CN103157099B - 一种用于血管外膜快速消化的混合酶消液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种用于血管外膜快速消化的混合酶消化液，其特征在于：所述的混合酶消化液由消化液和中止液混合而成，消化液和中止液两者的摩尔体积比为1∶10-20；10mL消化液中含有如下成分：胰蛋白酶12.5-13.0mg，2型胶原酶8-22mg，甘油2.5-3.5g，氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，余量为双蒸馏水；100mL中止液中含有如下成分：白蛋白0.8-2.2g，氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g，磷酸氢二钠200-250mg和氢化可的松20-22mg，余量为双蒸馏水。本发明用廉价的胰蛋白酶部分替代胶原酶以降低费用，在中止液中加入白蛋白成分以中止酶消反应，同时改用甘油PBS作为溶剂，实现消化液成分在-20度下的液态保存，避免反复冻融导致的消化酶活性的降低，将能为构建外膜损伤的动物模型以及制备无外膜的血管组织提供稳定可靠的混合酶消化液。
Description
技术领域
本发明涉及的医学技术领域，具体地说是一种用于血管外膜快速消化的混合酶消液及其制备方法。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性血管疾病已成为威胁国人健康的″头号杀手″，随着我国经济的发展，发病率呈逐年上升趋势，我国每年用于该类疾病的医疗费用高达千亿元人民币，加强AS性血管疾病及其并发症的防治已成为我国重大疾病防治的主要任务。
但其具体的发病机制目前仍不清楚，既往认为血管内膜是其首发的病理环节，但近期的大量研究表明：在血管内膜病变还未发生时，外膜即已经出现病理性改变，表现为新生血管的大量增生、炎症细胞的浸润等，因此迫切需要一种稳定的经血管外膜诱导的AS动物模型应用于相关研究，现有的诱导血管外膜病变的动物模型多采用化学腐蚀、物理损伤和生物酶消的方法，与前两种方法相比生物酶消具有可控性强，实验操作重复性好，很少诱导血管发生假性动脉瘤等优点，从而日益成为相关研究的首选方法。
此外近年来血管移植研究的深入，特别是无细胞组织支架的提出，提示以除去血管外膜的动脉血管为基础制备无细胞血管组织可能是将来组织工程修复的重要手段，无疑也推动了对去外膜血管特别是动脉血管的需求，但由于血管外膜组织的存在，通过人工显微外科的方法去除外膜存在操作损伤大、耗时长、成本高等诸多问题，也迫切需要一种方便快捷的血管外膜消化液。
生物酶消的方法大多基于胶原酶消化和部分的显微外科操作，但该方法存在耗费2型胶原酶量大、费用高的缺点，同时由于该体系不含有其他胶体成分，因此整体胶体渗透压较低，易发生术中血管组织脱水和术后血管内凝血等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的用于血管外膜快速消化的混合酶消液及其制备方法，它可克服现有技术中人工显微外科的方法去除外膜存在操作损伤大、耗时长、成本高，而现有的生物酶消的方法大多基于胶原酶消化和部分的显微外科操作，但该方法存在耗费2型胶原酶量大、费用高的缺点，同时由于该体系不含有其他胶体成分，因此整体胶体渗透压较低，易发生术中血管组织脱水和术后血管内凝血等缺点的一些不足。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种用于血管外膜快速消化的混合酶消化液，其特征在于：所述的混合酶消化液包括消化液和中止液，消化液和中止液两者的摩尔体积比为1∶10-20；
其中，10mL消化液中含有如下成分：胰蛋白酶12.5-13.0mg，2型胶原酶8-22mg，甘油2.5-3.5g，氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，余量为双蒸馏水；
100mL中止液中含有如下成分：白蛋白0.8-2.2g，氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g，磷酸氢二钠200-250mg和中短效糖皮质激素4-22mg，余量为双蒸馏水。
一种用于血管外膜快速消化的混合酶消化液的制备方法，其特征在于：所述的混合酶消化液包括消化液和中止液，其中消化液和中止液两者的摩尔体积比为1∶10-20；
按照10mL消化液的配制量的具体步骤如下：
1)称取氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，溶于7ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量胰蛋白酶12.5-13.0mg和2型胶原酶8-22mg，加入上述溶液中混匀；
3)取2.5-3.5g纯甘油加入上述混合液中搅拌至均匀，pH值调至8.0，定容至10ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至1.5ml无菌EP管中，每管1ml，置于-20度冰箱保存；
按照100mL中止液的配制量的具体步骤如下：
1)称取氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g和磷酸氢二钠200-250mg，溶于800ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量白蛋白0.8-2.2g和氢化可的松20-22mg，搅拌溶解于80ml溶液中，pH值调至8.0，定容至100ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至15ml无菌离心管中，每管10ml，置于-20度冰箱保存。
使用时，本发明用廉价的胰蛋白酶部分替代胶原酶以降低费用，在中止液中加入白蛋白成分以中止酶消反应，同时改用甘油PBS作为溶剂，实现消化液成分在-20度下的液态保存，避免反复冻融导致的消化酶活性的降低，将能为构建外膜损伤的动物模型以及制备无外膜的血管组织提供稳定可靠的混合酶消化液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明所述的混合酶消化液包括消化液和中止液，消化液和中止液两者的摩尔体积比为1∶10-20；
其中，10mL消化液中含有如下成分：胰蛋白酶12.5-13.0mg，2型胶原酶8-22mg，甘油2.5-3.5g，氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，余量为双蒸馏水；
100mL中止液中含有如下成分：白蛋白0.8-2.2g，氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g，磷酸氢二钠200-250mg和中短效糖皮质激素4-22mg，余量为双蒸馏水。
白蛋白采用牛血清白蛋白或者人血清白蛋白，甘油采用纯甘油，中短效糖皮质激素选用氢化可的松、泼尼松龙或甲泼尼龙。氢化可的松的剂量为20-22mg，其他两种激素按照氢化可的松20mg＝泼尼松龙5mg＝甲泼尼龙4mg进行换算。
一种用于血管外膜快速消化的混合酶消化液的制备方法，其特征在于：所述的混合酶消化液包括消化液和中止液，两种液体混合操作要求在室温状态下超净台或生物安全柜中进行，避免微生物污染，其中消化液和中止液两者的摩尔体积比为1∶10-20；
按照10mL消化液的配制量的具体步骤如下：
1)称取氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，溶于7ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量胰蛋白酶12.5-13.0mg和2型胶原酶8-22mg，加入上述溶液中混匀；
3)取2.5-3.5g纯甘油加入上述混合液中搅拌至均匀，pH值调至8.0，定容至10ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至1.5ml无菌EP管中，每管1ml，置于-20度冰箱保存；
按照100mL中止液的配制量的具体步骤如下：
1)称取氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g和磷酸氢二钠200-250mg，溶于800ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量白蛋白0.8-2.2g和中短效糖皮质激素4-22mg，搅拌溶解于80ml溶液中，pH值调至8.0，定容至100ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至15ml无菌离心管中，每管10ml，置于-20度冰箱保存。
白蛋白采用牛血清白蛋白或者人血清白蛋白，中短效糖皮质激素选用氢化可的松、泼尼松龙或甲泼尼龙。氢化可的松的剂量为20-22mg，其他两种激素按照氢化可的松20mg＝泼尼松龙5mg＝甲泼尼龙4mg进行换算20-22mg。
配制本混合酶消化液的试剂来源：胰蛋白酶，Sigma公司，T4799，1,000-2,000units/mg；2型胶原酶，Sigma公司，C6885；甘油，国药集团化学试剂有效公司，分析纯，C3H8O3，分子量：92.09；氯化钾，国药集团化学试剂有效公司，分析纯，KCl，分子量：74.55；磷酸二氢钾，国药集团化学试剂有效公司，分析纯，KH2PO4，分子量：136.09；氯化钠，国药集团化学试剂有效公司，分析纯，NaCl，分子量：58.44；磷酸氢二钠，国药集团化学试剂有效公司，分析纯，Na2HPO4，分子量：358.14；白蛋白，Amresco公司，生物技术级，CAS：9048-4-6-8；氢化可的松，Sigma公司，H0888，CAS：50-23-7。
实施例1
一种用于血管外膜快速消化的混合酶消液由消化液和中止液两大组分构成，其两者的体积比为1∶10。
10mL消化液的配制量的具体步骤如下：
1)称取氯化钾2mg，磷酸二氢钾2mg，氯化钠80mg，磷酸氢二钠21.6mg，溶于7ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量胰蛋白酶12.5-13.0mg和2型胶原酶8-22mg，加入上述溶液中混匀；
3)取2.5g纯甘油加入混匀，pH值调至8.0，定容至10ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至1.5ml无菌EP管中，每管1ml，置于-20度冰箱保存。
100mL中止液的配制量的具体步骤如下：
1)氯化钾20mg，磷酸二氢钾20mg，氯化钠0.8g，磷酸氢二钠216mg，溶于800ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量白蛋白(可为牛血清白蛋白或者人血清白蛋白，根据实验需要选用)0.8-2.2g，和氢化可的松21.3mg，溶于80ml溶液中，pH值调至8.0，定容至100ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至15ml无菌离心管中，每管10ml，置于-20度冰箱保存。其中氢化可的松21.3mg，可用泼尼松龙5.325mg或甲泼尼龙4.26mg来替代。
本发明的优点在于：1)将血管外膜酶消反应分为混合酶消化和中止两个部分，分别对应消化液和中止液，从而提高酶消反应的可控性；2)消化酶中使用廉价的胰蛋白酶部分代替2型胶原酶，在保证酶消效果的前提下，降低了反应的消耗；3)使用25％的甘油-PBS作为混合酶的溶剂，实现了-20度低温状态下的液态保存结合制备过程中的分装操作，避免了因反复冻融操作导致的酶活力的降低；4)在中止液中加入白蛋白和糖皮质激素，前者可以起到中止胰蛋白酶避免过度酶消的作用，还能降低外膜消化过程中的组织脱水，后者则可显著抑制因外膜消化操作所诱导的炎症反应。
实施例2
一种用于血管外膜快速消化的混合酶消液由消化液和中止液两大组分构成，其两者的体积比为1∶20。
10mL消化液的配制量的具体步骤如下：
1)称取氯化钾2mg，磷酸二氢钾2mg，氯化钠80mg，磷酸氢二钠21.6mg，溶于7ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量胰蛋白酶12.5-13.0mg和2型胶原酶8-22mg，加入上述溶液中混匀；
3)取2.5g纯甘油加入混匀，pH值调至8.0，定容至10ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至1.5ml无菌EP管中，每管1ml，置于-20度冰箱保存。
200mL中止液的配制量的具体步骤如下：
1)氯化钾40mg，磷酸二氢钾40mg，氯化钠1.6g，磷酸氢二钠432mg，溶于1600ml双蒸水中，搅拌均匀；
2)称量白蛋白(可为牛血清白蛋白或者人血清白蛋白，根据实验需要选用)1.6-4.4g，和泼尼松龙10.65mg，溶于160ml溶液中，pH值调至8.0，定容至200ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至15ml无菌离心管中，每管10ml，置于-20度冰箱保存。
受试对象：雄性新西兰兔(体重2.5±0.5kg)；
将新西兰兔分为：1)胶原酶消化对照组：颈动脉分离后使用2型胶原酶(其含量与混合酶消液中的2型胶原酶一致)消化，n＝8；2)混合酶消化组：颈动脉分离使用混合酶消化，n＝8。
实施过程：新西兰兔耳静脉戊巴比妥麻醉后，腹部向上，四肢和门牙固定于兔台上，颈部皮肤消毒，铺好洞巾，正中切口切开皮肤及皮下组织，小心从颈动脉鞘中分离颈动脉，确定酶消部分，进行酶消，单纯2型胶原酶消化25-30分钟，随后用PBS反复冲洗血管3分钟，以尽量去除消化液，显微外科手术小心去除未消化完的血管外膜，混合酶消化使用其中的消化液消化20-25分钟，随后用中止液反复冲洗血管3分钟，以尽量去除消化液，吸去手术视野的残留液体，逐层关闭手术切口，手术电热毯保持动物体温，待其苏醒后将其从兔台上放入兔笼中观察。
对上述所制备的血管外膜损伤诱导动脉粥样硬化的新西兰兔的动物模型的成功率情况，结果如下：
表1.不同酶消法诱导新西兰兔颈动脉外膜损伤诱导动脉粥样硬化成功率
术后死亡的动物，经解剖发现出现血管内血栓，与单纯胶原酶消化组相比，*p＜0.05，混合酶消化组可以显著减少术中血管出血、显微外科手术干预的几率，同时显著提高手术的成功率。
对上述所制备的血管外膜损伤诱导动脉粥样硬化的新西兰兔的动物模型，经高脂喂养3周后，使用小动物超声活体观察颈动脉斑块的情况，随后处死动物，留取颈动脉血管经血管弹力纤维染色观察，发现：1)混合酶消组可显著促进颈动脉的斑块形成，其斑块负荷显著高于单纯胶原酶消化组(p＜0.05)；2)混合酶消组的颈动脉血管弹力纤维的完整性显著高于单纯胶原酶消化组(p＜0.05)，同时巨噬细胞浸润程度显著低于单纯胶原酶消化组(p＜0.05)，提示：除外血管外膜，混合酶消对血管壁其他结构的影响显著降低。
以上结果表明，用本发明方法可以实现能减少去除外膜所需的复杂的显微外科手术的实施、提高术后血管的通畅性，为研究血管外膜在动脉粥样硬化的病理过程中的作用提供了稳定的动物模型的制备手段，同时还能为日后无细胞血管支架材料的大量需求提供优质的血管材料。
Claims (2)
1.一种用于血管外膜快速消化的混合酶消化液，其特征在于： 所述的混合酶消化液包括消化液和中止液，消化液和中止液两者的摩尔体积比为1：10-20；其中，10mL消化液中含有如下成分：胰蛋白酶12.5-13.0mg，2型胶原酶8-22mg，甘油2.5-3.5g，氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，余量为双蒸馏水；100mL中止液中含有如下成分：白蛋白0.8-2.2g，氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g，磷酸氢二钠200-250mg和中短效糖皮质激素4-22mg，余量为双蒸馏水；白蛋白采用牛血清白蛋白或者人血清白蛋白，甘油采用纯甘油，中短效糖皮质激素选用氢化可的松、泼尼松龙或甲泼尼龙。
2.根据权利要求1所述的一种用于血管外膜快速消化的混合酶消化液的制备方法，其特征在于：所述的混合酶消化液包括消化液和中止液，其中消化液和中止液两者的摩尔体积比为1：10-20；按照10mL消化液的配制量的具体步骤如下：1）称取氯化钾1-3mg，磷酸二氢钾1.5-3mg，氯化钠70-90mg和磷酸氢二钠20-23mg，溶于7ml双蒸水中，搅拌均匀；2）称量胰蛋白酶12.5-13.0mg和2型胶原酶8-22mg，加入上述溶液中混匀；3）取2.5-3.5g纯甘油加入上述混合液中搅拌至均匀，pH值调至8.0，定容至10ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至1.5ml无菌EP管中，每管1ml，置于-20度冰箱保存；按照100mL中止液的配制量的具体步骤如下：1）称取氯化钾18-22mg，磷酸二氢钾18-23mg，氯化钠0.7-1.0g和磷酸氢二钠200-250mg，溶于800ml双蒸水中，搅拌均匀；2）称量白蛋白0.8-2.2g和中短效糖皮质激素4-22mg，搅拌溶解于80ml溶液中，pH值调至8.0，定容至100ml，经0.22μm无菌滤器过滤，分装至15ml无菌离心管中，每管10ml，置于-20度冰箱保存；白蛋白采用牛血清白蛋白或者人血清白蛋白，中短效糖皮质激素选用氢化可的松、泼尼松龙或甲泼尼龙。
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