CN103154253B

CN103154253B - 改变植物细胞壁反应性的方法

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Publication number: CN103154253B
Application number: CN201180049761.0A
Authority: CN
Inventors: F·莫伊勒韦特; B·范霍尔姆
Original assignee: Bayer CropScience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: CN103154253A; EP2627771A1; EP2627771B1; ES2548166T3; AU2011316154A1; MY172312A; MX2013004173A; PE20131462A1; WO2012048807A1; AU2011316154B2; US20130198976A1; CA2816156A1; US20190153458A1; US10202613B2; KR101966619B1; MX344886B; ZA201302604B; KR20130122635A; AR083452A1

Abstract

提供了通过向所述植物细胞中导入与异源的高尔基体信号锚定序列融合的结瘤C蛋白在植物细胞壁中生产带正电的寡糖的方法和工具。

Description

改变植物细胞壁反应性的方法

本发明涉及对植物细胞壁的反应性的修饰，所述植物细胞壁包括次生植物细胞壁，特别是可见于纤维生产植物的天然纤维中的细胞壁。特别的是，本发明涉及具有改变的反应性的棉纤维。经修饰的反应性可用于对含有细胞壁的植物来源的材料(例如天然纤维)进行染色的方法中，所述方法使用纤维反应性染料，来改良例如不褪色性，或减少在染色工艺过程中使用的废水体积。经修饰的反应性还可用于改良天然纤维与反应剂(如阻燃剂、水、油和污渍的驱避剂、抗皱剂、软化剂、抗静电剂、荧光增白剂等)的反应性。

本发明提供了增加植物细胞壁中N-乙酰葡糖胺寡聚物的生产效率的方法，所述方法还具有这样的优点，即，由本发明的方法生产的植物不表现出根生长的延迟。

背景技术

人类已经使用天然纤维，包括来自植物(如棉花和亚麻)的含有纤维素的天然纤维超过5000年。然而，由于由β-1-4连接的葡萄糖单体组成的纤维素的相对惰性的本质，含有天然纤维素的纤维不具有合成纤维的化学多功能性。

该相对惰性的本质在例如棉纤维和织物的染色过程中是明显的。使用若干类型的染料对棉花着色，如直接染料，和最重要的，纤维反应性染料，两者都是阴离子分子。棉花本身在水中呈现阴离子电荷，导致在没有特殊处理的条件下，纤维或织物对染料的摄取是非常费力的。

直接染料与纤维素聚合物产生相对弱的氢键，形成半永久性吸附。直接染料比纤维反应性染料更易于使用并且较廉价，但不耐良好洗涤。纤维反应性染料是组合了生色团和反应基团的分子，所述反应基因通过与羟基反应，与纤维形成强共价键。共价键为经染色的纤维提供了良好的抗洗涤抗性。

在染色过程中，需要大量电解质以隔离阴离子染料和阴离子纤维电荷。需要通过多次洗涤步骤去除未反应的经水解的染料(多达40％)，产生大量废水，还含有上述电解质。

提供具有正电荷的纤维素纤维(例如通过掺入带正电的化学化合物)因此能够改良天然纤维素纤维的可染性，以及改良经修饰的纤维素纤维与带负电的化学化合物的任何化学反应。还可以利用可能的酸性染料。

若干出版物已经描述了将壳聚糖寡聚物掺入或涂敷入纤维素纤维中来制备壳聚糖/纤维素掺合物、纱或织物。壳聚糖是带正电的葡糖胺聚合物，其可以通过几丁质的脱乙酰作用获得，例如通过碱处理。几丁质本身是β-1-4连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的聚合物。

US专利申请US2003/0134120描述了用壳聚糖涂敷天然纤维。

Liu等人(Carbohydrate Polymers44(2003)233-238)描述了通过在60℃水中用高碘酸钾和用含水乙酸中的壳聚糖溶液进行随后处理来氧化棉线，用壳聚糖涂敷棉纤维的方法。伴随壳聚糖涂敷，棉纤维表面变得生理学和生物学活化。由于氨基的化学反应性大于纤维素单体的羟基，纤维具有更大的潜力进行进一步的化学修饰。此外，棉纤维的平滑表面变得粗糙，提示用于药物吸附及其受控释放的更大的潜力。

基于壳聚糖在抑制例如皮肤真菌中的生理学功能，许多功能性衣物、织物和纤维都应用了纤维素-壳聚糖掺合纤维、纤维素纤维-壳聚糖缀合物和用含有壳聚糖的树脂涂敷的织物。

WO00/09729描述了在植物中表达几丁质合酶和几丁质脱乙酰酶基因以改变细胞壁用于工业用途，和改良的疾病抗性。具体提及的用途是：以提供纤维素、几丁质和壳聚糖的单一的植物来源；增加张力强度和增加脆化snap。具体提示了几丁质合酶基因源自真菌生物体。对于在植物中生产几丁质或壳聚糖，以及对于将其掺入植物细胞壁中没有提供任何实验数据。

WO2006/136351显示WO00/09729提出的对策不导致几丁质功能性掺入到植物细胞壁中。相反，WO2006/136351公开了仅当N-乙酰葡糖胺转移酶重新定位至高尔基体时，棉纤维的次生细胞壁中才有效生产几丁质。对于来自粗糙脉孢菌的真菌几丁质合酶，通过有效融合该真菌几丁质合酶与高尔基体特异性的异源信号锚定序列，和通过在植物中表达所获得的嵌合基因，实现重新定位至高尔基体。然而，对于NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶，添加信号锚定序列不是NodC蛋白定位至高尔基体所必需的，也不是在缺少外部GlcNAc补料的条件下将壳寡糖掺入植物细胞壁中所必需的。虽然可以在植物细胞壁中有效生产几丁质，也观察到包含NODC的转基因植物具有比野生型植物短的根。

因此，仍然需要备选方法来生产包含带正电的多糖的植物细胞壁，如次生细胞壁。特别是需要提供在其细胞壁中具有带正电的寡糖而没有根生长迟缓的植物。如下文的不同实施方案、实施例和权利要求所述，解决的上述和其他的问题。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了生产植物细胞或植物(例如棉花植物)的方法，所述植物细胞或植物在植物细胞的细胞壁中，特别是次生细胞壁中包含带正电的寡糖，所述方法包括将嵌合基因导入植物细胞中，其中嵌合基因包含有效连接于编码与高尔基体信号锚定序列融合的NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的DNA区的、植物可表达的启动子；和转录终止和多聚腺苷酸化区。在另一个实施方案中，提供了使用根据本发明的方法，生产在细胞中包含带正电的寡糖的植物(如棉花植物)的方法，其特征在于所述植物的根长度基本上与不包含NODC基因的野生型植物相同。

本发明还提供了生产在细胞壁中包含带正电的寡糖的植物的方法，还包括将由N-乙酰葡糖胺单体组成的寡糖脱乙酰的步骤，所述步骤是通过用碱性溶液处理来自所述植物的细胞壁，或者通过几丁质脱乙酰酶的酶促作用。

本发明还提供了嵌合基因，所述嵌合基因包括植物可表达的启动子；编码与靶向高尔基体的膜的信号锚定序列融合的结瘤C蛋白的DNA区；和转录终止和多聚腺苷酸化区，和包含此类嵌合基因的植物细胞、植物(如棉花)和棉纤维。在另一个实施方案中，本发明提供了基本由包含嵌合基因的植物细胞组成的植物，所述嵌合基因包含与高尔基体信号锚定序列融合的NODC，所述植物特征在于所述植物的根长度基本上与不包含NODC的野生型植物的根长度相同。

本发明还提供了从包含嵌合基因的棉纤维生成的植物细胞、植物(如棉花植物)、棉纤维和纱，所述嵌合基因包含与高尔基体信号锚定序列融合的NODC。

本发明还提供了包含增加的寡糖量的植物细胞壁，所述寡糖可以是带正电的寡糖，如寡聚-N乙酰葡糖胺，聚合度为2至10、或2至9、或2至8、或2至7、或2至6、或2至5、或3至5。此类植物细胞壁是通过本发明的方法可获得的。可对这些植物细胞壁进行其他化学修饰。

在特别的实施方案中，本发明提供了包含增加的量的本文所述的带正电的寡糖的棉纤维，和包含此类棉纤维的纱、织物。棉纤维可以以其本身使用，也可以进行其他化学修饰，包括染色。当与从不含有与本文所述的高尔基体信号锚定序列有效连接的嵌合NODC基因的同基因品系的棉花植物获得的棉纤维相比较时，可以通过例如检测包含嵌合基因的NODC，通过其与阴离子染料(包括刚果红)增加的结合，通过其与小麦胚芽凝聚素增加的结合或通过与胺反应性染料增加的反应性，来识别这些棉纤维。还可以直接确定棉纤维中的寡糖的存在和/或量，通过例如高性能薄层色谱(HPTLC)或高性能液相色谱和质谱(HPLC-MS)。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码能够被靶向至植物细胞的高尔基体的N-乙酰葡糖胺转移酶的DNA区用于增加植物细胞的细胞壁中的带正电的寡糖的量或用于增加植物细胞壁对于此类植物细胞壁的化学修饰的反应性的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及对棉纤维、纱或织物进行染色的方法，包括提供本文所述的纤维，或本文所述的纱或织物，和应用与所述纤维、纱或织物反应的染料。

本发明还提供了包含下列有效连接的DNA区的嵌合基因：植物可表达的启动子；编码与高尔基体信号锚定序列融合的NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的DNA区；和转录终止和多聚腺苷酸化区；以及这些嵌合基因用于增加植物细胞壁中的带正电的寡糖的量和用于生产具有改良的反应性(如可染性)的棉纤维、纱和织物的用途。

附图简介

图1：不同NODC蛋白的氨基酸序列比对。用粗体标出了在所有蛋白质中保守的氨基酸残基。ROT_NODC_RHILP：来自豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(菜豆生物变种)的NODC蛋白；ROT_NODC_BRAJA：来自大豆根瘤杆菌(Bradyrhizobium japonicum)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHIS3：来自根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)(菌株N33)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHISN：来自根瘤菌属的NODC蛋白；ROT_NODC_RHILV：来自豌豆根瘤菌(蚕豆生物变种)的NODC蛋白；和ROT_NODC_AZOCA：来自甘蓝固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)的NODC蛋白。

图2：不同NODC蛋白的氨基酸序列比对。用粗体标出了在所有蛋白质中保守的氨基酸残基。ROT_NODC_BRAJA：来自大豆根瘤杆菌的NODC蛋白；ROT_NODC_RHIS3：来自根瘤菌属物种(菌株N33)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHISN：来自根瘤菌的NODC蛋白；ROT_NODC_RHILV：来自豌豆根瘤菌(蚕豆生物变种)的NODC蛋白；和ROT_NODC_AZOCA：来自甘蓝固氮根瘤菌的NODC蛋白。

图3：野生型(col)和用pTJN6和pTGK42转化的转基因拟南芥植物的根长度。A：野生型植物和用pTJN6转化的植物和含有pTGK42的两株植物之间的比较。黑色柱：野生型；格子柱：pTJN6-23；阴影柱：pTGK42-10；垂直竖线柱：pTGK42-28。B：野生型植物和含有pTJN6的不同转基因品系之间的比较。黑色柱：野生型；格子柱：pTJN6-4；阴影柱：TJN6-14；垂直竖线柱：pTJN6-23；水平横线柱：pTJN6-26。

图4：用pTJN6转化的拟南芥植物中存在的GlcNAc的单体、二、三、四和五聚体。画圈的值代表GlcNAc寡聚物的值；这些值上方的六角形的数量代表这些寡聚物的聚合度。图形成对显示，上图为野生型，下图是含有pTJN6的转化物。

本发明的不同实施方案的详细描述

本发明基于这样的发现，即，相比来自表达不与高尔基体信号锚定序列融合的NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的植物的细胞壁，在植物细胞中表达时，异源高尔基体信号锚定序列与NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的融合体出人意料地使植物细胞壁中掺合的特定N-乙酰葡糖胺寡聚物增加至多65倍。GlcNAc寡聚物的合成不需要向生长培养基中外部添加GlcNAc。

与此同时，NODC在植物中的表达对根长度有负面影响，而异源高尔基体信号锚定序列与NODC的融合体使根长度恢复为野生型水平。

因此，在本发明的第一个实施方案中，提供了生产在植物细胞壁中，特别是在次生细胞壁中的带正电的寡糖的方法，其中方法包括向植物细胞中导入嵌合基因的步骤，并且嵌合基因包括下列有效连接的DNA片段：

-植物可表达的启动子

-编码与靶向高尔基体膜的信号锚定序列融合的NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的DNA区；和

-转录终止和多聚腺苷酸化区。

在另一个实施方案中，提供了生产在细胞壁，特别是在次生细胞壁中包含带正电的寡糖的植物的方法，其中方法包括步骤

○向植物细胞中导入嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效连接的DNA片段：

■可在植物表达的启动子；

■编码与靶向高尔基体膜的信号锚定序列融合的NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的DNA区；和

■转录终止和多聚腺苷酸化区；

○将所述植物细胞再生成为植物。

适合本发明方法的是在所述植物细胞中表达结瘤C蛋白。结瘤C蛋白可以在所述植物的所有细胞中表达。备选地，结瘤C蛋白可以仅在所述植物的特定组织中表达，而在其他组织中不表达，如根或棉花叶子。

结瘤蛋白及其编码基因参与脂几丁寡糖信号或乙酰化几丁寡聚物(Nod因子)的合成，导致在根瘤菌科(Rhizobiaceae)和豆科(leguminous)植物之间共生时典型的瘤形成。

合成这些脂几丁寡糖所需的最关键的nod基因产物是NODA、NODB和NODC。在缺少其他nod基因产物的条件下，上述基因产物可以形成由携带N-连接的酰基的4或5个N-乙酰葡糖胺残基的寡聚物所组成的核心信号。在结瘤因子合成中三种蛋白质各自的功能是普遍已知的：NODC是生产几丁寡糖链的N-乙酰葡糖胺基转移酶；NODB从几丁寡糖链的非还原型N-乙酰葡糖胺残基上去除N-乙酰基，作为几丁质寡糖脱乙酰酶发挥作用；NODA参与酰基链附着至通过NODB的作用生成的游离氨基。由其他nod基因编码的其他Nod因子提供了区别不同结瘤因子的任何修饰性化学基团。用于本发明的目的，仅NODC蛋白和编码基因是相关的。

结瘤C蛋白(“NODC蛋白“)是良好表征的蛋白质(综述参见Kamst和Spaink，1999，Trends in Glycoscience and Glycotechnology，11，第187-199页)。它属于β-多糖合酶蛋白质家族，参与含有β-连接的单糖残基的线性多糖合成。与NODC结构上最密切相关的酶是参与几丁质(β-1-4连接的N-乙酰葡糖胺)；纤维素(β-1-4连接的葡萄糖残基的聚合物)；透明质酸(N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸的共聚物)和在斑马鱼胚胎早期发育过程中生产的几丁质寡糖的合成的转移酶。可以识别出这些蛋白质之间的6个短的保守区域。对于NODC蛋白，这些短序列对应于：

1)SEQ ID No1(来自甘蓝固氮根瘤菌的NODC)的第23位处的K残基

2)SEQ ID No1的第86-88位处的序列DDG

3)SEQ ID No1的第137-141位处的序列VDSDT

4)SEQ ID No1的第207-213位处的序列GPCAMYR

5)SEQ ID No1的第237-242位处的序列GEDRHL；和

6)SEQ ID No1的第274-278位的序列QQLRW

然而，重要的是认识到可能存在一些NODC蛋白或其变体，其中一个或多个上述共有序列不是绝对保守的。

还经常通过代表跨膜结构域的氨基酸残基的疏水段来表征NODC蛋白(Barney等人1996，Molecular Microbiology19，第443-453页)。N端疏水性结构域按N_外-C_内的定向跨越细菌细胞膜，相邻的大型亲水性结构域暴露在细菌细胞质中。此定向似乎取决于在C末端存在疏水性区域，可能含有3个穿膜区，使NODC的C末端通常位于细菌的周质中。

NODC的大型亲水性环还与其他β-葡萄糖基转移酶的相似区域具有其他的结构相似性。已经提出该区域由A结构域(从约SEQ ID No4的序列中第45位残基延伸至第140位)和B结构域(对应于SEQ ID No4的第215-280位残基)组成，其中A结构域由交替的β-片层和α-螺旋组成；B结构域被认为负责NODC的持续合成能力。在A-结构域中，2个天冬氨酸残基是保守的(SEQ ID No4的第88位和第139位残基)；在B-结构域中，1个天冬氨酸残基和基序QXXRW也是保守的(SEQ ID No4的第240位和第276-280位残基)并被认为对催化活性是关键性的。

当在它们之间比较不同的NODC蛋白时，揭示了较保守的氨基酸序列。图1显示了来自SEQ ID No1、2、8、4、7、5的不同NODC蛋白的比对，并且提示在不同NODC蛋白之间的多个保守的残基，包括(按顺序)：

-序列PXVDVIXPXXNE

-序列VDDGSXN

-序列GDXXLDVDSDTXXXXDV

-序列GXXMGQ

-序列DMEYWLACNEERXXQXRFGXVMXCXGXCXMYR

-序列FRTXYXPXAXAXTXVP

-序列YLXQQLRWARSTXRXTXL

-序列QNXGXXLL

-序列RFXFXXXHXXXNXXXLXPLKXYALXT

图2显示了不同NODC蛋白亚组的比对，显示了更保守的残基，如：

-序列

WLTRLIDMEYWLACNEERXXQXRFGXVMCCCGPCAMYRRS

-序列

LLXXYEXQXFXGXPSXFGEDRHLTILMLXAGFRTXYVPXAXAXTXVP

-序列

YLRQQLRWARSTXRDTXLA

由不同的根瘤菌生产的脂几丁质寡糖中的寡糖骨架的长度在2至6个残基之间变动。已经显示结瘤蛋白NODC是几丁质寡糖链合成中几丁质寡糖链长度的重要决定子(Kamst等人，1997，Journal of Bacteriology179，第2103-2108页)。

可以从细菌直接获得编码NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶的编码区，所述细菌属于根瘤菌属(Rhizobium)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、链霉菌属(Streptomyces)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、独岛菌属(Dokdonia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)或冷弯菌属(Psychroflexus)。然而，显而易见的是，此类编码区还可以合成地制备，甚至使用适合于其中导入过表达NODC型蛋白的嵌合基因的植物，特别是纤维生产植物的密码子使用。

可自数据库获得NODC蛋白的不同序列，如由下列登录号鉴别的蛋白质序列：1615305C、1615305D、1615305E、AAA26226、AAA63602、AAB16897、AAB24745、AAB34509、AAB47353、AAB51164、AAB71694、AAB91695、AAB95329、AAC80567、AAD11313、AAD11315、AAD11317、AAD11319、AAD11321、AAD11323、AAD11325、AAD11327、AAD11329、AAD11331、AAD11333、AAD11335、AAD11337、AAD11339、AAD11341、AAD11343、AAD11345、AAD11347、AAD11349、AAD11351、AAD11353、AAD11355、AAD11357、AAD11359、AAD11361、AAD11363、AAD11365、AAD11367、AAD11369、AAD11371、AAD11373、AAD11375、AAD11377、AAD11379、AAD11381、AAD11383、AAD11385、AAD11387、AAD11389、AAD11391、AAD11393、AAD11395、AAD11397、AAD11399、AAD11401、AAD11403、AAD11405、AAG60998、AAK00157、AAK39956、AAK39957、AAK39958、AAK39959、AAK39960、AAK39961、AAK39962、AAK39963、AAK39964、AAK39965、AAK39966、AAK39967、AAK50872、AAK65131、AAL88670、AAN62903、AAS91748、AAU11338、AAU11339、AAU11340、AAU11341、AAU11342、AAU11343、AAU11344、AAU11345、AAU11346、AAU11347、AAU11348、AAU11349、AAU11350、AAU11351、AAU11352、AAU11353、AAU11354、AAU11355、AAU11356、AAU11357、AAU11358、AAU11359、AAU11360、AAU11361、AAU11362、AAU11363、AAU11364、AAU11365、AAX30049、AAX30050、AAY44091、AAY44092、AAY44093、AAY89044、AAZ81541、ABC40958、ABC67303、ABD39006、ABD39007、ABD39008、ABD39009、ABD39010、ABD39011、ABD39012、ABD39013、ABD39014、ABD39015、ABD39016、ABD39017、ABD39018、ABD39019、ABD39020、ABD39021、ABD39022、ABD39023、ABD39024、ABD39025、ABD39026、ABD39027、ABD39028、ABD39029、ABD39030、ABD39031、ABD39032、ABD39033、ABD39034、ABD39035、ABD39036、ABD39037、ABD39038、ABD67413、ABD67416、ABD67419、ABD67422、ABD67425、ABD67428、ABD67431、ABD67434、ABD73319、ABD73320、ABD73321、ABD73322、ABD73323、ABD73324、ABD73325、ABD73326、ABD73327、ABD73328、ABD73329、ABD73330、ABD94161、ABD94162、ABD94163、ABD94164、ABD94165、ABF93198、ABF93199、ABF93200、ABF93201、ABF93202、ABM69186、ABM69187、ABM69188、ABM69189、ABM69190、ABN09217、ABN09218、ABN09219、ABN11177、ABN11178、ABN11179、ABP93834、ABS85176、ABS85177、ABS85178、ABS85179、ABS85180、ABS85181、ABS85182、ABU69044、ABU69045、ABU69046、ABU69047、ABU69048、ABU69049、ABU69050、ABU69051、ABU69052、ABU69053、ABU69054、ABU69055、ABU69056、ABU69057、ABU69058、ABU69059、ABU69060、ABU69061、ABU89879、ABV25689、ABV25690、ABV25691、ABV25692、ABV25693、ABV25694、ABW96196、ABW96197、ABW96198、ABW96199、ABW96200、ABW96201、ABW96202、ABW96203、ABW96204、ABW96205、ABW96206、ABW96207、ABW96208、ABW96209、ABW96210、ABW96211、ABY59633、ABY59634、ABY59635、ABY59636、ABY59637、ACA80309、ACA80310、ACA80311、ACA80312、ACA80313、ACC77565、ACD39337、ACD39338、ACD39339、ACD39340、ACD39341、ACD39342、ACD39343、ACD39344、ACD39345、ACD39346、ACD39347、ACD62595、ACD63093、ACD63094、ACD63095、ACD63096、ACD63097、ACD63098、ACD63099、ACD63100、ACD63101、ACD63102、ACD63103、ACD63104、ACF19762、ACF19763、ACF19764、ACF19765、ACF19766、ACF19767、ACF19768、ACF19769、ACF19770、ACH91221、ACH91222、ACH91223、ACH91224、ACH91225、ACH91226、ACH91227、ACH91228、ACH91229、ACH91230、ACH91231、ACH91232、ACH91233、ACH91242、ACH91243、ACH91244、ACH91245、ACH91246、ACH91247、ACH91248、ACH91249、ACI47333、ACI47334、ACI47335、ACI47336、ACI47337、ACI47338、ACI47339、ACI47340、ACI47341、ACI47342、ACI47343、ACI47344、ACI47345、ACL12058、ACL12059、ACL50517、ACL50518、ACL50519、ACL50520、ACL50521、ACL50522、ACL50523、ACM69382、ACM79634、ACM79635、ACM79636、ACM79637、ACM79638、ACM79639、ACM79640、ACM79641、ACM79642、ACM79643、ACM79644、ACM79645、ACM79646、ACN17701、ACN69201、ACN69202、ACN69203、ACN69204、ACN69205、ACN69206、ACN69207、ACN69208、ACN69209、ACN69210、ACN69211、ACN69212、ACN69213、ACO58664、ACO58665、ACO58666、ACO58667、ACO58668、ACO58669、ACO58670、ACO58671、ACO58672、ACO58673、ACO58674、ACO58675、ACP40990、ACS35430、ACS35434、ACT34091、ACT34094、ACT34097、ACT34100、ACT34101、ACT34104、ACT34107、ACT34110、ACT34113、ACT34116、ACT34119、ACT34122、ACT34125、ACT34128、ACT34131、ACT34134、ACT34137、ACT34140、ACT34143、ACV52950、ACV52951、ACV52952、ACV52953、ACV52954、ACV52955、ACX47326、ACX47327、ACX47328、ACX47329、ACX47330、ACX47331、ACX47332、ACX47333、ACX47334、ACY02884、ACY78518、ACZ52692、ACZ52693、ACZ52694、ACZ52695、ACZ52696、ACZ52697、ADD20957、ADD20958、ADD20959、ADD20960、ADD20961、ADD20962、ADD20963、ADD20964、ADD20965、ADD20966、ADD20967、ADD20968、ADD20969、ADD20970、ADD20971、ADG63645、ADG63646、ADG63647、ADG63648、ADG63649、ADG63650、ADG63651、ADG63652、ADJ18191、ADJ18192、BAA06082、BAA06083、BAA06084、BAA06085、BAA06086、BAA06087、BAA06088、BAA06089、BAA06090、BAA24092、BAB52500、C26813、CAA25810、CAA25811、CAA25814、CAA26310、CAA26311、CAA51773、CAA51774、CAA608779、CAA67139、CAB56055、CAC42489、CAD29949、CAD29950、CAD29951、CAD29952、CAD29953、CAD29954、CAD29955、CAD29956、CAD29957、CAD31533、CAD43933、CAD90257、CAD90583、CAD90584、CAD90585、CAD90586、CAD90587、CAD90588、CAH04369、CAN84684、CAP64017、EAQ38847、EAS72439、NP_106714、NP_435719、NP_443883、P04340、P04341、P04677、P04678、P04679、P06234、P06235、P17862、P24151、P26024、P50357、P53417、P72334、Q07755、Q53513、YP_001796208、YP_002605865、ZP_01050448或ZP_01252570(通过引用整合到本文中)。

下表概括了UNIPROT数据库中指代全长NODC蛋白的其他入口。登录号引用的所有提及的氨基酸序列都通过引用整合到本文中。

表：全长NODC蛋白

然而，显而易见的是：可以从上述氨基酸序列推断NODC蛋白的变体，其中一个或多个氨基酸残基已经被缺失、替换或插入；如果酶活性没有改变，也可以相同的效应用于根据本发明的方法中。这些变体NODC蛋白可以与任一种本文所述NODC蛋白具有约95％序列同一性。用于在体外确定NODC蛋白的酶促活性的方法描述在例如Kamst等人，1997Journal ofBacteriology，179，第2103-2108页中。

因此，如本文中使用的，“NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶”是催化GlcNAc部分从UDP-GlcNAc转移到新生几丁质寡糖的N-乙酰葡糖胺转移酶。优选地，蛋白质含有通过比较不同NODC蛋白可发现的保守区。

适合本发明方法的是SEQ ID No1至SEQ ID No9中列举的蛋白质，特别是SEQ ID No1列举的蛋白质，和编码此类蛋白质的DNA片段。

NODC应该装备了将NODC靶向至高尔基体的膜的异源信号锚定序列。此类序列是本领域已知的，包括α-2，6-唾液酸基转移酶的跨膜区段内或相邻的序列(特别是其前44或52个氨基酸；Munro等人1991，EMBOJournal，10：3577-3588)；来自人半乳糖基转移酶的信号锚定序列(特别是其前60个氨基酸)或酵母HDEL受体的拟南芥同源物(AtERD2)的信号锚定序列(Saint-Jore等人，2002，The Plant Journal，29：661-678)；来自β1，2-木糖基转移酶蛋白的信号锚定序列(特别是其前36个氨基酸；Pagny等人，2003，The Plant Journal33：189-203)、N-乙酰葡糖胺基转移酶I的信号锚定序列(特别是其前77个氨基酸；Essl等人1999，FEBSLett.453：169-173)或人溶酶体蛋白LAMP1的20个氨基酸片段(Brandizzi等人，2002，Plant Cell14：1077-1092)(所有出版物都通过引用整合到本文中)。通过在N-乙酰葡糖胺转移酶C末端融合来使用的其他高尔基体靶向信号包括可见于拟南芥DAGAT1蛋白的氨基酸序列“YYHDL”或可见于拟南芥DAGAT2的氨基酸序列“LKLEI”。可以使用标准的重组DNA技术，通过连接编码相应多肽的DNA片段，来实现此类高尔基体信号锚定序列与NODC的融合。

如本文中使用的异源信号锚定序列意指不是与其相融合的蛋白质的天然部分的信号锚定序列。因此，异源信号锚定序列可源自同一物种的另一种蛋白质，或者可以源自来自另一物种的蛋白质。

根据本发明的嵌合基因包含植物可表达的启动子。如本文中使用的，术语“启动子”表示在转录起始的过程中，被DNA依赖性RNA聚合酶识别和结合(直接地或间接地)的任何DNA。启动子包括转录起始位点，和转录起始因子和RNA聚合酶的结合位点，还可以包含可以结合基因表达调控蛋白的多种其他位点(例如，增强子)。

如本文中使用的，术语“植物可表达的启动子”意指能够控制植物细胞中(起始)转录的DNA序列。这包括植物源的任何启动子，还包括能够指导植物细胞中的转录的任何非植物源的启动子，即，某些病毒或细菌起源的启动子，如CaMV35S、地三叶草病毒启动子No4或No7、T-DNA基因启动子，如Pmas、Pnos、Ptr1、Ptr2、木薯叶脉花叶病毒等。

本文中使用的转录终止和多聚腺苷酸化区是驱动新生RNA切割的序列，其后在所获得的RNA3’端添加多聚(A)尾。在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号包括但不限于3’nos、3’35S、3’his和3’g7。

优先在纤维细胞中控制起始和维持转录的植物可表达的启动子是这样的启动子，所述启动子驱动有效连接的DNA区在纤维细胞和下层的表皮细胞中以高于植物的其他细胞或组织的水平转录。此类启动子包括来自棉花的纤维特异性β-微管蛋白基因的启动子(如WO0210377所述)、来自棉花的纤维特异性肌动蛋白基因的启动子(如WO0210413所述)、来自棉花的纤维特异性脂转运蛋白基因的启动子(如US5792933所述)、来自棉花的种皮和纤维特异性蛋白酶的启动子(Hou等人，2008，ChineseScience Bulletin53，第2639-2645页)、来自棉花的纤维特异性R2R3MYB基因的启动子(Pu等人，2008，Genetics180，第811-820页)、来自棉花的扩展蛋白的启动子(WO9830698)、来自棉花中的几丁质酶基因的启动子(US2003106097)、CesA1的启动子(US6271443)或US6259003或US6166294或WO96040924中所述的纤维特异性基因的启动子。

根据本发明的带正电的寡糖可以由N-乙酰葡糖胺寡聚物，如β1-4连接的N-乙酰葡糖胺寡聚物组成。所述寡糖可以包含2至10、或2至9、或2至8、或2至7、或2至6、或2至5、或3至5个N-乙酰葡糖胺单体。

本文中使用的聚合度是寡聚物和聚合物中存在的单体数量。N-乙酰葡糖胺寡聚物的聚合度是所述寡聚物中存在的N-乙酰葡糖胺单体的数量。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用根据本发明的方法，生产在细胞壁中包含带正电的寡糖的植物的方法，其特征在于所述植物具有与不包含NODC基因的植物基本上相同的根长度。

当根具有的长度是不包含NODC基因的野生型根的长度的至少70％、或80％或90％、或95％、或在70％和120％之间、或在80％和120％之间、或在80％和110％之间、或在90％和110％之间、或在95％和110％之间，或与不包含NODC基因的野生型根的长度相同时，根长度是基本上相同的。

在另外的实施方案中，根据本发明的植物选自棉花、大麻或亚麻。在另外的实施方案中，所述植物是包含纤维的棉花植物。

本发明还提供了使用根据本发明的方法，从植物细胞获得的植物细胞壁，如次生细胞壁或包括此类细胞壁的纤维。此类植物细胞壁包含包埋在纤维素中的带正电的寡糖，如N-乙酰葡糖胺寡聚物、β1-4连接的N-乙酰葡糖胺、或几丁质。

本发明还提供了通过从本发明的方法获得的植物分离植物细胞壁和纤维的步骤。

可以对根据本发明的带正电的多糖进行进一步修饰，例如部分或完全的脱乙酰，从而获得包含葡糖胺残基的寡聚物。所获得的葡糖胺的氨基在化学上比N-乙酰葡糖胺的氨基乙酰基或纤维素的羟基更活跃。

使用包括通过应用热机械力化学技术的碱水解(Pelletier等人，1990，Biotechnol Bioeng.36，第310-315页)，使用碱浸渍技术(Rao等人，1987，Indian Journal of Technology，25，第194-196页)，使用与水混溶的有机溶剂作为稀释剂(Batista和Roberts，1990，MakromolekulareChemie-Macromolecular Chemistry and Physics，191，第429-434页)，在脱乙酰作用过程中使用苯硫酚捕获氧(Domard和Rinaudo，1983，International Journal of Biological Macromolecules，5，第49-52页)，或使用高压灭菌条件(No等人，2000，Journal of Agricultural and FoodChemistry，48，第2625-2627页)的方法，可以在化学上实施N-乙酰葡糖胺的脱乙酰作用。还可以使用几丁质脱乙酰酶实施几丁质的脱乙酰作用。此类几丁质脱乙酰酶包括来自鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、兰色犁头霉(Absidia coerulea)、构巢曲霉(Aspergillus nidulan)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的几丁质脱乙酰酶。

根据本发明获得的植物细胞壁，特别地已接受脱乙酰作用步骤的植物细胞壁可以进一步化学修饰。含有这类植物细胞壁的产品，如纤维、纱或织物，具有与本领域描述过的纤维素-壳聚糖掺合物相似的品质，包括改良的可染性，改良的对例如皮肤真菌的抑制作用，受控的药物释放等。

本发明还提供了如本文描述的嵌合基因，和含有此类嵌合基因的植物细胞或植物，和所述嵌合基因用于增加细胞壁中带正电的寡糖的量，或用于增加植物细胞壁、棉纤维或纱或织物对于化学修饰的反应性，如可染性的用途。本发明还提供了含有此类嵌合基因的植物，如棉花植物，其特征在于所述植物的根长度与不含有此类嵌合基因的同基因植物基本相同。本发明还提供了此类棉花植物的纤维，和由所述纤维制成的纱或织物。

N-乙酰葡糖胺寡聚物生产效率的增加，或植物细胞壁中带正电的寡糖的量的增加如本文中所用意指植物细胞壁中的带正电的寡糖或N-乙酰葡糖胺寡聚物增加至少2倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少20倍，或2至100倍，或5至100倍，或10至100倍或20至100倍。

在特别的实施方案中，本发明提供了从根据本发明的方法的棉花植物获得的棉纤维，或能够从根据本发明的方法的棉花植物获得的棉纤维，或包含根据本发明的嵌合基因的棉纤维。换言之，从其细胞的基因组(如核基因组)中包含嵌合基因的棉花植物提供棉纤维，所述嵌合基因包含与DNA区有效连接的植物可表达的启动子，所述DNA区编码与高尔基体信号锚定序列融合的NODC型N-乙酰葡糖胺转移酶。在本文件的别处描述了包含于被转移到棉花植物中的嵌合基因中的DNA编码区或启动子的特定实施方案。

通过此类纤维增加的用阴离子染料的染色能力(包括例如刚果红)，此类纤维增加的用胺反应染料的染色能力(包括例如四氟苯基酯)，可以区分根据本发明的棉纤维和天然存在的棉纤维，即，从不包含根据本发明的嵌合基因的同基因品系中获得的棉纤维。根据本发明的棉纤维还具有结合小麦胚芽凝聚素的能力，所述凝聚素结合几丁寡聚物。还可以通过直接检测N-乙酰葡糖胺和GlcNAc寡聚物，如几丁二糖、几丁三糖或几丁四糖，优选地在用纤维素酶处理纤维细胞壁材料之后进行检测，来区分根据本发明的棉纤维和天然存在的棉纤维。还可以通过其增加的氮含量区分根据本发明的棉纤维。

根据本发明的棉纤维可以区别于壳聚糖涂敷的纤维或壳聚糖/纤维素掺合的纱，区别在于带正电的寡聚物几乎均匀分布在构成纤维的次生植物细胞壁中。因此，如下文所述，例如用WGA或用刚果红或四氟苯基酯染色的棉纤维的显微镜截面中，染料将几乎均匀地分布在构成棉纤维的细胞壁中，而在壳聚糖涂敷的纤维中，染色集中在作为片层位于经处理的纤维表面的壳聚糖涂层上

可以通过检测核酸中包含NODC的嵌合基因来区分根据本发明的棉纤维和其他棉纤维，所述基因仍然存在于与棉纤维相关的植物材料中。

可以如下定量根据本发明的植物细胞壁材料所增加的阴离子染料(如刚果红)染色，例如通过在标准条件下用统一量的材料进行染色，将材料在标准化的区域(如多孔板中的孔)中展开，对区域图像的材料着色层的灰度比例进行数字化。灰度越少，植物细胞壁材料的染色越多。以该方式，相比来自没有NODC编码基因的同基因植物品系的对照细胞壁材料或纤维，可以获得增加至少10％、或至少30％、或至少50％的刚果红染色的根据本发明的纤维和细胞壁材料。

还可以用酸性染料(如酸性橙7)对根据本发明的植物细胞壁材料进行染色。相比来自没有NODC编码基因的同基因植物品系的对照细胞壁材料或纤维，可以获得增加至少50％、或至少70％、或在50％和100％之间的酸性橙7染色的根据本发明的纤维和细胞壁材料。

新型棉纤维特异性结合小麦胚芽凝聚素的能力(可通过偶联的荧光素基团检测)是提供的新型棉纤维优于天然存在的棉纤维的明显区别的特征。当用WGA-alexa fluor488或555处理时，除极低的背景荧光外，天然存在的棉纤维不被染色/无荧光。当存在几丁寡聚物时，棉纤维的荧光增加了至少5倍。因此，本发明提供了能够特异性结合小麦胚芽凝聚素或与荧光团偶联的WGA(如WGA Alexa488或WGA Alexa555)的棉纤维，或者当用WGA Alexa488或WGA Alexa555处理时，在UV光下产生明亮荧光的棉纤维。该荧光不限于棉纤维的表面，而是分布在纤维细胞的整个细胞壁中。

根据本发明的植物细胞壁材料，包括棉纤维，通常具有浓度为至少0.1μg/mg细胞壁材料，或至少1μg/mg细胞壁材料，或至少5μg/mg细胞壁材料的几丁寡糖。

在任何情况下本发明的方法涉及在植物细胞中导入嵌合基因，显而易见的是此类方法还可以在这样的情况下使用，其中将植物细胞掺入到成熟的植物中。例如，可以根据已经建立的方法，将转基因细胞再生成转基因植物。

转化植物细胞和植物的方法是本领域普遍已知的。转化棉花植物的方法也是本领域普遍已知的。农杆菌介导的棉花转化已经描述在例如美国专利5,004,863或美国专利6,483,013中，并且通过颗粒轰击的棉花转化报道在例如WO92/15675中。

还可以通过在棉花植物中进行转化来导入嵌合基因，胚性愈伤组织可源于所述棉花植物，如Coker312、Coker310、Coker5Acala SJ-5、GSC25110、FiberMax819、Siokra1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、AcalaSJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、AcalaB1654-43、Acala B3991、Acala GC356、Acala GC510、Acala GAM1、AcalaC1、Acala Royale、Acala Maxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、Acala B2724、Acala B4894、Acala B5002、非Acala″picker″Siokra、″stripper″变种FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMA S6和ORO BLANCOPIMA、FM5013、FM5015、FM5017、FM989、FM832、FM966和FM958、FM989、FM958、FM832、FM991、FM819、FM800、FM960、FM966、FM981、FM5035、FM5044、FM5045、FM5013、FM5015、FM5017或FM5024和具有源自其的基因型的植物。

本文中使用的“棉花”包括陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、木本棉(Gossypium arboreum)和草本棉(Gossypium herbaceum)，或这些物种之间杂交的后代。

本发明的方法和手段也可用于其他植物物种，如大麻、黄麻、亚麻和木本植物，包括但不限于松属物种(Pinus spp.)、杨属物种(Populus spp.)、云杉属物种(Picea spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)等。

获得的经转化的植物可用于常规的育种方案，用于生产更多的具有相同特征的经转化的植物，或用于将根据本发明的嵌合基因导入至相同或相关植物物种的其他变种中或杂交植物中。从经转化的植物获得的种子含有作为稳定的基因组插入片段的本发明的嵌合基因，并且也涵盖在本发明中。

可以与对棉纤维、纱或织物进行染色的方法联合使用的反应性染料包含反应性红120(RR120)、反应性黄176(RY176)、Levafix蓝CA、反应性橙35、反应性黑5、反应性红116。还可以用酸性染料进行染色，如酸性橙7、酸性蓝62、酸性蓝281、酸性红361、酸性蓝277、酸性红4、酸性蓝113、Acid Yellow137、酸性蓝127:1和酸性蓝193。可以根据本领域普遍已知的规程应用这些染料。

本文中使用的“包含”解释为说明存在所述的特征、整数、步骤或组分，但不排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组分，或其组。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即，嵌入在更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上定义的DNA区的嵌合基因可以包含额外的DNA区等。

通过本文公开的方法获得的转基因植物细胞和植物还可以用于后续的转化程序中，例如用于导入其他嵌合基因。

还可以用棉花除草剂，如敌草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、MSMA、氧氟吩(Oxyfluorfen)、扑草净(Prometryn)、氟乐灵(Trifluralin)、氟酮唑草(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、吡氟禾草灵(Fluazifop-butyl)、草甘膦(Glyphosate)、达草灭(Norflurazon)、二甲戊乐灵(Pendimethalin)、嘧硫钠(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron)；棉花杀虫剂，如杀虫灵(Acephate)、涕灭威(Aldicarb)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿维菌素(Abamectin)、啶虫脒(Acetamiprid)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin Benzoate)、吡虫啉(Imidacloprid)、茚虫威(Indoxacarb)、λ-氟氰戊菊酯(Cyhalothrin)、多杀菌素(Spinosad)、硫双威(Thiodicarb)、γ-氯氟氰菊酯(Cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、氟虫酰胺(Flubendiamide)、杀铃脲(Triflumuron)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、β-氟氯氰菊酯(Cyfluthrin)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、噻虫胺(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、Dinetofuran、氟虫酰胺(Flubendiamide)、Cyazypyr、多杀菌素(Spinosad)、Spinotoram、γ氯氟氰菊酯(Cyhalothrin)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威(Thiodicarb)、阿维菌素(Avermectin)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)；和棉花杀真菌剂，如嘧菌酯(Azoxystrobin)、Bixafen、啶酰菌胺(Boscalid)、多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、铜、环菌唑(Cyproconazole)、苯醚甲环唑(Difenoconazole)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氟环唑(Epoxiconazole)、咪唑菌酮(Fenamidone)、氟啶胺(Fluazinam)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异丙二酮(Iprodione)、Isopyrazam、异噻菌胺(Isotianil)、代森锰锌(Mancozeb)、代森锰(Maneb)、苯氧菌胺(Metominostrobin)、吡噻菌胺(Penthiopyrad)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、甲基代森锌(Propineb)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、五氯硝基苯(Quintozene)、戊唑醇(Tebuconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、肟菌酯(Trifloxystrobin)来处理包含本文公开的嵌合基因的棉花植物或种子，或通过本文公开的方法获得的棉花植物或种子。对于用棉花除草剂处理，所述棉花植物或种子优选地还包含赋予相应除草剂耐受性的性状或天然耐受所述除草剂。

下列非限制性实施例描述了改变植物细胞壁的方法。除非在实施例中另外提出，则所有的重组DNA技术都是根据Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY和Ausubel等人，(1994)Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷中描述的标准规程进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述在R.D.D.Croy与BIOS Scientific Publications Ltd(UK)and Blackwell ScientificPublications，UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中。

在整个说明书和实施例中，参考序列表中展示的下列序列：

SEQ ID No1：甘蓝固氮根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No2：大豆根瘤杆菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No3：山羊豆根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No4：豌豆根瘤菌蚕豆生物变种的结瘤蛋白C

SEQ ID No5：苜蓿根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No6：热带根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No7：豌豆根瘤菌菜豆生物变种的结瘤蛋白C

SEQ ID No8：根瘤菌属菌株N33的结瘤蛋白C

SEQ ID No9：百脉根根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No10：pTJN6的T-DNA

SEQ ID No11：连接Golgi-信号锚定序列的NODC的氨基酸序列

SEQ ID No12：包含嵌合基因的T-DNA核酸序列，所述嵌合基因包含与额外包含高尔基体靶向序列的NODC编码核酸有效连接的F286纤维选择性启动子(＝pTDBI146)

SEQ ID No13：包含嵌合基因的T-DNA核酸序列，所述嵌合基因包含与额外包含高尔基体靶向序列的NODC编码核酸有效连接的Gluc1A启动子(＝pTDBI158)

SEQ ID No14：包含嵌合基因的T-DNA核酸序列，所述嵌合基因包含与额外包含高尔基体靶向序列的NODC编码核酸有效连接的Gluc1D启动子(＝pTDBI159)

SEQ ID No15：包含嵌合基因的T-DNA核酸序列，所述嵌合基因包含与额外包含高尔基体靶向序列的NODC编码核酸有效连接的扩展蛋白启动子(＝pTDBI165)

SEQ ID No16：包含嵌合基因的T-DNA核酸序列，所述嵌合基因包含与额外包含高尔基体靶向序列的NODC编码核酸有效连接的E6启动子(＝pTGK96)

实施例

实施例1：构建编码与高尔基体信号锚定序列融合的N-乙酰葡糖胺转移酶蛋白的嵌合的植物可表达的基因

使用标准的重组DNA技术，构建含有下列有效连接的DNA片段的植物可表达的NODC嵌合基因：

●来自CaMV的35S启动子区

●编码非翻译前导序列的DNA片段(5’Cab22L)

●编码来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β-1，2-木糖基转移酶的35个N端氨基酸的DNA片段

●编码与之前的DNA片段框内(in frame)克隆的甘蓝固氮根瘤菌的NODC的DNA片段

●来自CaMV的35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸化信号(3’35S)

将嵌合基因连同提供草丁膦(phosphinotricin)抗性的嵌合bar基因导入到T-DNA载体的T-DNA边界之间。所获得的T-DNA载体被命名为pTJN6。SEQ ID No10中提供了该载体的T-DNA序列。

将T-DNA载体pTJN6导入到农杆菌菌株C58C1RIF(pEHA101)(Hood等人(1986)J.Bact.168：1291)中，所述菌株用于通过浸花法转化拟南芥(Clough SJ和Bent AF(1998)Plant J.16：735-743).

实施例2：转基因拟南芥植物的根长度分析

对用pTJN6(具有异源高尔基体信号锚定序列的NODC)和pTGK42(没有异源高尔基体信号锚定序列的NODC；参见WO2006/136351)转化的野生型拟南芥和转基因拟南芥植物进行空气消毒，并种植在包括经修饰的维生素(Sigma)和20g/l葡萄糖的0.5x Murashige和Skoog(MS)基础盐培养基上。在4℃吸收2天后，将平板垂直放置在生长室中，进行在21℃的光照16h的昼/夜方案9天。在台式扫描仪下扫描，并在ImageJ中进行测量。将数据输出至Microsoft Excel用于分析。测量根长度，并与野生型植物的根长度比较。图3A显示，用pTGK42转化的植物的根长度比野生型的根长度短约25％，而在野生型和包含pTJN6的转基因植物的根长度之间则没有显著的差异。图B显示，对于包含pTJN6的不同转基因品系，在野生型和转基因植物的根长度之间没有显著的差异。

实施例3：转基因拟南芥植物的细胞壁中的GlcNAc寡聚物的表征

如Rozaklis等人(2002，Clinical Chemistry48：131-139)中所述，使用衍生化、高性能液相色谱和质谱的组合，分析用pTJN6转化的转基因拟南芥植物中的GlcNAc寡聚物。简而言之，在液氮中快速冷冻叶样品(20-150mg)并使用rich mill研磨器在2ml eppendorf管中磨碎。加入0.5ml80％MeOH并在预冷的桌面离心机中漩涡振荡和离心试管(5min14000rpm)。将上清液转移至新鲜的2ml管中并在快速真空中冻干。在含有0.5M PMP的100μl MeOH和100μl800mM NH₃中重悬沉淀。在热混合器(Eppendorf)中70℃，850rpm孵育反应混合物9min。在这一孵育步骤之后，通过添加200μl800mM甲酸中和反应混合物，并再用水制成500μl。在之后3次使用0.5ml氯仿进行氯仿萃取后，冻干样品，并重悬在200μl水中。在Acquity UPLC BEH C18柱(Waters Corp.，Milford，MA，USA)(1.7μm，150mm×2.1mm)上，使用Finnigan Mat LCQ质谱分析样品。移动相由(A)含有1％CAN和0.1％醋酸铵的水，和(B)含有1％水和0.1％醋酸铵的CAN组成。将柱温维持在55℃，并将自动取样机的温度维持在10℃。在开始梯度洗脱的过程中使用300μl/min的流速。条件如下：0min时间处，20％(B)；10min时间处25％(B)；和14min时间处100％(B)。用正模式操作的电喷雾离子化(ESI)获得洗脱化合物的完全MS和MS/MS波谱。在正模式下，衍生化的GlcNAC的m/z值为552，认为总峰面积是定量的最佳方式。通过MS/MS检测GlcNAC寡聚物，其中仅选择具有特定m/z值的特定化合物用于进一步的片段化。使用分别与经衍生化的单体或二聚体相对应的552-峰或755-峰进行定量。将这些水平与用pTGK42转化的拟南芥植物(WO2006/136351)和野生型拟南芥植物比较。

表1显示，在存在高尔基体信号锚定序列的情况下，相比缺少高尔基体信号锚定序列的情况，GlcNAc2的量高多达65倍，而GlcNAc3的量高多达35倍。

表1.在用pTJN6(具有异源高尔基体信号锚定序列的NODC)和用pTGK42(没有异源高尔基体信号锚定序列的NODC；见WO2006/136351)转化的拟南芥植物的叶中的N-乙酰葡糖胺寡聚物GlcNAc2和GlcNAc3的相对量。

由于含有NODC高尔基体信号锚定序列的植物的根与野生型植物的根具有相同的长度，而含不具有高尔基体信号锚定序列的NODC的植物的根显著短于野生型的根，使用上述用于叶的方法，研究了GlcNAc2和GlcNAc3的寡聚物是否存在于包含不具有高尔基体信号锚定序列(pTGK42)和具有高尔基体信号锚定序列(pTJN6)的NODC的拟南芥植物的根中。

表2显示来自pTJN6植物的根含有水平高于来自pTGK42植物的根中的GlcNAc2和GlcNAc3寡核苷酸。根中的GlcNAc2和GlcNAc3的水平显著高于叶中的水平。推测在野生型植物根中存在的GlcNAc寡聚物是由于pTGK42植物和pTJN6植物的根材料污染。

这些结果显示通过向NODC中加入高尔基体信号锚定序列来恢复根长度至野生型水平不是由于根中缺少GlcNAc寡聚物积累。

表2a.在用pTJN6(具有异源高尔基体信号锚定序列的NODC)和用pTGK42(没有异源高尔基体信号锚定序列的NODC；参见WO2006/136351)转化的拟南芥植物的根和叶中的N-乙酰葡糖胺寡聚物GlcNAc2的相对量，以每mg组织表示

表2b.在用pTJN6(具有异源高尔基体信号锚定序列的NODC)和用pTGK42(没有异源高尔基体信号锚定序列的NODC；参见WO2006/136351)转化的拟南芥植物的根和叶中的N-乙酰葡糖胺寡聚物GlcNAc3的相对量，以每mg组织表示

实施例4：表征转基因拟南芥植物的细胞壁中具有多达5的聚合度的GlcNAc寡聚物

为了检测较之野生型拟南芥植物，在用pTJN6转化的拟南芥植物中具有多达5的聚合度的GlcNAc寡聚物，实施PMP衍生化。在与SynaptHDMS Q-Tof质谱(Micromas、Manchester，UK)连接的Waters AcquityUPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA，USA)上实施LC-MS分析。使用梯度洗脱，在Acquity BEH C18柱(2.1mmx150mm，1.7μm)(WatersCorp.，Milford，MA，USA)上进行层析分离。移动相由(A)含有1％CAN和0.1％甲酸的水，和(B)含有1％水和0.1％甲酸的CAN组成。将柱温维持在40℃，并将自动取样机的温度维持在10℃。在开始梯度洗脱的过程中使用350μl/min的流速；在0min时间处5％(B)，30min时间处50％(B)，33min时间处100％(B)。将洗脱液导至装备了电喷雾离子化源和lockspray界面的质谱中，进行精确的质量测量。MS源参数如下：毛细管电压1.5kV，取样锥40V，抽提锥4V，源温度120℃，去溶剂化温度350℃，锥气流50L/h，去溶剂化气流550L/h。捕获和转移室的碰撞能分别设为6和4V。为了获取数据，激活动态范围增强模式。使用Masslynx软件(Waters Corp.，Milford，MA，USA)，以负质心V模型记录完整的扫描数据，质量范围设为m/z100-1600之间，扫描速度为0.2s/扫描。使用Leu-脑啡肽(400pg/μl溶解在用甲酸酸化的水/CAN中(1∶1，v/v))，通过每10秒进行扫描，扫描时间0.5秒，平均3次扫描，进行lock质量校正。对于MS/MS的目的，应用相同的设置，除了陷阱碰撞能量从10上升到45V。使用的所有溶剂都是ULC/MS级(Biosolve，Valkenswaard，The Netherlands)，水是用DirectQ-UV纯化系统(Millipore S.A.、Molsheim，法国)生产的。图4显示表达pTJN6-23的植物含有GlcNAc的单体、二聚体、三聚体、四聚体和五聚体。

实施例5：与高尔基体信号锚定序列融合的NODC在棉花中的纤维特异性表达

使用US6483013中描述的转化方法，生成包含实施例1概括的与高尔基体信号锚定序列融合的嵌合NODC基因的转基因棉花植物，所述嵌合基因处于F286纤维选择性启动子(公开在US2003/106097中)(＝pTDBI146)、Gluc1A(＝pTDBI158)和Gluc1D(＝pTDBI159)启动子(WO2008/083969)、E6启动子(US6096950)(＝pTGK96)或扩展蛋白启动子(US6566586)(＝pTDBI165)的控制下。分离来自这些转基因棉花植物的纤维，并通过HPLC分析N-乙酰葡糖胺聚合物。这些转基因纤维含有多达0.5％的葡糖胺，所述葡糖胺仅可以在TFA水解的条件下检测，显示其是聚合物的部分。未转化品系的纤维含有少于0.01％的GlcN。证实在来自用pTDBI158转化的品系之一的纤维中存在几丁二糖。在来自未转化品系的纤维中没有检测到几丁二糖。在田地中生长具有高水平N-乙酰基寡聚物的选定品系，并且可以选择生长正常并且形成正常棉铃的品系。使用来自这些品系的纤维生产具有改良的反应性(如改良的可染性)的纱和织物。从转基因植物的棉铃中分离的纤维具有增加的N-乙酰葡糖胺聚合物的量，所述N-乙酰葡糖胺聚合物均匀地分布在整个细胞壁中。

实施例6：具有增加的反应性的棉纤维

如实施例5所述，生成包含与高尔基体信号锚定序列融合的与纤维特异性启动子有效连接的嵌合NODC基因的转基因棉花植物。从这些植物收获成熟的棉纤维，并且可以用刚果红染色或可以与WGA-Alexa fluor555反应。此外，可以用商业染料，包括棉花反应性染料(例如反应性红120，Levafix蓝CA)、酸性染料(酸性橙7、酸性蓝281)和羊毛反应性染料(例如反应性红116，丽雅伦琥珀黄EHF)对所获得的成熟棉纤维进行染色。

WGA-Alexa555染色

棉纤维不需要脱水或透化。相反，通过在氯仿-甲醇混合物(1∶1)中3次10分钟处理纤维，随后在丙酮中进行2次10分钟处理和在乙醚中进行2次5分钟处理去除脂类和蜡。允许纤维空气干燥。

可以用WGA-Alexa555，WGA-Alexa488或WGA-四甲基罗丹明对纤维进行染色。

将纤维放在封闭溶液(150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液pH7.4；0.1％Tween20和1％牛血清白蛋白)中并孵育1小时。之后，用含有WGA-荧光染料的相同缓冲液替代缓冲液并孵育4hr。用封闭溶液替代WGA-荧光染料溶液，洗涤10分钟，随后用不含BSA的封闭溶液进行3次10min洗涤，和用不含BSA且不含Tween的封闭溶液进行2次5min洗涤。将经染色的纤维装载在显微镜载玻片上并通过荧光显微镜进行评估(Axioplan2(Zeis、Jena，德国)使用滤镜组38(激发：BP470/40；发射：BP525/50)用于Alexa fluor488缀合物或滤镜组20(激发：BP546/12；发射：BP575-640)用于Alexa fluor555或四甲基罗丹明缀合物。在来自非转基因棉花植物的棉纤维中没有检测到特异性荧光，而在包含与高尔基体信号锚定序列融合的嵌合NODC基因的转基因棉花植物的棉纤维中可检测到明亮的荧光。棉纤维的可视显微镜切片显示WGA-fluor555均匀分布在棉纤维细胞的整个次生细胞壁中。

为了准备进行染色，用含有1g/l碳酸钠和1g/l Sandozin NIN(非离子型去垢剂)的蒸馏水在80℃处理纤维30min，再进行干燥。用2％omf酸性蓝62，使用50∶1的液体∶纤维比在98℃对纤维染色60min。在染色后，用冷水漂洗纤维样品，并在环境条件下干燥。使用分光光度计，通过测量染色前后的染料浴液中的染料浓度来确定消耗。

如用T-DNA载体pTDBI158转化的棉花品系的实例中可见，根据上述规程用酸性蓝62染色的纤维表现出增加的消耗水平。

Claims

1.在植物细胞的次生细胞壁中生产并掺入带正电的寡糖的方法，所述方法包括：

i.在植物细胞中导入或提供嵌合基因，所述嵌合基因包含：

(1).植物可表达的启动子；

(2).编码与靶向高尔基体膜的异源信号锚定序列融合的结瘤C蛋白的DNA区；和

(3).转录终止和多聚腺苷酸化区

其中当和来自表达不与所述靶向高尔基体膜的信号锚定序列融合的结瘤C蛋白的植物的细胞壁比较时，所述在来自植物的细胞壁中掺入的带正电的寡糖增加；

其中所述植物选自棉花和拟南芥(Arabidopsis)。

2.根据权利要求1的方法，还包括将所述植物细胞再生成为植物的步骤。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述植物的根长度与不包含结瘤C蛋白的野生型植物的根长度相同。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述带正电的寡糖由聚合度为2至10的β1-4连接的N-乙酰葡糖胺组成。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述信号锚定序列选自大鼠唾液酸转移酶的信号锚定序列、人半乳糖基转移酶的信号锚定序列、称为AtERD2的酵母HDEL受体的拟南芥属同源物的信号锚定序列、α-2,6-唾液酸转移酶的信号锚定序列、来自拟南芥的β1,2-木糖基转移酶的信号锚定序列、来自烟草的N-乙酰葡糖胺转移酶I的信号锚定序列或氨基酸序列YYHDL或LKLEI。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述DNA区编码可从根瘤菌属(Rhizobium)物种、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)物种、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)物种、贪铜菌属(Cupriavidus)物种、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)物种、热脱硫杆菌属(Desulfobacterium)物种、独岛菌属(Dokdonia)物种、甲基杆菌属(Methylobacterium)物种、叶杆菌属(Phyllobacterium)物种或冷弯菌属(Psychroflexus)物种获得的结瘤C蛋白。

7.权利要求6的方法，其中所述结瘤C蛋白由SEQ ID No 1、SEQ IDNo 2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ IDNo 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、1615305C、1615305D、1615305E、AAA26226、AAA63602、AAB16897、AAB24745、AAB34509、AAB47353、AAB51164、AAB71694、AAB91695、AAB95329、AAC80567、AAD11313、AAD11315、AAD11317、AAD11319、AAD11321、AAD11323、AAD11325、AAD11327、AAD11329、AAD11331、AAD11333、AAD11335、AAD11337、AAD11339、AAD11341、AAD11343、AAD11345、AAD11347、AAD11349、AAD11351、AAD11353、AAD11355、AAD11357、AAD11359、AAD11361、AAD11363、AAD11365、AAD11367、AAD11369、AAD11371、AAD11373、AAD11375、AAD11377、AAD11379、AAD11381、AAD11383、AAD11385、AAD11387、AAD11389、AAD11391、AAD11393、AAD11395、AAD11397、AAD11399、AAD11401、AAD11403、AAD11405、AAG60998、AAK00157、AAK39956、AAK39957、AAK39958、AAK39959、AAK39960、AAK39961、AAK39962、AAK39963、AAK39964、AAK39965、AAK39966、AAK39967、AAK50872、AAK65131、AAL88670、AAN62903、AAS91748、AAU11338、AAU11339、AAU11340、AAU11341、AAU11342、AAU11343、AAU11344、AAU11345、AAU11346、AAU11347、AAU11348、AAU11349、AAU11350、AAU11351、AAU11352、AAU11353、AAU11354、AAU11355、AAU11356、AAU11357、AAU11358、AAU11359、AAU11360、AAU11361、AAU11362、AAU11363、AAU11364、AAU11365、AAX30049、AAX30050、AAY44091、AAY44092、AAY44093、AAY89044、AAZ81541、ABC40958、ABC67303、ABD39006、ABD39007、ABD39008、ABD39009、ABD39010、ABD39011、ABD39012、ABD39013、ABD39014、ABD39015、ABD39016、ABD39017、ABD39018、ABD39019、ABD39020、ABD39021、ABD39022、ABD39023、ABD39024、ABD39025、ABD39026、ABD39027、ABD39028、ABD39029、ABD39030、ABD39031、ABD39032、ABD39033、ABD39034、ABD39035、ABD39036、ABD39037、ABD39038、ABD67413、ABD67416、ABD67419、ABD67422、ABD67425、ABD67428、ABD67431、ABD67434、ABD73319、ABD73320、ABD73321、ABD73322、ABD73323、ABD73324、ABD73325、ABD73326、ABD73327、ABD73328、ABD73329、ABD73330、ABD94161、ABD94162、ABD94163、ABD94164、ABD94165、ABF93198、ABF93199、ABF93200、ABF93201、ABF93202、ABM69186、ABM69187、ABM69188、ABM69189、ABM69190、ABN09217、ABN09218、ABN09219、ABN11177、ABN11178、ABN11179、ABP93834、ABS85176、ABS85177、ABS85178、ABS85179、ABS85180、ABS85181、ABS85182、ABU69044、ABU69045、ABU69046、ABU69047、ABU69048、ABU69049、ABU69050、ABU69051、ABU69052、ABU69053、ABU69054、ABU69055、ABU69056、ABU69057、ABU69058、ABU69059、ABU69060、ABU69061、ABU89879、ABV25689、ABV25690、ABV25691、ABV25692、ABV25693、ABV25694、ABW96196、ABW96197、ABW96198、ABW96199、ABW96200、ABW96201、ABW96202、ABW96203、ABW96204、ABW96205、ABW96206、ABW96207、ABW96208、ABW96209、ABW96210、ABW96211、ABY59633、ABY59634、ABY59635、ABY59636、ABY59637、ACA80309、ACA80310、ACA80311、ACA80312、ACA80313、ACC77565、ACD39337、ACD39338、ACD39339、ACD39340、ACD39341、ACD39342、ACD39343、ACD39344、ACD39345、ACD39346、ACD39347、ACD62595、ACD63093、ACD63094、ACD63095、ACD63096、ACD63097、ACD63098、ACD63099、ACD63100、ACD63101、ACD63102、ACD63103、ACD63104、ACF19762、ACF19763、ACF19764、ACF19765、ACF19766、ACF19767、ACF19768、ACF19769、ACF19770、ACH91221、ACH91222、ACH91223、ACH91224、ACH91225、ACH91226、ACH91227、ACH91228、ACH91229、ACH91230、ACH91231、ACH91232、ACH91233、ACH91242、ACH91243、ACH91244、ACH91245、ACH91246、ACH91247、ACH91248、ACH91249、ACI47333、ACI47334、ACI47335、ACI47336、ACI47337、ACI47338、ACI47339、ACI47340、ACI47341、ACI47342、ACI47343、ACI47344、ACI47345、ACL12058、ACL12059、ACL50517、ACL50518、ACL50519、ACL50520、ACL50521、ACL50522、ACL50523、ACM69382、ACM79634、ACM79635、ACM79636、ACM79637、ACM79638、ACM79639、ACM79640、ACM79641、ACM79642、ACM79643、ACM79644、ACM79645、ACM79646、ACN17701、ACN69201、ACN69202、ACN69203、ACN69204、ACN69205、ACN69206、ACN69207、ACN69208、ACN69209、ACN69210、ACN69211、ACN69212、ACN69213、ACO58664、ACO58665、ACO58666、ACO58667、ACO58668、ACO58669、ACO58670、ACO58671、ACO58672、ACO58673、ACO58674、ACO58675、ACP40990、ACS35430、ACS35434、ACT34091、ACT34094、ACT34097、ACT34100、ACT34101、ACT34104、ACT34107、ACT34110、ACT34113、ACT34116、ACT34119、ACT34122、ACT34125、ACT34128、ACT34131、ACT34134、ACT34137、ACT34140、ACT34143、ACV52950、ACV52951、ACV52952、ACV52953、ACV52954、ACV52955、ACX47326、ACX47327、ACX47328、ACX47329、ACX47330、ACX47331、ACX47332、ACX47333、ACX47334、ACY02884、ACY78518、ACZ52692、ACZ52693、ACZ52694、ACZ52695、ACZ52696、ACZ52697、ADD20957、ADD20958、ADD20959、ADD20960、ADD20961、ADD20962、ADD20963、ADD20964、ADD20965、ADD20966、ADD20967、ADD20968、ADD20969、ADD20970、ADD20971、ADG63645、ADG63646、ADG63647、ADG63648、ADG63649、ADG63650、ADG63651、ADG63652、ADJ18191、ADJ18192、BAA06082、BAA06083、BAA06084、BAA06085、BAA06086、BAA06087、BAA06088、BAA06089、BAA06090、BAA24092、BAB52500、C26813、CAA25810、CAA25811、CAA25814、CAA26310、CAA26311、CAA51773、CAA51774、CAA608779、CAA67139、CAB56055、CAC42489、CAD29949、CAD29950、CAD29951、CAD29952、CAD29953、CAD29954、CAD29955、CAD29956、CAD29957、CAD31533、CAD43933、CAD90257、CAD90583、CAD90584、CAD90585、CAD90586、CAD90587、CAD90588、CAH04369、CAN84684、CAP64017、EAQ38847、EAS72439、NP_106714、NP_435719、NP_443883、P04340、P04341、P04677、P04678、P04679、P06234、P06235、P17862、P24151、P26024、P50357、P53417、P72334、Q07755、Q53513、YP_001796208、YP_002605865、ZP_01050448或ZP_01252570的氨基酸序列组成。

8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述与高尔基体信号锚定序列融合的NODC由SEQ ID No.11的氨基酸序列组成。

9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述植物可表达的启动子是纤维特异性的启动子。

10.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述植物可表达的启动子是纤维特异性的启动子，所述纤维特异性的启动子选自来自棉花的β微管蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的肌动蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的脂转运蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的种皮和纤维特异性蛋白酶的启动子、来自棉花的纤维特异性R2R3MYB基因的启动子、来自棉花的扩展蛋白基因的启动子或来自棉花中的几丁质酶基因的启动子。

11.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述植物为棉花。

12.权利要求11的方法，其中所述棉花植物中的植物细胞壁包含纤维。

13.权利要求1至3中任一项的方法，还包括通过用碱溶液处理来自所述植物的细胞壁足以使所述由N-乙酰葡糖胺单体组成的寡糖脱乙酰的时间，或者通过几丁质脱乙酰酶的酶促作用，将所述由N-乙酰葡糖胺单体组成的寡糖脱乙酰的步骤。

14.权利要求2或3中任一项的方法，还包括从所述植物分离植物细胞壁或纤维的步骤。

15.权利要求2或3中任一项的方法，其中所述植物的细胞壁是次生植物细胞壁。