CN103160542A

CN103160542A - 一种山豆根生物脱毒方法

Info

Publication number: CN103160542A
Application number: CN2013100933362A
Authority: CN
Inventors: 钱利武; 张毅; 马玲; 周国勤
Original assignee: ANHUI INSTITUTE OF MATERIA MEDICA
Current assignee: ANHUI INSTITUTE OF MATERIA MEDICA
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2013-06-19

Abstract

一种山豆根生物脱毒方法，以山豆根药材为原料，其特征是将山豆根药材粉末与麸皮、豆粉均匀混合，加入适当水分，经灭菌、冷却后接入培养成熟的ATCC13273菌液，于25-35℃发酵培养5-8天，发酵液经稀酸渗滤，注入大孔树脂柱，经水和30%乙醇洗脱去杂后，以60%乙醇洗脱，洗脱液浓缩蒸干得减毒产物。或者自山豆根药材粉末中先提取总碱提取物，然后以总碱提取物为底物，以少量乙醇溶解后添加到培养成熟的ATCC13273菌液中，每升菌液中添加量为3-5g，于25-35℃发酵培养5-8天，发酵产物经乙醇回流提取、过滤分离和减压浓缩蒸干得减毒产物。

Description

一种山豆根生物脱毒方法

一、技术领域

本发明涉及降低植物中草药毒性的方法，具体涉及一种利用微生物对天然有毒山豆根整体或总碱提取物进行生物脱毒，以获得减毒持效的山豆根总碱提取物。

二、背景技术

山豆根系豆科槐属植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根及根茎，具有清热解毒、消肿止痛的功效，为治疗咽喉肿痛之要药。临床常用于治疗咽喉及牙龈肿痛、温热黄疸、心律失常、肝炎肝癌等疾病（黄兆胜，中药学，人民卫生出版社，2002:113）。现代植物化学研究显示山豆根中含有生物碱、黄酮、三萜类、多糖、酚类、有机酸等多种活性成分，其中生物碱类既是山豆根的功能成分也是毒性成分。山豆根的毒性主要表现为胃肠道反应、神经毒性反应、过敏反应等，中毒后出现恶心、呕吐、肌肉痉挛、全身抽搐、呼吸衰竭直至死亡。

如何发挥山豆根在临床上的疗效，同时降低毒性所带来的不良反应，成为众多药学专家和学者关注的焦点。已有报道的解毒方法不是很多，主要有通过中药配伍解毒，山豆根与生甘草合用可以减轻毒性，但不能消除对肠胃的不良反应，制约着山豆根的临床应用。

微生物转化是通过微生物细胞对外源性物质进行结构修饰，即利用微生物在代谢过程中产生的单一或一系列酶系对外源性物质进行的催化反应。以微生物为代谢模型，考察药物在生物体内发生的化学反应，已在药物代谢研究中得到了广泛的应用，其优点是：微生物与人体代谢相似性较高；微生物来源广泛、种类繁多；催化过程易于调控；可节省大量实验动物、降低药物研究成本。微生物转化实质上为有机合成的一种，具有反应条件温和、环境友好、处理简便、成本低廉等优点，已成为新药创制的一个重要途径。目前，山豆根总碱的微生物脱毒研究尚未见报道。

三、发明内容

本发明针对现有减毒技术的不足，旨在提供一种利用微生物对山豆根进行脱毒的方法，所要解决的技术问题是遴选微生物并确立脱毒的工艺条件。

山豆根脱毒（亦称减毒）其实质是对其活性成分（即山豆根总碱提取物简称总碱提取物）进行脱毒，因此本脱毒方法有两种，一是以山豆根药材为原料进行脱毒处理，然后提取出总碱提取物；二是首先提取出山豆根药材中的总碱提取物，然后以该提取物为原料进行脱毒处理。两种方法的最终目标是得到减毒的活性产物（简称减毒产物）。

本发明遴选的微生物为灰色链霉菌Streptomyces griseus ATCC13273，保藏于美国模式菌种保藏中心（简称ATCC）。

以山豆根药材为原料的脱毒方法，包括以下步骤：

1、将山豆根药材粉碎后过至少40目筛，与麸皮、豆粉按质量比10-20：2-5：1-3混合均匀。

2、在混合粉料（下简称粉料）中加入粉料重量70-90%的蒸馏水，搅拌均匀后装瓶密封，121℃、0.14MPa下灭菌20min，冷却后在无菌条件下接入培养成熟的ATCC13273菌液于25-35℃发酵培养5-8天，菌液接种量为粉料质量的1-3%。

3、培养结束后加入20倍量的5%（质量百分浓度，下同）盐酸渗滤，渗滤液装入732型阳离子交换树脂柱，依次用水和30%乙醇（质量百分浓度，下同）洗脱去杂，经60%乙醇洗脱，洗脱液浓缩蒸干得减毒产物。

以山豆根总碱提取物为原料的脱毒方法，包括山豆根总碱的提取和总碱提取物的脱毒，所述的山豆根总碱的提取是山豆根药材粉末经17倍量0.5%盐酸水溶液渗漉，渗漉液过滤并载入732型阳离子交换树脂柱，依次用水及30%乙醇溶液洗脱除杂，然后以6%（质量百分浓度，下同）氨醇溶液洗脱总生物碱成分，洗脱液减压蒸馏回收氨醇液得山豆根总碱提取物。所述的总碱提取物的脱毒是以山豆根总碱提取物为底物，以少量乙醇溶解后添加到培养成熟的ATCC13273菌液中，每升菌液中添加量为3-5g，于25-35℃发酵培养5-8天。发酵产物经乙醇回流提取、过滤分离和减压浓缩蒸干得减毒产物。

本发明利用微生物对山豆根粉末或总碱提取物进行生物转化，实现减毒增效或持效的效果，有利于山豆根植物资源的开发和利用。

四、具体实施方式

在无菌条件下将保藏在4℃的ATCC13273菌种（由中国药科大学余伯阳教授惠赠）由斜面转接到PDA液体培养基（配方为：200g去皮马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，无水MgSO₄0.73g，维生素B₁10mg），培养温度为28℃，培养2天成为种子液，每mL种子液中菌体不少于1.0×10⁸个。种子液再转接到新鲜的PDA培养基中，每升培养基转接种子液10ml，培养2天至菌体不再明显增加时即得培养成熟的菌液。

实施例1：

称取山豆根粉碎后过60目筛药粉2kg，与小麦麸皮0.5kg、黄豆粉0.3kg均匀混合，加入2.4kg蒸馏水，置容器内采用高压灭菌，条件为121℃，0.14MPa，灭菌20min，冷却至30℃左右时，接种占混合干物料1%的ATCC13273菌液，添加1.8L无菌水，在无菌条件下均匀混合。固体发酵培养温度为30℃，时间为5天；培养结束后20倍量的5%稀盐酸液渗滤，渗滤液装入732型阳离子交换树脂柱，依次用水和30%乙醇洗脱去杂，经60%乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液浓缩蒸干得减毒产物0.17kg。

实施例2：

称取山豆根粉碎后过60目筛药粉2kg，经17倍量0.5%盐酸水溶液渗漉，渗漉液过滤并载入732型阳离子交换树脂，依次用水及30%乙醇溶液洗脱除杂，然后以6%氨醇溶液洗脱总生物碱成分，最后减压回收氨醇液得山豆根总碱提取物。总碱提取物以乙醇溶解，添加到培养成熟的ATCC13273菌液中混匀。每升菌液加总碱提取物4g。液体发酵温度为28℃，时间为7天；发酵产物经乙醇回流充分溶解后，滤除菌体，滤液减压浓缩得山豆根发酵减毒产物0.18kg。

为便于理解本发明的理解，下面提供山豆根总碱和总碱减毒产物的急性毒性和抗炎活性研究资料。

实验例1急性毒性研究

取实验所需健康昆明小鼠140只，适应性饲养7d后，按体质量、性别分层随机法分为山豆根总碱组、空白菌体组、实施例1组、实施例2组，受试起始剂量为0.4g/kg，等比级数为1：0.76，总碱组、实施例1和例2组设置四个给药剂量，每个剂量10只，另设阴性对照组给予等容积生理盐水。禁食(不禁水)12h后，各组均按10mL/kg一次性尾静脉注射，给药后记录动物的即时反应并连续观察7d，记录动物毒性出现时间及恢复时间、死亡情况。

表1半数致死量及置信区间（单位：g/kg）

结果显示总碱减毒组的毒性弱于原药组，实施例1组和2组为ATCC13273的转化产物，对小鼠的急性毒性明显减小。其中，提取物的液体发酵产物减毒效果要优于粉末固体发酵。

实验例2小鼠腹腔毛细血管通透性研究

选取雄性昆明小鼠60只，18g～22g，随机分组，每组10只，设置生理盐水组、吲哚美辛组原药组及2个减毒组，尾静脉注射给药。

表2小鼠腹腔毛细血管通透性实验

结果表明ATCC13273减毒产物均有抑制小鼠腹腔毛细血管通透性活性，同一菌种的固体发酵减毒组分和液体发酵组分的抗炎活性无明显变化。ATCC13273减毒组明显优于原药组，提示减毒产物中可能出现了新的抗炎成分。

Claims

1.一种山豆根生物脱毒方法，以山豆根药材为原料，其特征在于包括以下步骤：

（1）将山豆根药材粉碎后过至少40目筛，与麸皮、豆粉按质量比10-20：2-5：1-3混合均匀；

（2）向粉料中加入粉料重量70-90%的蒸馏水，搅拌均匀后装瓶密封，121℃、0.14MPa下灭菌20min，冷却后在无菌条件下接入培养成熟的ATCC13273菌液于25-35℃发酵培养5-8天，菌液接种量为粉料质量的1-3%；

（3）培养结束后加入20倍量的5%盐酸渗滤，渗滤液装入732型阳离子交换树脂柱，依次用水和30%乙醇洗脱去杂，经60%乙醇洗脱，洗脱液浓缩蒸干得减毒产物。

2.一种山豆根生物脱毒方法，包括山豆根总碱的提取和总碱提取物的脱毒，其特征在于：

所述的总碱提取物的脱毒是以山豆根总碱提取物为底物，以少量乙醇溶解后添加到培养成熟的ATCC13273菌液中，每升菌液中添加量为3-5g，于25-35℃发酵培养5-8天，发酵产物经乙醇回流提取、过滤分离和减压浓缩蒸干得减毒产物。