短，检测范围宽，适用范围广，成本低廉，简捷实用，易实现量产。组成该传感器的水滑石层板稳定、无毒，生物相容性良好，与聚合物载体相比不易老化，保存时间长；而且水滑石层板可以保持客体赤藓红分子最大程度的分散，有效阻止因客体分子团聚导致的荧光淬灭现象，从而保持赤藓红分子的光学稳定性和热稳定性，并显著提高其pH适用范围；检测过程中该传感器不污染待测体系，且无试剂损耗；检测完成后，通过油酸钠竞争结合大分子蛋白，实现传感器对大分子蛋白的解吸附，从而实现传感器的再生和重复使用。
附图说明
图1为实施例1中Mg2Al(OH)6(CO3)·6H2O水滑石和Mg2Al(OH)6(NO3)·6H2O水滑石前体的X射线粉末衍射图；其中横坐标为2θ值，单位：度；纵坐标为强度；A为Mg2Al(OH)6(CO3)·6H2O水滑石，B为Mg2Al(OH)6(NO3)·6H2O水滑石前体。
图2为实施例1步骤6中得到的复合薄膜的紫外-可见光吸收图谱；其中横坐标为波长，单位：nm，纵坐标为吸收强度；内部小图为不同组装层数的薄膜在545nm吸收强度值的线性图，横坐标为复合薄膜的组装层数，纵坐标为545nm处的吸收强度。
图3为实施例1制备的血清蛋白浓度测定荧光传感器对不同浓度的牛血清蛋白溶液荧光响应值图；其中横坐标为波长，单位：nm；纵坐标为荧光值；从上至下牛血清蛋白浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140μg/ml的溶液的荧光响应值图。
图4为实施例1制备的血清蛋白浓度测定荧光传感器对不同浓度的牛血清蛋白溶液荧光响应值线性图；其中横坐标为浓度，单位：μg/ml，纵坐标为荧光值。
图5为实施例1中吸附有血清蛋白的血清蛋白浓度测定荧光传感器在油酸钠溶液中不同时间的荧光值；其中横坐标为波长，单位：nm；纵坐标为荧光值，从下至上分别为静置5s、30s、60s、90s的荧光响应曲线。
图6为实施例1制备的血清蛋白浓度测定荧光传感器重复检测牛血清蛋白溶液浓度的荧光值图，BSA浓度为70μg/ml，油酸钠的水溶液浓度为300μg/ml，横坐标为重复次数，纵坐标为荧光强度。
图7为实施例1制备的血清蛋白浓度测定荧光传感器对不同血清物质溶液的荧光响应相对变化值的柱状图；其中横坐标为溶液类型，从左到右依次为30μg/ml的BSA、葡萄糖、镁离子、半胱氨酸、钙离子、亮氨酸、铜离子、丝氨酸的溶液；纵坐标为荧光响应相对变化值，即变化值与初始荧光值的比值。
具体实施方式
实施例1
1.制备水滑石前体：称取5.128gMg(NO3)2·6H2O、3.7513gAl(NO3)3·9H2O和6.006g尿素溶于100ml去离子水中配制成盐溶液，然后转入高压反应釜中，110℃反应12h，将产物离心、洗涤，得化学式为Mg2Al(OH)6(CO3)·6H2O的水滑石；取所得水滑石1g加入200ml除去CO2的水中，搅拌1h溶胀，然后加入硝酸钠溶液搅拌0.5h，所述硝酸钠溶液为127gNaNO3溶于300ml去CO2的水中配制而成；然后用移液枪缓慢加入350μl浓硝酸，搅拌48h后，用乙醇离心两次，得Mg2Al(OH)6(NO3)·6H2O水滑石前体；
2.取步骤1中制备的Mg2Al(OH)6(NO3)·6H2O水滑石前体0.10g，加入装有100ml甲酰胺的烧瓶中，在N2保护下搅拌反应40h，离心后得到剥层后的水滑石层板胶体溶液；
3.配制浓度为10-5mol/L的赤藓红B钠盐的水溶液，用NaOH调节pH值为7.2后，避光保存在容量瓶中；
4.取3cm×1cm大小的石英片，用体积比为7:3的浓H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超声2次，每次15min，得到表面富含羟基的石英片，然后将其置于步骤2制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡18min进行预组装，取出后用去离子水冲洗并在室温下吹干；
5.将步骤4得到的石英片放入步骤3配置的赤藓红B钠盐的水溶液中浸泡8min，取出后用去离子水清洗并在室温下吹干；然后置于步骤2制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡8min，取出后去离子水清洗并在室温下吹干；
6.重复步骤5，25次，得到组装26层的复合薄膜，即为血清蛋白浓度测定荧光传感器。
由UV-vis、XRD、荧光谱图可知，成功组装成规则有序的复合薄膜。
血清蛋白浓度测定荧光传感器性能测试：
（1）对不同浓度牛血清蛋白溶液的荧光响应值变化：
将所制得血清蛋白浓度测定荧光传感器置于液体池中，加入1.990ml蛋白缓冲溶液，检测其初始荧光值；用微量进样器量取配置好的牛血清蛋白溶液（BSA）10μl使液体池中BSA浓度达到5μg/ml，考察其荧光图谱变化并记录；然后依次测量BSA浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml的溶液，考察其荧光图谱变化并记录。由荧光图谱可以看出，加入牛血清蛋白后，荧光值明显减弱，并在一定范围内呈现出线性关系。
（2）对不同血浆物质的溶液的荧光值响应值变化：
将所制得血清蛋白浓度测定荧光传感器置于液体池中，加入1.990ml去离子水溶液，检测其初始荧光值。用微量进样器量取配置好的牛血清蛋白溶液10μl使液体池中血清蛋白浓度达到30μg/ml，考察其荧光图谱变化并记录。
重复上述步骤，分别测量30μg/ml的葡萄糖、镁离子、半胱氨酸、钙离子、亮氨酸、铜离子和丝氨酸的溶液，考察其荧光图谱变化并记录。
通过荧光图谱的变化可以看出，该血清蛋白浓度测定荧光传感器对牛血清蛋白有很好的选择性，并在一定范围内呈现出线性关系。
（3）传感器的再生和重复使用：
血清蛋白浓度测定荧光传感器在检测过牛血清蛋白溶液后，会导致薄膜表面吸附上大分子蛋白（吸附的BSA浓度为90μg/ml），将其静置在油酸钠的水溶液（300μg/ml）中，考察其荧光信号随浸泡时间的变化，由图4可以看出，随着浸泡时间的延长（5s到90s），薄膜的荧光信号增强，90s后恢复，表明吸附上BSA分子的薄膜在油酸钠的水溶液中发生了解吸附，即油酸钠分子在与传感器薄膜竞争结合BSA的过程中占优势，因此使用油酸钠实现了薄膜检测血清蛋白浓度的再生。
将上述再生的血清蛋白浓度测定荧光传感器检测BSA（70μg/ml）溶液浓度，其荧光值依然有明显下降，且与第一次测量后荧光值相近，如此可循环使用6-7次。
实施例2
1.同实施案例1；
2.取步骤1中制备的Mg2Al(OH)6(NO3)·6H2O水滑石前体0.11g，加入装有110ml甲酰胺的烧瓶中，在N2保护下搅拌反应45h，离心后得到剥层后的水滑石层板胶体溶液；
3.配制浓度为2×10-5mol/L的赤藓红B钠盐的水溶液，用NaOH调节pH值为7.5后，避光保存在容量瓶中；
4.取3cm×1cm大小的石英片，用体积比为7:3的浓H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超声3次，每次20min，得到表面富含羟基的石英片，然后将其置于步骤2制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡20min进行预组装，取出后用去离子水冲洗并在室温下吹干；
5.将步骤4得到的石英片放入步骤3配置的赤藓红B钠盐的水溶液中浸泡10min，取出后用去离子水清洗并在室温下吹干；然后置于步骤2制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡10min，取出后去离子水清洗并在室温下吹干；
6.重复步骤5，26次，得到组装27层的复合薄膜，即为血清蛋白浓度测定荧光传感器。
实施例3
1.同实施案例1；
2.取步骤1中制备的Mg2Al(OH)6(NO3)·6H2O水滑石前体0.13g，加入装有130ml甲酰胺的烧瓶中，在N2保护下搅拌反应50h，离心后得到剥层后的水滑石层板胶体溶液；
3.配制浓度为3×10-5mol/L的赤藓红B钠盐的水溶液，用NaOH调节pH值为7后，避光保存在容量瓶中；
4.取3cm×1cm大小的石英片，用体积比为7:3的浓H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超声4次，每次25min，得到表面富含羟基的石英片，然后将其置于步骤2制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡22min进行预组装，取出后用去离子水冲洗并在室温下吹干；
5.将步骤4得到的石英片放入步骤3配置的赤藓红B钠盐的水溶液中浸泡12min，取出后用去离子水清洗并在室温下吹干；然后置于步骤2制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡12min，取出后去离子水清洗并在室温下吹干；
6.重复步骤5，27次，得到组装28层的复合薄膜，即为血清蛋白浓度测定荧光传感器。
Claims (2)
1.一种血清蛋白浓度测定荧光传感器测定血清蛋白浓度的应用，其特征在于，该血清蛋白浓度测定荧光传感器的检测范围为5-90μg/ml，检测限为2.51μg/ml，检测时间为10-20s；检测完成后，将其静置在浓度为250-320μg/ml的油酸钠的水溶液中80-100s，实现血清蛋白浓度测定荧光传感器的再生，可重复用于血清蛋白浓度的检测；
所述的血清蛋白浓度测定荧光传感器的制备方法为：
1).制备水滑石前体，所述水滑石前体的化学式为Mg1-xAlx(OH)2(NO3)x·mH2O，其中0.2≤x≤0.33，m为结晶水数量，取值范围为0.5-9；
2).取步骤1)中制备的水滑石前体0.10-0.13g，加入装有100-130ml甲酰胺的烧瓶中，在N2保护下搅拌反应40-50h，离心后得到剥层后的水滑石层板胶体溶液；
3).配制浓度为1×10-5-3×10-5mol/L的赤藓红B钠盐的水溶液，用NaOH调节pH值为7-7.5后，避光保存在容量瓶中；
4).将石英片用体积比为7:3的浓H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超声2-4次，每次15-25min，得到表面富含羟基的石英片，然后将其置于步骤2)制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡18-22min进行预组装，取出后用去离子水冲洗并在室温下吹干；
5).将步骤4)得到的石英片放入步骤3)配置的赤藓红B钠盐的水溶液中浸泡8-12min，取出后用去离子水清洗并在室温下吹干；然后置于步骤2)制备的水滑石层板胶体溶液中浸泡8-12min，取出后去离子水清洗并在室温下吹干；
6).重复步骤5)，25-27次，得到组装26-28层的复合薄膜，即为血清蛋白浓度测定荧光传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的水滑石前体采用共沉淀法、成核/晶化隔离法、非平衡晶化法、离子交换法或水热合成法制备。
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