CN103130692A - 3-巯基丙酰胺类化合物在抑制ndm-1活性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有下列通式(I)的3-巯基丙酰胺类化合物，及其制备方法和应用，其中，R1选自氢或C1-C4烷基，R2选自氢或C1-C4烷基，R3选自C1-C4烷基。所述化合物具有良好的抑制NDM-1活性的作用。
Description
技术领域
本发明涉及药学领域，具体而言，涉及3-巯基丙酰胺类化合物、其制备方法和应用。
背景技术
在被称为抗生素“黄金时代”的20世纪五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人数约为700万，这一数字到1999年上升到了2000万。病死率升高的主要原因是耐药菌带来的用药困难。
目前，细菌耐药性问题已经非常严重。在发达国家，有5％～10％的住院病人发生过一次或更多的感染。美国每年发生医院感染的患者约为200万，死亡90000人，经济损失达45亿～57亿美元。在发展中国家，发生医院感染的危险要高出发达国家2倍～20倍。我国医院感染发生率为6％左右，但漏报率很高，可达50％以上，致死率尚不清楚。主要感染部位依次为下呼吸道、泌尿道及手术切口感染等。
2010年8月，著名医学杂志《柳叶刀》报道了一例对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药、对环丙沙星也不敏感、仅对粘菌素敏感的病例，深入研究发现其携带肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)编码的一种新型金属β-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点(印度新德里)将这种酶命名为新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1，New Delhi metallo-β-lactamase-1)。
根据上述研究结果，英国、印度等国研究人员在印度、巴基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-1肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2％-13％，主要菌种为大肠埃希菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌，其它细菌还有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、变形杆菌(Proteusspecies)、弗劳地枸橼酸菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、摩根摩根菌(Morganella morganii)、普罗威登菌(Providencia Ewing)等；这些细菌主要引起尿路、血流、伤口、肺部和导管相关感染等。不到一个月的时间内，在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我国大陆、香港、台湾地区等都已经有感染病例报道。
由于产NDM-1细菌的蔓延十分迅速，有关产NDM-1细菌感染治疗的临床和基础研究还较少。目前已经阐明NDM-1属于B类β-内酰胺酶超家族中的一员，在其活性部位结合有锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。与之前发现的其他B类β-内酰胺酶相比，NDM-1具有能够水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，且耐受大多数β-内酰胺酶抑制剂等特点。NDM-1的存在是导致NDM-1超级细菌几乎对所有β-内酰胺抗菌药物耐药的分子基础，同时由于细菌具有其它耐药机制，对氨基糖苷类、喹诺酮类等也多耐药，目前只对多粘菌素和替加环素具有较高体外敏感性。
NDM-1能轻易地从一种细菌跳到另一种上面，科学家忧虑NDM-1跟危险性病毒接合，变成无法医治的人传人病毒，并且NDM-1是导致细菌多重抗药性的基础原因，一旦在全球散播，抗生素作废的时期将拉开序幕，因此开发用于抑制产NDM-1耐药细菌的活性的药物迫在眉睫。
发明内容
为了有效抑制NDM-1的活性，从而提高抗生素疗效、治疗耐药细菌感染，本发明提供了具有下列通式(I)的3-巯基丙酰胺类化合物(在下文中有时简称式I化合物)：
其中，R1选自氢或C1-C4烷基，R2选自氢或C1-C4烷基，R3选自C1-C4烷基。
本文所用的“C1-C4烷基”选自甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基或仲丁基，优选甲基。
本发明还提供了通式(I)中R1选自氢或甲基、R2和R3都选自甲基的3-巯基丙酰胺类化合物。
在一些具体实施例中，所述3-巯基丙酰胺类化合物是3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺；3-巯基丙酰胺类化合物是3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺；(S)-3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺；(S)-3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺；(R)-3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺；和(R)-3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺。
本发明提供了一种制备所述3-巯基丙酰胺类化合物及其中间体的方法，该方法包括下列步骤：
步骤a)
使式II化合物与式IIa化合物在缩合剂、酰化催化剂和碱的存在下发生缩合反应，生成式III化合物，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、二环己基碳二亚胺(DCC)或者N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)，优选EDCI，所述酰化催化剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、二甲氨基吡啶(DMAP)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或者N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，优选HOBt，所述碱选自4-甲基吗啡啉、三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIEA)或者二甲基甲酰胺(DMF)，优选4-甲基吗啡啉；以及
步骤b)
使式III化合物在甲醇中与碳酸氢钠反应脱去乙酰基，生成式I化合物，其中，各个化合物中的R1、R2和R3如式I化合物中所定义。
所述方法中的起始原料均为可商购的或者可以通过本领域已知的方法可以制备得到的，所述方法中的具体反应条件也为本领域中已知的，为简明起见不再重复，优选实施例中提到的反应条件。
本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物可以单独包含至少一种所述3-巯基丙酰胺类化合物。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物可以包含至少一种所述3-巯基丙酰胺类化合物；以及一种或多种β-内酰胺类抗生素。所述β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素中的一种或多种。
本发明所述药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。术语“药学上可接受的”是指当给药至动物例如哺乳动物(例如人类)时生理学上可耐受且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如头晕等)的添加剂或组合物。药物载体和赋形剂可以包括但不限于稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；润滑剂；聚乙二醇；粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的话，还包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；和/或吸附剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂和甜味剂。
本发明还提供了本发明所述的药物组合物在抑制耐药细菌活性中的应用。所述耐药细菌是指对于几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物具有耐药性，同时对氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物也多具有耐药性的细菌。在一个具体实施例中，耐药细菌是指产NDM-1耐药细菌。产NDM-1耐药细菌选自大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌和普罗威登菌中的一种或多种。
本发明的3-巯基丙酰胺类化合物对NDM-1具有抑制效果。将本发明的3-巯基丙酰胺类化合物单独联用，或者与β-内酰胺类抗生素联用可以通过抑制NDM-1的活性，减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解，可以缓解NDM-1引起的耐药性，进一步地提高抗生素疗效，从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染，具有良好的药物应用前景。
附图说明
图1示出了药筛酶活体系底物亚安培南一水合物的化学结构式及其与NDM-1的作用位点。
图2示出了底物亚安培南一水合物反应前后全波长扫描的紫外吸收光谱图的比较结果。
图3A至图3F示出了根据实施例1-6所述的化合物的NDM-1剩余活性分数对化合物浓度对数的曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
木发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。
下列实施例仅用于举例说明本发明，对本发明没有任何限制。
所用的起始原料为已知产物或者根据已知方法可以很容易制备得到的。下述各种制备用于制备本发明化合物的合成中间体。
实施例和制备中所述化合物的结构根据常用的波谱技术(核磁共振氢谱等)来确定。
制备1：3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺
在50ml三口瓶中，在冰浴条件下加入3-乙酰基硫烷基-2-甲基-丙酸(购自TCI，100.04mg，0.62mmol)、N，O-二甲基羟胺盐酸盐(购自TCI，60.13mg，0.62mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(236.41mg，1.23mmol)、4-甲基吗啡啉(68.59mg，0.68mmol)和羟基苯并三氮唑(99.96mg，0.74mmol)，然后升至室温(20℃-30℃)搅拌过夜，将反应体系用饱和食盐水淬灭，用乙酸乙酯(3*50ml)萃取，合并有机相并用5％的柠檬酸(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，得到105mg预期产物，收率为82.97％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 3.703(s，3H)，3.214(s，3H)，3.138(q，1H)，3.083(q，1H)，3.036(m，1H)，2.340(s，3H)，1.215(d，3H)。
制备2：3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺
(100.05mg，0.62mmol)、O-甲基羟胺盐酸盐(购自TCI，72.70mg，0.74mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(236.24mg，1.23mmol)、4-甲基吗啡啉(68.41mg，0.68mmol)、和羟基苯并三氮唑(100.21mg，0.74mmol)，然后升至室温(20℃～30℃)搅拌过夜，将反应体系用饱和食盐水淬灭，用乙酸乙酯(3*50ml)萃取，合并有机相并用5％的KHSO4水溶液(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，得到75.32mg预期产物，收率为63.88％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 8.627(s，1H)，3.801(s，3H)，3.112(q，2H)，2.986(t，1H)，2.367(s，3H)，1.261(d，3H)。
制备3：(S)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺
在50ml三口瓶中，在冰浴条件下加入(S)-3-乙酰基硫烷基-2-甲基丙酸(购自TCI，100.12mg，0.62mmol)、N，O-二甲基羟胺盐酸盐(60.15mg，0.62mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(237.31mg，1.23mmol)、4-甲基吗啡啉(63.53mg，0.68mmol)、和羟基苯并三氮唑(99.54mg，0.74mmol)，然后升至室温(20℃～30℃)搅拌过夜，将反应体系用饱和食盐水淬灭，用乙酸乙酯(3*50ml)萃取，有机相合并用5％的柠檬酸水溶液(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，得到85.11mg预期产物，收率为67.25％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 3.582(s，3H)，3.083(s，3H)，2.975(m，2H)，2.907(t，1H)，2.221(s，3H)，1.092(d，3H)。
制备4：(S)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺
在50ml三口瓶中，在冰浴条件下加入(S)-3-乙酰基硫烷基-2-甲基丙酸(100.01mg，0.62mmol)、O-甲基羟胺盐酸盐(72.59mg，0.74mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(235.13mg，1.23mmol)、4-甲基吗啡啉(67.54mg，0.68mmol)、和羟基苯并三氮唑(99.24mg，0.74mmol)，然后升至室温(20℃～30℃)搅拌过夜，将反应体系用饱和食盐水淬灭，用乙酸乙酯(3*50ml)萃取，合并有机相，并用5％的KHSO4水溶液(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，得到90.15mg预期产物，收率为76.46％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 9.484(s，1H)，3.756(s，3H)，3.058(q，1H)，2.988(t，1H)，2.406(m，1H)，2.329(s，3H)，1.223(d，3H)。
制备5：(R)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺
在50ml三口瓶中，在冰浴条件下加入(R)-3-乙酰基硫烷基-2-甲基丙酸(购自TCI，100.13mg，0.62mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(234.75mg，1.23mmol)、4-甲基吗啡啉(65.76mg，0.68mmol)、和羟基苯并三氮唑(98.56mg，0.74mmol)，搅拌30分钟，然后加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(62.23mg，0.62mmol)，然后升至室温(20℃～30℃)，在室温下搅拌4小时，将反应体系用饱和食盐水淬灭，用乙酸乙酯(3*50ml)萃取，合并有机相，并用5％的柠檬酸水溶液(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到65.23mg预期产物，收率为51.54％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 3.682(s，3H)，3.192(s，3H)，3.073(q，2H)，3.007(m，1H)，2.318(s，3H)，1.192(d，3H)。
制备6：(R)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺
在50ml三口瓶中，在冰浴条件下加入(R)-3-乙酰基硫烷基-2-甲基丙酸(100.11mg，0.62mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(234.14mg，1.23mmol)、4-甲基吗啡啉(65.99mg，0.68mmol)和羟基苯并三氮唑(99.31mg，0.73mmol)，搅拌30分钟后，加入O-甲基羟胺盐酸盐(51.49mg，0.62mmol)，然后升至室温，在室温(20℃～30℃)下搅拌4小时，将反应体系用饱和食盐水淬灭，用乙酸乙酯(3*50ml)萃取，有机相合并用5％的KHSO4水溶液(3*20ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到64.65mg预期产物，收率为54.83％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 9.188(s，1H)，3.763(s，3H)，3.068(q，2H)，2.986(m，1H)，2.235(s，3H)，1.229(d，3H)。
实施例1 3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺
在室温(20℃～30℃)下，将上面制备1中得到的化合物3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺(100.15mg，0.49mmol)溶入10ml甲醇中，然后加入碳酸氢钠(45.02mg，0.54mmol)，在室温(20℃～30℃)下反应8小时，然后旋干甲醇，将残余物溶于水(15ml)，用石油醚(3*20ml)萃取，然后将水相用5％的柠檬酸水溶液调节至pH＝6，用乙酸乙酯(3*20ml)萃取，合并乙酸乙酯相，经无水硫酸镁干燥，过滤，经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)纯化，得到60.31mg标题化合物，收率为75.84％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 3.731(s，3H)，3.138(q，1H)，3.092(q，1H)，2.730(d，1H)，2.203(s，3H)，1.282(s，3H)，1.592(s，1H)。
实施例2 3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺
在室温下(20℃～30℃)，将上面制备2中得到的化合物3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺(100.02mg，0.52mmol)溶于10ml甲醇中，然后加入碳酸氢钠(87.85mg，1.05mmol)，在室温中反应4小时，然后旋干甲醇，将残余物溶于15ml水中，用石油醚(3*20ml)萃取，然后将水相用5％的KHSO4水溶液调节至pH＝6，用乙酸乙酯(3*20ml)萃取，合并乙酸乙酯相，经无水硫酸镁干燥，过滤，经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)纯化得到61.12mg标题化合物，收率为78.33％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 8.372(s，1H)，3.801(s，3H)，2.879(m，1H)，2.568(d，1H)，2.290(t，1H)，1.593(s，1H)，1.272(d，3H)。
实施例3(S)-3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺
实施例4(S)-3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺
在室温(20℃～30℃)下，将上面制备4得到的化合物(S)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺(100.01mg，0.52mmol)溶于10ml甲醇中，然后加入碳酸氢钠(86.43mg，1.03mmol)，在室温下反应4小时，然后旋干甲醇，将残余物溶于15ml水中，用石油醚(3*20ml)萃取，然后将水相用5％的KHSO4水溶液调节至pH＝6，用二氯甲烷(3*20ml)萃取，合并二氯甲烷相，经无水硫酸镁干燥，过滤，经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)纯化，得到52.42mg标题化合物，收率为67.19％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm9.316(s，1H)，3.801(s，3H)，3.057(m，1H)，2.998(q，1H)，2.847(m，1H)，1.552(s，1H)，1.242(d，3H)。
实施例5(R)-3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺
在室温(20℃～30℃)下，将上面制备5中得到的化合物(R)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺(100.16mg，0.49mmol)溶入10ml甲醇中，然后加入碳酸氢钠(44.64mg，0.53mmol)，在室温下反应8小时，然后旋干甲醇，将残余物溶于15ml水中，用石油醚(3*20ml)萃取杂质，然后将水相用5％的柠檬酸水溶液调节至pH＝6，用乙酸乙酯(3*20ml)萃取，合并乙酸乙酯相，经无水硫酸镁干燥，过滤，将滤液旋干，得到60.02mg标题化合物，收率为75.48％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 3.740(s，3H)，3.218(s，3H)，3.056(q，1H)，2.899(q，1H)，2.463(m，1H)，1.530(s，1H)，1.176(d，3H)。
实施例6(R)-3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺
在室温(20℃～30℃)下，将上面制备6中得到的化合物(R)-3-乙酰基硫烷基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺(100.04mg，0.52mmol)溶入10ml甲醇中，然后加入碳酸氢钠(88.25mg，1.05mmol)，在室温中反应3小时，然后旋干甲醇，将残余物溶于15ml水，用石油醚(3*20ml)萃取杂质，然后将水相用5％的KHSO4水溶液调节至pH＝6，用二氯甲烷萃取(3*20ml)，合并二氯甲烷相，经无水硫酸镁干燥，过滤，将滤液旋干，得到61.10mg标题化合物，收率为78.31％。其氢谱数据如下所示：1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 8.372(s，1H)，3.807(s，3H)，3.085(d，1H)，2.862(m，1H)，2.566(m，1H)，1.553(s，1H)，1.252(d，3H)。
药理活性测试部分
本发明的活性测试方法以亚胺培南一水合物作为NDM-1的底物进行活性检测，亚胺培南一水合物的结构式见图1，其中表示NDM-1裂解底物的反应部位。其酶活机制是：底物亚胺培南一水合物的母核部分具有O＝C-N-C＝C共轭结构，表明底物可产生紫外吸收。由于NDM-1可以水解β-内酰胺环酰胺键，因此NDM-1与底物反应时可以水解底物的酰胺键，导致共轭结构被破坏，从而使紫外吸收消失。通过对比NDM-1与底物反应前后的全波长扫描紫外吸收光谱图发现，底物在300nm处有最强紫外吸收，如图2所示。如果化合物对NDM-1具有抑制作用，则阻止了NDM-1对底物的水解，导致底物的紫外吸收值降低减慢，由此可以判断化合物对NDM-1是否具有抑制效果，从而进行NDM-1抑制剂药物的筛选。
药理活性测试方法包括以下6个步骤：
步骤1.NDM-1底物储备液的制备
将亚胺培南一水合物(Imipenem monohydrate，购自Sigma公司)溶于50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，购自BioBasic公司)中，配制成10mM的底物储备液备用。
步骤2.化合物的处理
将化合物在95％DMSO+5％ddH2O(双蒸水)中溶解，配制成100mM浓度的溶液，然后将配制好的化合物溶液放置在1.5ml ep管中，于4℃下保存备用。
步骤3.NDM-1蛋白缓冲液的配制
将NDM-1(由本实验室MDC蛋白纯化组提供，制备方法参见Yu Guo，Jing Wang等，A structural view of the antibiotic degradation enzyme NDM-1from a superbug.Protein & Cell，2011，2(5)：384-394)溶解在蛋白缓冲液(pH＝6.8)中，配制成50nM的NDM-1蛋白缓冲液，其中蛋白缓冲液含有50mM HEPES、5μM ZnCl2(购于BioBasic公司)、10μg/ml BSA(小牛血清蛋白，购于上海生工工程有限公司)。
步骤4.NDM-1药筛酶活体系的建立
NDM-1药筛酶活体系中包含的成分，其体积和浓度见表1。
表1NDM-1的药筛酶活体系
| 体系 | 体积 | 浓度 |
| NDM-1 | 100μl | 50nM |
| 底物 | 50μl | 600μM |
| 化合物 | 2μl | 100mM |
| 总计 | 152μl |
检测体系设置阴性对照，阴性对照体系中加入2μl 95％DMSO双蒸水溶液取代化合物，用于检测NDM-1的活性。
步骤5.化合物的初步筛选
向96微孔板中的每孔中加入100μl的浓度为50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μl的浓度为100mM的化合物溶液。振荡，室温孵育1分钟后，每孔加入50μl的600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪(Varioskan Flash，Thermo scientific)检测一次，共测20次。
绘制曲线，取阴性对照曲线斜率的最大处值为V0，化合物曲线斜率的最大处值为Vi，则NDM-1的剩余活性分数＝Vi/V0。剩余活性分数越低，表示化合物对NDM-1的活性抑制越强。当NDM-1的剩余活性分数在0.2以内时，将进一步测定该化合物的IC50值。
步骤6.化合物的IC50值的测定
将原始浓度为100mM的化合物溶液用95％DMSO按1∶2(体积比)的比例进行等比稀释，共稀释11个浓度梯度。最终浓度依次为1316、658、329、164.5、82.2、41.1、20.6、10.3、5.1、2.6、1.3μM。接着进行化合物的IC50值检测，向96微孔板中的每孔中加入100μl的浓度50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μl的上面配置的11个浓度的化合物溶液。振荡，室温孵育1分钟后，每孔加入50μl的600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪检测一次，共测20次。然后绘制曲线，计算NDM-1的剩余活性分数。最后以化合物浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性分数为纵坐标绘制曲线。根据曲线，采用GraphPad Prism version5.0软件(GraphPad software公司)计算IC50值。
采用上面所述的活性测试方法，测定实施例1-6中制得的化合物对NDM-1活性的抑制作用，以化合物浓度对数为横坐标，以NDM-1的剩余活性分数为纵坐标绘制IC50曲线图，分别见图3A至图3F，最后计算IC50值。所得的试验数据见表2。
表2实施例1-6中制得的化合物对NDM-1的抑制率、IC50值及对应的附图编号
| 实施例No. | 抑制率(100mM) | IC50 | IC50曲线图 |
| 实施例1 | 97.7％ | 13.50±1.30μM | 图3A |
| 实施例2 | 77％ | 261.70±39.20μM | 图3B |
| 实施例3 | 85.81％ | 20.07±1.59μM | 图3C |
| 实施例4 | 97.41％ | 55.65±4.09μM | 图3D |
| 实施例5 | 92.76％ | 48.52±2.69μM | 图3E |
| 实施例6 | 89.48％ | 92.68±9.29μM | 图3F |
根据上述实施例，可以了解本发明涉及的3-巯基丙酰胺类化合物具有显著的抑制NDM-1活性的作用。本领域普通技术人员应当理解，本发明涉及的化合物单独使用或者与β-内酰胺类抗生素联用通过明显抑制NDM-1的活性，减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解，减轻NDM-1引起的耐药性，可以进一步地提高抗生素疗效，从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染，具有良好的药物应用前景。
为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。
Claims (10)
1.具有下列通式(I)的3-巯基丙酰胺类化合物：
其中，R1选自氢或C1-C4烷基，R2选自氢或C1-C4烷基，R3选自C1-C4烷基。
2.根据权利要求1所述的通式(I)中R1选自氢或甲基、R2和R3都选自甲基的3-巯基丙酰胺类化合物。
3.根据权利要求1所述的3-巯基丙酰胺类化合物是3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺、3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺、(S)-3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺、(S)-3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺、(R)-3-巯基-N-甲氧基-N，2-二甲基丙酰胺、和(R)-3-巯基-N-甲氧基-2-甲基丙酰胺。
4.一种制备根据权利要求1-3任一项所述的3-巯基丙酰胺类化合物的方法，所述方法包括：
步骤a)使式II化合物
与式IIa化合物
以及缩合剂、酰化催化剂在碱条件下发生缩合反应，生成式III化合物
步骤b)使式III化合物在甲醇中与碳酸氢钠反应脱去乙酰基，生成式I化合物，其中，各个化合物中的R1都是相同的，选自氢或C1-C4烷基；R2都是相同的，选自氢或C1-C4烷基；R3都是相同的，选自C1-C4烷基。
5.药物组合物，所述药物组合物包含至少一种权利要求1-3中任意一项所述的化合物。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，还包含β-内酰胺类抗生素。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素中的一种或多种。
8.权利要求5-7任意一项所述的药物组合物在抑制细菌活性中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述细菌是产新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)细菌。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述产NDM-1细菌选自大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、和普罗威登菌中的一种或多种。
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|---|
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