CN103156856A - 3-巯基丙酰胺类化合物的应用 - Google Patents

3-巯基丙酰胺类化合物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有下列通式(I)的3-巯基丙酰胺类化合物通过抑制NDM-1活性从而抑制多药耐药细菌活性的药物中的用途，其中，R1选自
Figure DDA0000121840940000012
且R2选自C1-C4烷基。

Description

3-巯基丙酰胺类化合物的应用
技术领域
本发明涉及药学领域，具体而言，涉及3-巯基丙酰胺类化合物的用途。
背景技术
在被称为抗生素“黄金时代”的20世纪五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人数约为700万，这一数字到1999年上升到了2000万。病死率升高的主要原因是耐药菌带来的用药困难。
目前，细菌耐药性问题已经非常严重。在发达国家，有5％～10％的住院病人发生过一次或更多的感染。美国每年发生医院感染的患者约为200万，死亡90000人，经济损失达45亿～57亿美元。在发展中国家，发生医院感染的危险要高出发达国家2倍～20倍。我国医院感染发生率为6％左右，但漏报率很高，可达50％以上，致死率尚不清楚。主要感染部位依次为下呼吸道、泌尿道及手术切口感染等。
2010年8月，著名医学杂志《(柳叶刀)》报道了一例对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药、对环丙沙星也不敏感、仅对粘菌素敏感的病例，深入研究发现其携带肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)编码的一种新型金属β-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点(印度新德里)将这种酶命名为新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1，New Delhi metallo-β-lactamase-1)。
根据上述研究结果，英国、印度等国研究人员在印度、巴基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-1肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2％-13％，主要菌种为大肠埃希菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌，其它细菌还有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、变形杆菌(Proteus species)、弗劳地枸橼酸菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、摩根摩根菌(Morganella morganii)、普罗威登菌(Providencia Ewing)等；这些细菌主要引起尿路、血流、伤口、肺部和导管相关感染等。不到一个月的时间内，在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我国大陆、香港、台湾地区等都已经有感染病例报道。
由于产NDM-1细菌的蔓延十分迅速，有关产NDM-1细菌感染治疗的临床和基础研究还较少。目前已经阐明NDM-1属于B类β-内酰胺酶超家族中的一员，在其活性部位结合有锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。与之前发现的其他B类β-内酰胺酶相比，NDM-1具有能够水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，且耐受大多数β-内酰胺酶抑制剂等特点。NDM-1的存在是导致NDM-1超级细菌几乎对所有β-内酰胺抗菌药物耐药的分子基础，同时由于细菌具有其它耐药机制，对氨基糖苷类、喹诺酮类等也多耐药，目前只对多粘菌素和替加环素具有较高体外敏感性。
NDM-1能轻易地从一种细菌跳到另一种上面，科学家忧虑NDM-1跟危险性病毒接合，变成无法医治的人传人病毒，并且NDM-1是导致细菌多重抗药性的基础原因，一旦在全球散播，抗生素作废的时期将拉开序幕，因此开发用于抑制产NDM-1耐药细菌的活性的药物迫在眉睫。
其中，3-巯基-2-甲基-1-吗啉丙酰胺，3-巯基-2-甲基-N-苯基丙酰胺，N-丁基-3-巯基-2-甲基丙酰胺购买于天津尚德药缘科技有限公司。
发明内容
为了有效抑制NDM-1的活性，本发明提供了3-巯基丙酰胺类化合物，用于很好地抑制NDM-1的活性，可被开发成抑制NDM-1活性、提高抗生素疗效、治疗耐药细菌感染的药物。
本发明提供了具有下列通式(I)的3-巯基丙酰胺类化合物的用途，具体而言，提供了其在制备抑制多药耐药细菌活性的药物中的用途，尤其是在制备抑制产NDM-1耐药细菌活性的药物中的用途：
其中，R1选自
Figure BDA0000121840930000031
Figure BDA0000121840930000032
且R2选自C1-C4烷基。
本文中所用的“C1-C4烷基”是指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基。实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。优选甲基、乙基、叔丁基，更优选甲基。
在一个具体实施例中，3-巯基丙酰胺类化合物具有上述通式，其中R1是吗啉基，R2是甲基。在另一个具体实施例中，3-巯基丙酰胺类化合物具有上述通式，其中R1是苯胺基，R2是甲基。在又一个具体实施例中，3-巯基丙酰胺类化合物具有上述通式，其中R1是正丁胺基，R2是甲基。
在该用途中，所述多药耐药细菌是指对于几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物具有耐药性，同时对氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物也多具有耐药性的细菌。在一个具体实施例中，多药耐药细菌是指产NDM-1耐药细菌。产NDM-1耐药细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等中的一种或几种。
在该用途中，所述抑制多药耐药细菌的活性的药物包含上面所述的3-巯基丙酰胺衍生物类化合物和一种或多种β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类或碳青霉烯类抗生素中的一种或几种。
本发明的3-巯基丙酰胺类化合物对NDM-1具有抑制效果，从而可以减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解。本发明的3-巯基丙酰胺类化合物与β-内酰胺类抗生素联用，通过抑制NDM-1的活性，可以进一步提高抗生素疗效，从而能够治疗由NDM-1引起的多药耐药细菌感染，具有良好的药物应用前景。
具体实施方式
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
木发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希一望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。所用的缩略语及其含义如下所示：
Figure BDA0000121840930000041
本发明的活性测试方法以亚胺培南一水合物作为NDM-1的底物进行活性检测，其酶活机制是：底物亚胺培南一水合物的母核部分具有O＝C-N-C＝C共轭结构，表明底物可产生紫外吸收。由于NDM-1可以水解β-内酰胺环酰胺键，因此NDM-1与底物反应时可以水解底物的酰胺键，导致共轭结构被破坏，从而使紫外吸收消失。通过对比NDM-1与底物反应前后的全波长扫描紫外吸收光谱图发现，底物在300nm处有最强紫外吸收。如果化合物对NDM-1具有抑制作用，则阻止了NDM-1对底物的水解，导致底物的紫外吸收值降低减慢，由此可以判断化合物对NDM-1是否具有抑制效果，从而进行NDM-1抑制剂药物的筛选。
本发明的活性测试方法包括以下6个步骤：
步骤1.NDM-1底物储备液的准备
将亚胺培南一水合物(Imipenem monohydrate，购自Sigma公司)溶于50mM HEPES(购自BioBasic公司)中，配制成10mM的底物储备液备用。
步骤2.化合物的处理
将化合物在95％DMSO+5％ddH2O中溶解，配制成100mM浓度的溶液，然后将配制好的化合物溶液放置在1.5ml ep管中，于4℃下保存备用。
步骤3.NDM-1蛋白缓冲液的配制
将NDM-1(由本实验室MDC蛋白纯化组提供，制备方法参见Yu Guo，Jing Wang等，A structural view of the antibiotic degradation enzyme NDM-1form a superbug.Protein & Cell，2011，2(5)：384-394)溶解在蛋白缓冲液(pH＝6.8)中，配制成50nM的NDM-1蛋白缓冲液，其中蛋白缓冲液含有50mMHEPES、5μM ZnCl2(购于BioBasic公司)、10μg/ml BSA(购于上海生工工程有限公司)。
步骤4.NDM-1药筛酶活体系的建立
NDM-1药筛酶活体系中包含的成分，其体积和浓度见表1。
表1 NDM-1的药筛酶活体系
  体系   体积   浓度
  NDM-1   100μl   50nM
  底物   50μl   600μM
  化合物   2μl   100mM
  总计   152μl
而且，检测体系设置阴性对照，阴性对照体系中加入2μl 95％DMSO取代化合物，用于检测NDM-1的活性。
步骤5.化合物的初步筛选
向96微孔板中的每孔中加入100μl的浓度为50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μl的浓度为100mM的化合物溶液。振荡，室温孵育1分钟后，每孔加入50μl的600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪(Varioskan Flash，Thermo scientific)检测一次，共测20次。
绘制曲线，取阴性对照曲线斜率的最大处值为V0，化合物曲线斜率的最大处值为Vi，则NDM-1的剩余活性分数＝Vi/V0。剩余活性越低，表示化合物对NDM-1的活性抑制越强。当NDM-1的剩余活性分数在0.2以内时，将进一步测定该化合物的IC50值。
6.测定化合物的IC50值
将原始浓度为100mM的化合物溶液用95％DMSO按1∶2(体积比)的比例进行等比稀释，共稀释11个浓度梯度。最终浓度依次为1316、658、329、164.5、82.2、41.1、20.6、10.3、5.1、2.6、1.3μM。接着进行化合物的IC50值检测，向96微孔板中的每孔中加入100μl的浓度50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μl的上面配置的11个浓度的化合物溶液。振荡，室温孵育1分钟后，每孔加入50μl的600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪检测一次，共测20次。然后绘制曲线，计算NDM-1的剩余活性分数。最后以化合物浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线。根据曲线，采用GraphPad Prism version 5.0软件(美国GraphPad software公司)计算IC50值。
实施例1 3-巯基-2-甲基-1-吗啉丙酰胺抑制NDM-1活性的测定
Figure BDA0000121840930000061
将上述的3-巯基-2-甲基-1-吗啉丙酰胺(4mg)在95％DMSO(211.3μL)中溶解，配制成100mM浓度的溶液，然后将该溶液放置在1.5ml ep管中，于4℃下保存。
然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC50值的测定)中所述的内容进行操作。在终浓度为1.3mM时，对NDM-1的抑制率达到51.44％
实施例2 3-巯基-2-甲基-N-苯基丙酰胺抑制NDM-1活性的测定
Figure BDA0000121840930000062
将上述的3-巯基-2-甲基-N-苯基丙酰胺(4mg)在95％DMSO(204.8μL)中溶解，配制成100mM浓度的溶液，然后将该溶液放置在1.5ml ep管中，于4℃下保存。
然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC50值的测定)中所述的内容进行操作。然后以3-巯基-2-甲基-N-苯基丙酰胺的浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线，见图3。最后根据该曲线，采用GraphPad Prism version 5.0软件计算，得到的IC50值为199.50±44.53μM。
实施例3 N-丁基-3-巯基-2-甲基丙酰胺抑制NDM-1活性的测定
Figure BDA0000121840930000071
将上述的N-丁基-3-巯基-2-甲基丙酰胺(4mg)在95％DMSO(228.1μL)中溶解，配制成100mM浓度的溶液，然后将该溶液放置在1.5ml ep管中，于4℃下保存。
然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC50值的测定)中所述的内容进行操作。然后以N-丁基-3-巯基-2-甲基丙酰胺的浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线，见图4。最后根据该曲线，采用GraphPad Prism version 5.0软件计算，得到的IC50值为20.65±1.24μM。
根据上述实施例，可以了解本发明涉及的化合物具有抑制NDM-1活性的作用。本领域普通技术人员应当理解，将本发明涉及的化合物与β-内酰胺类抗生素联用可以明显抑制NDM-1的活性。进一步地，3-巯基丙酰胺类化合物可以提高抗生素疗效，从而能够治疗由NDM-1引起的多药耐药细菌感染，具有良好的药物应用前景。
为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。

Claims (9)

1.具有下列通式(I)的3-巯基丙酰胺类化合物通过抑制NDM-1活性从而抑制多药耐药细菌活性的药物中的用途。
Figure FDA0000121840920000011
其中，R1选自
Figure FDA0000121840920000012
Figure FDA0000121840920000013
且R2选自C1-C4烷基。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述R2是甲基。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述R1是
Figure FDA0000121840920000014
或
Figure FDA0000121840920000015
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述3-巯基丙酰胺类化合物中的R1选自
Figure FDA0000121840920000016
且R2是甲基。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述多药耐药细菌对于β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物具有耐药性。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述多药耐药细菌是产新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)耐药细菌。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述产NDM-1耐药细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含所述3-巯基异丁酸衍生物类化合物和一种或多种β-内酰胺类抗生素。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类或碳青霉烯类抗生素中的一种或多种。
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